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방법 논문

인간 세포주를 사용하여 간 기관 형성 모델링, 조립체 구축 및 합성 조직 설계를 위한 체외 배양 기술

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/66229

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2025년 4월 18일

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1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

이 논문에서

요약

오가노이드는 장기 개발, 약물 발견 및 질병 연구를 위한 맞춤형 조직 모델링에 혁명을 일으켰습니다. 오가노이드 엔지니어링은 복잡한 합성 조직을 만드는 것으로 발전합니다. 목표는 형태 형성, 조립체 기술 및 생체 매트릭스를 통합하여 조직 공학을 발전시키는 것입니다. 이 프로토콜은 간 기관 형성을 모델링하고 합성 조직 구축에 대한 지침을 수립하는 데 도움이 됩니다.

초록

만성 간 질환은 전염병처럼 번지고 있으며 전 세계적으로 8억 명 이상의 사람들에게 영향을 미치고 있습니다. 현재 치료법인 정소성 간 이식에는 몇 가지 한계가 있습니다. 간 재생 의학 분야에서 유망한 솔루션이 등장했으며, 간 기관 형성은 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. E8.5와 11.5 사이에 발생하는 조기 간 기관 형성은 형태 형성, 탯줄 형성 및 집단 이동으로 이어지는 상피-중간엽 상호 작용의 형성을 포함합니다. 그러나 이 프로세스의 체외 모델링을 위한 방법이 부족합니다. 이 연구에서는 인간 세포주를 이용한 간 기관 형성의 다양한 단계와 측면을 모델링할 수 있는 일련의 상세한 방법을 제시합니다. 한 가지 방법 시리즈에서는 간(HEP) 및 중간엽(MES) 스페로이드를 사용한 아셈블로이드 기술을 활용하여 간 기관 형성에서 발견되는 초기 구조를 복제하고, 초기 형태 형성을 모델링하고, 생체 내에서 볼 수 있는 간질 세포 이동을 입증합니다. 이러한 혁신적인 아상블로이드 시스템은 아상블로이드 형성 및 이동에 영향을 미치는 요인을 식별하는 데 도움이 됩니다. HEP 스페로이드 배양 시스템은 또한 집단 이동 및 분기 형태 형성을 모델링하는 데 사용되었습니다. 중간엽 조건화 배지(M-CM)는 용량 의존적 분기 이동을 시작하는 데 중요한 역할을 합니다. 제시된 모든 방법은 높은 성공률로 재현성이 높은 것으로 나타났습니다. 이러한 이벤트를 함께 연결함으로써 우리의 연구는 순차적인 형태 유전학적 이벤트를 재현하여 체외 및 생체 내 기관 형성을 리버스 엔지니어링할 수 있도록 합니다.

서론

간 세포 이동은 간 기관 형성, 질병 및 세포 치료에서 중요한 역할을 합니다. 간 기관형성(E8.5-9.0, 마우스) 동안, 복부 앞장 전(前) 간상피는 주변 중간엽과 심장에서 나오는 유도 신호로 인해 간 유전자를 발현하기 시작합니다. E9.0에서 세포가 직육면체에서 가성층화된 원주형 형태로 전환됨에 따라 앞장 상피가 두꺼워져 간 diverticulum1,2를 형성합니다. 이 중요한 단계에서 간 게실은 ~1,500개의 세포로 구성됩니다. 다음으로, 간 게실을 둘러싸고 있는 간 내배엽은 두꺼워지고, 박리되고, 이동하는 간아세포(HB)의 탯줄을 형성합니다. 이러한 HB는 내피 세포 및 중간엽 세포와 함께 이동하며, 주변 중간엽 조직으로 분기하여 3차원 집단 세포 이동을 시작하여 간 싹을 형성합니다3,4. 실제로, 이 단계에서 세포는 집단적으로 (1) 공동 이동 또는 다른 세포 유형과 함께 이동, (2) 분기 형태 형성 또는 분기 튜브 같은 구조의 형성, (3) 간질 이동 또는 다른 세포 위 또는 세포 사이의 이동을 겪습니다. E11.5에 이르러서는 이동이 멈추고 원시 간이 형성되어 103 fold3으로 확장됩니다. 쥐 태아 HB 발현은 3D 집단 세포 이동, 형태 형성 및 세포외 기질 리모델링과 관련된 고도로 상향 조절된 유전자의 증거를 보여주었기 때문에 간 세포 이동은 간 기관 형성의 후기 단계에서도 필요할 수 있습니다5. 3D 집단 이동은 초기 간 기관 형성에서의 역할 외에도 진행성 간세포 암종(HCC)의 국소 확산 및 전이와 복잡하게 연결되어 궁극적으로 예후를 악화시키고 치료 내성을 증가시킵니다6. 성체 및 태아 간세포는 또한 간 재증식 기간 동안 비장에서 간 내부로 이동할 때 집단 이동을 사용합니다. 생체 내 이미징 연구에 따르면 이식된 간세포는 몇 시간 내에 문맥으로 들어간 다음 모세혈관으로 들어가 간 정현파를 가로질러 간 조직을 통해 이동합니다7,8,9. 마지막으로, 최근 연구에 따르면 HB의 이동은 쥐와 인간의 간 재생 중에 발생하며, sheets10에서 이동의 일부 증거가 있습니다. 전반적으로, 다양한 형태의 형태 형성이 가능한 간 집단 이동은 기관 형성, 암, 간세포 세포 치료 및 간 재생에 중요한 역할을 합니다.

