Method Article

B형 간염 바이러스 DNA의 실시간 중합효소 연쇄 반응 기반 검출 및 정량

DOI:

10.3791/66249

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December 15th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
13B BlackBio Biotech India Limited

In This Article

Summary

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B형 간염 바이러스(HBV) DNA의 실시간 중합효소연쇄반응(PCR) 기반 검출 및 정량화는 B형 간염 바이러스 감염을 진단하고 모니터링하기 위한 민감하고 정확한 방법입니다. 여기에서는 HBV DNA 검출 및 샘플의 바이러스 부하 측정을 위한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

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B형 간염 바이러스(HBV)는 전 세계적으로 간 질환의 중요한 원인입니다. 급성 또는 만성 감염으로 이어질 수 있어 치명적인 간경변과 간암에 매우 취약합니다. 혈액 내 HBV DNA의 정확한 검출 및 정량화는 HBV 감염을 진단하고 모니터링하는 데 필수적입니다. HBV DNA를 검출하는 가장 일반적인 방법은 Real-Time PCR로, 바이러스를 검출하고 바이러스 부하를 평가하여 항바이러스 요법에 대한 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 IVD 마킹 Real-Time PCR 기반 키트를 사용하여 인간 혈청 또는 혈장에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 키트는 HBV 게놈의 고도로 보존된 핵심 영역을 표적으로 하는 프라이머와 프로브를 사용하며 모든 HBV 유전자형(A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J)을 정확하게 정량화할 수 있습니다. 이 키트에는 가능한 PCR 억제를 모니터링하기 위한 내인성 내부 대조군도 포함되어 있습니다. 이 분석은 40 사이클 동안 실행되며 컷오프는 38 Ct입니다. 임상 샘플에서 HBV DNA의 정량을 위해 5가지 정량 표준물질 세트가 키트와 함께 제공됩니다. 이 표준물질에는 핵산 검사를 위한 HBV DNA에 대한 4번째 WHO 국제 표준(NIBSC 코드 10/266)에 따라 보정된 HBV 특이적 DNA의 알려진 농도가 포함되어 있습니다. 이 표준물질은 HBV 특이적 DNA 증폭의 기능을 검증하고 표준 곡선을 생성하는 데 사용되며, 이를 통해 샘플에서 HBV DNA를 정량화할 수 있습니다. PCR 키트를 사용하여 2.5IU/mL의 낮은 HBV DNA를 검출했습니다. 이 키트의 높은 감도와 재현성은 임상 실험실에서 강력한 도구가 되어 의료 전문가가 HBV 감염을 효과적으로 진단하고 관리하는 데 도움이 됩니다.

Introduction

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B형 간염 바이러스(HBV)는 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus) 속과 헤파드나비리과(Hepadnaviridae family)1에 속하는 부분 이중 가닥 DNA 바이러스입니다. 이는 평생 지속되는 만성 감염을 유발할 수 있으며, 간경변증과 간세포암으로 이어질 수 있다 2,3,4. 세계보건기구(WHO)에 따르면 2019년 약 2억 9,600만 명의 인구가 만성 B형 간염 감염을 앓고 있었으며 매년 150만 명이 새로 감염되었습니다5.

혈청 또는 혈장 샘플에서 HBV DNA의 식별 및 측정은 진행 중인 B형 간염 감염자를 검출하고, 항바이러스 치료의 효능을 평가하고, 치료 성공 확률을 예측하는 데 유용한 방법입니다 6,7,8,9,10,11.

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Protocol

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이 연구는 인간 참가자나 임상 샘플을 포함하지 않았습니다. 유일하게 사용된 생물학적 물질은 핵산 검사용 HBV DNA에 대한 4번째 WHO 국제 표준(NIBSC 코드 10/266)이었습니다. 이 표준은 개인 정보나 식별 가능한 데이터를 포함하지 않는 공개적으로 사용 가능한 참조 자료입니다. 따라서 이 연구에는 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다.

