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방법 논문

생쥐의 비행 행동을 유도하기 위한 수정된 공포 조건화

1.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66266

⸱

2023년 12월 15일

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

정오 공지

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요약

두려운 맥락에서 비행 행동을 연구하기 위해 수정된 공포 조건화 프로토콜을 도입합니다. 이 프로토콜은 마우스가 공포 조건화에서 신호를 제시하는 동안 일관되게 비행 행동을 보이도록 합니다.

초록

위협적인 상황에서 방어 행동을 적절하게 표현하는 것은 생존에 매우 중요합니다. 지배적인 이론에 따르면 점프 또는 빠른 돌진과 같은 능동적 방어 행동은 높은 위협 임박 또는 실제 위협에서 표현되는 반면, 동결과 같은 수동적 방어 행동은 위협이 예측되지만 위협 임박성이 상대적으로 낮을 때 표현됩니다. 고전적 공포 조건화에서 피험자는 일반적으로 조건화된 방어 반응으로 얼어붙는 모습을 보이며, 대부분의 경우 적극적인 방어 행동이 거의 발현되지 않는다. 여기에서는 생쥐가 냉동에서 비행으로 또는 그 반대로 전환되는 것을 관찰하기 위해 이틀 동안 조건화된 자극(CS; 연속 톤, 8kHz, 95dB SPL(음압 레벨))과 무조건 자극(US; 발 충격, 0.9mA, 1.0초)의 5가지 반복적인 쌍을 포함하는 수정된 공포 조건화 절차를 소개합니다. 이 수정된 공포 조건화 절차는 비교적 많은 수의 조건화 세션과 조건화 일수를 필요로 하지만 비행 행동의 적당한 표현을 위해 고강도의 발 충격을 필요로 하지 않습니다. 컨디셔닝 및 두드러진 CS 프레젠테이션에 동일한 컨텍스트를 사용하는 것은 비행 행동을 유도하는 데 필수적입니다. 이 수정된 공포 조건화 절차는 쥐의 적극적인 방어 행동을 관찰하기 위한 신뢰할 수 있는 방법이며, 두려움이 있는 상황에서 그러한 행동의 미세한 메커니즘과 특성을 설명할 수 있는 기회를 제공합니다.

서론

위협적인 상황에서 방어 행동을 적절하게 선택하는 것은 모든 동물의 생존에 매우 중요합니다. 방어 행동은 위협 근접성에 따라 점진적으로 전환되는데, 예를 들어 동결 행동과 비행 행동 사이의 전환이그렇다 1,2,3. 이러한 행동의 조절 장애는 다양한 정신 장애에서 자주 관찰된다4. 외상 후 스트레스 장애(PTSD)는 위협적이지 않은 자극에 대한 공황 반응과 같은 과장된 방어 행동을 특징으로 하는 장애 중 하나이다4.

설치류의 고전적 공포 조건화는 일반적으로 PTSD 5,6,7의 모델로 사용되지만, 설치류는 이 모델8에서 도피(공황과 같은) 행동을 표현하지 않는다. 결과적으로, 종종 '설치류 PTSD 모델'이라고 불리는 고전적인 공포 조건화 모델은 인간의 PTSD에 대한 얼굴 타당성이 부족하며, 특히 잘 연구되지 않은 비행 또는 공황과 유사한 증상을 포착하는 데 부족합니다.

최근에, 몇 가지 수정된 공포 조건화 프로토콜은 설치류 피험자가 이러한 절차 중에 비행 행동을 보인다는 것을 성공적으로 입증했습니다. 예를 들어, 조건자극(CS)과 무조건자극(US)을 하루에 7번 반복적으로 연관시키면 암컷 쥐는 비행 행동과 유사한 돌진 행동을 보일 수 있었다9. 연속 복합 자극(serial compound stimuli, SCS; 음색과 소음으로 구성됨)을 사용한 이틀간의 공포 조건화에서, 마우스는 SCS 프리젠테이션10,11,12의 소음 부분에서 비행 행동을 보이기 시작했다. SCS 방법에 대한 상세한 설명은 프로토콜 보고서(13)에 제공된다. SCS를 이용한 3일간의 공포 조건화는 쥐가 비행 행동을 유도하는 데에도 효과가 있었다14. 그러나 이러한 새 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 직렬 큐 프리젠테이션의 사용은 방어 행동에 대한 근접 추정의 영향을 배제하는 것을 허용하지 않습니다. 쥐에서 CS-US의 7회 연관성의 경우, 대부분의 비행 반응은 수컷이 아닌 암컷에서 관찰되었습니다.