수많은 유전 연구에서 3D 간 집단 세포 이동의 기저에 있는 분자 경로를 탐구했습니다. 이러한 연구는 간삭의 부재가 간 형성을 방해한다는 것을 밝히며, 간 형성의 필요성과 간 형성을 위한 지지 세포와의 상호 작용을 강조합니다1,11,12,13. 이러한 연구는 또한 간 성장이 심장 중배엽에서 분비되는 FGF-2, 주변 중간엽에서 분비되는 BMP4, HGF 및 내피 세포 상호 작용을 포함한 다양한 요인에 의해 시작됨을 보여줍니다. 또한 HEX, PROX1 및 TBX3을 포함한 마이그레이션 관련 전사 인자는 중요한 역할을 합니다2,14. 결론적으로, 유전학 연구는 전사 인자 발현을 유도하는 용해성 인자 신호전달이 HB와 주변 중간엽 사이의 이동, 신호 전달 및 분자 상호 작용을 주도한다는 증거를 제공합니다.

초기 간 기관 형성에서의 세포 이동은 광범위하게 조사되었지만, 현재 간 이동에 대한 체외 연구에서는 생체 내 종양 모델과 함께 고도의 이동성 HCC 세포를 활용하는 2D 분석을 사용하는 경우가 많습니다15. 이러한 연구는 TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20 및 miRNAs21,22,23. 3D 간 세포 이동의 분자 메커니즘을 이해하는 데 주목할 만한 진전이 있었지만 2D와 3D 세포 이동 간의 뚜렷한 차이는 2D 분석에 고유한 한계가 있음을 시사합니다. 더욱이, 이러한 모델에는 이동과 성장 모두에 필수적인 중간엽 세포 유형이 포함되지 않는 경우가 많습니다. 지지 간엽을 통합하는 간 이동을 위한 3D 모델 개발이 발전했지만, 이러한 모델은 다양한 집단 이동 방식을 탐색하기보다는 주로 공동 이동을 강조합니다.

다양한 자기 조립 및 형태 유전 과정을 통해 스페로이드에서 조직을 생성하는 능력은 합성 조직의 과학적 탐구를 용이하게합니다. 이러한 조직은 약물 개발 및 스크리닝, 질병 모델링, 치료 및 기타 생물 의학 및 생명 공학 응용 분야에서 광범위하게 응용됩니다. 다양한 형태의 간 3D 집단 이동을 나타내도록 설계된 여러 3D 체외 배양 시스템의 방법론적 세부 사항이 제공됩니다. 이러한 시스템은 (1) 매트릭스 내 HEP 및 MES 스페로이드를 사용한 코스페로이드 배양, (2) M-CM으로 배양된 HEP 스페로이드 매트릭스 액적, (3) HEP-MES 혼합 스페로이드 및 (4) 고밀도의 MES 세포로 배양된 HEP 스페로이드 매트릭스로 구성됩니다. 이러한 시스템은 3D 환경에서 간 집단 이동에 대한 강력한 모델링을 가능하게 하여 간 기관 발생, 암 및 치료의 기초가 되는 분자 및 세포 과정에 대한 이해를 발전시킵니다.

