Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

Summary

이 논문은 살아있는 선충에서 단일 뉴런 해상도로 내인성 표지된 화물의 축삭 수송을 시각화하기 위한 형광 현미경 획득 매개변수의 최적화에 대해 설명합니다.

Abstract

축삭 수송은 신경 세포체의 합성 부위에서 축삭의 목적지까지 축삭 단백질을 전달하기 위한 전제 조건입니다. 결과적으로, 축삭 수송의 손실은 신경 세포의 성장과 기능을 손상시킵니다. 따라서 축삭 수송을 연구하면 신경 세포 생물학에 대한 이해가 향상됩니다. 최근 CRISPR Cas9 게놈 편집이 개선됨에 따라 축삭 화물의 내인성 라벨링이 가능해짐에 따라 이소성 발현 기반 운송 시각화를 넘어서게 되었습니다. 그러나 내인성 라벨링은 종종 낮은 신호 강도를 희생시키며 강력한 데이터를 얻기 위해 최적화 전략이 필요합니다. 여기에서는 획득 매개변수와 확산 세포질 배경에 대한 내인성 라벨링 화물의 신호를 개선하기 위한 표백 접근 방식에 대해 논의하여 축삭 이동의 시각화를 최적화하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 당사는 녹색 형광 단백질(GFP) 태그가 지정된 RAB-3로 표지된 시냅스 소포 전구체(SVP)의 시각화를 최적화하기 위해 프로토콜을 적용하여 획득 매개변수를 미세 조정하여 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 내인성으로 표지된 축삭 화물의 분석을 개선할 수 있는 방법을 강조합니다.

Introduction

일생 동안 뉴런은 세포체에서 단백질, 지질 및 기타 분자를 축삭의 최종 목적지까지 전달하기 위해 축삭 수송에 의존합니다. 결과적으로, 축삭 수송의 손상은 신경 기능의 상실과 관련이 있으며 종종 신경 퇴행성 질환의 병리학에 관여합니다 ^1,2. 따라서 축삭 수송의 기초가 되는 메커니즘을 이해하는 것은 매우 중요합니다.

축삭 수송에 대한 수십 년간의 연구는 이 수송을 매개하는 분자 기계, 그 구성 및 조절 메커니즘에 대한 많은 중요한 통찰력을 보여주었습니다. 장거리 축삭 수송은 미세소관 세포골격에서 발생하며, 이는 일반적으로 축삭돌기³에서 플러스 엔드로 배향되는 부분적으로 겹치는 미세소관 중합체로 구성됩니다. 결과적으로, 전행성 수송은 미세소관의 플러스 말단, 키네신으로 걸어가는 운동 단백질에 의해 매개되는 반면, 역행 수송은 마이너스 말단 방향의 다인 모터에 의존합니다. 수송의 많은 측면이 밝혀졌지만, 많은 축삭 단백질의 경우 여전히 불분명한 상태로 남아 있으며, 어떻게 수송 기계에 적재되는지, 개별 수송 패키지가 어떻게 구성되는지, 그리고 이^{수송이 어떻게} 조절되는지는 3.

축삭 수송은 처음에 방사성 표지 된 아미노산을 체세포 구획에 주입하여 초기 내인성 단백질에 통합하고 자동 방사선 촬영에 의해 축삭 구획에서 시간이 지남에 따라 추적 할 수있는 방사선 표지 실험에서 연구되었습니다⁴. 방사성 표지 실험은 생체 내에서 내인성 단백질의 축삭 수송을 연구할 수 있게 해주었지만, 기계론적 통찰을 얻기 위해 개별 화물의 거동을 직접 추적할 수는 없다⁴. 이러한 한계는 형광 현미경을 사용하여 극복되었습니다. 그러나 축삭 수송은 종종 내인성 단백질에서 시각화되지 않고 대신 형광 표지 사본의 발현에 의해 시각화됩니다. 특히 낮게 발현된 단백질의 경우, 과발현은 더 높은 신호 강도를 제공하여 단일 뉴런 분해능으로 시각화를 가능하게 합니다. 또한, 형광 태그 단백질의 이소성 발현은 게놈 편집의 필요성과 어려움을 우회합니다. 반대로, 이토픽적으로 표현된 화물의 거동은 내인성 화물(⁵)의 거동과 다를 수 있다는 주장이 제기되어 왔다.

