방법 논문

Slipper Limpet, Crepidula fornicata의 유충의 실험실 및 현장 배양

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DOI:

10.3791/66208

⸱

2024년 1월 5일

1Department of Biology, Dickinson College

이 논문에서

요약

이 논문은 복족류 Crepidula fornicata 의 유충 배양 방법을 소량의 실험실 규모 시스템과 현장에 배치할 수 있는 주변 해수 중우주 시스템에서 제시합니다.

초록

꽃받침 복족류 연체 동물, Crepidula fornicata는 유충 발달 생물학, 생리학 및 생태학 연구에 널리 사용되었습니다. 이 종의 육화된 벨리거 유충은 성충에 의해 자연 방출된 후 체에 사이펀하여 수집하고, 200/L의 밀도로 배양에 배포하고, 1 x 105 cells/mL의 Isochrysis galbana(균주 T-ISO)를 공급했습니다. 주변 공기 또는 정의된 대기 가스 혼합물에 대한 평형을 위해 설계된 환기가 가능한 800mL 배양에서 사육된 형제 유충에 대해 껍질 성장 및 변태 능력 획득이 문서화되었습니다. 이러한 실험실 배양 조건과 대조; 성장 및 역량 데이터는 또한 생식 가능한 성인의 현장 개체군에 위치한 15L 유동 주변 해수 중간우주에서 사육된 유충에 대해 수집되었습니다. 실험실 배양에서 변성 능력의 성장 속도 및 시기는 이전에 발표된 연구에서 보고된 것과 유사했습니다. 현장에서 자란 유충 중우주는 실험실 연구에서 보고된 것보다 훨씬 더 빨리 성장하고 더 빨리 변태했습니다. 이러한 방법은 실험실에서 미리 결정된 통제된 조건뿐만 아니라 현장에서 자연적으로 발생하는 조건 하에서 유충 발달을 탐색하는 데 적합합니다.

서론

슬리퍼 절름발이, Crepidula fornicata (복족류 : Calyptraeidae)는 발달 모델로서의 유용성과 침입 종으로서의 광범위한 영향으로 인해 현재 및 역사적 연구 문헌에 잘 표현되어 있습니다. 이는 고전적 실험발생학(experimental embryology)1 시대에 나선형 발달의 기초적인 사례였으며, 로포트로코조아(lophotrochozoan)의 초기 발달 메커니즘을 해부하기 위해 현대 이미징 및 게놈 도구를 적용함으로써 관심의 재탄생을 경험했다 2,3. 그것의 생명 역사의 다른 쪽 끝에서, 다른 조사는 북아메리카 동부의 원래 분포에서 멀리 떨어진 온대 연안 해양 환경에서 이 생태계 공학자의 성인 개체군의 영향에 초점을 맞추었습니다 4,5. 배아와 성충 사이에서, 이 종의 벨리거 유충은 유충 발달 및 생태학에 대한 수많은 연구의 대상이었으며, 특히 성장과 변태 능력 획득에 영향을 미치는 요인, 유충 정착을 매개하는 내부 및 외부 신호, 유충 경험이 유년기 수행에 미치는 영향 6,7,8,9,10,11 . 최근 연구는 해양 산성화에 대한 C. fornicata의 유충과 청소년의 회복력을 밝혀냈으며,이 동물의 생산적인 연구 사용을위한 또 다른 방법은 12,13,14,15,16입니다.

해양 유충 생물학 연구를위한 C. fornicata 의 장점은 편모 Isochrysis galbana의 단일 식단으로 자연 또는 인공 해수에서 실험실에서 비교적 쉽게 자랄 수 있다는 것입니다. 배양 방법은 저자가 이전에 출판한 방법 중심의 인쇄 간행물17에서 자세히 설명했다. 현재 기부하는 이유는 두 가지입니다. 첫째, 문화를 확립하고 돌보는 것과 관련된 일상적인 신체적 움직임은 개념적으로는 매우 간단하지만 실습이나 비디오 시연 없이는 올바르게 수행하기 어렵습니다. 둘째, 해양 산성화, 부영양화 및 산소 고갈과 같은 환경 스트레스 요인에 대한 반응에 대한 실험실 및 현장 연구에 특히 적합한 앞서 설명한 배양 방법의 두 가지 변형이 설명됩니다. 첫 번째는 소량의 기포 가스를 통해 해수의 pH 및 용존 산소를 조작하는 데 적합한 저용량(800mL) 배양 시스템이고, 두 번째는 현장에 배치할 수 있고 주변 해수를 자유롭게 교환할 수 있는 더 큰 부피(15L) 중간우주 시스템입니다.

