방법 논문

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

DOI:

10.3791/66231

⸱

2024년 1월 26일

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 쥐 뼈, 골수, 흉선 및 단일 세포 다생물체학(single-cell multiomics)과 호환되는 인간 흉선 조직에서 기질 세포를 분리할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단일 세포 염기서열 분석은 조혈 장기의 기질에서 이질적인 세포 집단을 매핑할 수 있게 해주었습니다. 이러한 방법론은 정상 상태에서 이전에 해결되지 않은 이질성뿐만 아니라 외적 스트레스 또는 노화 중에 유발된 세포 유형 표현의 변화를 연구할 수 있는 렌즈를 제공합니다. 여기에서는 쥐와 인간의 흉선, 쥐 뼈 및 골수에서 고품질 기질 세포 집단을 분리하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜을 통해 분리된 세포는 고품질 단일 세포 멀티오믹스 데이터 세트를 생성하는 데 적합합니다. 여기에서는 시료 분해의 영향, 조혈 계통 고갈, FACS 분석/분류 및 이러한 요인이 단일 세포 염기서열분석과의 호환성에 미치는 영향에 대해 설명합니다. 성공적이고 비효율적인 해리를 나타내는 FACS 프로파일과 염기서열분석 후 분석에서 다운스트림 기질 세포 수율의 예를 통해 사용자가 인식할 수 있는 포인터가 제공됩니다. 기질 세포의 특정 요구 사항을 고려하는 것은 해당 분야의 지식을 발전시킬 수 있는 고품질의 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

건강한 성인의 경우, 골수와 흉선에서 혈액 세포의 새로운 생성이 발생합니다. 이 부위의 기질 세포는 조혈 유지에 필수적이지만 기질은 조직 1,2,3,4의 1% 미만을 구성합니다. 따라서 기질을 지지하는 조혈의 순수 분리물을 얻는 것은 특히 고품질 샘플을 얻기 위해 편리한 처리가 필요한 단세포 다생물체학의 경우 상당한 도전이 됩니다. 다양한 분해 칵테일의 구성 요소는 멀티오믹스 분석의 특정 단계를 방해할 수 있습니다 5,6. 여기에 제시된 프로토콜은 골수 및 흉선 조직에서 다양한 기질 세포를 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.

골수와 흉선의 기질 구성 성분의 교란은 혈액 세포 발달에 심각한 혼란을 초래하고 악성 종양을 초래할 수 있습니다 7,8,9. 세포독성 조건화 및 골수 이식 후 기질을 지지하는 조혈이 손상되어 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 지탱하는 사이토카인 및 성장 인자의 분비가 감소합니다2,10,11. 또한, 노화는 골수와 흉선 기질 세포에 영향을 미치며, 이는 노화된 조혈 표현형에 기여할 수 있습니다. 흉선(thymus)은 광범위한 노화 관련 침범을 겪는 첫 번째 장기입니다. 지방 및 섬유화 조직은 사춘기가 시작되자마자 T 세포 지지 기질을 대체하기 시작한다12,13. 골수에서는 지방세포 함량이 나이가 들면서 증가하고 혈관 및 내추 틈새가 크게 리모델링됩니다 14,15,16.

여러 스트레스 상태와 인간 및 쥐 조직 모두의 흉선의 경우 조혈 지지 기질에 대한 연구를 가능하게 하기 위해 이전에 발표된 소화 프로토콜 1,2,8,17,18을 최적화했습니다. 이러한 프로토콜은 효율적이고 재현 가능한 세포 분리를 보장하며 단일 세포 RNAsequencing(scRNAseq) 및 기타 유형의 멀티오믹스와 호환됩니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인체 조직을 사용한 모든 작업은 Massachusetts General Hospital Internal Review Board(IRB)의 승인을 받은 후 수행되었습니다. 모든 동물 시술은 Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC) 지침에 따라 수행되었습니다. 본 연구에는 8-10주 된 C57Bl/6마리의 마우스와 수컷 모두가 사용되었습니다. 동물은 상업적인 출처에서 얻었다( 재료 표 참조).

