이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.
이 논문에서
요약
초록
제브라피시는 놀라운 심장 재생 능력으로 유명한 흥미로운 모델 유기체입니다. 생체 내에서 수축하는 심장을 연구하는 것은 부상에 대한 반응으로 인한 구조적 및 기능적 변화에 대한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다. 그러나 제브라피시 심장의 고해상도 및 고속 4차원(4D, 3D 공간 + 1D 시간) 이미지를 획득하여 심장 구조와 수축성을 평가하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이러한 맥락에서 이러한 기술적 한계를 극복하기 위해 자체 광시트 현미경(LSM)과 맞춤형 컴퓨터 분석이 사용됩니다. LSM 시스템 구축, 후향적 동기화, 단일 세포 추적 및 사용자 지향 분석을 포함하는 이 전략을 통해 형질전환 Tg(myl7:nucGFP) 제브라피시 유충의 단일 세포 분해능에서 전체 심장의 미세 구조 및 수축 기능을 조사할 수 있습니다. 또한 저분자 화합물의 미세 주입을 통합하여 정확하고 제어된 방식으로 심장 손상을 유도할 수 있습니다. 전반적으로, 이 프레임워크를 통해 생리학적 및 병태생리학적 변화뿐만 아니라 심장 형태 형성 및 재생 중 단일 세포 수준의 지역 역학을 추적할 수 있습니다.
서론
제브라피시(Danio rerio)는 광학적 투명성, 유전적 다루기 쉬움 및 재생 능력 1,2,3,4로 인해 심장 발달, 생리학 및 수리를 연구하는 데 널리 사용되는 모델 유기체입니다. 심근경색 시 구조적, 기능적 변화가 심장 박출과 혈류역학에 영향을 미치지만, 기술적 한계로 인해 높은 시공간 해상도로 심장 재생 중 동적 과정을 조사하는 능력이 계속 방해를 받고 있습니다. 예를 들어, 컨포칼 현미경과 같은 기존의 이미징 방법은 동적 변화를 포착하고 여러 심장 주기 동안 심장 수축 기능을 평가하기 위한 이미징 깊이, 시간적 해상도 또는 광독성 측면에서 한계가 있다5.
광시트 현미경은 심장의 심실과 심방을 가로질러 레이저를 빠르게 스윕하여 향상된 시공간 해상도와 무시할 수 있는 광표백 및 광독성 효과로 상세한 이미지를 달성함으로써 이러한 문제를 성공적으로 해결하는 최첨단 이미징 방법을 나타냅니다 6,7,8,9,10,11.
이 프로토콜은 LSM 시스템 구축, 4D 이미지 재구성, 3D 세포 추적 및 대화형 분석을 포함하는 포괄적인 이미징 전략을 도입하여 여러 심장 주기 동안 심장 전체에 걸쳐 심근세포의 역학을 캡처하고 분석합니다12. 맞춤형 이미징 시스템과 계산 방법론을 통해 형질전환 Tg(myl7:nucGFP) 제브라피시 유충의 단일 세포 수준에서 심근 미세 구조 및 수축 기능을 추적할 수 있습니다. 또한, 약물 유발 심장 손상 및 후속 재생을 평가하기 위해 미세 주입을 사용하여 저분자 화합물을 배아에 전달했습니다. 이 전체론적 전략은 심장 발달 및 재생 중 단세포 수준에서 심근의 구조적, 기능적, 기계적 특성을 생체 내에서 조사할 수 있는 진입점을 제공합니다.
프로토콜
이 연구에 대한 승인은 프로토콜 번호 #20-07에 따라 댈러스에 있는 텍사스 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 부여되었습니다. 본 연구에는 Tg(myl7:nucGFP) 형질전환 제브라피시 유충12 가 사용되었다. 모든 데이터 수집 및 이미지 후처리는 오픈 소스 소프트웨어 또는 연구 또는 교육용 라이선스가 있는 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. 리소스는 합리적인 요청에 따라 저자로부터 사용할 수 있습니다.
1. 제브라피시 사육 및 배아 미세주입
타이밍 : 2 일
- 표준 관리 및 번식 절차를 통해 성인 제브라피시를 유지하고 번식시킵니다. 자세한 방법은 이전 보고서13을 참조하십시오.
- 확립된 프로토콜14에 따라 미세 주입을 수행합니다. 본 연구에서는 1-2 세포(접합체) 단계에서 미세주입을 수행하였다.
참고: 효과적인 미세 주입을 위해 이 단계를 정확하게 식별하고 발달 일관성을 보장하는 것이 중요합니다. 단세포 단계에서는 노른자 위에 작은 돔이 형성되며 이 단계는 일반적으로 약 12분 동안 지속됩니다. 2세포 단계로 진행되면, 인접한 두 개의 돔이 보이고, 이 단계는 수정 후 약 45분 동안 지속된다15. 시스템 구축에 대한 보다 상세한 정보는 다른 보고서 또는 프로토콜 12,16,17에서 찾을 수 있다.
