여기에서는 저비용의 에너지 효율적인 벤치탑 열혼합기를 인큐베이터로 활용하는 호열성의 적응을 위한 실험적 진화 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 최적 성장 온도가 75 °C인 고세균인 Sulfolobus acidocaldarius의 온도 적응 특성화를 통해 입증되었습니다.
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방법 논문
삶의 극한에서의 적응 : 극한 고령 Archaeon Sulfolobus acidocaldarius를 사용한 실험적 진화
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이 논문에서
요약
초록
고세균 Sulfolobus acidocaldarius 는 유망한 호열성 모델 시스템으로 부상했습니다. 호열식물이 온도 변화에 어떻게 적응하는지 조사하는 것은 기본적인 진화 과정을 이해하는 것뿐만 아니라 S. acidocaldarius 를 생명공학의 섀시로 개발하기 위한 핵심 요구 사항입니다. 호열성으로 실험적 진화를 수행하는 데 있어 주요 장애물 중 하나는 고온 성장을 위한 기존 인큐베이터의 장비 유지 관리 및 에너지 사용 비용입니다. 이 문제를 해결하기 위해 저비용 및 에너지 효율적인 벤치탑 열혼합기를 사용하여 S. acidocaldarius 에서 실험 진화를 수행하기 위한 포괄적인 실험 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜에는 상대적으로 적은 부피(1.5mL)의 배치 배양 기술이 포함되어 있어 여러 독립적인 계통에서 적응을 추적할 수 있습니다. 이 방법은 추가 열혼합기를 사용하여 쉽게 확장할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 실험 조사와 관련된 초기 투자 및 지속적인 비용을 모두 줄임으로써 모델 시스템으로서 S. acidocaldarius 의 접근성을 높입니다. 또한, 이 기술은 다양한 환경 조건에 대한 적응을 탐구하기 위해 다른 미생물 시스템으로 이전할 수 있습니다.
서론
지구상의 초기 생명체는 극도로 높은 온도와 산성도를 특징으로 하는 열수 분출구와 같은 극한 환경에서 기원했을 수 있다1. 미생물은 온천과 화산 솔파타라를 포함한 극한 환경에서 계속 서식하고 있습니다. 이러한 극한 조건에서 발생하는 진화 역학을 특성화하는 것은 이러한 조건에서 생존을 가능하게 하는 특수한 생리학적 과정에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다. 이는 생물 다양성의 기원에 대한 이해부터 생명공학적 응용을 위한 새로운 고온 효소 개발에 이르기까지 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.
극한 환경에서의 미생물 진화 역학에 대한 이해는 그 중요한 중요성에도 불구하고 제한적인 상태로 남아 있습니다. 대조적으로, 중온성 환경에서의 진화에 대한 중요한 지식은 실험적 진화로 알려진 기술의 적용을 통해 획득되었습니다. 실험적 진화는 실험실 조건 2,3,4,5 하에서 진화적 변화를 관찰하는 것을 포함한다. 종종 여기에는 정의된....
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프로토콜
1. S. acidocaldarius 성장 배지(BBM+)의 제조
참고: S. acidocaldarius를 배양하기 위해 이 프로토콜은 Basal Brock Medium (BBM+)23을 사용합니다. 이것은 먼저 아래에 설명된 무기 원액을 결합하여 BBM-을 생성함으로써 준비되며, 이는 미리 준비될 수 있습니다. 그런 다음 BBM+ 는 BBM−에 유기 원액을 추가하여 필요에 따라 준비됩니다. 원액 레시피는 표 1에도 제시되어 있습니다. 모든 배지 및 스톡 용액은 이중 증류된 H2O (ddH2O)로 준비해야 합니다.
- 성장 매체를 위한 무기 재고 솔루션 준비
- 미량 원소 원액을 준비합니다.
- ddH2O에 9g / L의 테트라 보산 나트륨 데카 하이드레이트 (Na2B4O7·10H2O....
- 미량 원소 원액을 준비합니다.