1. 쥐 흉선 조직의 준비

  1. 다음 버퍼와 용액을 준비합니다.
    1. 미디엄 199(M199), 2%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)( 재료 표 참조).
    2. 쥐 해리 칵테일: M199 + 2% FBS에서 0.5 WU/mL Liberase TM 및 6.3 U/mL DNase I( 재료 표 참조).
    3. M199와 2%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA).
      참고: FBS 함유 배지는 RNA 품질을 향상시키기 위해 BSA로 전환할 수 있습니다.
  2. 쥐 흉선 절제술을 수행합니다.
    1. CO2 질식(제도적으로 승인된 프로토콜에 따라)으로 쥐를 안락사시키고 등에 눕힙니다. 70% 에탄올을 분사하여 가슴의 털을 적시고 흉강을 엽니다.
    2. 먼저 수술용 가위로 흉곽 바로 아래를 가로로 절개하여 흉선을 조심스럽게 절개합니다. 마우스의 양쪽에 있는 갈비뼈를 쇄골까지 자릅니다. 그런 다음 흉벽이 풀릴 수 있도록 횡격막을 자릅니다. 한 쌍의 집게로 갈비뼈를 들어 올려 흉강을 노출시킵니다.
      1. 흉선은 흰색 이중창 기관으로, 심장 바로 위의 구멍 상단에 있습니다. 집게로 흉선을 잡고 흉선을 제자리에 고정하는 결합 조직을 부드럽게 자릅니다. 절개된 흉선 조직을 얼음 위에 M6 + 199% FBS가 있는 2웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
        참고: 늙거나 방사선 조절이 된 쥐 또는 흉선 결함이 있는 돌연변이 균주로 작업할 때 흉선이 너무 작아서 장기를 안정적으로 절제하기 위해 박리 현미경이 필요할 수 있습니다.
    3. 해부 현미경을 사용하여 끝이 뭉툭한 집게와 마이크로 스프링 가위를 사용하여 흉선 외 조직을 제거합니다.
  3. 쥐 흉선 조직의 효소 해리 수행(10분 단위로 30분)
    1. 세척한 흉선을 15mL 튜브의 캡에 넣고 멸균 수술용 가위로 조직을 곱게 다집니다.
      참고: 소화에 사용될 튜브의 캡에 있는 조직을 다지면 한 용기에서 다른 용기로 이동으로 인한 조직 손실을 최소화할 수 있습니다. 이것은 늙거나 방사선 상태에 빠진 쥐 또는 흉선 결함이 있는 돌연변이 균주와 함께 작업할 때 매우 중요합니다. 이러한 환경에서 흉선 크기가 작기 때문에 가능한 한 재료 손실을 줄여야 합니다.
    2. 15mL 튜브에 쥐 해리 칵테일 2mL를 넣고 흉선 조각이 들어있는 캡을 부착한 다음 조직이 해리 칵테일에 재현되도록 5번 뒤집습니다.
    3. 누출을 방지하려면 튜브의 캡을 파라핀 필름으로 감쌉니다. 그런 다음 37rpm으로 흔드는 250°C 수조에 튜브를 수평으로 놓습니다. 10분 동안 배양합니다.
      참고: 분해 프로토콜의 성공 여부는 37°C에서 교반으로 수행되는 배양에 달려 있습니다. 설명된 프로토콜은 진탕 수조를 사용하여 최적화되었습니다. 사용할 수 없는 경우 가열된 환경에서 교반을 가능하게 하는 다른 접근 방식이 작동할 수 있지만 먼저 이러한 설정에 맞게 프로토콜을 최적화하는 것이 좋습니다.
    4. 15mL 튜브를 랙에 놓고 티슈 조각이 가라앉을 때까지 기다립니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 70μm 세포 여과기를 통해 얼음처럼 차가운 50ml 튜브에 넣습니다.
    5. 2-4단계를 두 번 반복하여 총 3번의 소화를 합니다. 조직은 마지막 배양이 끝날 때까지 다소 완전히 해리되어야 합니다.
    6. 수집된 세포 현탁액에 20mL의 M199 + 2% FBS를 추가합니다. 4 °C에서 5분 동안 500 x g 으로 스핀 다운합니다.
    7. 상층액을 제거하고 적절한 부피의 M199 + 2% FBS에 재현탁시킵니다. 그런 다음 셀 카운팅을 진행합니다.
      알림: M199 + 2% FBS가 현탁하는 부피는 흉선의 상태에 따라 다릅니다. 6-10주 된 마우스의 경우 M199 + 2% FBS 3-4mL에 조직을 현탁시키는 것이 좋습니다. 그러나 노화되거나 방사선 조절된 조직 또는 흉선 결함이 있는 돌연변이 균주를 사용하는 실험의 경우 작은 흉선 크기로 인해 0.1-1mL 범위의 더 낮은 부피가 필요합니다.
    8. 세포 현탁액을 0.4%(w/v) 트리판 블루 용액에 1:2로 희석하여 세포를 계수합니다. 혈구계에 세포를 로드하고 명시야 현미경으로 계수합니다. 염색되지 않은 세포의 수를 계산하여 밀리리터당 살아있는 세포의 수와 파란색으로 염색된 세포의 수를 측정하여 샘플 생존율을 평가합니다.
  4. murine thymic stroma의 형광 활성화 세포 분류 수행
    1. 4 °C에서 5분 동안 500 x g 의 셀을 스핀 다운합니다. M199 + 25 U/mL Protector RNase inhibitor가 보충된 2% FBS에서 5 x 107 cells/mL 농도로 세포를 재현탁시킵니다( 재료 표 참조).
    2. 2 μg/mL 농도의 murine Fc Block( 재료 표 참조)을 추가하고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
    3. CD45-PE/Cy7(4μg/mL), Ter119-PE(4μg/mL), CD31-BUV737(2μg/mL) 및 EpCam-BV711(2μg/mL)( 재료 표 참조) 항체로 세포를 염색합니다.
    4. M199 + 2% BSA에서 샘플을 세척하고 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 스핀다운합니다.
    5. DAPI(0.5μg/mL) 또는 7-AAD(1μg/mL)와 같은 생존도 염료를 포함하는 M199 + 2% BSA에서 상층액을 제거하고 세포를 재현탁시킵니다( 재료 표 참조). 확립된 프로토콜19에 따라 흉선 기질 세포의 FACS 분리를 진행합니다.