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프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다. 이 기사에서 사용된 약어는 보충 파일 1에 정의되어 있습니다.

1. 1% 저전기내오스마(EEO) 아가로스 용액의 제조

  1. 낮은 EEO 아가로스 분말 2.5g의 무게를 달아 비커에 옮깁니다.
    알림: 용액 준비 중에 버블링을 수용할 수 있도록 비커가 원하는 부피의 두 배 이상인지 확인하십시오.
  2. 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 250mL의 증류수를 측정하고 1%의 최종 농도(w/v)를 목표로 비커에 붓습니다.
  3. 비커의 입구를 플라스틱 랩으로 덮고 환기를 위한 작은 구멍을 남겨둡니다. 비커를 전자레인지에 30초 동안 가열합니다.
  4. 조심스럽게 비커를 제거하고 내용물을 휘젓습니다. 용해가 완료될 때까지 30초마다 이 과정을 반복합니다.
    주의 : 전자레인지에 돌린 유리 그릇은 적절한 장갑을 사용하여 조심스럽게 다루십시오. 과열이나 끓는 것을 방지하기 위해 용액을 면밀히 모니터링하십시오.
  5. 균일한 용액이 나오면 전자레인지에서 비커를 꺼냅니다. 사전 멸균된 병에 옮기기 전에 용액을 부드럽게 휘젓습니다. 용액을 오토클레이브하고 사용할 준비가 될 때까지 아가로스 용액을 실온(RT)에서 보관합니다.

2. 96웰 플레이트 코팅

참고: 384웰 초저 부착 스페로이드 마이크로플레이트는 이러한 실험 및 추가 실험에 활용될 수 있습니다.

  1. 멸균 1% 아가로스 용액이 들어 있는 병의 뚜껑을 풉니다. 액상으로 전환 될 때까지 전자 레인지에서 용액을 30 초 간격으로 따뜻하게하십시오. 그런 다음 캡을 조입니다.
    주의 : 전자레인지에 돌린 유리 그릇은 적절한 장갑을 사용하여 조심스럽게 다루십시오. 과열 또는 끓는 것을 방지하기 위해 용액을 면밀히 모니터링하십시오.
    알림: 멸균 조직 배양 층류 후드 아래에서 다음 단계를 수행하십시오.
  2. 웰당 55-65μL의 1% 아가로스 용액을 96웰 조직 배양 플레이트를 코팅하고 플레이트를 즉시 회전시킵니다.
  3. 1% 아가로스 용액이 원하는 수의 웰로 옮겨지면 플레이트를 4°C 냉장고에 20-30분 동안 넣어 아가로스가 응고되도록 합니다. 사용하기 전에 플레이트를 실온(그림 1A)으로 가져오십시오.