이러한 고려 사항에 비추어 우리는 쥐가 두려운 상황에서 비행 행동을 조사할 수 있도록 수정된 공포 조건화 프로토콜을 도입합니다. 수컷 쥐는 우리의 수정된 공포 조절 과정에서 일관되게 비행 행동을 보인다. 이 프로토콜에서는 두드러진 신호음이 SCS 대신 CS로 사용됩니다. 또한, 최소 이틀 동안 하루에 최소 5쌍의 CS-US가 필요하며, 조건화된 상황에 의한 공포 강화가 필요합니다. 이 프로토콜은 연구 목적에 따라 이전 프로토콜을 보완하여 비행 행동을 조사하기 위한 또 다른 옵션을 제공합니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 일본 생리학회의 지도 원칙에 따라 수행되었으며 가나자와 의과대학 동물 관리 위원회(2021-32)의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다. 성체 수컷 C57BL/6J 마우스(3-6개월령)를 연구에 활용하였으며, 이들 마우스가 본 원고15에 기술된 비행 행동을 나타낸다는 것이 이전에 확인되었다.

1. 동물 준비

  1. 실험이 시작될 때까지 그룹 하우스 마우스(케이지당 3-4마리, 23-27°C에서 유지, 12시간 밝음/어두움 주기 하에서, 음식과 물에 대한 애드리비텀 접근 제공).
  2. 이 수정된 공포 조건화를 받기 전에 최소 3일 동안 각 쥐를 플렉시글라스 케이지(14cm × 21cm × 12cm)에 개별적으로 수용합니다.

2. 도구/장비 설정

  1. 공포 조절 상자(그림 1A)
    1. 소음 감쇠 상자(67cm × 53cm × 55cm)에 동봉된 공포 조절 챔버(25cm × 25cm × 25cm)를 활용하십시오( 재료 표 참조).
    2. 두 개의 컨텍스트(A 및 B)가 필요합니다. 컨텍스트 A의 경우 흰색 플라스틱 판지와 검은색 테이프(너비 3cm, 보드에 4개)를 부착하여 벽에 검은색 및 흰색 줄무늬를 만듭니다. 바닥에는 흰색의 부드러운 플라스틱 보드를 사용하십시오.
    3. 각 세션 전에 헵탄올(1%)로 벽과 바닥을 닦으십시오.
      알림: 능동 환기 시스템을 사용하지 않습니다. 세션이 끝날 때 알코올로 청소하면 헵탄올 냄새가 줄어 듭니다.
    4. 컨텍스트 B의 경우 컨텍스트 A에 사용된 보드를 제거하여 벽의 모양을 완전히 검은색으로 만듭니다. 바닥은 격자 바닥입니다.
      알림: 청소를 위한 약간의 알코올 냄새 외에는 특별한 냄새가 나지 않습니다.
    5. 오버헤드 백색 발광 다이오드(LED, 240lux)를 사용하여 실험 상자를 비춥니다( 재료 표 참조).
  2. 충격
    1. 스크램블 쇼커(재료 표 참조)를 스테인리스 스틸 막대로 구성된 그리드 바닥에 연결합니다. 이것은 발 충격을 제공하는 데 사용됩니다. 발 충격 강도는 공포 조건화10,11,12,13의 일반적인 방법에 따라 0.9mA로 설정되었습니다.
  3. 오디오 제너레이터
    1. 스피커( 재료 표 참조)를 천장에 놓습니다. 모든 음향 자극이 증폭됩니다.
    2. 디지털 방식으로 수정 및 보정 amp각 자극의 전체 진폭을 산출하여 20/5인치 마이크가 있는 스피커 전면의 음압 레벨(SPL, re: 1 μ 4Pa)을 생성합니다. 이 스피커를 통해 연속적인 톤이 터져 나옵니다.
      알림: 사운드 스피커를 보정하는 것은 이 수정된 공포 조건 동안 방어 행동에 대한 소리 자극의 미세한 영향을 조사하는 데 중요합니다.
  4. 변환기
    1. 진동 감지를 위해 테스트 챔버의 바닥을 변환기( 재료 표 참조)에 놓습니다. 변환기의 신호는 동작 진동을 기록하기 위해 8kHz 샘플링 주파수의 사운드 카드로 전송됩니다.
  5. 비디오 카메라
    1. CMOS 카메라( 재료 표 참조)를 천장에 배치하여 피사체의 움직임을 추적하고 컨디셔닝 박스에 사운드를 녹음합니다.
  6. 트리거링 시스템
    1. 사운드 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 예약된 타이밍에 톤 또는 풋 쇼크를 트리거합니다.
      알림: 시중에서 판매되는 모든 자극기가 이를 위해 작동합니다.