2. 제브라피시 배아/유충 준비 및 장착
타이밍 : 7 일
- 색소 형성을 방지하기 위해 수정 후 1일(dpf)에 배아를 0.2mM 1-Phenyl-2-thiourea(PTU)( 재료 표 참조)가 있는 E3 물로 옮깁니다.
- LSM 이미징이 이루어질 때까지 매일 PTU가 있는 깨끗한 E3 물로 배지를 교체합니다.
- 실체 현미경으로 배아 또는 유충을 이미지화하여 0에서 7dpf 사이의 원하는 시점에서 발달을 기록합니다.
- LSM 시스템12 아래에 제브라피시 유충을 매립하기 위해 내경이 2mm인 분할된 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 튜브를 준비합니다.
알림: FEP 튜브는 물과 같은 주변 매체와 매우 유사한 굴절률 일치 물질로 샘플을 고정하는 데 사용됩니다. - 3dpf에서 시작하여 물고기를 150mg/L 트리케인(MS-222) 용액( 재료 표 참조)으로 옮겨 이미징 전에 물고기를 고정시킵니다.
- 150mg/L 트리카인으로 0.8% 저융점 아가로스를 준비하고 실온으로 냉각된 후 이송 피펫을 사용하여 마취된 물고기를 아가로스로 옮깁니다18.
- 다른 이송 피펫을 사용하여 FEP 튜브에 아가로스가 있는 물고기를 장착합니다(그림 1).
참고: 발달 중인 배아의 최소 스트레스를 확인하기 위해 심박수와 같은 심장 활동에 대한 고정 전후 검사를 현미경 관찰 하에 수행했습니다. 이러한 평가는 트리케인 마취 전과 후의 유의미한 차이를 확인하는 것을 목표로 했습니다. 부종과 같은 심장 구조의 불규칙성에 대한 피부와 근육계의 추가 검사도 고정 후 수행할 수 있습니다. 트리카인의 농도는 심장 영상에서도 중요한 역할을 하므로19 150mg/L 농도의 트리카인 용액은 이 프로젝트에서 제브라피시 유충의 수축 이미징에 활용되었습니다. 현재의 후향적 동기화를 통해 불규칙한 심장 박동을 해결할 수 있지만(20), 제브라피쉬의 심장 부정맥 및 장기 이미징의 4D 이미징을 위한 포괄적인 솔루션은 아직 개발 중입니다.
3. 라이트 시트 이미징 시스템 설정 및 구성
타이밍 : 3-14 일
- 473nm 및 532nm와 같은 특정 파장에서 연속파 다이오드 펌핑 고체(DPSS) 레이저 시스템을 광원으로 사용하여 원통형 렌즈를 기반으로 하는 사내 LSM 시스템을 구축합니다(그림 2A).
- 이미지 시퀀스를 캡처하기 위해 병진 샘플 스테이지, 광시트 조명 및 sCMOS 카메라 노출의 동기화를 위해 LabVIEW ( 재료 표 참조) 컨트롤 코드를 사용자 정의하십시오.
참고: 시스템 구성에 대한 자세한 정보는 다른 보고서 또는 프로토콜 12,16,17에서 찾을 수 있습니다. 우리는 연구 그룹이 시스템 구축 중에 광학 이미징에 대한 확립된 전문 지식을 보유한 실험실과 협력할 기회를 모색할 것을 권장합니다.
4. 제브라피시 이미징 준비 및 데이터 수집
타이밍 : 1 일
- LSM 시스템 공간 분해능을 보정하고 형광 비드를 측정하여 다양한 깊이에서 불투명도 변화를 최소화합니다.
- 먼저, 0.8% 저융점 아가로스를 이용하여 직경 0.53μm의 형광 비드(재료 표 참조)를 1:1.5 x 10-5의 농도로 희석하고, 용액을 분할된 FEP 튜브로 옮긴다.
- 둘째, LSM 시스템을 사용하여 비드를 이미지화하고 전체 샘플에 걸쳐 점 확산 함수(PSF)를 측정하여 공간 분해능 및 시스템 정렬12을 검증합니다.
참고: 이 시스템에서 FWHM(Full Width at Half Maximum)에 대한 대표 결과 분석은 각각 1.26 ± 0.15 및 2.48 ± 0.15 μm(n = 60 비드)의 측면 및 축 분해능을 나타냅니다. 이는 이미징 깊이 전체에 걸쳐 일관된 공간 해상도를 시사합니다.