3. HEP 스페로이드의 제조

  1. 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)이 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM)으로 구성된 완성 성장 배지(cDMEM)를 사용하여 T-75 플라스크에서 HepG2-WT 세포를 배양합니다. 세포 배양을 37°C 및 5% CO2로 유지하고 성장 배지를 매일 변경합니다.
  2. 80% 농도에 도달하면 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 헹구고 헹굼액을 버립니다. 0.05% 트립신-EDTA 5mL를 플라스크에 넣고 37°C 및 5% CO2에서 5-10분 동안 배양합니다.
  3. 동일한 양의 cDMEM을 넣고 플라스크에서 세포를 씻어냅니다. 세포가 분리되면 혼합물을 15mL 멸균 원추형 원심분리 튜브로 옮기고 RT.
    에서 5분 동안 300 x g의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 참고: 이 프로토콜에 설명된 모든 원심분리 단계는 실온(RT)에서 수행되었습니다. 그러나 이러한 원심분리 절차는 저온에서 대안적으로 수행할 수 있습니다.
  4. 새로운 cDMEM에서 세포 현탁액을 다시 현탁시키고 세포를 계수하여 세포/mL 단위의 최종 농도를 측정합니다(그림 1B).
  5. 세포의 염료 라벨링
    참고: 이 단계는 선택 사항입니다.
    1. 원하는 양의 세포 현탁액을 15mL 멸균 코니컬 원심분리 튜브로 옮기고 300 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
    2. 세포 펠릿을 무혈청 성장 배지에 다시 현탁시켜 1.0 x 106 cells/mL의 최종 농도를 달성합니다. 세포 현탁액 mL당 5μL의 형광 세포 표지 용액을 추가하고 세포 현탁액을 37°C에서 20분 동안 회전 시 5% CO2로 배양합니다
      참고: 무혈청 성장 배지는 DMEM이며 1%의 펜 스트렙만 보충됩니다. 세포 현탁액 밀도에 따라 균일한 염색을 위해 배양 시간을 조정합니다.
    3. 배양이 완료되면 세포 현탁액을 450 x g에서 5분 동안 원심분리하고 새로운 cDMEM에서 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복합니다(그림 1C).
  6. 스페로이드 형성
    1. 세포 수를 기준으로 5.0 x 104 cells/mL의 최종 농도를 달성하기 위해 새로운 cDMEM에서 세포를 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 혼합하고 웰당 100μL의 세포 현탁액을 아가로스 코팅된 96-well plate.
      로 옮깁니다. 참고: 세포 현탁 밀도는 아가로스로 코팅된 96-웰 플레이트에서 웰당 5,000개의 세포를 달성하도록 설정됩니다. 384웰 플레이트를 사용하기 위해 세포는 2.0 x 105 cells/mL의 최종 농도로 현탁되고, 웰당 10,000개 세포의 농도를 달성하기 위해 웰당 50μL의 세포 현탁액이 전달됩니다.
    2. 플레이트를 340 x g에서 10분 동안 원심분리하고 37°C 및 5% CO2에서 5-9일 동안 배양합니다(그림 1D).
      참고: 도금 후 격일로 성장 배지를 교체하고 cDMEM의 50%를 부드럽게 제거하고 교체하십시오. HEP 스페로이드는 HEP-MES 어셈블리 모델 또는 M-CM 모델에 적합합니다.

4. MES 스페로이드의 준비

  1. 10% FBS 및 1% Pen-Strep이 보충된 DMEM으로 구성된 cDMEM을 사용하여 T-175 플라스크에서 HFF/MRC-5 세포를 배양합니다. 세포 배양을 37°C 및 5% CO2로 유지하고 배지를 격일로 변경합니다.
  2. 80% 포화도에 도달하면 1x PBS로 세포를 헹구고 헹굼을 버립니다. 0.25% 트립신-EDTA 5mL를 플라스크에 넣고 37°C 및 5% CO2에서 5-10분 동안 배양합니다.
  3. 동일한 양의 cDMEM을 넣고 플라스크에서 세포를 씻어냅니다. 세포가 분리되면 혼합물을 15mL 멸균 원뿔형 원심분리 튜브로 옮기고 300 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
  4. 새로운 cDMEM에서 세포 현탁액을 다시 현탁시키고 세포를 계수하여 세포/mL 단위의 최종 농도를 측정합니다(그림 1B).
  5. 세포의 염료 라벨링
    참고: 이 단계는 선택 사항입니다.
    1. 원하는 양의 세포 현탁액을 15mL 멸균 코니컬 원심분리 튜브로 옮기고 300 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
    2. 세포 펠릿을 무혈청 성장 배지에 다시 현탁시켜 1.0 x 106 cells/mL의 최종 농도를 달성합니다. 세포 현탁액 mL당 5μL의 형광 세포 표지 용액을 추가하고 세포 현탁액을 37°C에서 20분 동안 회전 시 5% CO2로 배양합니다
      참고: 무혈청 성장 배지는 DMEM이며 1%의 펜 스트렙만 보충됩니다. 세포 현탁액 밀도에 따라 균일한 염색을 위해 배양 시간을 조정합니다.
    3. 배양이 완료되면 세포 현탁액을 450 x g에서 5분 동안 원심분리하고 새로운 cDMEM에서 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이 세척 과정을 두 번 더 반복합니다(그림 1C).
  6. 스페로이드 형성
    1. 세포 수를 기준으로 1.0 x 105 cells/mL의 최종 농도를 달성하기 위해 새로운 cDMEM에서 세포를 현탁합니다. 세포 현탁액을 혼합하고 웰당 100μL의 세포 현탁액을 아가로스 코팅된 96-well plate.
      로 옮깁니다. 참고: 세포 현탁액 밀도는 아가로스로 코팅된 96-well 플레이트에서 well당 10,000개의 세포 밀도를 달성하도록 설정됩니다.
    2. 플레이트를 340 x g에서 10분 동안 원심분리하고 37°C 및 5% CO2에서 5-9일 동안 배양합니다(그림 1D).
      참고: 도금 후 격일로 성장 배지를 교체하고 cDMEM의 50%를 부드럽게 제거하고 교체하십시오. MES 스페로이드는 HEP-MES 어셈블리 모델에 적합합니다.

