방법 논문

세포질 내 정자 주입 후 생쥐 자손의 혈당 모니터링

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DOI:

10.3791/66212

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2024년 5월 17일

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1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

이 논문에서

요약

여기에서는 세포질 내 정자 주입(ICSI)-배아 이식(ET) 마우스 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시하여 ICSI에 기인할 수 있는 포도당 대사의 연령 관련 변화를 관찰하고 인간 발달에 대한 잠재적인 장기적 영향에 대한 통찰력을 제공합니다.

초록

인간의 수명은 상당히 긴 반면, 마우스 모델은 비교적 짧은 기간에 전체 인간의 수명을 시뮬레이션할 수 있으며, 1년의 마우스 수명은 대략 인간의 40년에 해당합니다. 세포질 내 정자 주입(ICSI)은 임상에서 일반적으로 사용되는 보조 생식 기술입니다. 그러나 약 30년 전에 비교적 최근에 출현한 것을 감안할 때 이 기술이 인간 발달에 미치는 장기적인 영향은 불분명합니다. 본 연구에서는 마우스 모델을 이용하여 배아 이식(ET) 방법과 결합된 ICSI를 확립하였다. 그 결과, 정상 쥐의 정자는 체외 배양 및 후속 ICSI를 거친 후 89.57%의 수정률과 87.38%의 2세포 비율을 나타냈다. ET에 이어 자손의 출산율은 약 42.50%였습니다. 또한, 마우스가 나이가 들면서 포도당 대사 수준의 변동이 관찰되었으며, 이는 ICSI 기술의 적용과 관련될 수 있습니다. 이러한 발견은 마우스 ICSI-ET 기술이 정자 이상이 배아 발달에 미치는 영향과 특히 포도당 대사와 관련하여 자손 건강에 대한 장기적인 영향을 평가하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공한다는 것을 의미합니다. 이 연구는 인간 발달에 대한 ICSI 기술의 잠재적 영향에 대한 추가 연구를 위한 중요한 통찰력을 제공하며 이 기술의 장기적 영향에 대한 심층적인 조사의 필요성을 강조합니다.

서론

불임 문제는 특히 출산율 감소와 불임 유병률 및 중증도의 심각성이 증가하는 현대 사회에서 의학적, 사회학적 관심의 주요 초점으로 부상했습니다. 보조 생식 기술(ART)은 일반적으로 치료 중재로 사용되는 세포질 내 정자 주입(ICSI)을 통해 이러한 문제를 해결할 수 있는 다양한 가능성을 제공합니다.

1992년 팔레르모가 세포질 내 정자 주입(ICSI)을 통해 최초로 임신에 성공했다고 보고한 이후 ICSI는 보조 생식 기술(ART)1의 중추적인 기술이 되었습니다. 그러나 ICSI가 임상 환경에서 사용된 기간은 인간의 수명에 비해 상대적으로 짧은 기간인 30년밖에 되지 않았다는 점을 고려할 때, ICSI가 특히 자손 발달에 미치는 장기적인 영향은 광범위하게 조사되고 해명되지 않았습니다. 현재 마우스는 균일한 유전적 배경과 짧은 수명을 특징으로 하여 의학 연구에서 널리 활용되는 대체 모델로 부상했습니다. 더욱이, 생쥐 모델은 압축된 시간 프레임 내에서 인간의 전체 수명을 요약할 수 있는데, 생쥐의 경우 1년은 인간의 경우 대략 40년에 해당한다2.

지난 10년 동안 여러 소규모 연구에서 ICSI를 통해 임신된 개인은 노년에 비정상적인 혈당 수치와 같은 대사 증후군이 발생할 위험이 증가할 수 있다고 보고했습니다 3,4. 증거가 확정적이지는 않지만, 그럼에도 불구하고 이 발견은 ICSI의 장기적인 건강 영향에 대해 과학계 내에서 심각한 우려를 불러일으켰습니다. 이러한 상황은 ART와 ART가 장기적으로 건강에 미치는 영향에 대한 보다 엄격한 평가가 시급히 필요하다는 점을 강조합니다. 특히 인간 연구의 한계와 윤리적 고려 사항에 비추어 볼 때, ICSI에 따른 인간 자손의 발달을 정확하게 요약할 수 있는 동물 모델을 개발하는 것이 점점 더 중요해지고 있습니다. 이러한 맥락에서, 마우스 ICSI-ET(Intracytoplasmic Sperm Injection-Embryo Transfer) 모델은 인간 ICSI를 모방하고 자손의 건강 결과에 대한 장기적인 모니터링을 용이하게 하는 능력으로 인해 자손에 대한 ICSI 기술의 잠재적 건강 위험을 평가하는 효과적인 도구가 되었다5.

이 연구는 무작위 혈당 모니터링, 공복 혈당 검사 및 포도당 내성 검사를 사용하여 마우스의 포도당 대사 상태를 평가함으로써 널리 퍼진 대사 표현형, 즉 자손 포도당 대사 건강에 대한 ICSI-ET 기술의 영향을 조사하는 것을 목표로 합니다. 무작위 혈당 모니터링은 정상적인 생리적 활동 중 포도당 대사의 자연적인 변동을 포착하는 데 사용되는 반면, 공복 혈당 및 포도당 내성 검사는 잠재적인 당뇨병 전증 상태를 평가하기 위해 사용됩니다.