- 제브라피시 유충이 장착된 FEP 튜브를 6축(x, y, z, 피치, 요 및 롤) 전동 샘플 스테이지에 단단히 부착하고 튜브를 E3 물로 채워진 샘플 챔버에 담그십시오. 난황낭에 의한 빛의 산란을 피하고 심장의 위치를 더 잘 찾으려면 제브라피시 유충을 회전시켜 복부 쪽에서 이미지를 촬영합니다(그림 2B). 이 경우 캡처된 대부분의 이미지에는 심실과 심방이 모두 포함됩니다(그림 2C).
참고: 현재 이미징 절차는 일반적으로 물고기당 1시간 미만으로 지속되고 통제된 실내 온도 환경에서 수행되었다는 점을 감안할 때 챔버 온도 제어 및 산소 수준 조절은 이 프로젝트에서 선택 사항으로 간주됩니다. 그러나 장기간의 타임 랩스 이미징 연구, 특히 발달 과정에 초점을 맞춘 연구의 경우 제브라피쉬의 생리학적 환경을 보장하고 잠재적인 발달 이상을 방지하기 위해 샘플 챔버 내에서 27°C에서 지속적으로 온도를 모니터링하고 조절하는 것이 좋습니다. - 전동식 샘플 스테이지를 워크스테이션에 연결하고 원하는 이동 모드를 포함하여 필요한 모든 매개변수를 구성합니다.
- sCMOS 카메라와 워크스테이션 간의 연결을 설정합니다. 5ms의 노출 시간 및 원하는 관심 영역과 같은 모든 필수 설정을 조정합니다.
- 맞춤 설정된 LabVIEW 컨트롤 프로그램 내에서 이미지 시퀀스 및 프레임 수를 설정합니다.
- 레이저의 전원을 켜고 샘플의 LSM 이미징을 시작합니다. 모든 이미지 시퀀스가 성공적으로 기록될 때까지 프로세스를 유지합니다.
- 300프레임을 2D 이미지 시퀀스로 기록하여 200프레임/초의 프레임 속도로 유충의 3-5회 심장 주기를 다룹니다. 기록은 라이트 시트에 의해 조명되는 선택면에서 심장 수축을 포착합니다.
- 광시트 조명을 가로질러 1μm의 단계 크기로 유충을 이동하여 샘플을 가상으로 절단합니다.
참고: 샘플 스테이지의 단계 크기는 Nyquist-Shannon 샘플링 정리12에 따라 광시트 시스템의 축 분해능을 기반으로 설정해야 합니다. - 7단계를 반복하여 심장 전체가 덮일 때까지 새 샘플 슬라이스의 다른 이미지 시퀀스를 기록합니다. 일반적으로 1μm의 단계 크기를 가진 100-200개의 이미지 시퀀스는 제브라피시 유충의 전체 심장을 커버합니다(그림 2D).
참고 : 4.7-4.9 단계는 LabVIEW 프로그램에 의해 제어되며 LSM 시스템에 의해 자동으로 수행됩니다 (그림 3). 생성되는 이미지 데이터의 방대한 양을 감안할 때 이미지 시퀀스에 표준화된 명명 규칙을 사용하는 것이 좋습니다. 예를 들어, "z-1", "z-2" 등과 같은 이름의 폴더를 지정하여 다양한 이미지 시퀀스에서 데이터를 분류할 수 있습니다. 각 시퀀스 내에서 이미지의 이름은 고유한 시점을 나타내기 위해 순차적으로(예: "1", "2" 등) 지정되어야 합니다. 물고기를 장착하고, 이미징 각도를 조정하고, 제브라피시 유충 한 마리에 대한 모든 데이터를 수집하는 데 걸리는 총 시간은 약 1시간입니다.
5. 병렬 계산을 통한 4D 이미지 재구성
타이밍 : 1 일
참고: 우리 그룹에서 개발한 4D 재구성 알고리즘과 샘플 데이터는 공개적으로 액세스할 수 있습니다21. 이 방법을 사용하면 이전 단계에서 수집된 이미지 시퀀스에서 4D 심장 이미지를 재구성할 수 있습니다(표 1).
- MATLAB에서 파일 test_Parallel.m을 엽니다(재료 목차 참조). 원시 이미지 시퀀스가 저장되는 폴더 위치를 변수 "baseDir"에 지정합니다.
- 변수 "numOfSlice"에 총 이미지 시퀀스 수(일반적으로 100-150)를 할당하고 변수 "numOfImage"에 각 시퀀스의 이미지 수(일반적으로 300-500)를 할당합니다.
- 제브라피시 심장의 중간 평면을 보여주는 이미지 시퀀스를 검사합니다(예: 총 101개의 시퀀스 중 51번째 시퀀스). 이 시퀀스에서 첫 번째 수축기와 네 번째 수축기의 프레임 번호를 식별하고 변수 systolicPoint_1st 와 systolicPoint_4th에 할당합니다.
- 실행을 클릭하여 프로세스를 시작합니다.
