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방법 논문

Murine Left Pulmonary Hilar Clamp 폐 허혈 재관류 손상 모델

2.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66232

⸱

2024년 4월 12일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University, St. Louis

이 논문에서

정오 공지

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요약

이 프로토콜은 마우스 모델에서 폐 허혈 재관류 손상을 연구하는 데 사용할 수 있는 실현 가능하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 좌폐 고막 클램핑 방법을 설명합니다.

초록

폐 이식 중 허혈 재관류 손상(IRI)은 원발성 이식편 기능 장애, 급성 및 만성 거부 반응, 사망률을 포함한 이식 후 합병증의 주요 위험 요소입니다. IRI의 토대를 연구하기 위한 노력은 좌측 폐 힐라 클램핑의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 마우스 모델의 개발로 이어졌습니다. 이 모델은 마취되고 삽관된 마우스에서 수행된 수술 절차를 포함합니다. 좌측 흉곽 절개술을 시행한 후 조심스럽게 폐를 움직이고 좌측 폐 하골을 절제합니다. hilar clamp는 슬립매듭으로 폐 hilum의 가역적 봉합 결찰을 포함하여 동맥 유입, 정맥 유출 및 좌측 주줄기 기관지를 통한 공기 흐름을 차단합니다. 재관류는 봉합사를 조심스럽게 제거함으로써 시작됩니다. 우리 실험실은 현재 연구에서 실험 모델에 대해 30분의 허혈과 1시간의 재관류를 사용합니다. 그러나 이러한 기간은 특정 실험 질문에 따라 수정될 수 있습니다. 희생 직전, 4분 동안 오른쪽 힐라 클램핑을 한 후 좌심실에서 동맥혈 가스를 얻을 수 있어 얻은 PaO2 값이 손상된 왼쪽 폐에만 기인하는지 확인할 수 있습니다. 또한 유세포 분석을 통해 세포 유출을 측정하는 방법에 대해서도 설명하는데, 이는 희생 전에 연구할 세포에 특이적인 형광 색소 표지 항체의 정맥 주사를 포함합니다. 그런 다음 유세포 분석, 동결 또는 고정, 파라핀 포매 면역조직화학, 정량적 중합효소 연쇄 반응을 위해 왼쪽 폐를 채취할 수 있습니다. 이 힐라 클램프 기술을 사용하면 IRI의 기저에 있는 세포 및 분자 메커니즘을 자세히 연구할 수 있습니다. 대표적인 결과는 좌측 폐 산소 공급이 감소하고 힐라 클램핑 후 폐 손상의 조직학적 증거를 보여줍니다. 이 기법은 미세수술 경험이 있든 없든 누구나 쉽게 배우고 재현할 수 있어 신뢰할 수 있고 일관된 결과를 얻을 수 있으며 폐 IRI를 연구하기 위해 널리 채택할 수 있는 모델 역할을 합니다.

서론

장기 이식 중 IRI는 원발성 이식편 기능 장애 및 이후 이식편 거부 반응의 주요 위험 요인입니다 1,2. 이식 중 온열 허혈 시간은 기증자 대동맥 교차 클램프에서 냉간 관류 시작까지의 기간과 얼음에서 장기 제거에서 장기 이식까지의 기간으로 정의됩니다. 냉장 보관 시간은 냉간 관류가 시작된 시점부터 얼음에서 장기를 제거할 때까지의 기간으로 정의된다3. 온난허혈은 한랭허혈보다 후기 장기 기능에 더 해롭다 4,5,6, 그리고 그 기저에 깔린 메커니즘은 전임상 모델에서 추가 연구를 필요로 한다. 또한, 심장사 후 기증을 통한 장기 이식(DCD)은 뇌사(DBD) 후 전통적인 기증보다 따뜻한 허혈 시간이 더 긴 것과 관련이 있습니다(7). DCD 기증자의 사용은 기증자 풀을 확장하고 폐 이용률을 높일 수 있지만, 이식 후 폐 기능에 대한 온열 허혈의 영향을 평가하기 위한 추가 전임상 연구가 필요합니다. 아래에서는 왼쪽 폐 hilar 클램프를 통한 마우스의 따뜻한 IRI 모델을 설명합니다.