1. DNA 추출

  1. 인간 혈청 또는 혈장 샘플에서 바이러스 DNA를 추출합니다. 추출된 DNA를 PCR에서 추가로 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
    참고: DNA 추출을 위한 혈청 또는 혈장의 권장 부피는 500μL이고 용출량은 50μL입니다. 본 연구에서는 바이러스 핵산 추출 키트(Table of Materials)를 이용하여 바이러스 DNA를 추출하였다.

2. Real-time PCR

  1. PCR을 시작하기 전에 Real-Time PCR 키트의 모든 시약(표 1)을 실온(RT, 15-25°C)에서 해동합니다. 해동되면 적당한 속도로 10초 동안 펄스 와류로 구....

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Results

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인간 혈장/혈청에서 HBV DNA를 검출하고 정량화하기 위한 워크플로우의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. HBV와 IC에 대한 표준 2(PC로 사용됨) 및 NTC의 증폭 플롯이 그림 2에 나와 있습니다. 그림 3 은 HBV 양성 검체, HBV 음성 검체 및 PCR 억제 검체의 증폭 곡선을 보여줍니다. NIBSC 코드 10/266에 대한 증폭 곡선, HBV에 대한 Ct 값 및 마이크로리터당 국제 단위(IU/μL)의 HBV 농도는 그림 4에 나와 있습니다. 키트의 5가지 HBV 표준물질 모두의 HBV 표적에 대한 증폭 곡선과 이에 대한 대표적인 표준 곡선이 그림 5에 나와 있습니다. 표준 곡선의 기울기는 -3.361,R2 는 0.99996, 효율.......

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Discussion

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NIBSC 코드 10/266은 공급업체 정보21에 따라 0.5mL의 뉴클레아제가 없는 물에서 재구성할 때 9,55,000IU/mL의 단위가 할당되었습니다. 이것은 고부하 HBV 양성 샘플로 간주될 수 있습니다. 이 연구에 사용된 바이러스 부하 키트로 측정된 HBV 바이러스 양은 6,65,900IU/mL였습니다(그림 4). DNA 추출 키트의 DNA 추출 효율이 100%가 아니기 때문에 정제 과정에서 일부 DNA가 손실되는 경우가 많습니다. 키트에 의해 측정된 바이러스 부하가 시약(NIBSC 코드 10/266) 공급업체가 할당한 값보다 약간 낮지만, 두 값 간의 log10 차이가 컷오프 값(0.5)22보다 작은 0.157에 불과하기 때문에 데이터는 여전히 만족스럽습니다.

이 프로토콜에 사용된 바이러스 로드 키트는 매우 견고하며

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Disclosures

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저자는 이 연구에 사용된 HBV 바이러스 로드 키트의 제조업체인 Kilpest India Limited와 관련이 있습니다.

Acknowledgements

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기술 지원을 해주신 Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita 및 Shikha에게 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4th B형 간염 바이러스 DNA에 대한 WHO 국제 표준NIBSC NIBSC코드: 10/266B형 간염 바이러스(HBV) DNA에 대한 WHO 국제 표준 4차인 NIBSC 코드 10/266은 HBV 핵산 증폭 기술(NAT)에 사용되는 2차 참조 시약의 보정에 사용하기 위한 것입니다.
ABI real-time PCR 기계 써모피셔 사이언티픽ABI 7500; QuantStudio 5이것은 실시간 PCR 기계입니다 
HBV, HCV 및 HIV 멀티플렉스 14/198NIBSCNIBSC 코드: 14/198이것은 B형 간염 (HBV), C형 간염 (HCV) 및 인간 면역결핍 바이러스-1 (HIV-1)을 포함하는 NAT 분석을 위한 매우 낮은 양성 삼중 시약입니다
QIAGEN 실시간 PCR 기계QiagenRotor-Gene Q이것은 실시간 PCR 기계입니다 
TRUPCR HBV 바이러스 로드 키트 Kilpest India Limited3B294이것은 HBV DNA 검출 및 바이러스 부하 측정을 위해 이 연구에 사용된 실시간 PCR 기반 키트입니다
TRUPCR 바이러스 핵산 추출 키트Kilpest India Limited3B214이것은 NIBSC:10/266 및 NIBSC:14/198에서 HBV 바이러스 DNA를 추출하는 데 사용되는 DNA 추출 키트입니다
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and....

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