2. 인간 흉선 조직의 준비

  1. 다음 버퍼와 용액을 준비합니다.
    1. 중간 199 (M199) 2 % (v / v) FBS.
    2. 1.5%(w/v) BSA가 있는 M199.
    3. 인간 해리 칵테일: M199 +1.5% BSA에서 1mg/ml 콜라겐분해효소 IV 및 2mg/mL Dispase 및 6.3U/mL DNase I( 재료 표 참조).
      참고: 인간 흉선 조직 준비의 마지막 소화 단계에는 트립신이 포함됩니다. 따라서 FBS가 트립신 활성을 억제하므로 해당 시점까지의 모든 단계는 완충액이 포함된 BSA에서 수행되는 것이 중요합니다.
  2. 인간 흉선 조직 격리 수행
    1. 인간 흉선(이전에 발표된 방법19에 따라 수집)을 적절한 부피의 M199 + 1.5% BSA에 넣고 가공이 시작될 때까지 얼음 위에 보관합니다.
    2. 인간 흉선 조직으로 작업하는 동안 조직 배양 후드에서 작업을 수행하고 CDC 지침20에 따른 표준 예방 조치를 사용하여 잠재적으로 감염될 수 있는 것처럼 취급하십시오.
    3. 얼음처럼 차가운 M10 + 199% BSA 1.5mL가 든 10cm 페트리 접시에 티슈를 넣습니다. 멸균 집게와 가위를 사용하여 장기를 적출할 때 손상된 흉선외 지방이나 조직을 조심스럽게 닦아냅니다.
    4. 수술용 가위와 겸자를 사용하여 흉선을 1cm3 입방체로 자르고 10mL 주사기의 플런저를 사용하여 조각을 부드럽게 누릅니다. 이것은 발달 중인 흉선 세포의 일부를 방출하여 소화해야 할 조직의 부피를 줄입니다.
      참고: 흉선 세포 발달 단계에 대한 후속 분석이 필요한 경우 방출된 조혈 분획을 저장하십시오. 그러나 이 분획을 효소 분해 중에 생성된 기질 세포 분획과 결합하지 마십시오. 두 분획을 합치면 세포 현탁액에 막힘이 형성될 위험이 크게 증가하여 궁극적으로 기질 세포의 수율을 감소시키는 것으로 관찰되었습니다. 조직을 부드럽게 분쇄하는 동안 손실되는 기질 세포는 거의 없습니다.
  3. 인간 흉선 조직의 효소 해리 수행(30분 단위로 90분)
    1. 약 5mg의 가볍게 으깬 흉선 조직 조각을 50mL 원뿔형 튜브의 캡으로 옮깁니다. 그런 다음 멸균 수술 가위를 사용하여 조직을 잘게 자릅니다.
    2. 인간 해리 칵테일 8mL를 50mL 튜브에 피펫팅하고 다진 인간 흉선 조직이 들어있는 캡을 부착한 다음 튜브를 5번 부드럽게 뒤집어 모든 조직이 효소 칵테일과 섞이도록 합니다.
    3. 누출을 방지하기 위해 튜브의 캡을 파라핀 필름으로 고정합니다. 37°C의 진탕(250rpm) 수조에서 30분 동안 튜브를 수평으로 배양합니다.
    4. 50mL 튜브를 랙에 넣고 인간의 흉선 조직 조각이 가라앉도록 한 후 상층액을 제거하고 70μm 세포 여과기를 통해 얼음 위에 놓인 새로운 50ml 튜브에 통과시킵니다.
    5. 인간 해리 칵테일로 총 두 번의 소화를 위해 2.3.2-1.3.4 단계를 반복합니다.
    6. 두 번째 분해가 완료된 후 나머지 조직에 인간 해리 칵테일 8mL를 추가로 추가합니다. 그런 다음 0.25% 트립신 2mL를 조직 해리 튜브에 피펫팅합니다. 37°C에서 250rpm에서 흔드는 상태로 30분 더 배양합니다.
      참고: 인체 조직의 분해 시간은 최소 90분이어야 하며, 배양 시간이 짧을수록 기질 세포 수율이 급격히 감소합니다.
    7. 마지막 배양 단계가 완료되면 70μm 세포 여과기를 통과시켜 이전 단계에서 수집된 상층액과 함께 세포 현탁액과 남은 조직 조각을 합합니다. 샘플에 FBS 3mL를 추가하여 트립신 반응을 끊고 얼음 위에 놓습니다.
    8. 1.3단계에서 설명한 대로 셀 계산을 진행합니다.
  4. 인간 흉선 기질의 형광 활성화 세포 분류 수행
    1. 인간 흉선의 세포 현탁액을 스핀 다운하고 25U/mL Protector RNase 억제제가 보충된 M199 + 2% FBS에서 5 x 107 cells/mL의 농도로 재현탁합니다.
    2. human Fc Block (5 μg/mL)( 재료 표 참조)으로 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
    3. CD45-BV711(2.5μg/mL), CD235a-BV711(2.5μg/mL), Lineage-cocktail-FITC(3.76μg/mL), CD66b-FITC(20μL/100μL 샘플), CD8-APC/Cy7(5μL/100μL 샘플), CD4-BV605(5μL/100μL 샘플), CD31-PE/Dazzle594(10μg/mL) 및 EpCam-BV421(2.5μg/mL)로 4°C에서 30분 동안 샘플을 염색합니다( 재료 표 참조).
    4. M199 + 1.5% BSA에서 샘플을 세척하고 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 스핀 다운합니다.
    5. DAPI(0.5μg/mL) 또는 7-AAD(1μg/mL)와 같은 생존도 염료를 포함하는 M199 + 1.5% BSA에서 상층액을 제거하고 세포를 재현탁시킵니다. 확립된 프로토콜19에 따라 흉선 기질 세포의 FACS 분리를 진행합니다.

3. 쥐 뼈 및 골수 조직의 준비

참고: 뼈 및 골수 분획은 기질 세포의 최대 순도와 조직의 최적 해리를 얻기 위해 두 가지 별도의 분해 반응으로 준비됩니다. 샘플은 분해 단계 후에 취합하여 하나의 기질 구획으로 분류할 수 있습니다.