폐 힐라 클램핑의 여러 동물 모델이 지난 몇 년 동안 개발 및 적용되었으며 비외상성 미세혈관 클램프 8,9,10,11,12,13, 루멜 지혈대14,15 또는 봉합 결찰16의 사용이 포함될 수 있습니다 Hilar 클램프로. hilar 클램프의 핵심은 가역적이어야 하며 재관류가 달성될 수 있도록 hilar 구조에 손상을 최소화하거나 전혀 일으키지 않아야 한다는 것입니다. 여기에서는 좌측 폐 hilum의 가역적 봉합 결찰을 슬립매듭으로 포함하는 마우스의 hilar clamp 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 폐동맥 유입, 정맥 유출 및 기관지 주엽 안팎의 공기 흐름을 차단합니다. 혈관 클램프, 클립 또는 지혈대에 대한 슬립매듭의 주요 이점은 허혈이 장기간 지속되는 동안 가슴을 닫을 수 있어 마우스의 무감각한 체액과 열 손실을 최소화할 수 있다는 것입니다. 당사는 신뢰할 수 있는 동맥혈 가스(ABG) 측정을 얻고 hilar 클램핑 후 세포 유출을 측정하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

이 힐라 클램프 기술은 폐 이식에 대한 광범위한 연구에서 중요한 위치를 차지합니다. 기상피성 폐 이식의 소동물 모델과 비교했을 때, 힐라 클램프 기법은 외과적 문합 외상이나 동종성을 추가하지 않고도 IRI의 효과를 분리할 수 있다17. 또한 hilar clamp 기술은 마우스 폐 이식보다 더 쉽고 빠르게 마스터할 수 있습니다. 실제로, hilar 클램프 기술을 사용하여 지난 10 년 동안 TLR4, NADPH 산화 효소 및 아데노신 A2A 수용체 14,18,19,20과 같은 IRI의 발병기전에서 몇 가지 중요한 메커니즘이 확인되었습니다. 다음 프로토콜에서는 폐 IRI를 연구하기 위한 도구로서 신뢰할 수 있고 학습 가능하며 재현 가능한 hilar 클램핑 방법을 제시합니다.

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프로토콜

모든 연구는 Washington University School of Medicine의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 동물은 미국 국립과학원(National Academy of Sciences)이 준비하고 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the care and use of laboratory animals), 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한8판 21 호(Guide for the care and use of laboratory animals), 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한 실험동물 관리 원칙(Principles of laboratory animal care)에 따라 인도적 보호를 받았습니다.

1. 마취 및 삽관

  1. 무게가 25g 이상인 마우스를 선택하십시오. 이렇게 하면 성대 사이의 더 큰 구멍으로 인해 삽관이 더 쉬워집니다.
  2. 케타민(체중의 선량 100mg/kg)과 자일라진(체중의 선량 10mg/kg)의 혼합물로 마우스를 복강내로 주입합니다. 이 혼합물은 1/2인치 29G 바늘이 있는 1/2cc 주사기에 넣어야 합니다. 케타민이 효과를 발휘할 때까지 약 5분 정도 기다립니다 - 마우스는 자발적인 움직임을 보이지 않아야 하며 적절한 마취를 확인하는 발가락 꼬집음에 반응하지 않아야 합니다.
  3. 추가적인 통증 조절을 위해 수술 전에 부프레노르핀(체중 0.05mg/kg의 용량)을 피하에 주사합니다.
  4. 수술 중 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 약물을 사용하지 않는 안과 연고를 바르십시오.
  5. 왼쪽 가슴과 등을 클리퍼로 면도하고( 그림 1A 참조) 개복술을 계획한 경우 복부까지 확장합니다(5.3단계 참조).
  6. 마우스가 마취되면 선호하는 삽관 설정을 사용하여 삽관을 수행하고 나머지 절차는 ~37°C에서 따뜻해진 매트 위에 현미경으로 수행합니다(마우스의 정상 체온증을 유지하기 위해).
  7. 성대를 충분히 본 후 끝에 곡선이 있는 수제 주입기( 보충 그림 1 참조)를 기관내관(ETT)으로 사용되는 1인치 20G 혈관카테터에 삽입합니다. 도입기의 끝부분을 안내한 다음 ETT를 성대 사이와 성대 사이로 안내합니다.
    참고: ETT가 성대를 통해 통과하는 것을 시각화하여 식도로 잘못 삽관하는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 삽관 중 성대가 다치지 않도록 주의를 기울여야 합니다(즉, 삽관 시도 횟수를 5회로 제한해야 하며 저항이 충족되면 ETT가 진행되지 않아야 함).
  8. ETT가 삽입되면 도입기를 제거하고 ETT를 작은 동물 인공호흡기에 연결합니다. 올바른 기관내 삽관을 확인하기 위해 대칭적인 흉부 상승을 관찰합니다. 인공호흡기 설정은 분당 100-105회 호흡해야 하며 흡기 산소의 비율은 100%여야 합니다. 일회 호흡량은 0.35mL이고 호기말 양압은 1cm H2O입니다.
    알림: 우발적인 식도 삽관은 즉시 교정하지 않으면 사망에 이를 수 있으므로 복부가 아닌 가슴이 올라가고 있는지 확인하십시오.
  9. 제자리에 있는 것이 확인되면 ETT가 입 밖으로 미끄러지지 않도록 ETT와 코가 적절하게 접촉하도록 마우스 코 주위에 5cm 스트립으로 ETT를 고정합니다( 그림 1B-C 참조).
  10. 수술 내내 적절한 마취를 유지하려면 산소 흐름에 따라 1%-1.5% 이소플루란을 투여합니다.