최근 게놈 편집의 개선으로 내인성 라벨링 전략에 더 쉽게 접근할 수 있게 되었습니다. 따라서 더 낮은 신호 강도는 내인성 라벨링 대신 이소성 발현에 의한 화물의 축삭 수송을 연구하는 데 있어 주요 제한 사항이 되었습니다. 획득 조건의 최적화와 결합된 내인성 라벨링 전략에 대한 신중한 고려는 이러한 문제를 극복할 수 있습니다.

선충은 투명성과 유전자 조작의 용이성으로 인해 생체 내 축삭 수송을 연구하기 위한 우수한 연구 모델을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 살아있는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )에서 단일 뉴런 해상도로 내인성 단백질의 축삭 수송을 시각화하기 위한 연구 전략을 설명합니다.우리는 Jorgensen Lab⁶에 의해 생성된 균주를 사용하여 시냅스 소포 전구체의 축삭 수송을 시각화하며, 여기서 소포 관련 RAB GTPase, RAB3는 운동 뉴런 DA9에서 GFP로 내인성 표지됩니다. 다양한 획득 파라미터와 광표백에 대한 작은 조정이 개별 수송 이벤트의 시각화를 어떻게 개선할 수 있는지 질문함으로써 이 프로토콜은 이미징 조건을 최적화하는 방법에 대한 아이디어를 제공합니다.

Protocol

살아있는 세포 이미징을 위해 선충을 유지하고 준비하는 방법에 대한 자세한 프로토콜은 S.Niwa ⁷의 작업을 참조하십시오.

1. 웜 변형 생성

선충 균주를 생성하는 것 외에도 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)⁸ 에는 웹 페이지에서 직접 얻을 수 있는 내인성 형광 태그 단백질을 가진 선충 균주 컬렉션이 증가하고 있습니다.

1. fluorescence labeling strategy의 선택
   1. rab-3(ox699) 대립유전자⁶을 포함하는 선충 균주 MTS1161를 사용하여 DA9 운동 뉴런에서 RAB-3으로 표지된 내인성 GFP를 시각화합니다(균주는 CGC에 증착됨). 다른 축삭 단백질을 시각화하려면 Mello Lab⁹의 CRISPR Cas9 편집 프로토콜을 사용하여 내인성 태그 단백질로 선충 균주를 생성합니다.
      참고: MTS1161는 GFP 태그⁶을 사용하여 RAB-3를 내인성으로 특이적으로 라벨링하는 세포에 대한 재조합 접근법을 사용합니다. 일반적인 대안적 접근법은 분할 형광 단백질의 재구성을 기반으로 하며, 이는 다중 분할 형광 사본¹⁰을 사용하여 내인성 단백질당 형광 복제 수를 향상시키기 때문에 특히 저발현 단백질에 권장됩니다. 복제 수는 초기에 CenGen 웹페이지(https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹의 전사체 데이터셋을 기반으로 추정할 수 있다.
2. 축삭 수송을 시각화하기 위한 뉴런 선택
   1. 스트레인 MTS1161에서 운동 뉴런 DA9의 RAB-3를 시각화합니다( 그림 1 참조). 다른 축삭 화물, 특히 저발현 단백질의 경우 CenGen 웹페이지를 사용하여 분석된 단백질의 발현 수준이 가장 높은 뉴런을 식별합니다.
      참고: CenGen 프로젝트(cengen.org)는 예쁜꼬마선충 신경계의 302개 뉴런 모두를 포괄하는 대규모 전사체 데이터 세트를 기반으로 선충의 많은 뉴런에서 관심 단백질의 발현 수준을 추정할 수 있는 훌륭한 온라인 리소스를 제공합니다(^12,13).