  1. 다음 버퍼와 용액을 준비합니다.
    1. 199%(v/v) FBS가 있는 M2.
    2. Murine B&M(뼈 및 골수) 해리 칵테일: M199 +2% FBS의 Stemxyme 2mg/mL, Dispase 1mg/mL 및 10U/mL DNase I( 재료 표 참조).
      알림: B&M 해리 믹스를 신선하게 준비하고 사용할 때까지 얼음에 혼합물을 보관하십시오.
    3. M199, 0.5%(w/v) BSA.
    4. 인산염 완충 식염수(PBS)와 0.5%(w/v) BSA.
    5. 199%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA) 및 2mM EDTA가 포함된 M2.
      참고: FBS 함유 배지는 RNA 품질을 향상시키기 위해 BSA로 전환할 수 있습니다.
  2. 쥐 골수 분리 수행
    1. CO2 질식에 의해 마우스를 안락사시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 70% 에탄올을 뿌려 털을 적십니다.
    2. 양쪽에서 대퇴골, 경골, 골반 및 상완골을 조심스럽게 제거하고 얼음 199에 M2 +21,22 % FBS가 들어있는 우물에 넣으십시오.
    3. 티슈 와이프로 근육, 인대, 연골 조직을 모두 제거하여 뼈의 손상을 최소화하고 골막층을 보존합니다. 얼음 위에 M199 + 2% FBS가 있는 새 우물에 넣습니다.
    4. 메스를 사용하여 긴 뼈의 성장판을 잘라 골단을 제거하고 얼음에 M199 + 2% FBS가 있는 10cm 접시에 넣습니다.
    5. 옅은 흰색이 될 때까지 뼈에서 골수를 씻어냅니다. 28G 바늘과 10mL M199 + 2% FBS로 채워진 10mL 주사기를 사용하여 골수를 얼음 위의 15mL 튜브로 씻어냅니다. 홍조를 띤 뼈를 골단과 함께 10cm 접시에 놓습니다.
      참고: 조직의 전체 분리를 위해 골수를 완전히 세척하면 더 나은 샘플 준비가 가능합니다.
  3. 쥐 골수 조직의 효소 해리 수행(10분 단위로 총 30분)
    1. 골수가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 15mL 튜브를 얼음 위에 똑바로 세워 둡니다. 피펫팅으로 10mL M199 + 2% FBS를 천천히 제거합니다.
    2. 15mL 튜브에 B&M 해리 칵테일 4mL를 넣고 37°C 수조(흔들지 않음)에 10분 동안 넣습니다.
    3. 5분 후 튜브를 세 번 뒤집어 수조에 다시 넣습니다.
    4. 처음 10분 후 펠릿이 바닥에 있는지 확인하고 70μm 세포 여과기를 통해 얼음처럼 차가운 50mL 튜브로 여과하면서 상층액을 수집합니다. 남은 BM 펠릿에 신선한 B&M 해리 칵테일 2mL를 넣고 수조에 다시 넣습니다.
    5. 1mL 피펫을 사용하여 격렬한 피펫팅으로 남아 있는 골수 조각을 분리합니다. 이전 단계에서와 같이 동일한 튜브에 결과로 생성된 모든 세포 현탁액을 수집합니다. 수집된 세포 현탁액에 20mL의 M199 + 0.5% BSA + 2mM EDTA를 추가합니다.
      참고: 3.3.5 단계에서 최종 분해된 샘플 후에 추가된 완충액에는 추가 효소 활성을 억제하는 데 도움이 되는 EDTA가 포함되어 있습니다.
  4. 쥐 골수 조직의 조혈 세포 고갈을 수행합니다.
    1. 500 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 셀을 원심 분리합니다. CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 및 CD3를 표적으로 하는 비오틴 항체(5mg/mL)와 함께 500 μL의 PBS + 0.5% BSA에 재현탁합니다( 재료 표 참조). 캡이 있는 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.
    2. 어둠 속에서 실온에서 10분 동안 궤도 쉐이커에서 배양합니다.
    3. 마그네틱 비드를 철저히 소용돌이치고 25μL의 마그네틱 비드를 튜브에 추가합니다.
    4. 어둠 속에서 실온에서 5분 동안 궤도 쉐이커에서 배양합니다.
    5. 튜브를 일치하는 자석에 2-3분 동안 놓고 새 튜브에 상층액을 수집합니다.
      참고: 이 단계 후에 골수를 모으거나 골분지와 분리하여 보관할 수 있습니다. 계통 고갈이 성공적이라면, 그 결과로 생긴 세포 현탁액에는 적혈구가 없어야 합니다.
  5. 쥐 뼈 조직의 효소 해리를 수행합니다.
    1. 50mL 튜브의 평평한 캡 끝이 있는 10cm 접시에서 뼈를 더 작은 조각으로 나눕니다. 70μm 세포 여과기를 통해 상층액을 여과하여 필터 내부의 뼈 조각을 분리합니다.
      알림: 또는 모르타르와 유봉을 뼈 조각화에 사용할 수 있습니다. 그러나 이 옵션은 뼈가 부러지지 않고 연마될 때 더 많은 파편을 생성하고 기질 세포 생존율을 낮추는 경향이 있습니다. 기질 세포는 여전히 뼈에 붙어 있고, 조혈 세포를 포함하고 있는 상층액은 폐기해야 한다.
    2. 가위를 사용하여 세포 여과기의 뼈 조각을 자릅니다. 이렇게 하면 보다 효율적인 효소 해리를 위해 표면적이 증가합니다. 5mL의 M199 + 2% FBS로 뼈를 씻습니다.
    3. 뼈 분획을 5mL의 murine B&M 해리( 재료 표 참조)에 넣고 새 50mL 튜브에 섞습니다.
    4. 누출을 방지하려면 튜브의 캡을 파라핀 필름으로 감쌉니다. 그런 다음 튜브를 37분 동안 120rpm으로 흔드는 120°C 수조에 수평으로 놓습니다.
    5. 분해 후 25mL의 M199 + 0.5% BSA + 2mM EDTA를 추가하고 70μm 세포 여과기를 통해 기질 세포가 포함된 상층액을 얼음처럼 차가운 50ml 튜브에 여과합니다.
      알림: 생성된 뼈 조각이 소화에 의해 눈에 띄게 줄어들었는지 확인하십시오. 3.5.5 단계에서, 최종 분해된 샘플 후에 첨가된 완충액에는 추가적인 효소 활성을 억제하는 데 도움이 되는 EDTA가 포함되어 있습니다.
  6. 쥐 뼈와 골수 기질의 형광 활성화 세포 분류를 수행합니다.
    1. 4 °C에서 5분 동안 500 x g 의 셀을 스핀 다운합니다.
    2. PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA의 10μg/mL 농도로 murine Fc Block에 현탁시키고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
    3. CD45-PE/Cy7(1 μg/mL), Ter119-PE/Cy7(1 μg/mL), CD31-BV421(0.66 μg/mL), CD140a-APC(2 μg/mL), Sca1-AF700(0.66 μg/mL), CD51-PE(2 μg/mL), CD105-PE/dazzle(2 μg/mL) 항체로 세포(최대 1000만 백만개 세포/총 염색량 100μL)를 염색합니다( 재료 표 참조).
    4. Calcein-AM을 그대로 두어 실온과 평형을 이루고 50μL의 DMSO에 재현탁시킵니다. 모든 용도에 맞게 신선하게 준비하십시오. 재현탁 후에는 실온에 보관하십시오. 항체 염색 칵테일에 이미 재현탁된 샘플(20μg/mL)에 첨가하기 전에 PBS(0.1mg/mL)에서 칼세인을 사전 희석하고 어두운 곳에서 4°C에서 20-30분 동안 배양합니다.
    5. PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA에서 샘플을 세척하고 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
    6. 상층액을 제거하고 PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA에서 세포를 재현탁시킵니다. 확립된 프로토콜에 따라 뼈 및 골수 기질 세포의 FACS 분리를 진행합니다19.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이러한 프로토콜은 흉선과 골수에서 재현 가능한 기질 세포 품종을 생성하며, 유세포 분석에 적합한 뿐만 아니라 scRNA 염기서열분석과 같은 단일 세포 다중체학을 제공합니다. 쥐 흉선 조직은 골수 이식 또는 자연적인 노화 과정에 선행하는 세포 독성 조건화와 같은 스트레스 요인에 반응하여 상당한 리모델링을 거칩니다. 결과적으로, 흉선 세포성은 이 두 가지 설정 모두에서 급격히 감소합니다(그림 1A). 생후 8주 된 야생형 쥐의 흉선에는 약 1억 개의 백만개의 세포가 포함되어 있지만, 2세 된 쥐의 세포성은 그 절반으로 예상할 수 있으며, 방사선 조사 및 골수 이식 후 4일 후의 흉선은 5,00,000개의 세포만큼 낮을 수 있습니다(그림 1A).