참고: 각 이미지 시퀀스의 심장 주기 길이는 먼저 MATLAB 프로그램에서 서로 다른 시점의 이미지 간 유사성(차이의 제곱합) 비교를 통해 식별됩니다. 이어서, 심장 주기는 모든 이미지 시퀀스로부터의 주기 길이의 평균을 사용하여 추정될 것이다. 다음으로, 서로 다른 축 위치에 있는 이미지 시퀀스의 시작점은 첫 번째 이미지 시퀀스에서 마지막 이미지 시퀀스까지의 이미지 유사성의 반복적인 비교를 통해 프로그램에 의해 정렬됩니다. - 출력 폴더에서 결과를 확인합니다. 프로그램은 이미지를 타임스탬프가 있는 ".tif" 파일로 저장합니다. 각 ".tif" 파일은 특정 시점의 3D 하트 이미지입니다. 두 3D 이미지 사이의 시간 간격은 설정된 노출 시간과 같습니다.
참고: 이전 단계에서 획득한 이미지를 재구성하여 4D(3D 공간 + 1D 측두) 심장 수축을 묘사합니다. 후향적 동기화 중에 고처리량 조사에 대한 숙련도를 높이기 위해 이 접근 방식은 MATLAB 병렬 연산 툴박스를 통해 여러 CPU 코어를 활용하고 영상을 gpuArray 형식으로 변환하여 GPU에서 동시 계산 연산을 가능하게 합니다.
6. 3D 세포 분할 및 세포 추적
타이밍 : 1 일
- 3DeeCellTracker 패키지( 자료 표 참조)를 다운로드하고 Python 환경설정 22.
- ITK-SNAP 주석 소프트웨어23 ( 재료 표 참조)을 다운로드하고 이를 사용하여 심실 이완기와 심실 수축기에서 각각 하나씩 선택한 두 시점의 3D 심장 이미지에 수동으로 라벨을 지정하여 훈련 및 검증 데이터 세트를 생성합니다.
알림: 다른 라벨링 소프트웨어도 적용할 수 있습니다. - Python에서 3DeeCellTracker 훈련 프로그램을 실행하고 TrainingUNet3D 함수에서 noise_level(이 경우 100), folder_path 및 모델 매개변수를 초기화하여 미리 정의된 3D U-Net 모델을 설정합니다.
- MATLAB에서 imageDimConverter.m 프로그램을 사용하여 훈련 데이터셋과 검증 데이터셋을 불러오기에 적합한 형식으로 변환하고 이름을 바꿉니다.
- Python에서 trainer.load_dataset() 및 trainer.draw_dataset() 함수를 사용하여 학습 및 유효성 검사 데이터 세트를 로드합니다.
- Python에서 3DeeCellTracker 추적 프로그램의 첫 번째 부분을 실행하고 매개변수를 초기화합니다.
참고: 여기에는 이미지 크기를 특성화하기 위한 이미지 파라미터 정의, 셀 분할에 적용되는 기계 학습 모델을 선택하기 위한 분할 파라미터, 셀 정합에 사용되는 사전 훈련된 심층 신경망 모델을 선택하기 위한 추적 파라미터 정의가 포함됩니다. 처음 사용하는 경우 세포 분할을 위해 U-Net 모델을 사용하고 세포 정합을 위해 FFN+ PR-GLS를 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계에서 자동으로 생성될 폴더에 데이터, 모델 및 결과를 저장해야 합니다. - MATLAB에서 imageDimConverter.m 프로그램을 사용하여 모든 3차원 하트 영상을 적절한 형식으로 변환하고 이름을 바꾼 다음 마지막 단계에서 만든 데이터 폴더로 전송합니다.
- Python에서 3DeeCellTracker 프로그램의 두 번째 부분을 실행하여 세그멘테이션을 시작합니다.
- 첫 번째 3D 이미지가 분할되면 분할 결과를 원시 이미지와 비교하고 잘못된 분할이 발견되면 수동 수정을 수행합니다. 수정된 세그멘테이션을 생성된 "/manual_vol1" 폴더로 이동합니다.
- Python에서 3DeeCellTracker 프로그램의 세 번째 부분을 실행하여 모든 이미지를 분할합니다.
- Amira( 재료 목차 참조)를 사용하여 추적된 셀의 위치를 해당 원시 이미지와 비교하여 추적 결과에 대한 시각적 평가를 수행합니다. 테스트 결과가 만족스럽지 않은 경우 6.6단계부터 절차를 다시 시작하고 분할 또는 셀 정합을 위해 대체 기계 학습 모델을 사용한 다음 추적 프로세스를 다시 시작합니다.