2. 웜 처리 및 이미징 준비

1. 20 ° C에서 선충 성장 매체 플레이트에 파종 된 박테리아 (균주 : OP50)의 잔디밭에서 선충을 유지하고 이미징을 위해 성인이 될 때까지 1 일까지 성장시킵니다.
   참고: 다양한 축삭 화물, 뉴런 클래스 및 유기체 14,15,16,17,18-선충에서 유충 단계 L4 또는 성충 1일 이후의 선충류에서 일관되게 노화에 따라 수송 속도가 감소하기 때문에 정의된 연령 단계에서 축삭 수송을 측정하는 것이 중요하므로 대부분의 논문에서 사용되어 비교를 위한 가장 큰 데이터 세트를 제공합니다.
2. 살아있는 세포 이미징을 위한 선충 준비: 실체 현미경으로 모든 후속 단계를 수행하여 벌레를 시각화하고 처리합니다.
   1. 백금 와이어 픽을 사용하여 선충을 0.5mM 레바미솔 방울로 옮기고 방울에서 20분 동안 선충을 배양합니다.
   2. 레바미솔 방울에서 10-20개의 선충을 헤어 픽을 사용하여 유리 슬라이드의 유리 슬라이드에 10% 아가로스(M9 배지에 용해된) 패치의 M9 배지 12μL 방울에 조심스럽게 장착합니다. 10% 아가로스 패치를 만드는 방법에 대한 자세한 절차는 S.Niwa⁷의 프로토콜을 참조하십시오.
      알림: 동물이 저산소증으로 고통받기 시작하기 전에 슬라이드당 몇 마리의 동물만 이미지화되기 때문에 적은 수의 선충을 장착하는 것으로 충분합니다.
   3. 물방울 (22mm x 22mm 또는 18mm x 18mm) 위에 커버 슬립을 놓습니다. DA9 축삭돌기에서 이미징 전송을 위해 축삭을 커버 슬립에 가깝게 배치합니다. 이렇게하려면 덮개 슬립을 한천 패치 위에 놓은 후 45 ° 회전하여 동물을 뒤로 굴립니다.
   4. 커버 슬립과 유리 슬라이드 사이의 공간을 바셀린과 같은 점성 젤로 밀봉합니다. 이렇게 하면 아가로스 패치가 건조되는 것을 방지할 수 있으며, 이로 인해 선충이 이미징 필드 밖으로 떠내려갈 수 있습니다.
      알림: 동물을 가능한 한 부드럽게 대하는 것이 중요합니다. 레바미솔의 농도가 너무 높거나 웜에 대한 물리적 손상은 축삭 수송을 손상시킬 수 있습니다. 이미징 세션 중 꼬리의 가벼운 경련은 동물이 건강한 상태를 유지하고 있다는 좋은 신호입니다. 동물은 건강을 유지하며 이미징 세션 후에도 아가로스 패치에서 회복할 수 있습니다.

3. 살아있는 세포 현미경 검사

참고: 정확한 획득 파라미터 값은 현미경마다 다를 수 있습니다. 그러나 각 획득 파라미터에 대한 추세는 사용되는 현미경과 독립적이어야 합니다. 이 프로토콜에는 표백을 위한 별도의 레이저 라인이 장착된 스핀 디스크 컨포칼 현미경이 사용되었습니다(현미경에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조). 녹색 형광은 488nm 레이저에 의해 여기되었고 방출은 ET525/36 방출 필터에 의해 필터링되었습니다. 표백은 488nm 레이저 라인을 사용하여 수행하였다.