2. 흉강절개술

  1. 양쪽 앞발을 왼쪽 상단 모서리에 테이프로 붙이고, 오른쪽 뒷발을 왼쪽 하단 모서리에 테이프로, 왼쪽 뒷발을 오른쪽 하단 모서리에 테이프로 붙인 상태에서 마우스를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다(테이핑은 그림 2G 참조).
  2. 왼쪽 가슴 부위의 피부를 포비돈 요오드를 최소 3회 번갈아 가며 소독한 후 70%의 알코올을 도포합니다.
  3. 전방 겨드랑이 선에서 후방 겨드랑이 선까지 4번째 늑간 공간을 절개하여 가위를 사용하여 위에 있는 피부를 엽니다( 그림 2A 참조). 4번째 늑간 공간은 중간 겨드랑이 선에서 겨드랑이에서 약 1cm 아래에 위치합니다.
  4. 출혈을 최소화하려면 휴대용 소작 펜을 사용하여 피하층과 근육층 내에서 눈에 보이는 혈관을 응고시킵니다.
  5. 피부 절개 길이를 따라 가위를 사용하여 광배근과 전방근을 날카롭게 나눕니다( 그림 2B 참조).
  6. 가늘게 구부러진 집게를 사용하여 4번째 갈비뼈를 조심스럽게 들어 올리고(밑에 있는 폐를 다치게 하지 않도록 주의) 5번째 갈비뼈 바로 위의 가는 가위로 핀포인트 잘라 4번째 늑간 공간으로 들어갑니다(그림 2C 참조). 늑간 신경혈관 다발이 손상되지 않도록 4번째 갈비뼈 아래가 아닌 5번째 갈비뼈 위에서 개흉술을 시행합니다.
  7. 음흉강 압력이 사라지고 폐가 흉벽에서 멀어지면 5번째 갈비뼈 바로 위의 4번째 늑간 공간에서 흉곽 절개술을 전방 및 후방으로 확장합니다(그림 2D-E 참조). 절개 부위의 전체 길이는 폐 전체가 노출될 수 있을 만큼 충분히 길어야 하며, 보통 ~1cm여야 합니다.
    참고: 흉곽 절개술이 너무 앞쪽으로 확장되면 내부 유방 동맥 출혈이 발생할 수 있습니다 - 발생할 경우 과도한 출혈을 피하기 위해 소작해야 합니다.
  8. 두 개의 리브 견인기를 적용하여 리브 공간을 넓히고 적절한 시각화를 위해 최소 1cm2의 작업 창을 허용합니다(그림 2F-G 참조).