프로토콜

아래에 설명된 ICSI-ET 프로토콜은 지침을 따르며 Shanghai Institute of Planned Parenthood Research의 Animal Ethical Review에서 승인되었습니다. 안전 절차: 화학 물질이나 생물학적 물질을 취급할 때는 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 후드 사용: 인증된 흄 후드 또는 생물 안전 캐비닛 내에서 휘발성 화학 물질 또는 에어로졸 생성과 관련된 모든 절차를 수행합니다. 과배란 절차를 위해 암컷 마우스(6-8주 된 B6D2F1 균주)를 사용하십시오.

1. 생쥐의 ICSI

  1. 생쥐의 과배란
    1. 첫날 20:00경에 생쥐당 7.5IU의 용량으로 임신한 암말 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG)의 복강 내 주사를 투여합니다.
    2. 3일째 20:00경(PMSG 주사 후 48시간)에 마우스당 7.5IU의 용량으로 인간 융모성 성선 자극 호르몬(HCG)의 복강 내 주사를 투여합니다.
  2. HTF 배지를 1mL 부분 표본으로 준비하고 암컷 마우스에 HCG를 주입하는 당일에 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 평형을 위해 뚜껑을 덮지 않은 상태로 둡니다.
  3. ICSI 수정 방울의 준비
    1. 암컷 마우스에 HCG를 주입하는 당일, 50 x 9 mm 세포 배양 접시 뚜껑을 상반과 하반으로 나눕니다. 정자 배치를 위해 10% 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 사용하여 각각 5μL의 4-6개 방울을 만듭니다. 아래쪽 절반을 사용하여 ICSI 절차에 M2 배지를 사용하여 각각 5μL의 8-10 방울을 생성합니다.
    2. PVP 및 M2 배지 방울을 약 3mL의 미네랄 오일로 덮습니다(그림 1).
  4. 문화 요리의 준비
    1. 암컷 마우스에 HCG 주사 당일, 20 μL의 KSOM 배지 (MR-020P-D) 12 방울을 35 x 10 mm 세포 배양 접시에 균일하게 분배합니다. 약 3mL의 미네랄 오일로 방울을 덮습니다.
  5. 정자 채취:
    1. 수컷 마우스를 자궁 경부 탈구에 의해 4 일째 오전 9시 00 분 (HCG 주사 후 13 시간)에 안락사시킨다.
    2. 부고환 카우다를 분리하고 철저히 세척하여 멸균 거즈로 부드럽게 닦고 미리 데워진 HTF 배지로 헹구어 지방 조직과 혈액 잔여물을 제거합니다.
    3. 정자가 HTF 배지로 자유롭게 헤엄쳐 나갈 수 있도록 cauda 부고환을 잘라냅니다. 겸자를 사용하여 카우다를 부드럽게 짜내어 정자를 방출하고, 사전 평형화된 HTF 튜브에 수집하고, 추가 사용을 위해 정자 정전 용량을 위해 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 덮지 않은 상태로 보관합니다.
  6. 난모세포 회수
    1. 자궁경부 탈구에 의해 난모세포 회수를 자극받은 암컷 마우스를 4일째 되는 날 오전 9시 30분경에 안락사시킨다. 복부 피부와 근육층의 정중선을 따라 조심스럽게 절개하여 복강을 노출시킵니다.
    2. 미세한 겸자를 사용하여 난관의 양쪽, 특히 부풀어 오른 양판 부위의 조직을 부드럽게 분리하고 멸균 배양 접시에서 M2 배지로 옮깁니다. 지정된 모든 마우스에서 난관이 수집될 때까지 이 절차를 반복합니다.
    3. 해부 현미경으로 1mL 주사기 바늘을 사용하여 부풀어 오른 난관의 투명한 부분을 부드럽게 뚫어 적운-난모세포 복합체(COC)가 배지로 방출되도록 합니다.
    4. 동일한 주사기를 사용하여 COC를 조심스럽게 선택하여 100μL의 신선한 M2 배지가 들어 있는 새 접시에 옮깁니다. 모든 COC가 원래 배관 세그먼트에서 성공적으로 전달될 때까지 이 단계를 반복합니다.
    5. 혈액과 조직액을 닦아내고 해부 현미경으로 25G 바늘을 사용하여 난관의 앰풀라를 찢어 열면 수많은 COC가 방출됩니다.
    6. 난관 및 조직 조각을 제거하고 COC를 히알루로니다아제(HY)를 함유한 M2 배지 방울로 옮기고 37°C로 예열합니다.