세포독성 컨디셔닝은 우선적으로 조혈 세포를 절제하므로 기질 구획이 비례적으로 강화됩니다(그림 1B). 그러나 전반적으로 낮은 세포성으로 인해 충분한 수의 흉선 기질 세포를 분리하는 것이 어려워집니다. 따라서 다운스트림 멀티오믹스 응용 분야와 호환되는 세포 수를 얻고 가능한 한 물질 손실을 최소화하기 위해 동물을 풀링해야 할 수 있습니다. 흉선 기질 세포에 대한 다중오믹스를 수행하기 위해 살아있는 단일 CD45-Ter119- 세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS)(그림 1C)를 통해 대부분의 스트레스 조건에서 충분한 수의 세포를 분류할 수 있습니다.

기질 구획의 이질성을 보존하기 위해 일반적으로 단일 양성 기질 마커를 분류하지 않고 조혈 세포를 차단합니다. 적절한 조직 해리가 이루어졌는지 확인하기 위해 양성 기질 세포 마커를 포함하는 것이 여전히 권장됩니다. 그러나 FACS 분리는 불완전하며 scRNAseq에 의해 결정된 바와 같이 분류된 세포의 30%-50%는 조혈 기원입니다(그림 1D,E). 이는 FACS가 발생하기 전에 CD45+ 세포를 자기적으로 고갈시킴으로써 개선할 수 있습니다. 그러나 흉선 세포가 감소한 상태에는 권장되지 않는데(그림 1A), 자기 고갈과 관련된 추가 처리로 인한 물질 손실로 인해 기질 수율이 다운스트림 응용 분야에 비해 너무 낮기 때문입니다.

인간의 흉선 기질을 분리하기 위해 가장 중요한 단계는 효소 소화입니다. 해리 단계를 서두르면 전체 기질 세포 수율과 기질 세포 아형 표현이 심각하게 감소합니다(그림 2A). 또한 조직 소화가 최적화되었는지 확인하기 위해 흉선 내피 및 상피의 마커를 항상 포함하는 것이 권장되며, 이는 단순히 조혈 마커에 대한 음성을 게이팅하는 것만으로는 실제 기질 세포 방출을 측정하기에 충분하지 않기 때문입니다. 이는 그림 2A에 나타나 있으며, 여기서 조혈 마커에 대해 음성인 세포의 비율은 90분 동안 배양된 샘플에 비해 30분 동안 절단된 샘플에서 더 높습니다. 그러나 연속 게이트에서 볼 수 있듯이 내피 세포와 상피 세포의 수율은 더 짧은 소화 프로토콜에서 매우 열악합니다(그림 2A).

