Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

요약

이 논문은 살아있는 선충에서 단일 뉴런 해상도로 내인성 표지된 화물의 축삭 수송을 시각화하기 위한 형광 현미경 획득 매개변수의 최적화에 대해 설명합니다.

초록

축삭 수송은 신경 세포체의 합성 부위에서 축삭의 목적지까지 축삭 단백질을 전달하기 위한 전제 조건입니다. 결과적으로, 축삭 수송의 손실은 신경 세포의 성장과 기능을 손상시킵니다. 따라서 축삭 수송을 연구하면 신경 세포 생물학에 대한 이해가 향상됩니다. 최근 CRISPR Cas9 게놈 편집이 개선됨에 따라 축삭 화물의 내인성 라벨링이 가능해짐에 따라 이소성 발현 기반 운송 시각화를 넘어서게 되었습니다. 그러나 내인성 라벨링은 종종 낮은 신호 강도를 희생시키며 강력한 데이터를 얻기 위해 최적화 전략이 필요합니다. 여기에서는 획득 매개변수와 확산 세포질 배경에 대한 내인성 라벨링 화물의 신호를 개선하기 위한 표백 접근 방식에 대해 논의하여 축삭 이동의 시각화를 최적화하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 당사는 녹색 형광 단백질(GFP) 태그가 지정된 RAB-3로 표지된 시냅스 소포 전구체(SVP)의 시각화를 최적화하기 위해 프로토콜을 적용하여 획득 매개변수를 미세 조정하여 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 내인성으로 표지된 축삭 화물의 분석을 개선할 수 있는 방법을 강조합니다.

서론

일생 동안 뉴런은 세포체에서 단백질, 지질 및 기타 분자를 축삭의 최종 목적지까지 전달하기 위해 축삭 수송에 의존합니다. 결과적으로, 축삭 수송의 손상은 신경 기능의 상실과 관련이 있으며 종종 신경 퇴행성 질환의 병리학에 관여합니다 ^1,2. 따라서 축삭 수송의 기초가 되는 메커니즘을 이해하는 것은 매우 중요합니다.

축삭 수송에 대한 수십 년간의 연구는 이 수송을 매개하는 분자 기계, 그 구성 및 조절 메커니즘에 대한 많은 중요한 통찰력을 보여주었습니다. 장거리 축삭 수송은 미세소관 세포골격에서 발생하며, 이는 일반적으로 축삭돌기³에서 플러스 엔드로 배향되는 부분적으로 겹치는 미세소관 중합체로 구성됩니다. 결과적으로, 전행성 수송은 미세소관의 플러스 말단, 키네신으로 걸어가는 운동 단백질에 의해 매개되는 반면, 역행 수송은 마이너스 말단 방향의 다인 모터에 의존합니다. 수송의 많은 측면이 밝혀졌지만, 많은 축삭 단백질의 경우 여전히 불분명한 상태로 남아 있으며, 어떻게 수송 기계에 적재되는지, 개별 수송 패키지가 어떻게 구성되는지, 그리고....

프로토콜

살아있는 세포 이미징을 위해 선충을 유지하고 준비하는 방법에 대한 자세한 프로토콜은 S.Niwa ⁷의 작업을 참조하십시오.

1. 웜 변형 생성

선충 균주를 생성하는 것 외에도 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)⁸ 에는 웹 페이지에서 직접 얻을 수 있는 내인성 형광 태그 단백질을 가진 선충 균주 컬렉션이 증가하고 있습니다.

1. fluorescence labeling strategy의 선택
   1. rab-3(ox699) 대립유전자⁶을 포함하는 선충 균주 MTS1161를 사용하여 DA9 운동 뉴런에서 RAB-3으로 표지된 내인성 GFP를 시각화합니다(균주는 CGC에 증착됨). 다른 축삭 단백질을 시각화하려면 Mello Lab⁹의 CRISPR Cas9 편집 프로토콜을 사용하여 내인성 태그 단백질로 선충 균주를 생성합니다.
      참고: MTS1161는 GFP 태그^6....

결과

모델 시스템 및 측정 절차 개요
시냅스 소포 전구체의 축삭 수송을 시각화하기 위해 내인성 GFP 표지 RAB-3를 추적했습니다. 여기서 우리는 최근에 생성된 GFP::Flip-on::RAB-3 균주⁶을 사용하며, 여기서 세포 특이적 프로모터(glr-4p) 아래의 재조합 효소 Flippase의 발현이 DA9 운동 뉴런에서 내인성 RAB-3를 표지합니다. DA9은 양극성 운동 뉴런으로, 세포체는 항문에 가까운 복부 쪽의 동물 뒤쪽에 위치합니다(그림 1A). 그것은 복부 신경 삭수를 따라 앞쪽으로 달리는 짧은 수상돌기와 뒤쪽으로 뻗어 있는 긴 축삭돌기를 포함하고 있으며, commissure를 형성 한 다음 등쪽 신경삭을 따라 앞쪽으로 뻗어 있으며, 여기서 등쪽 근육과 성병 뉴런 22,23,24를 신경 자극하는 시냅스를 형성합니다.

토론

방법과 대체 방법의 한계
이 프로토콜에서는 시냅스 소포 전구체와 관련된 내인성 태그가 지정된 RAB-3의 축삭 수송을 시각화하기 위해 획득 매개변수를 최적화했습니다. RAB-3를 시각화하기 위해 최근에 발표된 FLIP-on::GFP::RAB-3 균주⁶을 사용하고 세포 특이적 프로모터(glr-4p)²⁵ 아래에서 재조합 효소 Flippase를 발현했습니다. 이 전략을 통해 단일 GFP 형광단으로 RAB-3를 표지할 수 있습니다. RAB-3는 시냅스 소포 전구체에서 고도로 발현되고 강하게 농축되어 개별 수송 이벤트가 세포질 배경에서 파생된 낮은 신호에 비해 밝은 신호 강도를 갖기 때문에 상대적으로 시각화하기 쉽습니다. 다른 축삭 단백질은 수송 이벤트를 시각화할 수 있도록 현미경 설정 외부에서 추가적인 최적화 전략이 필요할 수 있습니다. 특히 저발현 단백질.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	시그마-알드리치	A9539
커버 슬립(22mm x 22mm, No1); 골드 씰 커버 유리	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
현미경: Nikon Ti2 도립 현미경, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS 카메라, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA 오일 이멀젼 대물렌즈, ET525/36 방출 필터가 있는 488nm의 Nikon 광자극 스캐너	Nikon		Spinning Disc 컨포칼 현미경
NIS-elements AR	Nikon Nikon		Ti2용 소프트웨어
일반 사전 세척 현미경 슬라이드	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)MTS1161		CGC (https://cgc.umn.edu/)에 입금됩니다.