5. HEP-MES 집합체 형성

참고: HEP(그림 2A) 및 MES 스페로이드(그림 2B)의 형성은 3단계와 4단계를 참조하십시오.

  1. 96웰 플레이트의 피펫을 사용하여 HFF/MRC-5 스페로이드를 개별적으로 수집합니다. 새 cDMEM이 들어 있는 15mL 멸균 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 스페로이드가 튜브에 5분 동안 가라앉도록 한 다음 따뜻한 cDMEM.
    로 부드럽게 헹굽니다. 알림: 헹굼 과정을 부드럽고 조심스럽게 수행하십시오.
  2. 피펫을 사용하여 단일 HFF/MRC-5 스페로이드를 HepG2-WT 스페로이드가 들어 있는 웰로 부드럽게 옮깁니다. 1:1 및 1:5 희석에 얼음-저온 성장 인자 감소(GFR) 마트리겔(MG) 또는 쥐꼬리 콜라겐(CG)을 추가하고 37°C에서 5% CO2로 3시간 동안 배양합니다(그림 2C).
    알림: MG를 2°C에서 8°C 냉장고의 얼음에 넣어 밤새 해동합니다. MG는 10°C 이상에서 겔을 형성하므로 MG를 취급할 때 사전 냉각된 피펫, 팁 및 튜브를 사용하십시오.
  3. 배양 후 각 웰에 75μL의 신선한 cDMEM을 추가하고 37°C에서 5% CO2로 2-3일 동안 배양합니다
    참고: 도금 후 격일로 성장 배지를 교체하고 cDMEM의 50%를 부드럽게 제거하고 교체하십시오. 집합체는 최대 3-4일 동안 배지 변경 없이 계속 형성됩니다. HEP-MES 아상블로이드 형성은 매트릭스를 사용하지 않고도 발생할 수 있습니다.

6. HEP 스페로이드 액적 형성

참고: HEP 스페로이드의 형성은 3단계를 참조하십시오(그림 3A). HEP 스페로이드를 액적에 현탁시키기 위해 두 가지 다른 재료를 사용할 수 있습니다. 두 가지 방법이 아래에 제공됩니다.