참고: 분할 후 셀 레이블의 데이터는 기본적으로 8비트 이미지(0-255)로 저장되며, 이는 셀 분류를 위한 레이블로 256개의 스케일만 제공됨을 의미합니다. 추가 클래스가 필요한 경우 이 문제를 해결하기 위한 두 가지 솔루션이 있습니다. 한 가지 해결책은 추적 프로그램에서 셀 레이블의 데이터 형식을 16비트 이미지로 설정하는 것인데, 이 경우 처리 시간이 기하급수적으로 증가하여 현재 2일 이상 소요됩니다. 다른 해결책은 "separateTrackingResults.py" 프로그램을 사용하여 셀 레이블을 사후 처리하는 것인데, 이 프로그램은 물리적 위치에 따라 동일한 레이블을 가진 셀을 분리하고 각 셀에 다른 레이블을 할당합니다. 이 경우 이 프로세스는 약 10분이 소요됩니다.
7. 가상 현실 모드에서 심장 수축도 분석
타이밍 : 1 일
- 이전 단계에서 세포 추적 결과를 얻습니다.
- 수동으로 데이터를 검증하고 모든 볼륨에서 일관된 이미지 강도를 가진 셀을 선택합니다(약 600개 셀 중 약 500개 셀).
- cellLabelsToObj.ipynb 스크립트(21)를 이용하여, 3D 슬라이서 소프트웨어(24)(재료 표 참조)를 통해 각각의 개별 셀에 대한 표면 메쉬를 생성하고, 각 셀에 고유한 색상 코드를 할당한다.
- 단일 시점의 모든 셀로 구성된 각 3D 모델을 셀 레이블을 설명하는 .mtl 파일과 함께 여러 하위 오브젝트로 구성된 단일 .obj 파일로 내보냅니다.
- 확장 현실에 사용되는 개발 엔진인 교육용 라이선스를 사용하여 모델을 Unity로 임포트합니다.
- C#으로 작성된 함수로 구성된 사용자 지정 스크립트를 모델 및 사용자 인터페이스 요소에 적용하여 4D 시각화 및 대화형 분석을 가능하게 합니다. 7.7단계에 따라 VR 상호 작용을 수행합니다.
- 다음 기능을 사용하여 가상 현실(VR)에서 모델과 상호 작용합니다(그림 4).
- 셀 선택: 한 번에 최대 두 개의 셀을 선택하고 궤적, 속도, 부피, 표면적 및 상대 거리를 봅니다.
- 시점 선택: 데이터에서 특정 시점을 선택하여 선택한 세포의 출력을 분석합니다(예: 이완기 중 t = 0ms 또는 수축기 중 t = 200ms).
- 시간 일시 중지: 동적 모델을 고정하여 선택한 셀과 해당 출력에 초점을 맞춥니다.
- 대비: 모델에서 선택한 셀과 주변 셀 사이의 대비를 조절합니다.
결과
현재 프로토콜은 제브라피시 준비 및 미세 주입, 광시트 이미징 및 4D 이미지 재구성, 세포 추적 및 VR 상호 작용의 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 다 자란 제브라피시를 짝짓기로 하고, 수정란을 채취하고, 제안된 실험에 필요한 대로 미세주입을 수행했습니다(그림 1). 이 단계는 심장 발달 및 재생 연구에서 제브라피시 응용 분야를 탐색하기 위한 진입점을 제공하며, 후속 이미징 및 분석에서도 중요한 역할을 합니다. 수축하는 심장은 맞춤형 LSM 시스템을 사용하여 다양한 단계(3dpf에서 7dpf까지)에서 이미징되었으며 z축을 따라 이미지 시퀀스를 정렬하여 4D 제브라피시 심장 모델을 재구성했습니다(그림 2 및 그림 3). 이러한 모델은 심층적인 표현형 특성 분석을 위한 기초를 제공하며 발달 타임라인에 걸쳐 심장 형태 및 기능의 역학을 밝히는 데 중추적인 역할을 합니다. 제브라피시 심장의 개별 세포를 추적하고 맞춤형 VR 플랫폼을 사용하여 움직임과 상호 작용을 정량화했습니다. 선택된 세포의 속도 및 상대적 거리 변화도 심방과 심실의 한 심장 주기 동안 비교하여 국소 수축성을 평가하고 국소 변형을 조사했습니다(그림 4). 국소 변형률은 관심 영역에서 인접한 두 심근 세포 사이의 변위 변화에 기초하여 결정되었습니다. 분획 단축(FS) 및 박출률(EF)은 공표된 문헌25에 기술된 방법론을 사용하여 추정하였다. FS 및 EF에 대한 방정식은 다음과 같습니다.
여기서 Dd 및 Ds 는 각각 이완기 말기 및 수축기 말기 단계의 심실 직경(서로 다른 심실 세포 사이의 거리로 측정되는 짧은 축)이고, Vd 및 Vs 는 각각 이완기 말기 및 수축기 말기 단계의 심실 용적(심실의 장축 및 단축 직경으로 계산됨)입니다.
종합적으로 이러한 결과는 제브라피시 모델에서 체적 이미징 및 데이터 해석을 용이하게 하기 위해 생리학과 공학을 모두 통합하는 새로운 전략을 보여주며, 심장 형태 형성 및 역학의 탐구를 발전시킬 수 있는 큰 가능성을 가지고 있습니다.