    7. 약 5분 동안 배양한 후 적운 세포와 난모세포의 분리를 용이하게 하기 위해 부드러운 피펫팅을 수행합니다. HY 함유 용액에서 중기 II(MII) 난모세포를 신선한 M2 배지로 이동시키는 단계; 그런 다음 M2 매체의 여러 방울로 순차적 전달을 수행합니다.
    8. 2-3회 세척 후 난모세포를 KSOM 배양 배지의 방울로 옮기고 추가 사용을 위해 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 보관합니다.
  7. 넷째 날 오전 10:00 경, 용량 화 된 정자 100 μL의 초음파 처리 (1.5.2 단계 참조)를 5 초 동안 46kHz의 주파수로 꼬리에서 머리를 분리하고 전력 설정은 50 와트입니다.
    알림: 꼬리를 자르기 위해 정자를 초음파 처리할 때 5초를 초과해서는 안 되는 시간을 제어하는 데 주의하십시오. 초음파 처리 후 몇 초 후에 정자를 도립 현미경으로 관찰 할 수 있습니다. 정자의 약 절반이 잘린 꼬리를 보일 때 초음파 검사를 중단하십시오.
  8. ICSI 절차
    1. 25° 각도로 설정된 납작한 팁과 6μm의 내경을 가진 시중에서 판매되는 micromanipulation 바늘을 사용하여 주입합니다. 바늘 안쪽의 길이가 0.5cm인 채워진 부분과 함께 사용 유체를 바늘에 채웁니다. 유체의 수위가 ~ 0.5cm에 도달하는지 확인하십시오.
      참고: 수정 난모세포의 생존율을 감소시킬 수 있는 고온을 피하기 위해 주입 중 실내 온도를 19°C로 유지하십시오. 유체 레벨이 0.5cm에 도달하도록 하는 정밀도는 주입 과정의 무결성을 유지하고 난모세포의 생존력을 보장하는 데 매우 중요합니다.
    2. 마이크로 매니퓰레이터의 오른쪽 팔에 주입 바늘을 설치하고 홀딩 캡을 조여 단단히 고정합니다. 마이크로 매니퓰레이터의 왼쪽 팔에 마우스 난모세포용으로 설계된 시중에서 판매되는 납작한 팁 micromanipulation 홀딩 피펫을 설치하고 주입 바늘과 홀딩 피펫을 현미경의 시야에 배치합니다.
    3. 피펫을 사용하여 PVP 용액 방울에 1μL의 초음파 처리된 정자를 추가합니다.
    4. 20개의 MII 난모세포를 M2 배지 방울에 넣습니다.
    5. 주사 바늘을 사용하여 PVP 용액에 10-20개의 정자 머리를 흡인합니다. 그런 다음 난모세포가 들어있는 물방울에 주사 바늘을 넣습니다.
    6. 편광 현미경으로 난모세포 내 중기 방추체의 위치를 직접 측정하여 방추체 장치가 주입 측면에 있지 않도록 하며, 극체는 일반적으로 난모세포의 방향을 기준으로 12시 방향 또는 6시 위치에 위치합니다.
    7. 난모세포가 배양 접시의 바닥에 닿도록 합니다. 난모세포의 zona pellucida와 주사 바늘이 같은 평면에 있도록 초점면을 조정합니다.
    8. 주사 바늘이 zona pellucida에 닿으면 주사 바늘에 약간의 음압을 가하여 zona pellucida의 일부를 끌어들입니다.
    9. 강도 설정 5와 주파수 1로 피에조 펄스를 동시에 활성화하여 zona pellucida에 효과적으로 천공을 생성하고 주입 바늘이 통과할 수 있도록 합니다.
    10. 주사 바늘을 유리체 주위 공간으로 전진시켜 정자 머리를 바늘 끝으로 밀어 넣습니다. 주사 바늘을 난모세포의 반대쪽에 도달할 때까지 난모세포에 삽입합니다.
    11. 강도 1과 주파수 1로 설정된 피에조 펄스를 사용하여 원형질막에 작은 기공을 생성하여 PVP의 진입을 최소화하고 난모세포의 무결성을 최적으로 보존하면서 정자 머리가 난형질에 주입되도록 합니다.
    12. 20개의 난모세포가 모두 주입될 때까지 1.8.11단계를 반복한 다음 19°C에서 15분 동안 배양합니다.
    13. 살아남은 난모세포를 KSOM 배지로 옮기고 인큐베이터에 넣습니다. 2-cell, 4-cell, morula 및 blastocyst 형성 속도를 관찰합니다.
      참고: 난모세포로의 세포질 내 단일 정자 주입(ICSI) 타이밍을 제어해야 하며, HCG 주입 후 14-18시간 이내에 절차를 완료하는 것을 목표로 합니다.