1. 실내 온도 또는 온도 제어 stage를 사용할 수 있는 경우 일정한 온도로 설정되어 있습니다. 선충의 경우 온도를 20 °C로 설정하십시오.
2. 슬라이드를 장착하고 4x-20x 배율의 대물 렌즈를 사용하여 슬라이드에서 선충을 찾고 위치를 기억합니다. 이미지 획득을 위해 63x 배율 렌즈로 전환합니다.
3. 초기 획득 파라미터를 확인하기 위해 단일 이미지를 가져옵니다. 수집 소프트웨어의 강도 히스토그램을 사용하여 시야의 신호 강도를 추적하십시오. 강도 값은 카메라가 감지할 수 있는 최대 신호의 가장 낮은 1/3을 커버해야 합니다. 픽셀 채도를 피하십시오. 신호 강도가 너무 낮으면 excitation laser의 강도를 높이십시오.
   알림: 너무 높은 여기 레이저 강도는 타임랩스 동안 형광 단백질을 표백하므로 사용하지 마십시오.
4. 여기에서 획득 파라미터와 단계를 변경하여 형광 신호 검출을 최적화하십시오.
   1. 표백 단계 구현: 표백 단계를 위해 488nm 레이저(출력:15mW) 라인을 사용하여 분석할 축삭 영역을 표백합니다. 최소 90%의 표백 효율을 목표로 합니다. 표백 단계 전과 후의 영역의 신호 강도를 비교하여 표백 효율을 결정합니다.
      참고: 표백은 정지 입자에서 파생되는 신호와 배경에 있는 단백질의 세포질 분획에서 파생되는 신호를 낮춰 움직이는 입자의 신호를 향상시킵니다. 시냅스 소포 전구체의 RAB-3와 같은 막질 화물은 세포질 분율이 낮아 표백 단계가 세포질 배경에서 수송 패키지의 신호를 약간만 개선합니다(그림 2A, D). 그러나 표백은 더 먼 거리에 걸쳐 개별 운송 이벤트를 추적하는 것을 개선하고 일시 중지 시간을 정량화할 수 있습니다(그림 2A).
   2. 비닝: 2 x 2 비닝을 사용하여 개별 전송 이벤트의 신호 강도를 향상시킵니다. 범주화는 픽셀 배열을 하나의 더 큰 픽셀로 결합합니다. 이렇게 하면 공간 분해능은 감소하지만 개별 전송 이벤트의 신호 강도는 향상되며 특히 희미한 입자에 유용합니다(그림 2B, D).
   3. 노출 시간: 노출 시간을 향상시켜 신호 강도를 향상시킵니다. 노출 시간을 늘리면 샘플의 신호 강도가 향상되어 전송 이벤트에 대한 시간적 해상도를 낮추는 비용이 듭니다. 이 실험에서는 연속된 시점(100-500ms 노출 시간) 사이에 300ms에서 700ms의 시간 해상도를 사용하여 RAB-3의 개별 전송 이벤트를 따릅니다. (그림 2C,D)
5. 타임랩스 기록: 단백질의 신호 강도와 개별 수송 이벤트의 빈도에 따라 최소 1-3분의 타임랩스를 사용합니다. 시간 경과가 기록되면 다음 동물로 이동합니다. 기록된 동물이 건강한 상태인지 확인하기 위해 슬라이드에 있는 동물을 30분 이상 이미지화해서는 안 됩니다.
   알림: 녹음 중 동물의 꼬리가 약간 경련하는 것은 동물이 아직 살아 있다는 표시입니다.

4. 축삭돌기 수송 데이터 분석

참고: 후속 이미지 분석 단계에서는 ImageJ/Fiji¹⁹ 를 사용합니다. 피지는 모든 일반 현미경 소프트웨어 패키지로 데이터를 읽을 수 있습니다.

1. 카이모그래프 생성
   1. 데이터 가져오기: 타임랩스 데이터 파일을 피지로 가져옵니다. 데이터를 피지로 가져올 수 없는 경우 소프트웨어 패키지에서 시간 기록을 tiff 파일로 내보내고 나중에 피지로 로드합니다.
   2. 드리프트 보정: 이미지 획득 중에 동물/축삭 세그먼트가 움직이거나 약간 떠내려가는지 확인합니다. StackReg²⁰ 플러그인을 실행하여 동물의 움직임이나 표류를 수정합니다. 플러그인을 실행할 때 강체 변환을 선택합니다.
   3. kymograph의 수동 생성: 자세한 단계별 절차는 그림 3에 나와 있습니다. 드리프트 보정된 동영상을 사용하여 카이모그래프를 생성합니다. Segmented Line 도구를 사용하고 세그먼트 라인 아이콘을 마우스 왼쪽 버튼으로 두 번 클릭하여 분석할 axon 세그먼트를 따라 선을 그려 축삭 직경과 일치하도록 선 너비를 조정합니다. ImageJ/Fiji 플러그인 Kymoreslicewide를 실행하여 키모그래프를 생성하고 매개변수 설정에서 선 너비에 걸쳐 최대 강도 값을 활용합니다.
      참고: 선 그리기 방향의 일관성을 유지하면(예: 항상 원위 축삭에 근접 또는 역방향) 카이모그래프에서 이동 방향을 추적하는 것이 간단해집니다.
2. 수송 매개변수 분석
   1. 후속 단계에 따라 kymograph에서 전송 매개변수(이벤트 번호, 속도, 실행 길이 및 일시 중지 시간)를 계산합니다.
      1. 카이모그래프에서 전송 이벤트 추적: 직선 도구를 사용하여 카이모그래프에서 개별 전송 이벤트를 추적합니다. 각 라인을 ROI 매니저에 저장하고 카이모그래프에서 모든 전송 이벤트를 추적합니다. ImageJ/Fiji에서 Area, Bounding rectangle, Mean gray value, Feret's diameter와 같은 측정 매개변수를 선택합니다.
      2. 전송 매개변수 계산: 결과 테이블을 스프레드시트에 붙여넣고 결과 섹션의 다음 열을 사용하여 계산합니다.
         런 길이: 너비(픽셀)에 카메라 해상도(예: x μm/pxl)를 곱하여 런 길이(μm)를 결정합니다.
         속도: 실행 길이/실행 시간. 이동 이벤트의 지속 시간(초)을 결정하려면 높이(픽셀 단위)에 연속된 시점 사이의 획득 시간(예: x s/pixel)을 곱합니다.
         일시 중지 시간: 속도가 0인 두 개의 연속 이동 사이의 실행 시간입니다.
         이벤트 수: 총 이벤트를 kymograph의 총 길이로 정규화하여 분당 이벤트 수 및 축삭 길이 세그먼트를 결정할 수 있습니다. 이벤트는 전행성 및 역행 수송 이벤트로 더 분류할 수 있습니다. 각 이동 이벤트의 방향을 결정하려면 페렛 각도 도구를 사용합니다. 초기에 근위부에서 원위부까지 분절된 선을 그려 생성된 카이모그래프의 전방 수송 이벤트가 오른쪽에서 왼쪽을 가리키는 카이모그래프에서 90°< 페렛 각도는 전방을 나타내고 >90°는 역행 이벤트를 나타내며, 그렇지 않으면 그 반대가 됩니다.