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결과
성장 곡선 측정
S. acidocaldarius DSM639의 성장 곡선은 그림 3A에 나와 있습니다. 성장은 열혼합기를 사용한 배양과 기존 인큐베이터를 사용한 배양을 비교할 때 유사한 것으로 나타났습니다. 평균 성장률 매개변수는 로지스틱 곡선을 각 반복된 성장 곡선에 맞추고 평균 및 표준 오차를 계산하여 추정했습니다. 열혼합기와 인큐베이터에서 중간 지수 단계까지의 시간은 각각 27.2시간 ± 1.1시간 및 31.1시간 ± 1.9시간이었습니다. 75°C에서 열혼합기와 인큐베이터의 예상 초기 증식 시간은 각각 4.29시간 ± 0.28시간 및 4.19시간 ± 0.44시간이었으며, 이는 이전에 발표된 값24와 일치합니다. 로그10(OD600nm)과 로그10(CFU) 사이의 관계는 선형 모델(조정된 R2 = 0........
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토론
이 연구는 호열성을 위한 실험적 진화 프로토콜을 개발했으며, 여기서는 고세균 S. acidocaldarius에 맞게 조정되었지만 고온 성장 요구 사항이 있는 다른 미생물에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기에 중온성 박테리아를 위해 설계된 기술을 기반으로 하지만 고온 호기성 성장 2,4,5,24와 관련된 기술적 문제를 극복하기 위해 특별히 수정되었습니다. 이 방법의 생성은 생명 진화의 초기 단계에서 잠재적으로 존재했던 조건과 유사한 극한의 온도 조건에서 발생하는 이전에는 특성화되지 않은 진화 역학을 탐구할 수 있게 할 것입니다1.
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자들은 SV Albers 교수(프라이부르크 대학교), Eveline Peeters 교수(Vrije Universiteit Brussel) 및 Rani Baes 박사(Vrije Universiteit Brussel)에게 조언과 S. acidocaldarius DSM639 균주에 대해 감사를 표합니다. 이 연구는 왕립 학회 연구 보조금(DRG에 수여: RGS\R1\231308), UKRI-NERC "Exploring the Frontiers" 연구 보조금(DRG 및 CGK에 수여: NE/X012662/1) 및 쿠웨이트 대학교 박사 장학금(ZA에 수여)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 &무; m 주사기 구동 멤브레인 필터 | StarLab | E4780-1226 | 고압멸균이 불가능한 매체 구성 요소를 살균하는 필터용. |
| 1 &뮤; L 접종 루프 | Greiner | 731161, 731165 또는 731101 | 배양 접종용. 다른 루프를 사용할 수 있습니다. |
| 1000 &뮤; L 피펫 팁 | StarLab | S1111-6811 | 다른 피펫 팁을 사용할 수 있습니다. |
| 2 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | StarLab | S1620-2700 | 열혼합기에서 S. acidocaldarius 배양용. |
| 200 &뮤; L 피펫 팁 | StarLab | S1111-0816 | 다른 피펫 팁을 사용할 수 있습니다. |
| 바닥이 원뿔형 Corning 430828 또는 430829 다른 튜브가 있는 50mL 폴리스티렌 튜브 | 를 사용할 수 있습니다. 75°C에서 성능을 확인하십시오. 플러그 씰 캡이 있는 튜브는 충분한 폭기를 허용하지 않을 수 있습니다. 사용하기 전에 확인하십시오. | ||
| 50 mL 주사기 | BD plastipak | 300865 | 주사기 구동 필터와 함께 사용합니다. |
| 96웰 마이크로타이터 플레이트(처리되지 않음, 평평한 바닥) | Nunc | 260860 | 분광 광도계에서 600nm에서 OD를 측정하기 위한 용도. |
| 폭 조절 가능한 멀티채널 피펫 | Pipet-Lite | LA8-300XLS | 옵션이지만 마이크로 원심분리기와 96웰 플레이트 간 이송 시 시간 절약. |
| 황산 암모늄 ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | Brock 스톡 솔루션 I. |
| 오토클레이 | Priorclave | B60-SMART 또는 SV100-BASE | 다른 오토클레이브도 사용할 수 있습니다. |