2. 마우스 배반포의 자궁 이식

  1. 정관 절제된 수컷 마우스의 준비
    참고: 연구를 위해 6-8주 된 ICR 수컷 마우스를 사용하십시오.
    1. 1.25% 2,2,2-트리브로모에탄올을 0.2mL/체중 10g의 용량으로 복강내 주사하여 마취를 유도합니다. 통증 반응이 없다는 것은 성공적인 마취를 나타냅니다.
      참고: 현재 프로토콜에는 마취된 동물의 눈에 수의사 연고를 바르는 것이 포함되어 있지 않지만, 시술 중 눈 건조를 예방하고 동물의 건강과 편안함을 보장하기 위한 모범 사례로 권장됩니다. 수술 및 회복 과정 전반에 걸쳐 모든 수술 기구는 사용 전에 멸균 처리되었으며 수술 부위는 깨끗한 수술 환경을 보장하기 위해 소독액을 사용하여 준비되었습니다.
    2. 잠재적인 스트레스나 부상으로부터 보호하려면 초기 회복 단계에서 수술을 받은 쥐를 개별적으로 수용하십시오.
    3. 최적의 통증 완화를 보장하기 위해 체중의 0.05mg/kg의 용량으로 부프레노르핀을 투여하십시오.
      알림: 생쥐의 건강을 보장하기 위해 회복 기간 동안 생쥐를 면밀히 모니터링하고 흉골 누운 상태를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 생쥐를 방치하지 마십시오.
    4. 고환보다 위쪽인 하복부 부위에 수술 부위를 준비합니다. 털을 제거하고 포비돈 요오드로 소독하십시오. 멸균 가위를 사용하여 linea alba를 따라 1cm 세로로 절개합니다. 멸균되고 먼지가 없는 종이로 혈액을 부드럽게 제거하고 linea alba를 따라 복부 근육을 뭉툭하게 절개하고 복강에 접근합니다.
    5. 구부러진 집게를 사용하여 왼쪽 고환 및 관련 지방 패드를 부드럽게 잡고 노출시킵니다. 정관을 식별하고 뾰족한 집게를 사용하여 조심스럽게 분리하여 조작을 위한 10mm 세그먼트를 만듭니다.
    6. 구부러진 집게를 알코올 램프의 외부 화염에 몇 초 동안 유지하여 살균합니다. 정관을 부드럽게 잡으면 소작으로 인해 평평해지고 하얗게 됩니다. 첫 번째 소작 지점에서 3-5mm 떨어진 곳에 두 번째 소작 지점을 만듭니다. 멸균 수술용 가위를 사용하여 두 소작 지점 사이의 정관 지연 부분을 절제합니다.
    7. 정관 deferens의 소작된 끝 부분을 주의 깊게 검사하여 짧고 평평하고 하얗게 된 부분이 남아 있는지 확인합니다. 구부러진 집게를 사용하여 고환 및 관련 지방 패드를 복강으로 부드럽게 되돌립니다.
    8. 반대쪽(오른쪽)에서 2.1.6단계에서 설명한 절차를 반복합니다.
    9. 봉합사를 사용하여 수술 부위를 봉합하며, 일반적으로 근육층에 한 바늘을 꿰매고 피부에 세 바늘을 꿰맸습니다. 수술 절개 부위가 적절하게 정렬되었는지 확인하고 포비돈 요오드로 소독합니다. 관찰을 위해 동물을 가열 패드로 옮기고 동물이 의식을 회복할 때까지 10-15분 동안 모니터링합니다. 회수되면 동물을 케이지로 되돌려 보냅니다.
      참고: 정관 절제술 후 마우스는 14일의 회복 기간이 필요하며 1주일의 시험 교미 실험이 필요합니다.
    10. 이 주 동안 정관 수술을 받은 수컷을 암컷과 지속적으로 짝짓기하고 교미 플러그가 있는 모든 암컷의 임신 상태를 관찰합니다. 성공적인 짝짓기는 암컷 쥐의 질 구멍에 황백색의 뭉툭한 질 플러그가 있는 것으로 표시됩니다.
      1. 첫째 날 오후 4:00에서 오후 6:00 사이에 마우스를 페어링하고 둘째 날 오전 7:00에서 오전 9:00 사이에 질 플러그를 확인합니다. 질 플러그가 있는 암컷은 0.5일에 가성 임신 상태인 것으로 간주하고 후속 배아 이식 실험에 사용합니다. 질 플러그가 없는 암컷을 수용 그룹으로 되돌려 보냅니다.
        참고: 질 플러그가 없는 이 암컷은 가성 임신 암컷을 준비하기 위해 짝짓기에 계속 사용할 수 있습니다. 플러그가 꽂힌 모든 암컷이 임신하지 않도록 하십시오. 그런 다음에야 정관 수술을 받은 남성을 공식적인 실험에 사용할 수 있다.
      2. 정관 수술을 받은 수컷은 매일 짝짓기를 할 수 있지만 짝짓기 세션 사이에 1일의 휴식을 허용합니다.
        참고: 우리의 경험에 따르면, 정관 수술을 받은 남성은 1년 이상 높은 교미 플러그 비율을 유지할 수 있습니다. 그러나 4-6회 연속 시도 동안 짝짓기 암컷에서 교미 플러그를 생성하지 못하는 정관 수술을 받은 수컷은 연구에서 제거해야 합니다.
  2. 가성 임신 여성의 준비
    1. ICR 암컷 마우스(7-10주령, 체중 25g 이상)와 정관 절제된 수컷 마우스(3-6개월령)를 1:1 비율로 교배하여 가임신 암컷 마우스를 생성합니다.
      참고 : 정관 수술 된 수컷은 암컷 쥐의 자궁 경부를 자극하는 데 사용되었으며, 그 결과 corpora lutea가 활성화되었습니다.
  3. 배반포를 옮기기 위한 피펫 준비
    1. 인큐베이터에서 이식할 배아를 37°C의 온도에서 M2 배지 방울로 옮깁니다.
    2. 이송 피펫을 사용하여 소량의 액체를 흡입하고 소량의 공기를 흡입한 다음 6-10개의 배아를 흡인합니다. 마지막으로 다른 소량의 공기를 흡입하여 피펫을 밀봉합니다.
      알림: 이송 피펫의 유체 길이는 0.5cm를 초과해서는 안 됩니다.
  4. 자궁 이식(배반포)
    1. 가성 임신 암컷 마우스의 무게를 측정하고(교미 후 2.5일) 체중의 0.2mL/10g의 용량으로 1.25% 2,2,2-트리브로모에탄올을 복강 내 주사하여 마취합니다. 집게로 귀를 부드럽게 누릅니다.
    2. 생쥐에게 마취를 투여하고 알코올 소독을 통해 무균을 확인한 후 복부에 정중선 세로 절개를 합니다. 느슨한 피하 조직을 이용하여 이식에 필요에 따라 절개 부위를 왼쪽 또는 오른쪽으로 이동합니다. 작은 가위를 사용하여 요추 측면 ~ 0.5cm에서 복벽 근육 층을 둔하게 절개하여 복막강에 접근합니다.
    3. 비외상성 겸자를 사용하여 난소, 난관 및 자궁을 조심스럽게 외부화합니다.
    4. 주사기 바늘 끝을 사용하여 혈관을 피하고 자궁-난관 접합부 아래의 자궁 벽을 위쪽으로 작게 절개합니다. 이 절개는 자궁강에 대한 접근을 제공합니다. 작은 구멍을 통해 2-3mm 떨어진 곳에 난관을 부드럽게 삽입합니다.
    5. 배아를 천천히 주입하는 동안 전사 피펫을 주의 깊게 관찰하면서 전사 피펫 끝에 있는 작은 기포를 조심스럽게 배출합니다. 배양액의 중앙 부분이 배출되는 것이 확인되면 절차를 중단하고 전사 피펫을 조심스럽게 제거합니다.
    6. 난소, 난관 및 자궁을 복강 안으로 다시 재배치합니다. 근육층과 피부를 따로 봉합합니다. 마우스가 마취에서 회복될 때까지 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 쥐의 웰빙을 보장하기 위해 회복 기간 동안 쥐를 면밀히 모니터링하고 흉골 누운 상태를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 쥐를 방치하지 마십시오.
  5. 임신 관찰
    1. 수술 후 18-21일 동안 쥐를 관찰하여 태어난 자손의 수를 모니터링합니다. 난산(난산)의 경우 제왕절개를 시행합니다. 갓 태어난 쥐가 같은 연령대의 수유 댐에 의해 육성되도록 하십시오.