3. hilar 클램프의 적용

  1. 두 개의 뾰족한 솜으로 된 어플리케이터를 사용하여 왼쪽 폐를 두부로 들어 올린 다음 반투명한 하부 폐 인대를 뭉툭하게 나누어 움직입니다(그림 3A-B 참조).
    참고: 폐를 찢지 않고 수행하기 어려운 경우 가는 가위를 사용하여 하부 폐 인대를 날카롭게 나눌 수도 있습니다.
  2. 후방 좌측 폐 hilum을 시각화할 수 있도록 폐를 전방으로 반사합니다. 6-0 실크 넥타이 조각을 ~ 10cm로 자르고이 넥타이의 중간점을 힐룸 뒤쪽에 놓습니다 ( 그림 3C 참조).
  3. 그런 다음 왼쪽 폐를 뒤쪽으로 뒤집어 넥타이 위에 놓고 넥타이의 양쪽 끝을 앞쪽으로 당깁니다( 그림 3D 참조).
  4. 넥타이의 두 개의 자유 끝(A와 B)을 사용하여 집게와 구부러진 모기 클램프로 뒤집을 수 있는 슬립매듭을 악기로 묶습니다. 3.4.1 및 3.4.2 단계의 자세한 설명을 참조하십시오. 따뜻한 허혈 시간은 슬립매듭을 묶는 것으로 시작됩니다. 매듭이 묶이면 왼쪽 폐가 인공호흡기를 숨을 쉴 때마다 더 이상 팽창하지 않아야 합니다. 그것은 관류의 중단을 의미하는 창백한 흰색이 되어야 합니다.
    알림: 매듭이 hilum의 중앙에 위치하도록 주의를 기울여야 하며, 실수로 좌심방을 중앙으로, 폐 실질을 측면으로 올가미에 걸리지 않도록 주의해야 합니다( 그림 3F 참조).
    1. 주로 사용하는 손에는 클램프를, 주로 사용하지 않는 손에는 집게를 사용하여 A의 끝을 집게로 잡고 닫힌 클램프 주위에 A의 중간점을 한 번 감습니다( 그림 3E 참조).
    2. 클램프로 B의 중간 지점을 잡고 양손으로 당겨 슬립매듭을 조입니다. B의 끝이 매듭을 통해 당겨져 매듭을 되돌릴 수 없게 만들지 않도록 하십시오. 매듭을 묶은 후 B는 매듭에서 나오는 고리가 있어야 하고 A는 직선이어야 합니다( 그림 3F 참조). 매듭은 B의 끝을 당겨 풀 수 있습니다.
  5. ETT에서 인공호흡기로의 유출 튜브를 수동으로 폐색하여 기관지의 적절한 폐색을 확인하며, 이로 인해 왼쪽 폐가 팽창하지 않아야 합니다( 그림 3G 참조). 혈관 폐색은 연골 기관지에 비해 폐동맥과 정맥의 접힘 가능성이 높기 때문에 기관지 폐색으로 가정합니다.
  6. 힐라 클램프를 적용한 후 6-0 나일론 봉합사를 사용하여 한 번의 간단한 중단 스티치로 피부 절개 부위를 봉합하여 따뜻한 허혈 기간 동안 무감각한 체액 손실을 최소화합니다.

4. hilar 클램프 해제

  1. 원하는 따뜻한 허혈 기간이 지나면 실크 넥타이의 짧은 자유 끝 부분을 부드럽게 당겨 매듭을 풉니다( 그림 3F 및 3.4단계에서 B). 슬립매듭이 풀리면 재관류 시간을 시작합니다.
    참고: 넥타이를 푼 후 ETT의 유출을 다시 수동으로 폐색하여 폐 환기를 확인할 수 있으며, 이제 왼쪽 폐의 팽창을 유발해야 합니다. 다시 말하지만, 관류는 폐의 팽창과 함께 암시되지만 폐가 분홍색으로 변하는 것으로도 확인할 수 있습니다( 그림 4A 참조).
  2. 재관류 기간 동안에는 무감각한 손실을 최소화하기 위해 흉부를 3겹으로 봉합합니다. 먼저 6-0 나일론 봉합사로 한 땀 한 땀 바느질하여 4번째 갈비뼈 바로 위에 한 입, 6번째 갈비뼈 바로 위에 한 입 물린 상태로 4번째 갈비뼈 공간을 닫습니다(그림 4B-C 참조). 의인성 기흉의 위험을 최소화하기 위해 이를 최대 폐 팽창률로 묶습니다(그림 4D-E 참조).
  3. 다음으로, 6-0 나일론 봉합사로 간단한 러닝 스티치를 사용하여 근육 층을 닫습니다.
  4. 마지막으로 6-0 나일론 봉합사로 간단한 단속 스티치로 피부 절개 부위를 봉합합니다( 그림 4F 참조). 깨어 있는 동물이 절개 부위를 따고 상처가 완전히 제거될 위험이 있으므로 피부를 꿰매지 마십시오.
  5. 이 시점에서, 원하는 재관류 시간이 끝날 때 폐를 직접 적출할 수 있습니다. ABG 평가가 필요한 경우 5단계를 참조하십시오. 희생 전에 추가 정맥 주사가 필요한 경우 6단계를 참조하십시오. 이것은 말기 수술입니다.
  6. 재관류 시간이 몇 시간 이상이어야 하는 경우 이소플루란을 꺼서 쥐가 마취에서 깨어나 발관할 수 있도록 합니다. 발관 기준에는 발을 꼬집는 경련, 자발적인 호흡 및 움직임이 포함됩니다. 케타민과 이소플루란 마취에서 쥐를 깨우는 데는 일반적으로 30-45분이 걸립니다. 이것은 생존 수술입니다.
    1. 생존 수술을 위해서는 수술로 인한 체액 손실을 고려하여 1mL의 따뜻한 식염수를 피하에 주입합니다. 통증 조절을 위해 수술 전에 부프레노르핀(체중 0.05 - 0.1mg/kg의 용량)을 피하로 주사합니다. 수술 후 최소 4일 동안 4-6시간마다 마취를 반복하십시오. 추가적인 통증 조절을 위해 절개 부위를 따라 부피바카인 차단술을 고려해보세요.