3. 행동실험

  1. 4일간의 공포 조건화 절차를 계획하십시오: 습관화(1일, 5회 시행), 조건화(2일, 각각 5회 시행) 및 시험/소멸 세션(1일, 5회 또는 15회 시행). 시험 간격은 60-75초 사이였습니다(그림 1B).
    참고: 바람직하게는 신뢰할 수 있는 행동 경향을 얻기 위해 그룹에 10명 이상의 피험자를 포함시키는 것이 좋습니다. 연구 목적에 따라 두세 개의 그룹이 필요합니다.
    1. 컨디셔닝 세션 중에 그림 1B와 같이 컨디셔닝 자극(CS)(연속 톤 버스트, 8kHz, 20초, 95dB SPL)이 종료된 직후 조건 없는 자극(US)(1초, 0.9mA)을 표시합니다. 컨디셔닝 데이에 5개의 CS-US 쌍을 제공합니다.
    2. 5번째 발 충격이 종료된 후, 피험자를 1분 동안 그대로 두었다가 홈 케이지로 돌려보낸다. 각 행동 테스트 후 청소를 위해 70% 알코올로 챔버를 닦습니다.
      참고: CS 및 US 강도는 연구 목적에 따라 수정할 수 있습니다. 이전 보고에 따르면 CS 강도가 높을수록 약한 행동보다 더 적극적인 방어 행동을 유발하는 것으로 나타났다15. 컨디셔닝 일수도 연장할 수 있습니다.
  2. 아래에 언급된 일정에 따라 CS 프레젠테이션 중에 비행 행동을 유도합니다.
    참고: 이 실험에는 CS(95dB SPL) 및 US(0.9mA)가 사용됩니다.
    1. 1일차에 피험자를 컨텍스트 A에서 5개의 CS 단독 시험에 노출시킵니다.
    2. 2일과 3일차에 상황 B에서 5개의 CS-US 연관 시험이 있는 조건부 피험자.
    3. 4일째 되는 날, 피험자를 컨텍스트 B의 리콜 세션에 대한 5개의 CS 단독 시험에 노출시킵니다. 기억 소멸을 실험하는 경우, 피험자를 15개의 CS 단독 실험에 노출시킨다.
      참고: 메모리 안정성을 테스트하려면 소멸 세션을 2-3일 동안 연장하는 것이 도움이 됩니다. 또한 4일째가 아닌 1주일 후에 메모리를 테스트하면 메모리 안정성을 추가로 확인할 수 있습니다.

4. 방어 행동 분석

참고: CS 프레젠테이션 중 동작, 동결 비율 및 점프 횟수가 분석됩니다. 자세한 내용은 아래에 설명되어 있습니다. 가능하면 이중맹검 방식으로 분석하는 것이 좋습니다.