3. 무작위 혈당, 공복 혈당, 내당능 검사

  1. 마우스 성장 중 무작위 혈당 수치 추적
    1. 생쥐가 태어난 이래로 4주마다 먹이를 주고 즐거운 밤을 보낸 후 오전 9시에 무작위 혈당 수치를 모니터링하십시오.
      1. 쥐 꼬리 끝을 뚫어 꼬리 정맥 피를 얻습니다.
      2. 혈액의 첫 번째 한 방울은 조직액이 혼합되어 있기 때문에 당 측정 값이 더 높습니다. 따라서 깨끗한 흡수지를 사용하여 첫 번째 혈액 한 방울을 부드럽게 닦아내십시오.
      3. 휴대용 혈당계로 꼬리 정맥에서 두 번째 방울(~4μL)의 혈당을 측정합니다.
  2. 생쥐 발달 중 공복 혈당 및 포도당 내성의 변화 추적
    알림: 첫 번째 혈액 샘플링 시점이 15분임을 고려하면 모든 마우스는 15분 이내에 주입해야 합니다. 각 마우스 주입에는 20-30초가 걸렸으므로 이 시간 내에 주입이 완료되도록 하기 위해 각 테스트에 사용할 수 있는 최대 마우스 수는 30개를 초과할 수 없습니다.
    1. 하룻밤 동안 공복 한 쥐에서 출생 후 4 주마다 공복 혈당 및 포도당 내성 검사를 수행합니다.
      1. 첫날은 방사선 조사를 받은 신선한 부스러기, 침구, 깨끗한 케이지, 뚜껑, 물병을 준비합니다. 생쥐를 음식이 없는 신선한 케이지로 옮깁니다. 케이지에 먹이 금지 태그를 추가합니다.
      2. 충분한 10% 포도당 주사(멸균 및 발열원이 없음)와 1mL 주사기를 준비합니다.
      3. 각 그룹의 쥐가 16일째 오후 5:00부터 1일차 오전 00시까지 9:00 동안 금식하되 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 합니다. 포도당 측정기를 사용하여 3.1.1.1-3.1.1.3 단계에 설명된 대로 공복 혈당 수치를 측정합니다.
    2. 쥐의 무게를 측정하고 꼬리를 표시하여 빠른 식별을 용이하게 합니다. 마우스 무게가 10μL/g인 포도당 주사기를 준비합니다.
    3. 30초 간격으로 10μL/g 포도당을 마우스의 복강내강에 주입합니다.
      알림: 부정확한 액체 주입량을 피하기 위해 여기에서 주입 기술에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 운영의 핵심 포인트는 다음과 같습니다.
      1. 마우스를 움직이지 못하게 하고 한 손으로 꼬리를 고정합니다. 머리를 엉덩이보다 약간 낮게 유지하여 복강 내의 장기가 머리 쪽으로 이동하여 충분한 주입 공간을 남깁니다.
      2. 바늘을 정중선과 엉덩이 뼈 사이에 놓고 45도 각도로 피부를 통해 삽입한 다음 바늘을 피부 표면과 평행하게 ~0.5cm 동안 정렬하면서 바늘을 복강 깊숙이 부드럽게 안내합니다.
        알림: 내부 장기가 실수로 구멍이 뚫렸는지 확인하기 위해 주입 중 저항에 주의하십시오.
      3. 주사기를 복강으로 배출합니다.
      4. 주입이 시작된 시간을 기록하고 타이머를 사용하여 주입 속도를 제어합니다. 타이머를 다룰 때 시간을 낭비하지 않도록 3마리의 마우스에 대해 타이머를 90초로 설정하십시오.
    4. 원하는 간격(포도당 투여 전 0분, 포도당 로딩 후 15, 30, 60, 90, 120분)으로 꼬리 정맥에서 혈당을 측정합니다.
      알림: 후속 혈당 검사도 각 마우스에 대해 20-30초가 소요되어야 합니다.
    5. 실험이 끝난 후 쥐를 음식과 물이 있는 집 케이지로 돌려보냅니다.

결과

우리 실험실에서는 생쥐의 부고환 꼬리 정자와 함께 ICSI를 사용하여 89.57%의 수정률과 87.38%의 2세포 비율을 달성했습니다. ET 이후의 자손의 출산율은 약 42.50%입니다. 놀랍게도, 모든 수정률, 2세포 비율 및 자손 출생률은 인간 ART에서 달성한 수준과 비슷하여 마우스에서 인간 ART 기술의 여러 단계를 종합적으로 시뮬레이션할 수 있습니다. 자세한 내용은 표 1 및 표 2에 나와 있습니다. 성장 및 발달 과정에서 자연적으로 태어난 마우스와 ICSI 마우스 간의 무작위 혈당 수치에는 유의한 변동이 없었습니다(그림 2). 그러나 수컷 ICSI 마우스는 실험 내내 지속적으로 높은 수준의 공복 혈당을 보였는데(그림 3), 이는 공복 혈당 항상성 장애를 나타냅니다. 흥미롭게도, 암컷 ICSI 마우스는 대조군에 비해 아무런 변화도 보이지 않았다. GTT에서 혈당 수치는 수컷 ICSI 마우스와 대조군 간에 유의미한 변화를 보였으며(그림 4), 암컷 마우스에서는 이러한 차이가 없었습니다. 이 결과는 ICSI 기술을 사용하여 얻은 자손이 당뇨병을 앓고 있을 수 있음을 시사했으며, 그 결과는 성별과 관련이 있었습니다. 암컷 마우스는 당뇨병 표현형을 나타내지 않았지만 수컷 및 암컷 ICSI 마우스의 과체중 표현형은 일관되었습니다(그림 5).