  1. GFR MG 방울
    1. 96웰 플레이트의 피펫을 사용하여 HepG2-WT 스페로이드를 개별적으로 수집하여 얼음 위의 15mL 멸균 원추형 원심분리기에 침전시킵니다.
    2. 별도의 15mL 멸균 원추형 원심분리 튜브에 1mL의 얼음처럼 차가운 GFR MG와 얼음-차가운 대조군 성장 배지를 1:1 희석으로 혼합합니다. HepG2-WT 스페로이드가 들어 있는 15mL 튜브의 피펫을 사용하여 배지를 흡입하고 얼음 위에 놓습니다.
      알림: MG를 2°C에서 8°C 냉장고의 얼음에 넣고 밤새 해동합니다. MG를 취급할 때는 10°C 이상에서 젤을 형성하므로 사전 냉각된 피펫, 팁 및 튜브를 확인하십시오.
    3. HepG2-WT 스페로이드에 MG 용액을 추가하여 MG 용액 내부에 스페로이드가 균일하게 분포되도록 합니다.
    4. 200μL 피펫을 사용하여 MG 용액에서 15μL 부피의 단일 스페로이드를 수집하고 60mm 페트리 접시(그림 3B)에 천천히 시드합니다.
      참고: 방울당 두 개 이상의 스페로이드가 파종된 경우 적절하게 제거하고 다시 파종하십시오. 스페로이드는 필요한 경우 액적의 중심에 있도록 재배치됩니다. 최적의 스페로이드 파스딩을 위해서는 기포 형성을 최소화하기 위해 역 피펫팅을 사용하는 것이 좋습니다.
  2. 쥐 꼬리 CG 방울
    참고: 모든 CG 준비는 얼음 위에서 이루어져야 합니다.
    1. 96-well 플레이트의 피펫을 사용하여 HepG2-WT 스페로이드를 개별적으로 수집하여 얼음 위의 15mL 멸균 원추형 원심분리기 튜브에 침전시킵니다(그림 3B).
    2. 마이크로 원심분리기 튜브에 탈이온수 358.8μL, 10x PBS 100μL, 12.1μL의 1N NaOH 및 529.1μL의 스톡 랫테일 CG를 추가하여 총 부피 1mL를 만듭니다.
      참고: 스톡 쥐꼬리 CG는 항상 끝에 추가해야 합니다.
    3. HepG2-WT 스페로이드에 CG 솔루션을 추가하여 CG 솔루션 내부에 스페로이드가 균일하게 분포되도록 합니다.
    4. 200μL 피펫을 사용하여 CG 용액에서 15μL 부피의 단일 스페로이드를 수집하고 60mm 페트리 접시에 천천히 시드합니다.
      참고: 방울당 두 개 이상의 스페로이드가 파종된 경우 적절하게 제거하고 다시 파종하십시오. 스페로이드는 액적의 중심에 있도록 재배치됩니다. 최적의 스페로이드 파스딩을 위해서는 기포 형성을 최소화하기 위해 역 피펫팅을 사용하는 것이 좋습니다.
  3. 성장 배지를 추가하기 전에 37 ° C 및 5 % CO2에서 60 분 동안 액적을 배양합니다.
  4. 원하는 성장 배지 5mL를 페트리 접시에 천천히 추가하고 37 ° C에서 배양하고 3 일마다 성장 배지가 변경되는 5 % CO2 (그림 3C).
    참고: M-CM은 HEP 액적 형성 분석에 사용되었습니다.

7. M-CM 준비

  1. HFF/MRC-5 세포를 수확하여 5,000 cells/cm2의 파종 밀도로 T-75 조직 배양 처리된 플라스크에 파종하고 15mL의 cDMEM.
    에서 72시간 동안 37°C 및 5%CO2에서 플라스크를 배양합니다. 알림: 이 기간 동안 플라스크를 모니터링하여 최적의 세포 건강을 보장하십시오.
  2. 72시간 배양 후 15mL 멸균 원뿔형 원심분리 튜브에 M-CM을 수집합니다. 잔해물 제거를 위해 290 x g에서 M-CM을 5분 동안 원심분리하고 멸균을 위해 0.2μm 필터를 사용하여 필터(그림 4A)를 사용합니다.
  3. M-CM을 1:1 - 1:7 희석 비율로 완전한 성장 배지로 희석하고 원하는 실험에 추가합니다(그림 4B).
    참고: HEP 액적 형성 분석에서 M-CM을 활용하십시오.

8. HEP-MES 혼합 스페로이드 형성

참고: HepG2-WT 세포 현탁액 제제의 경우 3.1-3.5단계를 참조하고 HFF/MRC-5 세포 현탁액 제제의 경우 4.1-4.5단계를 참조하십시오.