5. ABG 평가

참고: ABG 측정이 필요한 경우 좌심실에서 동맥혈 흡인을 통해 얻는 것이 가장 좋습니다. ABG가 왼쪽 폐 기능만을 반영한다는 것을 확인하기 위해, 이 동맥혈은 오른쪽 hilum이22,23 고정된 후 약 4분 후에 얻어야 하며, 이 시간 동안 왼쪽 폐만 산소 공급 및 환기를 수행해야 합니다.

  1. hilar clamp 후 마우스가 마취에서 깨어난 경우 1단계에 따라 마우스를 다시 마취하고 삽관합니다.
  2. 원하는 재관류 시간이 끝나기 약 15-20분 전에 마우스를 누운 위치에 놓고 네 팔다리를 모두 테이프로 고정합니다.
    알림: 재관류가 끝나기 전에 다음 단계를 수행할 수 있도록 충분한 시간을 할당해야 합니다. 복부와 가슴을 여는 구체적인 시기는 외과 의사와 경험에 따라 다릅니다.
  3. 치골에서 시포이까지 정중선 개복술을 수행하여 가위로 피부를 절개한 다음 알바선(linea alba)을 따라 복벽을 절개합니다(그림 5A-B 참조).
  4. xiphoid에서 가장 아래쪽 갈비뼈의 곡선을 따라 전방 겨드랑이 선까지 개복술을 좌우로 확장합니다( 그림 5C 참조).
  5. 복부에서 정중선의 전방 횡격막을 절개하여 가슴으로 들어가게 하되 심장 부상을 피하기 위해 너무 깊게 들어가지 않도록 주의합니다(그림 5D-E 참조). 그런 다음 전방 횡격막 절개 부위를 가장 아래쪽 늑골을 따라 전방 겨드랑이 선까지 좌우로 확장합니다(그림 5D의 흰색 점선 참조).
  6. 전방 겨드랑이 선을 따라 양측 갈비뼈를 나누고 겨드랑이를 향해 위쪽으로 뻗어 조개 껍질 흉곽 절개술을 만듭니다. 그런 다음 심장과 양측 폐가 완전히 노출될 수 있도록 전방 흉벽(흉골 및 양측 전방 갈비뼈) 두부를 반사합니다( 그림 5F의 흰색 점선 참조).
  7. 수축을 용이하게 하기 위해 뒤집힌 두부골이 있는 전흉벽에 클램프를 적용합니다. 가슴의 시야를 개선하기 위해 정중선에 구부러진 모기 클램프를 사용하여 다이어프램을 아래쪽으로 집어넣습니다( 그림 5F 참조).
  8. 오른쪽 폐(4개의 엽이 있음)를 완전히 움직이려면 정중선을 지나 왼쪽 가슴으로 뻗어 있는 부속 엽을 다시 오른쪽 가슴으로 되돌립니다(그림 5G-H 참조). 이 엽을 왼쪽 가슴에 붙어있는 얇은 인대가 있습니다 - 이것을 솜 끝이 달린 어플리케이터로 뭉툭하게 나누거나 가위로 날카롭게 나눕니다.
    알림: 이 액세서리 로브는 하대정맥(IVC) 후방의 정중선을 가로지르므로 이 기동 중에 IVC를 손상시키지 않도록 주의해야 합니다.
  9. 모든 엽이 오른쪽 가슴으로 돌아오면 오른쪽 폐 전체를 전방으로 반사하고 오른쪽 hilum 뒤쪽에 또 다른 6-0 실크 넥타이(~10cm로 절단)를 놓습니다. 그런 다음 넥타이 위로 오른쪽 폐를 다시 가슴으로 교체합니다.