여기에 설명된 세포질 내 정자 주입(ICSI) 프로토콜을 사용하여 마우스에서 높은 수정 및 배아 발달률을 달성했습니다. 대표적인 실험에서 난모세포의 89.57%가 ICSI 후 수정되었으며, 이는 두 개의 전핵(pronuclei)이 형성된 것으로 입증되었습니다. ICSI 후 24시간이 지났을 때 접합체의 87.38%가 2세포 배아 단계로 발달했습니다. 수혜 암컷에게 배아를 이식한 후 살아있는 새끼의 출생률은 42.50%였습니다(긍정적인 결과). 여기에 설명된 최적화된 세포질 내 정자 주입(ICSI) 프로토콜을 사용하여 쥐 난모세포와 정자에서 자손을 효율적으로 생성했습니다. 중요한 것은, ICSI 유래 동물의 철저한 특성 분석이 심각한 발달 결함이 없는 상태에서 대사 섭동을 드러냈다는 것입니다.

자연적으로 사육된 대조군과 비교했을 때, 암컷이 아닌 수컷 ICSI 마우스는 공복 혈당 상승(그림 3)과 복강 내 포도당 내성 검사에서 포도당 내성 감소(그림 4)로 입증된 포도당 항상성 장애를 보였습니다. 이러한 변화는 ICSI 매개 수정 중 재프로그래밍 결함 또는 정자 조작 중에 발생하는 미묘한 유전적/후성유전학적 이상에서 비롯될 수 있습니다.

또한, 수컷과 암컷 ICSI 마우스 모두 대조군에 비해 체중이 증가했으며(그림 5), 이는 비만 성향을 시사합니다. 마우스 ICSI 기술은 인간 ICSI 결과를 신뢰할 수 있게 모델링하지만, 관찰된 대사 표현형은 ICSI 동물 모델의 결과를 신중하게 해석해야 할 필요성을 강조합니다. 성장, 건강 및 행동에 대한 포괄적인 평가는 다운스트림 응용 분야에 대한 ICSI 마우스의 적합성을 결정하는 데 필수적입니다.

종합하면, 이러한 데이터는 연구를 위한 자손을 효율적으로 생성하기 위한 마우스 ICSI 프로토콜의 유용성을 보여주는 동시에 ICSI 유래 동물에서 표현형 결과를 철저히 평가하는 것의 중요성을 강조합니다. 이 예에서 관찰된 성별에 따른 대사 이상은 ICSI 마우스 모델의 결과를 신중하게 해석해야 할 필요성을 강조합니다.

figure-results-1
그림 1: 생쥐의 세포질 내 정자 주입을 위한 접시 준비 다이어그램. 세포 배양 접시 뚜껑은 상반부와 하반부로 나뉘었다. 상반부에는 정자 배치를 위한 10% 폴리비닐피롤리돈 용액의 물방울이 포함되어 있었습니다. 하반부에는 ICSI 절차를 수행하기 위한 M2 매체의 액적이 포함되어 있습니다. 모든 물방울은 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일로 덮여 있습니다. 이 접시 설정을 통해 PVP와 M2 액적 사이에서 정자와 난모세포를 순차적으로 전달하여 ICSI 과정을 가능하게 했습니다. 분리된 영역은 절차 중 매체의 혼합을 방지했습니다. 약어: ICSI = intracytoplasmic sperm injection; PVP = 폴리비닐피롤리돈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 출생 후 발달 중 자연적으로 사육된 대조군(n = 5) 및 ICSI(n = 5) 마우스의 주간 무작위 혈당 수치. 혈당 수치는 혈당계를 사용하여 대조군과 ICSI 마우스의 꼬리 정맥에서 하룻밤 금식 후 매주 측정했습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되며, 통계적 유의성은 이원 분산 분석, ns, P > 0.05를 사용하여 평가하였다. 약어: SEM = 평균의 표준 오차; ICSI = 세포질 내 정자 주입; ns = 중요하지 않음; NM = 자연 짝짓기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 출생 후 발달 중 자연적으로 사육된 대조군(수컷의 경우 n=7, 암컷의 경우 n=7)과 ICSI 처리된 마우스(수컷의 경우 n=7, 암컷의 경우 n=7)의 주간 공복 혈당 수치. 하룻밤 단식 후, 혈당계를 사용하여 공복 대조군과 ICSI 처리된 마우스의 꼬리 정맥에서 혈당 수치를 매주 측정했습니다. 암컷이 아닌 수컷 ICSI 처리 마우스는 생후 8주부터 성별이 일치하는 대조군에 비해 공복 혈당 수치가 크게 상승한 것으로 관찰되었습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되며, 통계적 유의성은 양방향 분산 분석(two-way ANOVA, ns, P > 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001)을 사용하여 평가하였다. 약어: SEM = 평균의 표준 오차; ICSI = 세포질 내 정자 주입; ns = 중요하지 않음; NM = 자연 짝짓기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 생후 16주에 자연적으로 사육된 대조군(n = 5) 및 ICSI 처리된 수컷 마우스(n = 5)의 복강 내 포도당 내성 테스트. 하룻밤 단식 후, 마우스는 복강내 포도당 주사(체중 2g/kg)를 받았습니다. 그런 다음 주사 후 0, 30, 60 및 120분에 혈당 수치를 측정했습니다. 수컷 ICSI 처리된 마우스는 자연적으로 사육된 대조군에 비해 IPGTT 중 30분, 60분 및 120분에서 상당히 높은 혈당 수치를 보였습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되며, 분석은 양방향 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. ns, P > 0.05. *P < 0.05. 약어: IPGTT = 복강 내 포도당 내성 검사; SEM = 평균의 표준 오차; ICSI = 세포질 내 정자 주입; ns = 중요하지 않음; NM = 자연 짝짓기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 생후 4주에서 20주까지 자연적으로 사육된 대조군(n = 수컷 5명, n = 암컷 5명) 및 ICSI 처리된 마우스(n = 수컷 5명, n = 암컷 5명)의 체중 추적. 주간 측정에 따르면 ICSI를 처리한 수컷과 암컷 쥐 모두 생후 8주부터 성별이 일치하는 대조군에 비해 체중이 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되며, 분석은 양방향 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. P < 0.001입니다. P < 0.0001입니다. 약어: SEM = 평균의 표준 오차; ICSI = 세포질 내 정자 주입; ns = 중요하지 않음; NM = 자연 짝짓기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