  1. 각 세포 현탁액에 대해 1.0 x 105 cells/mL의 최종 농도를 달성하기 위해 새로운 cDMEM에서 HepG2-WT 세포를 현탁합니다.
  2. 새로운 cDMEM에서 HFF/MRC-5 세포를 현탁하여 각 세포 현탁액에 대해 1.0 x 105 cells/mL의 최종 농도를 달성합니다.
  3. HepG2-WT 및 HFF/MRC-5 세포 현탁액을 1:1 비율로 15mL 멸균 원추형 원심분리 튜브로 옮겨 2.0 x 105 cells/mL의 최종 농도를 얻습니다. 세포 현탁액을 철저히 혼합하고 웰당 100μL의 세포 현탁액을 아가로스 코팅된 96웰 플레이트로 옮깁니다.
    참고: 세포 현탁액 밀도는 아가로스로 코팅된 96-웰 플레이트에서 웰당 20,000개의 세포를 얻도록 설정됩니다.
  4. 플레이트를 340 x g에서 10분 동안 원심분리하고 37°C 및 5% CO2에서 1-2일 동안 배양합니다(그림 5C).
  5. 피브린 하이드로겔 첨가
    참고: 이것은 HEP-MES 혼합 스페로이드를 도금한 후 72시간 이내에 수행되는 선택적 단계입니다.
    1. 15mL 멸균 원뿔형 원심분리 튜브에 피브리노겐(3.25mg/mL)과 트롬빈(12.5단위/mL)을 4:1 비율로 혼합하여 피브린을 형성하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  6. 웰 내의 현재 cDMEM과 1:1 희석으로 기존에 혼합된 스페로이드를 사용하여 피브린을 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 37 ° C와 5 % CO2에서 30 분 동안 배양합니다.
  7. 배양 후 각 웰에 75μL의 신선한 cDMEM을 추가하고 37°C에서 5% CO2로 1-2일 동안 배양합니다
    참고: 도금 후 격일로 성장 배지를 교체하고 cDMEM의 50%를 부드럽게 제거하고 교체하십시오.

9. 고밀도 MES 마이그레이션 모델

참고: HepG2-WT 스페로이드 준비(그림 6A)는 3단계를 참조하고 HFF/MRC-5 세포 현탁액 준비는 4.1-4.5단계를 참조하십시오(그림 6B).

  1. HFF/MRC-5 세포를 새로운 cDMEM에 현탁시켜 최종 농도 6.0 x 105 cells/mL를 달성하고 얼음 위에 놓습니다.
  2. HFF/MRC-5 세포 현탁액과 얼음처럼 차가운 MG/CG를 1:1 희석(그림 6C).
    참고: 세포 현탁액 밀도는 아가로스로 코팅된 96-웰 플레이트에서 웰당 30,000개의 세포를 얻도록 설정됩니다. MG를 2 °C에서 8 °C 냉장고의 얼음으로 밤새 해동합니다. MG를 취급할 때는 10°C 이상에서 젤을 형성하므로 사전 냉각된 피펫, 팁 및 튜브를 확인하십시오.
  3. 피펫을 사용하여 100μL의 HFF/MRC-5 및 MG 용액을 HepG2-WT 스페로이드가 함유된 웰로 옮깁니다. 플레이트를 37 ° C와 5 % CO2에서 30 분 동안 배양합니다.
  4. 배양 후 각 웰에 75μL의 신선한 cDMEM을 추가하고 37°C에서 5% CO2로 최대 12일 동안 배양합니다.

10. 통계 분석

  1. Microsoft Excel 또는 통계/그래프 소프트웨어를 사용하여 수집된 데이터를 검토하고 분석합니다.
    참고: 두 그룹 간의 통계적 평가를 위해 학생의 t-테스트(꼬리가 두 개 있는 유형 II)를 수행했으며 0.05 이하의 p-값이 통계적 유의성이 있는 것으로 간주되었으며 텍스트 및 그림/그림 범례 내에 정의되었습니다.

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결과

질병 모델링, 약물 발견 및 조직 공학(그림 7)과 같은 다양한 생의학적 응용 분야를 위한 합성 조직에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 이 분야에서 인간 다능성 줄기 세포(hPSC) 유래 오가노이드, 스페로이드 및 세포들은 더욱 합성적이고 복잡하며 거대한 조직으로 변모하고 있습니다. 이러한 변화에는 형태 형성 원리의 적용, 미세 가공과 같은 도구의 활용, 그리고 바이오 매트릭스의 통합이 포함되며, 이를 통해 합성 조직의 정밀한 공학적 설계가 가능해집니다(그림 7). 여기서는 이러한 전반적인 주제와 부합하는 여러 방법들을 제시합니다.

클러스터링이 스페로이드 형성에 미치는 영향
본 연구에 활용된 방법들은 3D 스페로이드의 성공적인 형성에 의존하였습니다. 스페로이드 형성의 성공 여부는 5~9일 이내에 스페로이드들이 융합되어 완전한 형태의 스페...