프로토콜

1. C. fornicata의 유충 배양을 확립하고 유지하기 위한 일상적인 기동

참고: 이 방법은 방금 부화한 벨리거 유충을 방출한 성인 C. fornicata 가 들어 있는 바닷물 한 병(3.8L)으로 시작합니다. 성인은 현장에서 수집하거나 재료 표에 제공된 공급 업체로부터 얻을 수 있습니다. 성인은 짝짓기 스택에 사는 protandrous hermaphrodites이며 스택의 맨 아래에 고착 된 암컷이 있습니다. 성인 스택을 분해하지 마십시오. 번식의 계절성과 계절이 아닌 산란을 위해 성충을 조절하는 방법은 이전에 설명되었다17. 유충은 방출 후 2-3시간 이내에 가장 잘 수집되며, 이때 유충은 지리 음성이 강하고 항아리 표면 근처에 집중됩니다.

  1. 400mL 삼중 모서리 일회용 플라스틱 비커의 바닥을 자르고 236μm 나일론 메쉬 패널에 붙여서 체를 만듭니다. 이러한 목적과 특히 중우주 건설(아래)을 위해 폴리에틸렌에 대한 접착력이 우수하도록 제조된 핫멜트 접착제를 사용하십시오.
  2. 성인 항아리에서 통기를 제거하고 파편이 가라앉고 유충이 표면으로 쉽게 헤엄칠 수 있도록 15-20분 동안 그대로 두십시오.
  3. 60-80cm 길이의 부드러운 플라스틱 수족관 끝에 부착 된 5mm 유리관의 짧은 길이 (15-20cm)를 통해 유충을 위와 같이 준비된 체에 넣고 600mL 유리 비커에 매달아 과도한 바닷물이 유리 비커를 넘치고 유충은 체에 남아 있습니다. 체의 바닥을 수중에 유지하고 유충이 좌초되지 않도록 하십시오.
  4. 비커에서 체를 잠시 들어 올리고 여과된 해수(FSW)가 담긴 분출 병을 사용하여 저전력 해부 현미경으로 조작할 수 있는 편리한 크기의 FSW 유리 그릇에 유충을 헹굽니다.
    참고 : C. fornicata의 유충은 30 ppt 염도 근처의 여과 된 자연 해수 또는 20-25 ° C17,18에서 32 ppt의 염분으로 만들어진 인스턴트 오션 인공 해수에서 번성합니다. < 1μm에서의 여과는 실험실 배양에서 문제를 일으킬 수 있는 오염성 유행성 원생생물을 제거하기에 충분합니다.
  5. 파스퇴르 피펫을 사용하여 원하는 수의 유충을 수동으로 옮기고 배양 용기에 넣습니다. 최상의 결과를 얻으려면 C. fornicata에 대해 1 유충/5 mL 배양 부피를 사용하십시오. 유충의 수를 세고 숫자를 추정하려는 유혹을 피하십시오.
  6. 배양이 시작될 때 원하는 비율의 미세조류를 유충에게 먹이고 배양수를 교체할 때 이틀에 한 번씩 미세조류를 교체합니다.
    참고: 1 x 105 cells/mL Isochrysis galbana (균주 T-ISO)의 식단은 거의 최대 실험실 성장률을 산출하는 좋은 표준 식단입니다. T-ISO의 배양을 위한 식품 배급 및 방법은 이전 간행물17에 제공되어 있다.
  7. 위의 1.3단계와 같이 배양액의 내용물을 비커 안의 체에 부어 이틀에 한 번씩 배양수를 교체합니다. 체를 들어 올리고 FSW 분출 병을 사용하여 유충을 새 식품과 함께 신선한 FSW 배양 용기에 헹굽니다.
    알림: 가장 좋은 방법은 유충 배양에 사용되는 모든 유리 제품을 분리하고 해당 유리 제품이 고정제, 용해성 중금속염 또는 세제와 접촉하지 않도록 하는 것입니다. 일상적인 청소는 베이킹 소다(NaHCO3) 페이스트와 나일론 수세미를 사용하는 것이 가장 좋으며, 미네랄 침전물은 백식초나 희석된 HCl로 약산성 세척으로 제거할 수 있습니다.

2. C. fornicata의 유충에 대한 환기 배양 구축

알림: 권장되는 유리 용기(재료 표)에는 해수에 불활성이고 환기 가스 흐름을 위해 튜브 미늘 입구를 고정하는 데 적합한 두께의 폴리프로필렌 뚜껑이 있습니다.