Results

모델 시스템 및 측정 절차 개요
시냅스 소포 전구체의 축삭 수송을 시각화하기 위해 내인성 GFP 표지 RAB-3를 추적했습니다. 여기서 우리는 최근에 생성된 GFP::Flip-on::RAB-3 균주⁶을 사용하며, 여기서 세포 특이적 프로모터(glr-4p) 아래의 재조합 효소 Flippase의 발현이 DA9 운동 뉴런에서 내인성 RAB-3를 표지합니다. DA9은 양극성 운동 뉴런으로, 세포체는 항문에 가까운 복부 쪽의 동물 뒤쪽에 위치합니다(그림 1A). 그것은 복부 신경 삭수를 따라 앞쪽으로 달리는 짧은 수상돌기와 뒤쪽으로 뻗어 있는 긴 축삭돌기를 포함하고 있으며, commissure를 형성 한 다음 등쪽 신경삭을 따라 앞쪽으로 뻗어 있으며, 여기서 등쪽 근육과 성병 뉴런 22,23,24를 신경 자극하는 시냅스를 형성합니다. 우리는 비시냅스 영역에서 축삭 수송을 시각화합니다. 대부분의 수송 이벤트는 단일 초점면으로 캡처할 수 있습니다(그림 1A). 초기 광표백 단계는 이 영역에서 종종 일시 중지되는 경향이 있는 이 영역에서 고정 소포의 배경을 줄이기 위해 구현됩니다(그림 1B). 타임랩스 비디오는 3분 동안 녹화되고 비시냅스 영역을 따라 RAB-3 신호는 카이모그래프에 플롯되어 개별 전송 이벤트를 추출합니다(그림 1C).

축삭 수송 시각화를 최적화하기 위한 획득 파라미터 조정
많은 내인성 형광 태그 단백질의 낮은 신호 강도를 극복하려면 현미경의 획득 매개변수를 최적화해야 합니다. 운송 이벤트의 강력한 정량화를 위해 개별 운송 이벤트의 신호 강도는 세포질 배경 또는 일시 중지된 정지 화물에서 가능한 한 밝아야 합니다. 시냅스 소포 전구체는 종종 별개의 소포 풀에서 비시냅스 영역에서 일시 중지하는데, 이는 새로운 유입 소포의 감지를 방해하고 그들의 수송 흔적을 추적하기 어렵게 만든다⁷.

단일 초기 형광 표백 단계는 소포 풀에서 파생되는 형광 신호를 크게 줄여 새로 들어오는 소포의 움직임 감지를 향상시킬 수 있습니다(그림 2A). 표백 단계는 세포질 배경 강도를 통해 RAB-3 소포가 이동하는 신호를 약간만 향상시켰는데, 이는 RAB-3의 세포질 분율이 매우 낮기 때문일 수 있습니다(그림 2D).

비닝을 사용하면 픽셀 배열을 단일 픽셀로 결합하여 개별 전송 이벤트의 백그라운드에서 신호를 개선하기 위한 추가 계층이 제공됩니다. 2 x 2 비닝은 공간 해상도(여기서는 108.33nm/픽셀에서 216.7nm/픽셀로)를 절반으로 줄이며, 이는 여전히 개별 RAB-3 수송 입자를 추적하기에 충분하지만(그림 2B) 개별 소포의 신호 강도를 크게 향상시킵니다(그림 2D). 매우 높은 공간 해상도가 필요하지 않는 한, 비닝(binning)을 적용하여 다른 많은 축삭 화물을 시각화할 수도 있습니다.