그림 1: 제브라피시 알 채취 및 미세주입 공정. 이 과정에는 성인 제브라피쉬를 짝짓기하고, 수정란을 수집하고, 선택적 미세 주입을 수행하는 것이 포함됩니다. 미세주입 중에 미리 당겨진 유리 피펫에 원하는 재료가 로드됩니다. 수정란은 아가로스 몰드 슬릿 내에서 직선으로 정렬되고 바늘에 수직으로 위치합니다. 미세 주입은 난자와 바늘 끝 모두에 대한 지속적인 현미경 관찰하에 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 광시트 이미징 프로세스 및 4D 이미지 재구성. (A) 사내 광시트 이미징 시스템 구조의 개략도. CL: 원통형 렌즈. EO: 여기 대물렌즈. 해야 할 일: 탐지 목표. TL: 튜브 렌즈. FL: 필터. CAM: sCMOS 카메라. (B) FEP 튜브에 장착되고 아가로스에 의해 매립된 제브라피쉬의 개략도. (C) 4dpf 제브라피시 유충에서 캡처한 원시 2D 이미지 시퀀스. 각 프레임의 왼쪽 상단에 있는 시계는 수축기 말기에서 시작되는 심장 단계를 나타냅니다. (D) 4D 제브라피시 이미지 정합을 위한 소급 동기화의 그림. 이미지 시퀀스는 z축을 따라 특정 깊이에서 연속 기록을 나타냅니다. 이미지 시퀀스의 각 프레임은 빨간색 점으로 표시되며, 이완기 말기에서 수축기 말기까지의 시작 및 종료 단계가 노란색 상자에 강조 표시됩니다. (E) 2D 이미지 시퀀스에서 4D로 재구성된 심장 모델. Dpf: 수정 후 일수. 이 그림은 Zhang et al.12에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: LabVIEW 제어판. (A) 제어판에서 사용되는 설정에는 레이저, 카메라, 이미지 경로 및 모터 패턴의 구성이 포함됩니다. (B) LabVIEW 프로그램으로 캡처한 원시 제브라피시 심장 이미지의 예. 기준자: 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 세포 추적 및 VR 상호 작용은 제브라피시 심장 수축력을 밝히는 데 도움이 됩니다. (A) 3 dpf에서 Tg(myl7:nucGFP) 제브라피시 심장의 추적 세포. (B) VR 플랫폼은 사용자에게 4D 제브라피시 심장 모형의 몰입형 보기 및 대화형 경험을 제공하여 사용자 정의 분석을 통해 시간 경과에 따른 심장 기능을 시각화할 수 있습니다. (C) VR 플랫폼에서 측정값을 수집한 후 3dpf와 7dpf에서 선택한 세포 사이의 한 심장 주기 동안 속도 및 상대 거리 변화를 비교했습니다. 처음 두 그림은 5개의 심실 세포와 5개의 심방 세포의 평균 속도 변화를 나타내고, 다른 그림은 3개의 세포 그룹, 즉 2개의 심실 세포, 심실 세포와 심방 세포, 2개의 심방 세포 사이의 상대적인 거리 변화를 보여줍니다. (D) 3 dpf 및 7 dpf 제브라피시 심장의 심장 기능 평가. 제브라피시 심장에서 총 370개의 세포가 3dpf로 추적되었고, 580개의 세포가 7dpf에서 추적되었습니다. 이 그림은 Zhang et al.12에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | 사용법 | 식별자 | |
| 맞춤형 프로그램 및 알고리즘 | |||
| PSF.m (영문) | 형광 비드의 FWHM 측정 결과에서 PSF를 계산합니다. | MATLAB 프로그램 | |
| 4D 제브라피시 Imaging.vi | LSM 시스템의 하드웨어를 제어하고 동기화합니다. | LabVIEW 프로그램 | |
| test_Parallel.m 등 | 2D 이미지 시퀀스에서 4D 이미지를 재구성합니다. | MATLAB 프로그램 | |
| imageDimConverter.m | 셀 추적을 위해 이미지 데이터를 지정된 형식으로 변환합니다. | MATLAB 프로그램 | |
| separateTrackingResults.py | 동일한 레이블을 가진 세포를 분리하기 위한 세포 추적 결과를 사후 처리합니다. | 파이썬 프로그램 | |
| cellTracking_All.py | 모든 볼륨에서 일관된 이미지 강도를 가진 셀을 선택합니다. | 파이썬 프로그램 | |
| cellLabelsToObj.ipynb (셀 레이블스ToObj.ipynb) | 3D 슬라이서를 통해 각 개별 셀에 대한 표면 메시를 생성합니다. | 파이썬 프로그램 | |
| DynamicHeartModel.cs 등 | VR 환경을 만들고 개체와 상호 작용합니다. | C# 프로그램 | |
| 맞춤형 하드웨어 설계 | |||
| 3D 프린팅 시료 챔버 | 침수 대물렌즈와 함께 사용합니다. | 솔리드 웍스 설계 | |
| 3D 프린팅 시료 홀더 | 샘플 스테이지에 적응하고 샘플을 유지합니다. | 솔리드 웍스 설계 | |
표 1: 사용자 정의 자원 테이블. 샘플 코드와 데이터는 Zenodo21에 업로드됩니다.