  10. 3.4단계에서 설명한 것과 동일한 기술을 사용하여 오른쪽 폐의 4개 엽을 모두 둘러싸도록 주의하면서 오른쪽 hilum 주위에 다른 슬립매듭을 묶습니다. 이 오른쪽 힐라 clamp 단계는 재관류가 끝나기 약 4분 전에 시간을 맞춰야 합니다.
  11. 1cc 투베르쿨린 주사기에 1/2인치 31G 바늘에 약 200μL의 헤파린 1000단위/mL를 코팅합니다. 이렇게하려면 헤파린의 부피를 늘리고 플런저를 앞뒤로 3-4 번 반복적으로 당겨 헤파린이 주사기 내부 전체를 코팅 할 수 있도록합니다. 이는 수술 스테이션에서 ABG 기계로 이송하는 동안 흡인된 혈액이 응고될 위험을 최소화하기 위해 수행됩니다.
  12. 4분 후 오른쪽 힐라 클램핑, 좌심실에서 헤파린 코팅 주사기로 동맥혈을 흡인합니다( 그림 5I 참조). 심실 중격에 구멍을 뚫고 실수로 우심실 정맥혈을 흡인하지 않도록 주의하십시오. 더 어두운 우심실과 더 밝은 좌심실 사이에는 명확한 색상 차이가 있습니다( 그림 5I 삽입 참조). 바늘을 왼쪽 목 쪽으로 기울입니다. ABG(~150μL)를 실행하기에 충분한 혈액을 얻기 위해 여러 번의 천자가 필요할 수 있습니다.
    알림: 오른쪽 힐라 클램프의 4분 동안 마우스는 임박한 죽음을 예고하는 고통스러운 호흡을 보이기 시작할 수 있습니다. 이 경우 심정지 전에 동맥혈을 신속하게 흡인해야 합니다. 박동하지 않는 심장에서 혈액을 흡인하는 것은 불가능합니다.
  13. ABG 기계에서 동맥혈을 실행하여 산소 포화도, 산소 분압, 이산화탄소 분압 등을 측정합니다. ABG 채취 및/또는 항체 처리 후 마우스를 안락사시킵니다(6단계 참조).

6. 세포 유출 측정을 위한 정맥 항체 주입

참고: 이 기법은 이전에 발표된바와 같이 18에 발표된 바와 같이 형광 색소 표지 항체를 IVC에 정맥 주사한 후 유세포 분석을 수행하여 세포 유출을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 요컨대, 혈관 내 호중구는 호중구 특이적 항-Ly6G 항체를 사용하여 간질성 호중구와 구별할 수 있습니다. 플루오레세인 이소티오시아네이트 라벨링(FITC 라벨링) 항-Ly6G(클론 1A8)는 희생 5분 전에 정맥 주사하여 순환 혈관 내 호중구를 라벨링합니다. 사용된 FITC-Ly6G 항체의 농도는 200μL의 인산염 완충 식염수에 희석된 100ng입니다. 그런 다음 유세포 분석을 위해 왼쪽 폐에서 단세포 현탁액을 준비한 후 모든 호중구를 알로피코시아닌 표지(APC 표지) 항-Ly6G(클론 1A8)로 표지합니다. 따라서 APC-Ly6G+FITC-Ly6G+ 호중구는 혈관 내이고 APC-Ly6G+FITC-Ly6G- 는 혈관 외 또는 간질입니다. 이 기술은 예를 들어 항-Ly6C 항체가 있는 단핵구, 항-CD19 항체가 있는 B 세포에 적용할 수 있습니다.