멀티오믹스 응용 분야를 위한 인간 흉선 기질 세포의 FACS 분리를 위해 기질 세포 농축을 개선하기 위해 범 조혈 마커 CD45 및 적혈구 마커 CD235a(그림 2B) 외에도 조혈 계통 항체 칵테일과 CD4 및 CD8 항체로 염색하는 것이 좋습니다. 따라서 흉선 기질의 인간 다중오믹스 분석을 위해서는 살아있는 단일 CD45-CD235a-Lineage-CD4-CD8- 세포를 FACS 분류해야 합니다(그림 2B). 쥐 샘플의 scRNAseq에서 볼 수 있듯이 여전히 30%-50%의 조혈 세포를 오염시키지만 여전히 인간 흉선 기질 구획의 허용 가능한 해상도를 제공합니다(그림 2C,D).

뼈 및 BM 기질의 경우 흉선 조직과 동일한 전략이 사용되었습니다. 기질 세포는 조혈 마커에 대해 음성인 세포에 게이팅(gating)을 통해 분리되며, 추가적인 기질 세포 마커는 소화 대조군으로 포함됩니다(그림 3). 뼈와 같은 석회화된 조직의 해리는 상당한 파편의 축적을 초래합니다. 생존성 염료로 칼세인을 추가하면 이 파편의 대부분을 배제할 수 있으며, 그렇지 않으면 분류된 숫자를 잘못 부풀리고 게이트 개체군 빈도를 감소시킵니다(그림 3). 이는 모든 셀의 게이팅과 Calcein+의 게이팅을 비교하는 FACS 플롯에서 잘 나타납니다(그림 3). 인간 흉선 기질 세포에서 볼 수 있듯이 조혈 마커 음성 세포의 비율은 뼈 및 BM 조직 해리 효율성에 대한 신뢰할 수 있는 판독값이 아닙니다(그림 3). CD45-Ter119- 게이트는 분해 단계가 실패한 샘플에 많은 세포를 포함할 수 있지만, 일반적인 뼈 및 BM 기질 세포 마커 CD31, CD140a 및 CD51에 대한 추가 분석은 기질 방출이 불량하다는 것을 분명히 보여줍니다(그림 3 및 그림 4).

쥐뼈 및 BM 기질 세포의 FACS 분리를 위해 그림 3과 같이 CD45-Ter119-Calcein+만 분류하지만 최적의 소화를 보장하기 위해 분류된 집단의 전방 및 측면 산란 특성과 기질 세포 마커 발현을 모니터링하는 gating 전략을 사용하는 것이 좋습니다(그림 3A). FACS 전에 골수의 조혈 계통 양성 자기 세포 고갈과 표시된 게이트에 대한 분류의 조합은 >90% 기질인 세포의 단일 세포 시퀀싱을 생성합니다. 이러한 scRNA 염기서열 분석의 예(그림 5A,B)는 분석된 세포의 전사체 기반 주석 후 이러한 낮은 조혈 오염을 보여줍니다(조혈 마커 유전자의 예: 그림 5C). 이는 이식 후 흉선 조직의 제한된 시작 물질로 인해 분류 단계 전에 자기 세포 고갈이 수행되지 않았던 흉선 기질 제제와 극명한 대조를 이룹니다(그림 1F).

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그림 1: 쥐 흉선 기질의 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 염기서열 분석 (A) 8주 된 마우스(대조군), 4일 전에 치사량 조사 및 이식된 8주 된 마우스(이식) 및 2세 마우스(고령)의 흉선 세포 수 정량화. (B) 치명적인 방사선 조사 및 이식 후 4일 후 기질 세포 아형의 농축을 보여주는 대표적인 유세포 분석 플롯. (C) 단일 세포 다생물체 분석을 위해 쥐 흉선 기질을 분류하기 위한 유세포 분석 게이팅 전략. (D) 기질(파란색) 및 조혈 세포(빨간색)를 나타내는 쥐 흉선의 UMAP. (E) 흉선 샘플에서 쥐 조혈 마커 유전자를 보여주는 UMAP. (F) 흉선 scRNAseq 샘플에서 쥐 기질 및 조혈 세포의 정량화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 인간 흉선 기질의 유세포 분석 및 단세포 RNA 염기서열 분석 (A) 인간 흉선 기질 세포 집단의 방출에 대한 다양한 소화 시간의 영향에 대한 대표적인 결과를 보여주는 FACS 플롯. (B) 단일 세포 다생물학 분석을 위해 인간 흉선 기질을 분류하기 위한 유세포 분석 게이팅 전략. (C) 기질(파란색) 및 조혈 세포(빨간색)를 나타내는 인간 흉선의 UMAP. (D) 흉선 샘플에서 인간 조혈 마커 유전자를 보여주는 UMAP. (E) 흉선 scRNAseq 샘플에서 인간 기질 및 조혈 세포의 정량화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 쥐 골수 기질 마커와 Calcein은 해리 효율을 추정하는 데 도움이 됩니다. (A) 모든 세포 및 Calcein+ 세포에 게이트된 CD45-Ter119-쥐 골수 기질 세포의 대표적인 유세포 분석. 후속 CD31- 게이팅은 Calcein+ 세포를 선택할 때 CD140a+CD51+ 세포의 더 높은 비율을 보여줍니다. (B) CD140a+CD51+ 세포가 누락된 뼈 소화 실패를 나타내는 유세포 분석 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 골수 기질 게이팅 전략. (A) 단일 세포 다량체학을 위해 쥐 골수 기질을 분류하기 위한 유세포 분석 게이팅 전략. (B) CD140a+CD51+ 세포가 누락된 골수 소화 실패를 나타내는 유세포 분석 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 기질 및 조혈 세포 조성을 이용한 골수 단세포 RNA 염기서열분석. (A) 기질(파란색) 및 조혈 세포(빨간색)를 나타내는 쥐 뼈 및 골수의 UMAP. (B) 쥐 뼈 및 골수 샘플에서 기질 및 조혈 세포의 정량화. (C) 쥐 골수 샘플에서 조혈 마커 유전자의 UMAP. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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조혈 장기의 기질 세포는 정상적인 혈액 생성에 중요하며, 조혈 기질 섭동은 조혈 유지 및 스트레스에 대한 반응에 심각한 장애를 초래할 수 있다 9,23,24. 조혈 기질 세포에 대한 통찰력은 혈액 질환을 이해하는 데 필수적입니다 7,9,10,24 및 이를 퇴치하기 위한 치료법을 개발하는 능력25,26. 그러나 조혈 기질과 실질을 재현성 있게 분리하는 것은 특히 기질 세포 수율과 다양성을 극대화하면서 고품질 시료 전처리를 필요로 하는 단일 세포 다생물학의 출현으로 인해 어려운 과제가 되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 대부분의 다운스트림 멀티오믹스 애플리케이션과 호환되도록 최적화되었으며 조혈 기질 세포 1,2,19를 분리하는 문제를 해결합니다.