난모세포(Oocyte)접합자(Zygotes)수정률(%)2-셀2세포 속도(%)4-8 셀4-8 세포 속도(%)모룰라Morula 비율배반포(Blastocysts)배반포 비율
카우다 정자 ICSI1908493.337690.487285.716982.146476.19
카우다 정자 ICSI28072906286.115981.945373.614663.89
카우다 정자 ICSI3605083.334284377432642856
합계23020689.5718087.3816881.5515474.7613866.99

표 1: 마우스 ICSI에 따른 발달 결과. 약어: ICSI = intracytoplasmic sperm injection.

아니요.아니요. 이식된 배아의 수아니요. 출생 (%)남성여성출생률(%)
16330
26110
35202
48422
58211
67532
합계401710742.5

표 2: ICSI 마우스 배아의 자궁 이식 후 출산 결과. 약어: ICSI = intracytoplasmic sperm injection.

토론

이 연구는 인간 보조 생식 기술(ART)을 종합적으로 요약하고 ET와 함께 ICSI가 자손 발달에 미치는 영향을 조사하기 위해 마우스 세포질 내 정자 주입(ICSI) 및 배아 이식(ET) 기술을 통합했습니다. 정상적인 쥐 정자에 ICSI 기술을 적용하면 높은 수정률(86.76%)과 2세포 비율(88.48%)이 나타났습니다. ET에 이어 자손 마우스의 출산율은 약 42.50%로 기술 플랫폼의 견고성을 나타냅니다. 이 연구에서 가장 주목할 만한 발견은 ICSI 자손의 포도당 대사 수치의 연령 관련 변동으로, 이는 ICSI 기법6의 적용에 기인할 수 있습니다.

포도당 대사 수준의 변동을 관찰한 것은 이 연구에서 주목할 만한 발견을 구성합니다. 이 발견은 ICSI 기법이 자손의 건강, 특히 포도당 대사와 관련하여 장기적으로 영향을 미칠 수 있음을 시사한다7. 이러한 현상의 원인을 규명하기 위해 우리는 ICSI 절차에 포함된 중요한 기술 단계에 대한 포괄적인 조사를 수행했습니다. 우리는 미세주입 온도(19°C), 초음파 절단 시간(5초 이내) 및 전달 유체 부피(<0.5cm)를 제어하는 것이 높은 배아 생존율과 착상률을 유지하는 데 중요하다는 것을 발견했습니다. 이송 피펫의 사이펀 효과를 제어하는 것은 정확한 배아 이식을 위한 중요한 단계로 부상했습니다. 이송 피펫을 준비할 때 튜브 직경의 균일성을 보장하는 것은 사이펀 효과를 완화하고 튜브 내 액체의 움직임을 더 잘 제어하는 데 중요합니다. 이 조치는 배아 이식의 성공률과 정확성을 향상시키는 데 중요한 역할을 합니다. 또한, 배아 이식 중 장기간의 체외 배양과 과밀을 피하는 것도 발달 능력 향상에 도움이 되었습니다. 최적화된 프로토콜을 사용하여 ET 이후 86.76%의 수정률과 42.50%의 출산율을 달성했으며, 이는 ICSI 절차 자체가 본질적으로 생존 가능성을 손상시키지 않았음을 시사합니다. 따라서, 포도당 대사의 변동은 명백한 배아 손상보다는 ART 과정에 의해 유도된 미묘한 세포 내 변화와 더 그럴듯하게 연관되어 있었다.

ART는 널리 안전한 것으로 간주되지만, 겉보기에 정상으로 보이는 ART 자손조차도 부자연스러운 생식 특성과 배우자 및 배아 발달 중 개입의 결정적 시기로 인해 나중에 다양한 건강 위험을 나타낼 수 있음을 나타내는 증거가 증가하고 있습니다 5,8,9,10,11,12,13 . 우리의 연구 결과는 ART의 잠재적인 대사 효과에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 ART가 자손 건강에 미치는 장기적인 영향에 대한 추가 연구의 필요성을 강조합니다14.