토론
제브라피시 모델과 공학적 방법의 통합은 심근 경색, 부정맥 및 선천성 심장 결함의 생체 내 탐색을 위한 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 광학적 투명성, 재생 능력, 인간과의 유전적 및 생리학적 유사성을 활용하여 제브라피시 배아와 유충은 연구에 광범위하게 활용되고 있습니다 1,2,4. 광시트 이미징의 우수한 시공간 해상도, 최소 광손상 및 광학 절편 기능은 제브라피시 유충 12,26,27,28의 심장 형태 및 수축 기능에 대한 4D 조사에서 차별화되었습니다. 이 프로토콜은 광시트 이미징, 후향적 동기화, 3D 세포 추적 및 정량적 평가를 위한 대화형 가상 현실(VR) 플랫폼을 통합하는 포괄적인 접근 방식을 도입합니다. 심장 수축을 포착 및 재구성하고, 세포 역학을 추적 및 정량화하고, 심장 발달 및 재생 중 구조적, 기능적, 기계적 변화를 평가할 수 있는 진입점을 제공합니다. 이 방법은 또한 세포 이질성 및 세포 간 상호 작용을 조사하기 위해 다양한 세포 유형 및 계통을 추적하기 위해 다중 채널 형광 이미징을 통해 강화될 수 있습니다. 제브라피시 모델이 포유류 시스템과 이분법적으로 구분되고 급성 모델로서의 한계가 있어 신중한 고려가 필요하지만, 유전공학의 발전은 인간의 질병 상태와 더 유사한 유전자 변형 제브라피시 계통의 개발을 가능하게 하여 제브라피시 연구에서 도출된 결과의 중개 가치를 향상시킬 수 있다29.
주기적인 심장 주기의 가정을 기반으로 하는 이 후향적 동기화는 수축하는 제브라피시 심장의 광시트 이미지를 재구성하는 데 사용됩니다. 광시트 이미징에서 이 방법을 구현하면 초당 200개 이상의 부피로 수축하는 심장을 시각화하고 분석할 수 있습니다. 현재 분석에서 많은 양의 데이터로 인해 발생하는 문제를 해결하기 위해 멀티 코어 CPU 및 GPU를 사용한 병렬 계산이 사용되어 이미지 재구성 효율성이 10배 이상 향상되었습니다. 후향적 동기화 동안, 심근세포는 각 심장 박동과 함께 기준선 위치로 돌아가는 것으로 전제되었습니다. 이 가정은 그림 4C에서 볼 수 있듯이 제브라피시26에서 볼 수 있는 심장 박동의 낮은 변동성을 감안할 때 비교적 안전하지만, 모든 생물학적 뉘앙스를 설명하지 못할 수 있는 단순화로 남아 있습니다. 압축 형광 및 라이트 필드 현미경과 같은 이미징의 혁신은 슬라이스 중복을 줄임으로써 이러한 가정에서 비롯된 영향을 완화할 수 있습니다.
복잡한 4D 심장 모델에서 심층 분석을 가능하게 하기 위해 3DeeCellTracker 기반 세포 분할과 사용자 주도 조사를 위한 VR 플랫폼을 모두 포함하는 계산 프레임워크가 개발되었습니다. 높은 효율성과 상호 작용 조작을 포함한 이 프레임워크의 고유한 기능을 통해 세포 속도 변화를 정량화하고, 세포 간 상호 작용을 조사하고, 분획 단축, 박출률 및 국소 변형률과 같은 지역 및 전체 심근 역학을 평가할 수 있습니다30(그림 4). 기존 문헌 내에서 7 dpf에서 제브라피시 심장 기능에 대한 사전 평가가 없다는 점이 지적됩니다. 그러나, 다른 연구자들에 의해 제공된 3 dpf에서의 데이터와 비교했을 때, 현재의 결과는 3 dpf에서 7 dpf까지의 간격 동안 박출률(EF)과 분획 단축(FS)의 감소에 대한 이전의 징후와 일치한다25,31. 이러한 분석 방법은 제브라피시 심장 손상 모델12,25에서 심장 역학을 설명할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.