다음으로, 노출 시간의 변화가 단일 전송 이벤트의 신호 강도를 어떻게 향상시킬 수 있는지 물었습니다. 특히 후속 이미징 시점 사이에 700ms로 최대 500ms의 노출 시간이 여전히 시냅스 소포 전구체를 추적할 수 있는 시간적 해상도를 제공한다는 것을 보여주기 위해 분석에 노출 시간을 포함시켰습니다(그림 2C,D).

Fiji를 이용한 kymographs 생성 및 분석
kymograph를 생성하고 그림 3의 단계에 따라 개별 운송 이벤트를 분석합니다.

그림 1: 내인성 형광 RAB-3의 축삭 수송을 시각화하기 위한 모델 시스템의 개요. (A) 상부 패널: 후방-전방 및 복부-등쪽 축이 표시된 선충의 개요. 운동 뉴런 DA9는 파란색으로 표시되어 있습니다. 중간 패널: 표시된 DA9 구획화와 함께 상단 패널에 표시된 상자 영역을 확대합니다. En passant 시냅스는 녹색으로 표시되며 *는 항문을 나타냅니다. 축삭돌기는 외음부를 통과할 때까지 등쪽 신경삭에서 계속됩니다. 빨간색 상자는 비시냅스 영역의 영역을 나타냅니다. 하단 패널: 단일 초점면에서 근위 축삭돌기에서 RAB-3로 표지된 내인성 GFP의 컨포칼 현미경 이미지. 대부분의 RAB-3 신호는 시냅스 영역에 군집되어 있지만, 비시냅스 영역에는 RAB-3이 더 오래 일시 중지되는 소포 싱크가 있습니다. 비통시 영역은 빨간색 상자로 표시됩니다. 스케일: 20 μm. (B) 축삭 수송을 시각화하기 위한 타임랩스 기록의 대표 이미지. 고정 입자에 대한 개별 수송 입자의 추적성을 향상시키기 위해 비시냅스 영역은 처음에 광표백됩니다. 보라색 상자 영역의 아래쪽 패널은 전방(주황색 화살촉) 및 역행(파란색 화살촉) 이동 이벤트의 예를 보여줍니다. 패널은 위에서 아래로 연속된 시간점을 나타냅니다. (C) (B)의 타임랩스 기록은 카이모그래프(위치에 대한 시간의 2D 표현)로 표시되었습니다. 대각선은 기울기가 속도를 나타내는 이동 이벤트를 나타냅니다. 수직선은 정지된 이벤트를 나타냅니다. 보라색 상자는 (B)에도 표시되는 수송 이벤트를 강조하기 위한 kymograph의 확대이며, 전방(주황색) 및 역행(파란색) 수송 이벤트가 추적됩니다. 파선은 일시 중지 이벤트를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 내인성 축삭 화물의 시각화를 개선하기 위해 획득 단계 및 매개변수 최적화. 내인성 GFP::RAB-3는 컨포칼 회전 디스크 현미경에서 단일 초점면의 이미지를 촬영하여 DA9 축삭의 비시냅스 영역에서 시각화되었습니다. 카이모그래프를 획득하여 전방(오른쪽에서 왼쪽으로) 및 역행(왼쪽에서 오른쪽) 방향(A-C)으로 개별 운송 이벤트를 시각화했습니다. (A) 카이모그래프는 (왼쪽 카이모그래프) 또는 통합된 표백 단계가 있는 RAB3 수송 이벤트를 보여줍니다. bleaching 단계는 연속적인 transport 이벤트(주황색 화살촉) 사이의 일시 중지 이벤트(노란색 화살표 머리로 표시)의 시각화를 개선합니다. (B) 2 x 2 비닝을 구현하면 희미한 RAB3 전송 이벤트의 신호 강도를 개선하는 데 도움이 됩니다. 이미지는 300ms 노출 시간에 획득되었으며 (C) 노출 시간의 점진적인 증가(맨 왼쪽의 100ms에서 맨 오른쪽의 500ms로)는 개별 전송 이벤트의 신호 강도를 개선하는 데 도움이 됩니다. 이미지는 2 x 2 비닝에서 초기 광표백 단계를 사용하여 획득했습니다. 모든 카이모그래프는 총 3분의 지속 시간을 표시하며 동일한 배율로 그려지므로 연속된 이미징 포인트 사이의 시간 경과가 길어 획득 시간 포인트가 적은 카이모그래프는 카이모그래프의 총 길이가 더 짧습니다. (D) (A-C)의 카이모그래프에서 배경 형광을 뺀 후 수송 이벤트당 신호 강도의 정량화. 비닝(binning)과 사진 표백제(photo bleach) 단계는 300ms 노출 시간에 획득되었습니다. 100 ms_(n events = 27 in n_animals= 2), 200 ms_{(n events} = 30 in n_animals = 2), 300 ms_(n events = 88 in n_animals = 6), 500 ms_(n events = 12 in n_animals= 1), 300 ms without (w.o.) binning (n_events = 31 in n_animals= 3), 300 ms with (w) binning (n_events = 88 in n_animals= 6) 및 300 ms 동안 n events를 사용한 통계적 비교, 표백이 있는 2 x 2 비닝(n_이벤트= n 이벤트 = 88 in n_동물 = 6) 및 표백 없음. 각 데이터 포인트는 무작위로 선택된 추적을 따라 단일 시점에서 배경(축삭의 세포질) 빼기 후 개별 RAB-3 수송 이벤트의 신호 강도를 나타냅니다. 노출 시간은 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 비교한 다음 Dunn의 다중 비교를 사용하여 비교했으며, 비닝 및 사진 표백은 쌍별 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 비교했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: kymograph를 생성하고 개별 운송 이벤트를 측정하는 단계별 절차. (A) 비디오 녹화를 피지에 로드한 후 분할 선 도구를 사용하여 분석할 축삭 세그먼트의 길이를 따라 선을 추적합니다. (B) kymograph(오른쪽 패널)는 왼쪽 패널에 표시된 매개변수와 함께 Kymoreslicewide 플러그인을 사용하여 생성됩니다. (C) 개별 운송 이벤트는 리니어 라인 툴로 추적되고 ROI 매니저에 저장됩니다. 오른쪽 패널에는 결과 테이블을 생성하는 데 사용되는 측정 설정이 표시됩니다. (D) 표의 결과는 운송 매개변수를 계산하는 데 사용됩니다. 상자는 프로토콜의 methods 섹션에 설명된 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