| Breathe-EASY 가스 투과성 밀봉 멤브레인 | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | 피어싱된 마이크로 원심분리기 튜브에 사용할 수 있도록 크기로 절단합니다. 다른 가스 투과성 memrbanes를 대체하는 경우 성능이 75°C에서 적절한지 확인하십시오. C |
| 염화칼슘 이수화물 (CaCl2· 2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Brock 주식 해결책 I.를 위해. |
| CELLSTAR 6웰 플레이트(현탁액/비처리) | Greiner | M9062 | 다른 제조업체의 6웰 플레이트로 대체할 수 있습니다. 고온에서 성능을 확인하십시오. |
| 코발트 (II) 황산염 헵타 하이드레이트 (CoSO 4< / sub>· 7H2O) | Supelco | 1025560100 | 미량 원소 스톡 솔루션용. |
| 구리 (II) 염화물 이수화물 (CuCl2· 2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | 미량 원소 스톡 솔루션용. |
| D-(+)-글루코스 무수 (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | 다른 펜토오스 및 헥소스 당도 사용할 수 있습니다(예: D-자일로스, D-아라비노스). 포도당은 S. acidocaldarius에 선호되는 탄소원이 아닙니다 (SV Albers, 개인 커뮤니케이션) |
| 이중 증류수 (ddH2O)Gelrite | |||
| Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum)는 융점이 높기 때문에 한천 대신 고체 매체를 만드는 데 사용됩니다. | |
| 유리 100mm 페트리 접시 | 브랜드 | BR455742 | 유리 페트리 접시는 대부분의 표준 폴리스티렌 90mm 페트리 접시가 75°C에서 변형되기 때문에 사용됩니다. C(브랜드에 따라 다름). 또는 고온에서 변형되지 않는 6개의 웰 플레이트를 사용할 수 있습니다. |
| 인큐베이터 | New Brunswick | Innnova 42R | 다른 인큐베이터도 사용할 수 있습니다. 많은 인큐베이터가 65°C 이상의 온도를 견딜 수 없으므로 구매/사용하기 전에 장비의 작동 온도를 확인하십시오. |
| 철 (III) 염화물 육수화물 (FeCl3· 6H2O) | Supelco | 103943 | Fe 재고 용액 |
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| 망간 (II) 염화물 사수화물 (MnCl2· 4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | 미량 원소 원자재 솔루션용. |
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| 분광 광도계 | BMG | SPECTROstar OMEGA | 600nm에서 OD를 측정합니다. 600nm에서 OD를 읽을 수 있는 다른 분광 광도계를 사용할 수 있습니다. |
| 황산(물과 1:1 비율로 희석) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Brock 원액 II/III의 pH를 최종 pH 2–3로 조정하는 데 사용됩니다. |
| Thermomixer | DLab | HM100-Pro | 다른 온도 혼합기도 사용할 수 있으며; 주요 고려 사항은 65&ndash를 유지할 수 있는 능력입니다; 75 > C 온도 및 400 RPM |
| Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | pyrE의 결실은 S. acidocaldarius에 사용되는 일반적인 유전자 마커입니다. 결실 균주는 성장을 위해 우라실을 보충해야 합니다. DSM639 야생형 균주에 대해서는 보충제가 반드시 필요한 것은 아니지만, 향후 실험에 결실 균주가 포함될 수 있으므로 여기에 포함되었습니다. |
| 바나딜 설페이트 이수화물 (VOSO4· 2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | 미량 원소 스톡 솔루션용. |
| 아연 황산염 헵타 하이드레이트 (ZnSO 4< / sub>· 7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | 미량 원소 스톡 솔루션용. |
참고문헌
- Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
- Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Lenski, R. E.
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재인쇄 및 허가