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토론

본 프로토콜은 단순 및 복잡한 조립체 모두를 배양하기 위한 여러 방법뿐만 아니라 초기 간 기관 형성에서 3D 집단 세포 이동을 유도하는 기술을 포함합니다24,25. 설명된 프로토콜은 스페로이드 형성이 모든 방법론에서 중심적인 측면인 몇 가지 중요한 단계를 강조합니다. 마이크로웰(96웰 또는 384웰)은 스페로이드 형성을 달성하기 위해 비접착성 또는 아가로스 코팅 플레이트와 함께 활용됩니다. 이 방법은 예상 크기에 도달하지 못하거나 불규칙한 모양을 가질 수 있는 스페로이드를 고려하여 후속 실험을 위한 스페로이드의 풍부한 생산을 보장합니다. 원하는 기준을 충족하지 못하는 스페로이드는 다운스트림 실험에서 제외됩니다. 스페로이드 형성의 초기 효율성은 사용자의 전문 지식을 포함한 다양한 요인에 따라 달라집니다. 오가노이드를 처리하려면 스페로이드(또는 오가노이드) 형성, 웰 간 이동, 스페로이드에 생체 매트릭스 추가, 웰당 여러 스페로...

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공개 사항

NP는 급성 및 만성 간 질환 치료법을 개발하는 오가노이드 엔지니어링 회사인 Khufu Therapeutics의 창립자입니다.

감사의 글

저자는 이 논문에 사용된 데이터에 귀중한 기여를 한 Ogechi Ogoke와 Osama Yousef에게 진심으로 감사를 표하고 싶습니다. NP는 UB CBE 스타트업 펀드, Mark Diamond Fellowship, New York State Stem Cell Science C024316, UB Stem Cells in Regenerative Medicine(ScIRM) 센터, University at Buffalo Center for Cell, Gene, Tissue Engineering(CGTE)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
384웰 블랙/클리어 라운드 바닥 초저 부착 스페로이드 마이크로플레이트Corning3830
96-wl 세포 배양 플레이트 평면, TC,STRL,1/pk,100/CS실험실 제품 판매701001
AgaroseSigma-AldrichA0576Low EEO
Axiovision SoftwareZEISS버전 4
세포 배양 접시, 60mm, TC, STRL, 20/pk, 500/CS실험실 제품 판매705001
세포 배양 플라스크,175cm², Vent,TC,STRL,5/pk,40/CS실험실 제품판매 709003
세포 배양 플라스크,75cm², Vent,TC,STRL,5/pk,100/CS실험실 제품 판매708003
원심분리기 튜브, 15mL,PP,STRL,grad,50/bg,500/CS실험실 제품 판매L226010
콜라겐 I, 쥐꼬리, 100mgCorning354236
DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제, 피루브산ThermoFisher Scientific10569010
EVOS 형광, 위상차 현미경EVOSAMEFC4300R1,360 x 1,024 픽셀 밀도
소 태아 혈청, 인증, 미국ThermoFisher Scientific26140079
인간 혈장에서 추출한 피브리노겐Sigma-AldrichF4883-500MG500 mg
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r; https://imagej.net/ij/
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) 기저막 매트릭스, LDEV-free, 10 mLCorning354230
MRC-5ATCCCCL-171
MSCGMT 인간 중간엽 줄기 세포 성장BulletKit LonzaPT-3001
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
인간 혈장에서 트롬빈Sigma-AldrichT6884-100UN100 단위
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드ThermoFisher Scientific25300062
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드ThermoFisher Scientific25200072
Vybrant DiD 세포 라벨링 솔루션ThermoFisher ScientificV22887
Vybrant DiI 세포 라벨링 솔루션ThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO 세포 라벨링 솔루션ThermoFisher ScientificV22886
Zeiss Axio 형광 현미경ZEISSSE64, 1,344 × 1,024 pixel density

참고문헌

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  4. Ogoke, O., Oluwole, J., Parashurama, N. Bioengineering considerations in liver regenerative medicine. J Biol Eng. 11, 46(2017).
  5. Petkov, P. M., Kim, K., Sandhu, J., Shafritz, D. A., Dabeva, M. D. Identification of differentially expressed genes in epithelial stem/progenitor cells of fetal rat liver. Genomics. 68 (2), 197-209 (2000).
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