  1. 각 배양 용기의 뚜껑(뚜껑의 내부 라이너 포함)에 각각 가장자리에서 약 1.5cm, 서로 마주보고 있는 두 개의 5mm 구멍을 뚫습니다. (13/64인치 영국식 또는 #7 ASME 표준 기계공의 드릴 비트도 적절한 여유 구멍을 만듭니다.)
  2. 뚜껑의 외부 표면에 튜브 미늘이 있는 상태에서 1-8 나일론 너트를 사용하여 10/32 x 32-1 나사산 나일론 튜브 어댑터를 각 구멍에 설치합니다.
  3. 튜빙 어댑터 중 하나의 나사산 내부 부분의 구멍에 실리콘 고무 수족관 실런트를 살짝 바르고 튜빙 미늘의 외부 구멍 너머로 몇 mm 돌출되도록 내부에서 구멍을 통해 20cm 길이의 2mm(외경) 폴리에틸렌 튜브를 밀어 넣습니다.
  4. 튜브는 이제 튜브 미늘을 통해 돌출된 끝에 작은 수족관 밀봉 플러그가 있지만 미늘 끝 바로 너머에서 투명한 튜브를 볼 수 있습니다. 실런트가 경화되도록 한 다음 폴리에틸렌 튜브의 돌출된 끝을 잘라 튜브 미늘의 끝과 같은 높이가 되도록 합니다.
  5. 배양 용기에 FSW를 용기 상단의 어깨에서 1cm 이내로 채우고 뚜껑을 나사로 조인 다음 환기 공기 또는 실험용 가스 혼합 공급 장치를 폴리에틸렌 환기 튜브를 고정하는 튜브 미늘에 부착합니다. 환기 튜브의 길이를 잘라 끝이 용기 바닥에 깔끔하게 놓이도록 합니다.
  6. 환기 공기 또는 가스 혼합물의 흐름을 조정하여 기포가 천천히 생성되도록 합니다(그림 1). 일반적인 수족관 갱 밸브와 함께 수족관 공기 펌프를 사용하여 주변 공기를 환기시키거나 다른 실험용 대기 가스 혼합물에 질량 유량 컨트롤러를 사용하십시오14.

3. C. fornicata의 유충에 대한 현장 배치 가능한 중우주 배양 구축

  1. 표준 4갤런 폴리에틸렌 양동이의 측면에서 각각 25cm x 14.5cm의 균일한 간격의 직사각형 개구부 7개를 자릅니다. 각 개구부의 바닥을 양동이 내부 바닥에서 약 3.5cm 떨어진 곳에 배치합니다(그림 2A). 가는 톱니가 있는 날이 있는 휴대용 전기 세이버 톱이 이러한 목적에 이상적입니다. 잘라낸 쓰레기 조각은 그대로 두고 테이블쏘로 2cm 너비의 스트립으로 세로로 자릅니다.
  2. 양동이의 컷아웃 개구부가 편안하게 겹치도록(최소 2cm) 각각 최소 30cm x 20cm인 236μm 나일론 메쉬 패널 4개를 잘라냅니다. 작은 스프링 클램프 또는 빨래집게를 사용하여 컷아웃의 긴 가장자리 위에 메쉬 패널의 한쪽 가장자리를 임시로 고정합니다.
  3. 폴리에틸렌용으로 제조된 핫멜트 접착제로 철망 패널의 가장자리를 버킷 입구에 붙입니다. 첫 번째 가장자리가 고정되면 장력을 유지하면서 다른 가장자리를 접착제로 붙여서 메쉬 패널에 팽팽한 표면을 얻습니다.
  4. 3.1 단계에서 버킷 폐기물 조각의 스트립 길이를 잘라 철망 패널이 버킷 개구부와 겹치는 접착 영역을 깔끔하게 덮을 수 있도록 보강 스트립을 만듭니다. 넉넉한 양의 핫멜트 접착제로 각 덮개 스트립을 제자리에 누르고 접착제가 굳기 전에 각 스트립을 제자리에 고정하기 위해 빠르게 작업합니다.
  5. 버킷 외부에서 설치된 나일론 블라인드 리벳으로 각 스트립의 끝을 고정합니다. 다용도 면도칼로 보강 스트립의 바깥쪽 가장자리에서 과도한 접착제와 메쉬를 잘라냅니다.
    알림: 각 리벳에는 15/64인치 파일럿 구멍이 필요합니다. 리벳의 내부(블라인드) 부분은 그림 2B에서 완성된 중간우주의 내부에서 볼 수 있습니다.
  6. 양동이의 상단을 물 위로 잘 유지하는 부동 랙에 mesocosm을 배치합니다(그림 2C). 표시된 플로팅 랙은 2인치 Schedule 40 PVC 파이프의 30cm 세그먼트로 만들어졌으며 엘보우 및 티 조인트와 함께 접합되어 4개의 복제 중간우주 행을 수용할 수 있는 밀폐 구조를 만들었습니다.
  7. 국부적으로 조건에 따라서, 철망판은 mesocosm를 통해서 바닷물의 교환을 방해하는 방식으로 1-2 일에서 더럽게 될지도 모릅니다. 이런 일이 발생하는 정도까지, 오염된 중간우주를 물 밖으로 2/3정도 빼내고 2L 투수로 바닥에서 신선한 중간우주로 반복적으로 빠져나와 유충을 신선하고 깨끗한 중간우주로 옮깁니다.
  8. 대부분의 유충을 옮기기 위해 20-25 회 반복을 수행하거나 오염 된 중우주에서 유충이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 수행하십시오. 베이킹 소다(NaHCO3) 페이트를 적신 부드러운 스폰지로 메쉬 패널을 부드럽게 문질러 오염된 중간우주를 청소하고 수돗물로 헹굽니다.