이 연구가 쥐 모델을 사용했음을 인정하는 것이 중요합니다. 결과적으로, 결과는 인간 피험자에게 직접 전달되지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 생쥐와 인간 사이의 상당한 생물학적 유사성을 감안할 때, 이러한 발견은 상당한 참조적 중요성을 가지고 있다15. 또한, 임상에서 ICSI를 받는 환자는 종종 정자 이상을 가지고 있다는 것을 인정하는 것이 중요합니다. 반대로, 이 연구는 ICSI 시술을 위해 정상 마우스를 사용했기 때문에 정자 이상이 있는 마우스의 ICSI 자손에 대한 데이터가 부족했습니다. 그러나 정자 이상이 ICSI 기술의 장기적인 영향에 더 깊은 영향을 미칠 것으로 예상하는 것이 합리적입니다. 따라서 본 연구의 결과는 주목할 만한 참고문헌적 가치를 유지한다.

우리 연구의 또 다른 한계는 정자 고정화에 대한 마우스 모델과 인간 임상 관행 간의 방법론적 불일치입니다. ICSI의 임상 적용에서는 마이크로 피펫으로 꼬리를 물리적으로 파괴하여 인간의 정자를 고정시키는 것이 일반적입니다. 그러나 생쥐 모델 실험에서는 생쥐 배아 조작에 일상적으로 사용되는 방법인 정자를 준비하기 위해 초음파 꼬리 클리핑을 사용했습니다. 우리는 이러한 접근 방식이 특히 초음파로 인해 발생할 수 있는 정자 무결성 및 기능에 대한 가능한 손상을 고려할 때 모델에 의도치 않게 변동성과 잠재적 편향을 도입할 수 있음을 인정합니다. 이러한 방법론적 차이는 연구 결과의 직접적인 번역 가능성을 제한할 수 있습니다. 향후 연구에서 우리는 쥐 정자의 꼬리를 파괴하기 위한 마이크로피펫의 사용을 탐구할 계획입니다. 이 조정은 정자에 대한 의도하지 않은 영향을 최소화하고 인간 ICSI 절차에서 관찰된 조건과 결과를 더 잘 복제하는 것을 목표로 합니다. 우리는 연구 결과의 임상적 관련성을 향상시키기 위해 연구 관행을 지속적으로 개선하기 위해 최선을 다하고 있습니다.

앞서 언급한 기술 플랫폼을 기반으로 향후 연구에서 ICSI 기술이 심혈관 건강 및 면역 체계와 같은 자손 건강의 다른 측면에 미치는 영향을 추가로 조사할 것입니다. 또한, ICSI의 장기적인 효과를 종합적으로 이해하기 위해서는 장기적인 추적 연구가 필수적입니다.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 상하이 장장 국가 독립 혁신 시범구 특별 개발 기금 주요 프로젝트 계획(ZJ2022-ZD-006), 상하이시 과학기술위원회 대상 자금 지원 프로젝트(22DX1900400), 상하이시 위생건강위원회 청소년 프로그램(20204Y0276)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (32070849).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.25 % 아베르틴 (2,2,2- 트리 브로 모에탄올)남경 AibeiM2960마취
세균 페트리 접시 35 x 10mm 스타일 승 / 꽉 뚜껑, 크리스탈 학년 버진 폴리스티렌, 멸균BD353001
세균 페트리 접시 50 x 9mm 스타일 승 / 꽉 뚜껑, 크리스탈 등급 버진 폴리스티렌, 멸균BD351006
Biosafety CabinetESCOclass figure-materials-1 BSC무균 작업, 배양 접시 만들기, 시약 분취 등
CO2 인큐베이터Thermo8000DH배아 배양
해부 현미경OlympusSZX16마우스 배아 이식에 사용
Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770은 높은 절연 강도와 저항력을 가진 열적으로 안정적인 완전 불소화 액체로, 작동 유체
휴대용 혈당계RocheAccuChek performa. 포도당 측정
HTFMerckMR-070-D마우스 IVF와 함께 사용하도록 설계된 액체인 EmbryoMax HTF(Human Tubal Fluid)(1x)는 50mL 형식으로 제공되며 배아 배양을 위해 최적화 및 검증되었습니다.
유압식 마이크로인젝터EppendorfCellTram 4r Oil, 5196000030For sperm
injection InvertedMicroscope NikonTI2-UMicromanipulation observation host
KSOMMerckMR-020P-D(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Medium (1x), liquid, with Phenol Red
MicromanipulatorNARISHIGENTX-N4마이크로 매니저션 암
미네랄 오일 SIGMAM8410미네랄 오일은 다양한 분자 생물학 응용 분야에서 증발 및 교차 오염을 제어하기 위한 커버 레이어로 사용하기에 적합합니다.
바늘 절단기Nanjing AibeiSutter MF-800미세 조작 바늘 제작에 사용
바늘 풀러Nanjing AibeiSutter 모델 p-100미세 조작 바늘 제작에 사용
Piezo Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087ICSI 주사 바늘의 적용.
Piezoelectric Micromanipulator (Membrane Breaker)EppendorfEppendorf PiezoXpert마이크로 펄스를 사용하여 난모세포의 투명대와 난포를 파괴
Pneumatic MicroinjectorEppendorfCellTram 4r Air, 5196000013난모세포 고정용
즉시 사용 가능한 인간 융모성 성선 자극 호르몬 (Hcg)Nanjing AibeiM2520멸균 시약, 복강 내 주사.50 IU/mL
바로 사용 가능한 임산부 암말의 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG)난징 AibeiM2620살균 시약, 복강 내 주사.50 IU / mL
실체 현미경OlympusSZX7난모 세포 채취 및 배아 발달 관찰
Blood로 사용됩니다

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