방법과 대체 방법의 한계
이 프로토콜에서는 시냅스 소포 전구체와 관련된 내인성 태그가 지정된 RAB-3의 축삭 수송을 시각화하기 위해 획득 매개변수를 최적화했습니다. RAB-3를 시각화하기 위해 최근에 발표된 FLIP-on::GFP::RAB-3 균주⁶을 사용하고 세포 특이적 프로모터(glr-4p)²⁵ 아래에서 재조합 효소 Flippase를 발현했습니다. 이 전략을 통해 단일 GFP 형광단으로 RAB-3를 표지할 수 있습니다. RAB-3는 시냅스 소포 전구체에서 고도로 발현되고 강하게 농축되어 개별 수송 이벤트가 세포질 배경에서 파생된 낮은 신호에 비해 밝은 신호 강도를 갖기 때문에 상대적으로 시각화하기 쉽습니다. 다른 축삭 단백질은 수송 이벤트를 시각화할 수 있도록 현미경 설정 외부에서 추가적인 최적화 전략이 필요할 수 있습니다. 특히 저발현 단백질의 경우 split-GFP 시스템은 훌륭한 대안을 제공합니다. 이 체계에서는, GFP₁₁는 관심사의 단백질의 내인성 자리로 삽입되고 GFP_1-10는 세포 특정한 발기인에서 표현됩니다. 이 시스템의 가장 큰 장점은 유전체학적으로 삽입해야 하는 DNA 복구 템플릿(약 70개의 뉴클레오티드)의 크기가 작다는 것인데, 이는 전체 형광 태그(^26,27)의 ORF를 삽입하는 것에 비해 상동 재조합을 더 효율적으로 만듭니다. 그것의 작은 크기 때문에, 다수 GFP₁₁ 파편은 단백질 당 재편성한 GFP fluorophores의 수를 증폭시키고 이렇게 내인성 단백질의 형광 신호 및 이렇게 수송 포장²⁸의 강화하는 내인성 단백질에 삽입될 수 있다.

split-GFP 또는 GFP 접근법으로 단백질을 라벨링하는 것 외에도, 최근에 비교된 그들의 광화학적 특성에 대한 고유한 장점과 단점이 있는 다른 유전적으로 인코딩된 형광단을 활용할 수 있습니다²⁹. 더욱이, 더 많은 광안정성 특성을 가진 화학 형광단은 HALO 또는 SNAP 태그(³⁰)로 관심 단백질을 내인성 라벨링하여 사용할 수 있습니다.