결과

유충 성장 및 변태 능력 획득은 800mL 환기 배양물의 4회 동시 복제에서 측정되었으며, 각 배양에는 단일 알 덩어리에서 부화한 유충의 형제 배치에서 파생된 160마리의 유충이 포함되어 있으며 1 x 105 cells/mL의 밀도로 Isochrysis galbana를 공급했습니다. pH는 7.9-8.0, 온도는 20-21 °C, 염도는 30-31 ppt였습니다. 600마리의 유충을 포함하는 15L 중우주의 단일 시험에서 유충의 다른 형제 배치로 성장과 변태를 측정했으며, 이 유충은 미국 매사추세츠주 버저즈 베이에 배치되어 실험실 배양액과 유사한 pH, 온도 및 염도 조건에서 이루어졌지만 중우주의 철망 패널을 통해 흐르는 주변 해수에서 천연 식물성 플랑크톤에 의해 공급되었습니다. 측정된 pH는 7.8-8.3, 온도는 20-24°C, 염도는 26-28ppt였습니다. 성장은 껍질 길이의 변화로 결정되었습니다(그림 3). 유충은 부화 후 처음 4-5일 동안 실험실 배양(54μm/일)보다 중간우주(71μm/일)에서 더 빨리 성장했습니다(그림 4). 5일에서 6일 사이에 중간우주의 유충은 자발적으로 변태하기 시작했고, 6일째에 중우주에 남아 있는 유충은 5일째보다 평균 181μm 더 컸습니다. 중간우주에서 더 이상의 유충 측정은 없었는데, 대부분의 개체가 7일째에 변태했기 때문이다. 실험실 배양에서 유충은 4일째부터 8일째(41μm/일)까지, 8일째부터 13일째(31μm/일)까지 훨씬 느린 속도로 성장했습니다. 이 유충은 8일째에 변태에 능숙해지기 시작했으며8일에 설명된 [K+]가 상승된 하위 샘플의 자극에 의해 결정된 바와 같이 12일째까지 거의 모든 능력이 있었습니다. 실험이 종료된 13일째까지 실험실 배양물(<10%)에서 자발적인 변태가 거의 없었습니다. 생존율은 실험실 배양에서 91%-100%였으며 중간우주의 부피와 표면에서 모든 개체를 검사하고 회복하는 데 어려움이 있기 때문에 중간우주에서는 결정되지 않았습니다.

figure-results-1
그림 1: 환기 배양 설정. 그림은 1 유충/5 mL의 밀도로 비축된 Crepidula fornicata의 유충을 포함하는 800mL 환기 배양물을 보여줍니다. 특히 항아리 2와 4에서 볼 수 있는 얇은 거품 흐름에 주목하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 현장 배포 가능한 중간우주 배양 설정. 그림은 15L 중우주, (A) 측면도, (B) 평면도, (C) 플로팅 랙에 배치된 설정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 : 부화 후 4 일째의 Crepidula fornicata의 Veliger 유충. 파선은 쉘 길이 측정 축을 나타냅니다. 약어: s = 쉘; v = 벨룸; f = 발; o = operculum. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4 : 실험실 및 현장 배양에서 Crepidula fornicata의 유충 성장. 800mL 실험실 배양(점선, 열린 원) 및 15L 필드 중간(실선, 채워진 사각형)에서 유충의 성장. 각 점은 4개의 복제 실험실 배양 각각에서 15마리의 유충의 평균 또는 단일 중간우주에서 25마리의 유충의 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 1 SD± 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