  1. 원하는 항체를 5/16인치 31G 바늘이 있는 3/10cc 주사기에 넣고 주사기 내 기포를 최소화하도록 주의합니다. 6.5단계에서 IVC에 정맥 주사를 할 때 사용합니다.
  2. 5.3-5.4단계에 따라 개복술을 수행합니다.
  3. 개복술 후에는 끝이 뾰족한 두 개의 어플리케이터를 사용하여 오른쪽 내측 내장 회전을 무딘 상태로 수행합니다. 마우스의 경우, 이는 복부 왼쪽의 모든 장을 절제함으로써 수행되며, 이를 통해 IVC를 명확하게 볼 수 있습니다( 그림 6A 참조).
  4. 면봉 어플리케이터로 IVC 위에 있는 지방을 뭉툭하게 제거합니다.
  5. 정맥 천자를 통해 항체 용액을 IVC에 주입합니다( 그림 6B 참조). 바늘을 뽑은 후 즉시 면봉으로 정맥 천자 부위에 지혈이 될 때까지 부드러운 압력을 가합니다(보통 약 2-3분).
  6. 적출된 장을 면봉을 통해 복부로 되돌려 IVC에 계속 압력을 가합니다( 그림 6C 참조).
  7. 5.5-5.7단계에 따라 조개껍질 흉곽 절개술을 수행하여 왼쪽 폐를 채취합니다. 희생 및 수확 전에 항체가 전신적으로 순환할 수 있도록 최소 5분 동안 허용하십시오. ABG 채취 및/또는 항체 치료 후 마우스를 안락사시킵니다.

7. 조직학(H&E) 염색

  1. 왼쪽 폐를 포르말린 고정 및 파라핀 삽입하고 5μm 두께로 절편한 후 슬라이드를 자일렌으로 탈파라핀화합니다(10분 세척 2회).
  2. 순차 에탄올 세척으로 탈수: 100%로 5분 세척 2회, 95%로 2분 세척 1회, 70% 에탄올로 2분 세척 1회. 그런 다음 탈이온수로 헹굽니다.
  3. 헤마톡실린으로 슬라이드를 2-4분 동안 염색한 다음 탈이온수로 5분 동안 또는 맑아질 때까지 씻습니다. 헤마톡실린 염색의 정확한 기간은 조직과 원하는 핵 염색 강도에 맞게 최적화되어야 합니다.
  4. 얼룩을 구별하기 위해 정의 용액으로 30초 동안 세척한 다음 2분 동안 물로 세척합니다. 파란색 형성 용액으로 30초 동안 세척한 다음 2분 동안 물로 세척합니다.
  5. 95% 에탄올을 15배 담궈 더 탈수합니다. 1분 동안 에오신을 염색합니다.
  6. 2분 에탄올 세척(2회)으로 탈수한 다음 2분 자일렌 세척(2회)으로 탈수합니다. 장착 미디어와 커버 슬립을 적용합니다.

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결과

좌측 흉곽 클램핑 후 좌측 폐에 기인 한 동맥혈 (PaO2)의 산소 분압은 ~ 100 mmHg이며, 이는 가짜 흉곽 절제술 후 ~ 500 mmHg에 비해 현저히 낮습니다 (그림 7A, n = 6-7). 주목할 만한 점은, B6 마우스에서 가짜 흉곽 절제술을 수행했으며, ABG 측정은 4분 동안 오른쪽 힐라 클램핑을 한 후 수행되었으며, 이는 왼쪽 폐에만 기인한 값을 나타냅니다. 좌측 폐의 H&E 염색은 기도를 채우는 염증 세포의 침투와 적혈구로 혈관을 충혈하는 것을 보여주었지만, 이러한 소견은 순진한 좌측 폐에서는 나타나지 않았습니다(그림 7B, n=2). 이러한 결과는 허혈 및 재관류 기간 후 즉각적인 조직 손상 및 세포 침투를 보여줍니다.

6단계에서 논의한 바와 같이, 혈관 내 및 간질성 호중구는 희생 5분 전에 FITC 표지된 항-Ly6G 항...