특히 전체 축삭돌기에 걸쳐 풍부한 세포질 단백질의 경우 조건부 표지 접근법이 필요할 수 있습니다. 최근에는 새로운 합성 스펙트럼 단백질만 시각화하기 위해 시간적으로 제어되는 라벨링을 사용하여 형광 현미경으로 이러한 화물인 내인성 스펙트럼을 시각화했습니다. 단일 뉴런 분해능을 사용한 조건부 라벨링을 위해, 우리는 재조합효소의 열-충격 기반 발현을 split-GFP 시스템³¹과 결합했다.

연구 목표가 세포소기관의 수송을 이해하는 것을 목표로 하는 경우, 세포소기관과 관련된 단백질 영역의 발현은 전장 단백질을 외부적으로 발현하는 대안을 제공할 수 있습니다.

프로토콜의 중요한 단계
예상되는 발현 수준에 따라 단백질의 시각화를 최적화하고 최적의 라벨링 전략을 선택하기 위한 신중한 준비는 내인성 라벨링 단백질의 성공적인 시각화를 위해 특히 중요합니다. 많은 뉴런에서 대부분의 단백질에 대한 발현 수준은 Cengen¹³의 전사체 데이터 세트를 기반으로 추정할 수 있습니다. 저발현 또는 세포질 단백질에 대한 transport 이벤트의 예상되는 낮은 신호 강도는 fluorophore의 여러 복사본을 첨부하여 개선할 수 있습니다. 그러나 모든 라벨링 실험에서는 태그가 지정된 단백질의 기능을 방해하지 않도록 주의해야 합니다. 해당 돌연변이에 대해 알려진 표현형이 있는 경우 라벨링이 이 표현형을 생성하지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. 알려진 표현형이 없는 경우 사례별로 다른 대체 접근 방식이 필요합니다.

축삭 수송 사건의 이미징에서 중요한 단계는 동물의 건강 상태입니다. 동물은 이미징 중뿐만 아니라 이미지 준비를 위해 가능한 한 부드럽게 다루어야 합니다(예: 마비된 동물을 이송하기 위해 금속 와이어 대신 헤어쑤개를 사용, 마비제에서의 배양 시간 최소화, 광독성을 피하기 위해 이미징 시간 최소화).

수정 및 문제 해결
우리는 내인성 단백질의 축삭 수송 시각화를 최적화하려고 하지만, 획득 매개변수에 대한 최적화 전략은 이소성 발현 단백질에도 적용할 수 있습니다. 특히 내인성 발현 수준이 너무 낮아 수송 이벤트를 시각화할 수 없는 경우, 단백질의 이소성 발현이 대안이 될 수 있습니다.

내인성 표지된 단백질의 강한 신호 강도에도 불구하고 수송 이벤트를 기록할 수 없는 경우, 동물은 건강하지 않은 상태에 있을 수 있습니다. 이는 보다 부드러운 준비 절차에 따라 현미경 검사를 위해 동물을 준비함으로써 해결할 수 있습니다(예: 마비제의 배양 시간 단축). 또는 전송 이벤트가 드물게 발생할 수 있으며 3분 비디오 녹화가 이벤트를 캡처하기에 충분하지 않을 수 있습니다. 희귀 수송 사건 포착은 비디오 녹화 기간을 늘리거나, 영상화된 동물의 수를 늘리거나, 수송 사건이 더 빈번할 수 있는 다른 발달 단계에서 동물을 이미징함으로써 최적화할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아가로스	시그마-알드리치	A9539
커버 슬립(22mm x 22mm, No1); 골드 씰 커버 유리	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
현미경: Nikon Ti2 도립 현미경, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS 카메라, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA 오일 이멀젼 대물렌즈, ET525/36 방출 필터가 있는 488nm의 Nikon 광자극 스캐너	Nikon		Spinning Disc 컨포칼 현미경
NIS-elements AR	Nikon Nikon		Ti2용 소프트웨어
일반 사전 세척 현미경 슬라이드	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)MTS1161		CGC (https://cgc.umn.edu/)에 입금됩니다.