C. fornicata의 유충은 다른 플랑크토영양성 해양 유충에 비해 상대적으로 배양이 쉽지만, 좋은 배양 관행의 기본에 대한 관심은 여전히 필수적이다17,19. 건강한 유충은 부화 직후에 먹이를 먹기 시작해야 합니다. 이것은 부화 다음 날에 조류 세포로 가득 찬 전체 내장을 투과 조명이 있는 해부 현미경을 사용하여 관찰함으로써 쉽게 확인할 수 있습니다. 건강한 유충의 껍질은 깨끗하고 밝아야 하며 붐비는 배양에서 빠르게 퍼지는 줄기가 있는 섬모 원생생물 또는 고착성 페네이트 규조류에 의해 눈에 띄는 오염이 없어야 합니다. 조개 오염은 수영과 먹이를 방해하고 폐사를 유발하며 일반적으로 배양 내 유충의 밀도가 너무 높다는 표시입니다.

환기된 실험실 배양에서 문서화된 유충 성장 속도 및 능력의 시기는 유충 밀도, pH, 온도, 염도 및 식량 배급의 유사한 조건에서 이 방법의 이전 버전을 사용한 실험실 실험의 발표된 결과와 유사합니다 13,14,16. 여기에 설명된 방법과 후자의 연구에서 사용된 방법 사이의 유일한 실질적인 차이점은 본 실험에서 환기 가스 흐름이 용기 표면의 헤드스페이스를 통과하지 않고 배양 용기의 바닥에서 기포 흐름을 생성한 2mm(외경) 튜브를 통해 도입되었다는 것입니다. 따라서 버블 스트림에 의해 생성된 물 순환 및 혼합은 유충 성장 및 능력 획득에 해롭지 않으며, 변화하는 가스 혼합물에 대한 배양 해수의 신속한 평형을 필요로 하는 실험, 예를 들어, 생산적인 근해 해양 환경에서 발생하는 것과 같은CO2 및 용존O2의 분압에서 딜 사이클의 효과를 조사하는 실험에 이점을 가질 수 있다(20), 21.

Mesocosm 결과는 실험실 연구에서 발표 된 것을 능가하는 유충 성장률을 산출 시켰을 뿐만 아니라 변태 능력을 습득하는 데 가장 짧은 시간을 보냈습니다22,23. 비록 현재의 결과가 유충의 성장과 발달에 명백히 매우 유리한 현장 조건 하에서 얻어졌지만, 이 방법은 관리 및 개선의 목적으로 관심이 있는 위험에 처한 서식지와 황폐화된 서식지를 포함하여 자연적으로 발생하는 환경 스트레스 요인의 조합을 나타내는 현장 현장에서 유충 성능을 탐색하는 데 가장 유익해야 한다24.

공개 사항

보고해야 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저용량 환기 배양 시스템의 초기 개발은 미국 국립과학재단(National Science Foundation, CRI-OA-1416690, Dickinson College)의 지원을 받았습니다. Lauren Mullineaux 박사는 친절하게도 Woods Hole Oceanographic Institution의 실험실 시설을 제공했으며, 이곳에서 이 시스템에 대해 제시된 데이터(그림 4)를 수집했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
양동이, 폴리에틸렌, 7 갤런US 플라스틱16916메조코즘
Crepidula fornicataMarine Biological Laboratory, 해양 자원 센터760성인 브루
드스톡 핫멜트 접착제, Infinity Supertac 500Hotmelt.comINFINITY IM-SUPERTAC-500-12-1LB폴리에틸렌 접착에 좋음
항아리, 유리, 32 oz, 폴리프로필렌 뚜껑 포함UlineS-19316P-W, 800 mL 환기 배양용
Nitex mesh, 236 µ m다이나믹 아쿠아 서플라이 주식회사NTX236-136메소코즘
너트, 육각, 나일론, 10-32 스레드홈 디포1004554441튜빙 바브 고정용
리벳, 나일론, 블라인드, 15/64" 직경, 5/32"-5/16" 그립 범위, 8개 팩NAPA 자동차 부품BK 6652844메소코즘당 4팩 필요
튜빙 바브 1/8" x 10-32 스레드US 플라스틱65593배양 항아리
당 2개 필요튜빙, 폴리에틸렌, 2.08mm ODFisher Scientific14-170-11G, 배양 용기 내부 가스 스트림 환기
튜빙, Tygon, 1/8"x3/16"x1/32"US Plastic57810배양 환기를 위한 미늘에 맞습니다.
용 은

참고문헌

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