조혈 기질 세포의 분리를 위해 고려해야 할 첫 번째 문제는 해리 상태입니다. 최적의 해리는 기질 구획 1,2의 완전한 이질성을 반영하기 위해 조직에서 기질 세포를 방출하는 데 중요합니다. 올바른 해리 혼합물을 선택하는 것은 실험 범위와 다운스트림 프로토콜에 따라 다릅니다. 해리 혼합물을 가능한 한 신선하게 준비하고 사용할 때까지 얼음 위에 보관하는 것이 좋습니다. dispase와 같은 일부 성분은 용해하기 어려우며 피펫 혼합에 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. Vortexing은 소화 효소의 기본 구조를 방해하여 궁극적으로 불활성화로 이어질 수 있으므로 권장되지 않습니다. 중요한 것은 EDTA가 효소 활성을 억제하므로 활성 소화 단계에서는 피해야 하지만, 완충액을 함유한 효소를 즉시 제거할 수 없는 경우 반응을 중지하는 데 사용할 수 있습니다. 효소 혼합물 자체 외에도 조직의 효율적인 해리를 위해서는 (1) 표면적을 늘리기 위한 철저한 분쇄 및 절단, (2) 소화 효소와의 충분한 배양 시간이라는 두 가지 포인트가 중요합니다. 예를 들어, 인간의 흉선 조직은 쥐 조직보다 해리하기가 훨씬 더 어렵기 때문에 소화 시간이 더 길어야 합니다. 인체 조직에 대한 조정이 이루어지지 않으면 기질 수율과 세포 다양성이 감소합니다(그림 2A). 해리 효소는 37°C의 최적 온도를 필요로 하며, 이는 필연적으로 유전자 발현에 영향을 미친다27. 세포 상태를 보존하기 위해 저온 또는 저온 해리가 바람직하지만, 현재 뼈 및 골수에 적합한 상업적으로 이용 가능한 저온-활성 해리 효소 조합은 없습니다. 분해가 필요한 모든 조직의 경우, 다양한 세포 유형에서 획득한 이질성과 기여도는 분해 시간, 효소 칵테일 구성 및 처리에 따라 변변합니다. 이러한 초기 단계의 다운스트림에서는 까다로운 세포 유형(예: 기질의 지방세포) 및 유체 장치 채널 직경의 분류 및 캡처 중 노즐 크기와 같은 여과 단계에 의해 이질성 및 표현이 더욱 제한됩니다. 따라서 데이터 세트를 비교할 때 프로토콜의 이러한 차이가 하위 모집단의 표현에 영향을 미칠 수 있음을 염두에 두어야 합니다. 논리적으로 우리는 기질 시스템에서 섭동의 영향을 측정할 때 처리 단계를 동일하게 유지하는 것에 대해 경계해야 합니다.

염기서열분석 비용은 계속 감소하고 있지만, 단일 세포 기술은 분석할 수 있는 세포의 수에 의해 제한되는 경우가 많습니다. 각 시약 키트의 용량을 최적화하기 위해 가능한 한 조혈 세포 자기 고갈이 사용되었습니다. 이를 통해 골수 및 흉선 샘플 분획 모두에서 기질보다 훨씬 더 많은 수의 오염 세포를 피할 수 있습니다. 그러나, 이식 후 흉선 조직의 경우와 같이 시작 물질이 제한적인 경우, 자기 고갈 전략이 항상 초래하는 세포의 증가, 비특이적 손실로 인해 이것이 바람직하지 않을 수 있습니다. 또한, 조직의 준비 및 소화 과정에서 세포외 기질 구성 요소의 분쇄, 절단 및 효소 방출로 인해 많은 양의 파편이 생성됩니다. 이러한 유형의 오염 물질은 분석을 위해 샘플에 남아 있을 경우 다운스트림 공정에서 막힘 문제를 일으키고, 단일 세포 인덱스 정렬을 위한 네거티브 웰을 유발하고, 분석에서 부모 게이트 백분율을 크게 부풀릴 수 있습니다. Calcein 염색은 세포/살아있는 세포에 대한 양성을 게이트하는 데 사용되었습니다. Calcein은 다양한 색상으로 제공되어 염색 매트릭스에 매우 적합합니다. 칼세인으로 작업할 때 염료를 반복적인 동결-해동 주기에 노출시키지 않도록 주의하십시오(즉, 항상 신선하게 준비하고 용해 후 실온에 보관하십시오).