VR 기술 및 소프트웨어에는 입체 비전 및 세포 위치 자동 등록과 같은 고유한 기능이 포함되어 있기 때문에 이 플랫폼을 사용하면 특정 세포를 선택하고 심장 주기 전반에 걸쳐 궤적을 분석하는 몰입감 있고 간소화된 방법을 사용할 수 있습니다. VR의 활용은 세포 분할 및 주석과 같은 복잡한 작업을 더 높은 효율성과 정확도로 수행하는 직관적인 방법을 제공합니다 32,33,34. 또한 여러 사용자가 크고 복잡한 데이터 세트(34)에서 함께 작업할 때 고유한 도구를 활용할 수 있도록 지원합니다. VR을 장시간 사용하면 어지럼증과 같은 부작용이 발생할 수 있지만 향상된 인체공학적 디자인과 테더링되지 않은 헤드셋으로 완화할 수 있습니다. 또한 복잡한 생물학적 구조를 실시간으로 렌더링하는 데 필요한 상당한 컴퓨팅 성능을 해결하기 위해 즉각적인 처리를 위해 소프트웨어를 최적화하고 클라우드 기반 컴퓨팅 솔루션을 활용하면 복잡한 시각화를 관리하는 시스템의 기능을 향상시킬 수 있습니다.
하드웨어 장치와 계산 능력이 계속 발전함에 따라 이 전략은 세포 및 조직 수준 모두에서 심근의 심장 부정맥을 조사하도록 확장될 수 있으며, 궁극적으로 심장 형태 형성의 근본적인 메커니즘을 밝히고 치료 개입의 개발을 발전시킬 수 있는 잠재력을 보유할 수 있습니다.
공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
형질전환 제브라피시를 아낌없이 나눠주신 보스턴 아동병원의 캐롤라인 번스 박사님께 감사드립니다. UT Dallas에서 제브라피시를 기르는 데 도움을 주신 Ms. Elizabeth Ibanez에게 감사드립니다. 또한 UT Dallas의 D-인큐베이터 회원들이 제공한 모든 건설적인 의견에 감사드립니다. 이 연구는 NIH R00HL148493(Y.D.), R01HL162635(Y.D.) 및 UT Dallas STARS 프로그램(Y.D.)의 지원을 받았습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models | |||
| Tg(myl7:nucGFP) 형질전환 제브라피쉬 | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| 소프트웨어 및 알고리즘 | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a, | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | , The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f, | |
| 3DeeCellTracker | , Chentao Wen, et al.15 | v0.5.2 | |
| 유니티 | 유니티 소프트웨어 Inc. | 2020.3.2f1 | |
| 아미라 | 써모 피셔 사이언티픽 | 2021.2 | |
| 3D 슬라이서 | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
| Light-sheet system | |||
| cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X 조명 목표 | Nikon | MRH00045 | |
| 20X 감지 목표 | 올림푸스 | 1-U2M585 | |
| sCMOS 카메라 | 하마 마츠 | C13440-20CU | |
| 전동 XYZ 스테이지 | Thorlabs | PT3 / M-Z8 | |
| 2 축 틸트 스테이지 | Thorlabs | GN2 / M | |
| 회전 스테퍼 모터 | Pololu | 1474 | |
| 형광 구슬 | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS 레이저 | 레이저글로우 | R471003GX | |
| 532nm DPSS 레이저 | 레이저글로우 | R531003FX | |
| microinjector 및 진공 펌프 | |||
| microinjector | WPI | PV850 | |
| 진공 펌프 | Welch | 2522B-01 | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | |
| 젤 로딩용 모세관 팁 | Bio-Rad | 2239912 | |
| 가상 현실 하드웨어 | |||
| VR 헤드셋 | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L PTU 솔루션 | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 작업 솔루션 | - | - | |
| <강한>1% 아가로스 | - | - | |
| 저용융 아가로스 | Thermo Fisher | 16520050 | |
| 탈이온수 | - | - | |
| <강>10g/L 트리카인 원료 솔루션 | |||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| 탈 이온수 | - | ||
| 중탄산 나트륨 | 시그마 - Aldrich | S6014 | |
| < strong > 150mg / L Tricaine 작업 솔루션 < / strong > | |||
| 10g / L Tricaine 원액 | - | ||
| 탈 이온화 물 | - | ||
| -< 강> 60X E3 원액 < / 강> | |||
| 염화나트륨 | 실험실 동물 자원 센터 (LARC), 텍사스 대학교 댈러스 | NaCl | |
| 염화 칼륨 | - | KCL | |
| 염화칼슘 이수화물 | - | CaCL2 < / sub>x 2H 2 < / sub>O | |
| 황산 마그네슘 헵타하이드레이트 | - | MgSO4 x 7H2O | |
| RO 물 | - | - | |
| 1X E3 작업 솔루션 | |||
| 60X E3 재고 솔루션 | Lab Animal Resource Center(LARC), The University of Texas at Dallas | - | |
| RO 물 | - | ||
| 1 % 메틸렌 블루 (선택 사항) | - | C16H18ClN3S |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