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토론

우리는 폐동맥과 정맥 및 기관지를 폐색하는 왼쪽 힐럼에 슬립매듭을 적용하여 온열 허혈을 유도한 후 재관류를 수행하는 hilar clamp 기술에 대해 설명합니다. hilar 클램핑 후 왼쪽 폐를 채취하여 조직학, 유세포 분석, 벌크 또는 단일 세포 시퀀싱, 정량적 중합효소 연쇄 반응과 같은 다양한 실험 기법을 사용할 수 있습니다. 또한 혈액과 비장은 전신 효과를 연구하는 데 사용할 수 있으며 비허혈성 우폐는 내부 제어 역할을 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 ABG 측정값을 얻고/하거나 세포 유출을 측정하는 자세한 방법도 설명합니다.

murine hilar 클램핑 기술은 폐 IRI 연구와 더 넓은 폐 이식 분야에 매우 중요합니다. 예를 들어, 이 hilar clamp 모델을 사용하여 우리 그룹은 비장 유래 CCR2+ 고전적 단핵구가 IRI18에 따라 폐로의 호중구 외출을 매개한다는 것을 발견했습니다. 또 다른 그룹은 hilar clam...

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공개 사항

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감사의 글

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Medications
10% 포비돈-요오드 용액AplicareNDC 52380-0126-2소독제
부프레노르핀 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30통증 조절용
CarprofenCronus PharmaNDC 69043-027-18통증 조절용
Heparin 1000 units/mLSagentNDC 25021-404-01동맥혈
Isoflurane 1%-1.5%Sigma Aldrich26675-46-7마취용
케타민 염산염 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06마취용
Puralube Vet 안구 연고Medi-Vet.com11897눈 건조를 방지하기 위해
Xylazine 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20통증 조절
<강한>도구 및 기구
은빛 고온 미세 팁 소추 펜McKesson231혈관 응고용
곡선형 모기 클램프Fine Science Tools13009-12외과적 절차용
미세 곡선 겸자Fine Science Tools11274-20수술용 절차
Fine ScissorsFine Science Tools15040-11수술 절차용
삽관 클램프 설정Fine Science Tools18374-44, 18144-30삽관 중 혀로 마우스를 수직으로 잡기 위해. 보충 그림 1A를 참조하십시오. 
마그네틱 리브 견인기Fine Science Tools18200-01, 18200-10개흉술 후퇴용. 마그네틱 고정 장치와 견인기는 아래의 마이크로 라텍스 튜브로 연결해야합니다.
광학 등급 플라스틱 광섬유 Unjacketed, 500μ mEdmund Optics02-532기관내관의 도입기를 만들기 위해. 보충 그림 1B를 참조하십시오. 이 광섬유의 1.5인치 길이는 한쪽 끝에 실크 테이프 조각이 고정되어 있어야 합니다. 그런 다음 기관내관의 도입부로 사용할 수 있습니다. 도입부의 끝은 약간 곡선이어야 합니다.
파워 프로 울트라 클리퍼Oster078400-020-001클립 헤어
가위Fine Science Tools14370-22수술 용
작은 동물 발열 패드K& H Pet ProductsThermo-Peep 가열 패드정상 온도 유지용
소동물 인공호흡기Harvard Apparatus55-0000환기용(TV 0.35cc, PEEP 1cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (외경 1/8, 내경 1/16)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1수축용 개흉술
통계 프로필 프라임 중환자 혈액 가스 분석기Nova Biomedicalhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB   		개흉술 철회를 위해
스트레이트 클램프Fine Science Tools13008-12수술 절차용
스트레이트 펜치Fine Science Tools91113-10수술 절차용
수술용 현미경Wild Heerbrugg더 이상 생산되지 않습니다삽관 및 수술 절차를 위해; Leica surgical
microscopesSupplies으로 교체하는 것을 권장합니다>
½ cc 주사기와 ½ 인치 29G 바늘McKesson942665케타민/자일라진을 복강내로 주입하기 위해
½ 1cc 투베르큘린 주사기에 인치 31G 바늘McKesson16-SNT1C2705좌심실에서 동맥혈 흡인을 위해
1인치 20G IV 카테터TerumoSROX2025CA기관내관(ETT)을 위해
1인치 실크 테이프 Durapore3M ID 7100057168ETT를 코에 테이프로 붙이고 팔다리를 고정하기 위해
5/16 인치 31G 바늘이 있는 3/10cc 주사기McKesson102-SN310C31516P
P-10 바늘에 하대정맥 6-0 모노필라멘트 봉합McKessonS697GX개흉술, 근육층 및 피부 봉합
6-0 실크 넥타이외과 전문 보기SP102힐라 클램프용 슬립매듭을 만들기 위해
뾰족한 면 팁 어플리케이터Solon56225폐를 조작하고 둔기 해부를 위해
는 . 사 용

참고문헌

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재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 7/09/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66232

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