DNA oligos28 로 바코드화된 항체를 기반으로 샘플을 다중화할 수 있는 기능을 통해 10x Genomics와 같은 플랫폼에서 단일 세포 염기서열 분석 반응의 유용성을 높일 수 있습니다. 샘플 다중화를 위해 설계된 해시태깅 항체는 세포 표면 분자 또는 핵막에 대한 다양한 표적과 마우스와 인간 모두에 대한 특이성을 가지고 있습니다. 세포 해시태그 시스템은 여러 조직에 성공적으로 사용되었지만, 소화 효소 혼합물과 해시태그의 후속 사용을 결합한 실험은 회수율을 급격히 감소시킬 수 있습니다. 우리는 해리 후 추가 세척 단계를 포함하려고 시도했으며 소화 효소의 활동을 억제하기 위해 EDTA를 추가했습니다. 그러나 이러한 단계를 수행하더라도 조혈 세포보다 해시태그 식별이 낮을 것으로 예상됩니다. 효소 분해 프로토콜을 사용하면 해시태그 캡처율이 30%-70% 사이인 것으로 나타났습니다. 이는 형광 색소 접합체를 가진 동일한 항체 클론이 동일한 집단에서 기질 세포의 >90%를 표시했음에도 불구하고 발생합니다. 조직의 효소 분해와 해시태깅을 결합하는 모든 실험 설계는 시범 운영되어야 하며 효소 억제를 보장하기 위해 주의를 기울여야 합니다.

공개 사항

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D.T.S.는 Agios Therapeutics 및 Editas Medicines의 이사 겸 주주입니다. Magenta Therapeutics 및 LifeVault Bio의 설립자, 이사, 주주 및 과학 자문 위원회 위원, Fate Therapeutics 및 Garuda Therapeutics의 주주 및 설립자, Clear Creek Bio의 이사, 설립자 및 주주, FOG Pharma, Inzen Therapeutics 및 VCanBio의 컨설턴트, Sumitomo Dianippon의 후원 연구 자금 수혜자. D.T.S와 K.G는 특허 US20220143099A1의 발명자입니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

매사추세츠 종합병원(Massachusetts General Hospital)의 HSCI-CRM 유세포 분석 시설과 하버드 대학교(Harvard University)의 Bauer Core Facility로부터 전문적인 기술 지원을 받았습니다. T.K와 K.G는 스웨덴 연구 위원회(Swedish Research Council)가, C.M.은 독일 연구 재단(German Research Foundation)의 지원을 받았다. 단세포 RNA 염기서열 분석 데이터 분석에 도움을 주신 Sergey Isaev와 I-Hsiu Lee에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)BD Biosciences559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITCBD Biosciences643510
소 혈청 알부민Millipore SigmaA9647
C57Bl/6 마우스Jackson664수컷 또는 암컷, 8-12 몇 주 된
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning 멸균 세포 여과기, 흰색, 메시 크기: 70 &마이크로; mFisher Scientific08-771-2
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I 솔루션Thermo Fisher Scientific90083  2500 U/mL
Easysep 마우스 스트렙타비딘 RapidSpheres 분리 키트StemCell Technologies19860
Fetal Bovine SerumGibcoA31605-01인증 원샷
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
마우스 안티 휴먼 CD235a-BV77BD Biosciences740785
마우스 안티 휴먼 CD31-PE / Dazzle594Biolegend303130
마우스 안티 휴먼 CD45-BV77Biolegend304050
마우스 안티 휴먼 CD4-BV605BD Biosciences562658
마우스 안티 휴먼 CD66b-FITCBD Biosciences555724
마우스 안티 휴먼 CD8-APC / Cy7BD Biosciences557760
마우스 안티 휴먼 EpCam-BV421Biolegend324220
프로텍터 RNase 억제제Millipore Sigma3335402001
Rat 안티 마우스 CD105-PE / dazzle594Biolegend120424
쥐 안티 마우스 CD11b-BiotinBiolegend101204
쥐 안티 마우스 CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
쥐 안티 마우스 CD16 / CD32 (마우스 BD Fc 블록)BD Biosciences553142
쥐 안티 마우스 CD31-BUV737BD Biosciences612802
쥐 안티 마우스 CD31-BV421Biolegend102424
쥐 안티 마우스 CD3-BiotinBiolegend100244
쥐 안티 마우스 CD45.2-BiotinBiolegend109804
쥐 안티 마우스 CD45-PE/Cy7Biolegend103114
쥐 안티 마우스 CD45-PE/Cy7Biolegend103114
쥐 안티 마우스 CD45R / B220-BiotinBiolegend103204
쥐 안티 마우스 CD51-PEBiolegend104106
쥐 안티 마우스 EpCam-BV711BD Biosciences563134
쥐 안티 마우스 Ly-6A / E (Sca-1) -AF700Biolegend108142
쥐 안티 마우스 Ly-6G / Ly-6C (Gr1) - 비오틴바이오 레전드 108404
쥐 안티-마우스 Ter119-BiotinBiolegend116204
쥐 안티-마우스 Ter119-PEBiolegend116208
쥐 안티-마우스 Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme 워딩턴 생화학LS004107
쥐 안티 마우스 CD45-PE/Cy7 Biolegend 103114

참고문헌

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