  1. 비디오에 녹음된 톤 시작을 사용하여 비디오의 이벤트 타이밍과 자극의 타이밍(CS 및 US)을 동기화합니다.
  2. 맞춤형 코드를 활용하여 프레임에 걸쳐 피사체 실루엣의 질량 중심 차이를 기반으로 마우스의 평균 및 총 움직임을 모두 계산합니다.
    참고: 이 측정에는 임의의 단위가 사용되는데, 이는 동작 속도가 동영상의 샘플링 속도에 따라 달라지기 때문입니다.
  3. 동결 비율을 측정하려면 트랜스듀서 신호를 제 시간에 사용하십시오.
    1. 20-500Hz 대역 통과 필터를 사용하여 변환기 신호를 전처리합니다.
    2. 각 50ms Bin에 대한 시간에 따라 변환기 신호의 제곱 평균 제곱근 진폭을 계산합니다.
    3. 신호 진폭에 대한 임계값을 설정하여 부동성 기간을 감지합니다. 부동성의 지속 시간은 1초 이상 임계값보다 낮은 신호 주기입니다.
    4. 비디오를 보면서 동결 시간을 수동으로 측정하십시오.
    5. 수동으로 측정된 동결 비율과 변환기 신호에서 계산된 백분율을 비교하여 동결을 위한 신호 진폭의 임계값을 조정합니다.
  4. 비디오 파일에서 수동으로 점프 횟수를 계산합니다.
    알림: 다트의 수를 세는 것도 비행 응답을 평가하는 데 유용합니다.

5. 통계 분석

  1. 통계적 유의성을 p < 0.05로 설정합니다.
  2. 여러 그룹과 여러 요인을 비교하려면 다원 분산 분석을 수행한 후 사후 검정을 수행합니다. 컨디셔닝 일정의 특정 날짜를 테스트하는 경우 여러 비교 테스트 또는 치환 테스트를 수행합니다.

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결과

수컷 마우스(C57BL/6J, 3-6개월령)에서 수정된 공포 조건화로 얻은 결과는 그림 1C에 표시된 일정에 따라 제시됩니다. 이 실험은 조건화된 맥락이 비행 행동의 표현에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 고안되었습니다. 그룹 1(n = 10)과 그룹 2(n = 10)의 두 그룹이 할당되었습니다. 이 실험에서는 CS(95dB SPL) 및 US(0.9mA)를 사용했습니다.

1일째에 모든 마우스는 컨텍스트 A에서 5개의 조건 자극(CS) 단독 시험에 노출되었습니다. 그 후, 모든 마우스는 2일과 3일에 컨텍스트 B에서 5개의 CS-무조건 자극(US) 시험으로 조건화되었습니다. 4일째에 그룹 1은 컨텍스트 B에서 리콜 세션에 대해 5건의 CS 단독 시험을 경험한 반면, 그룹 2는 컨텍스트 A에서 테스트되었습니다.

그룹 1의 피험자들은 특히 3일차와 4일차에 CS 프레젠테이션을 ...

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토론

이 글에서 소개하는 수정된 공포 조건화 프로토콜은 공포 상황에서 비행 행동을 조사하기 위한 안정적인 방법이다. 이 프로토콜을 사용함으로써 우리는 두려운 상황에서 쥐의 비행 행동이 두드러진 자극에 의해 촉발되고 상황에 따라 달라진다는 것을 발견했습니다. 비행 행동을 관찰할 수 있는 적절한 프로토콜이 없었기 때문에 비행 행동의 특성은 잘 조사되지 않았습니다. 이 프로토콜은 두려운 상황에서 적극적인 방어 행동을 연구하는 데 적합한 방법 중 하나가 될 것입니다.

최근에는 본 프로토콜 외에도 여러 프로토콜이 도입되었습니다. SCS를 사용한 여러 날의 컨디셔닝은 생쥐 및 쥐 10,11,12,13,14에서 큐 프레젠테이션 동안 비행 행동을 안정적으로 유도합니다.

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공개 사항

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 KAKENHI Grants JP22K15795(T.F.), JP22K09734(N.K.), JP21K07489(R.Y.), Kanazawa Medical University(C2022-3, D2021-4, R.Y.) 및 The Naito Foundation(T.F.)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
오디오 스피커FostexFT17H
앰프소니TA-F500
CMOS 카메라산와 서플라이CMS-V43BK
피어 컨디셔닝 챔버Panlab S.L.U.LE116
식품 펠릿NosanLabo MR 표준
LEDYamazenLT-B05N
마이크ACO유형 4156N
스크램블 쇼커Panlab SLULE 100-26
사운드 카드Behringer,UMC202
사운드 소프트웨어Syntrillium 소프트웨어, 쿨 에디트 2000
트랜스듀서Panlab, SLU.르 111
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참고문헌

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재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66266

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