삶의 극한에서의 적응 : 극한 고령 Archaeon Sulfolobus acidocaldarius를 사용한 실험적 진화

지구상의 초기 생명체는 극도로 높은 온도와 산성도를 특징으로 하는 열수 분출구와 같은 극한 환경에서 기원했을 수 있다¹. 미생물은 온천과 화산 솔파타라를 포함한 극한 환경에서 계속 서식하고 있습니다. 이러한 극한 조건에서 발생하는 진화 역학을 특성화하는 것은 이러한 조건에서 생존을 가능하게 하는 특수한 생리학적 과정에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다. 이는 생물 다양성의 기원에 대한 이해부터 생명공학적 응용을 위한 새로운 고온 효소 개발에 이르기까지 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.

극한 환경에서의 미생물 진화 역학에 대한 이해는 그 중요한 중요성에도 불구하고 제한적인 상태로 남아 있습니다. 대조적으로, 중온성 환경에서의 진화에 대한 중요한 지식은 실험적 진화로 알려진 기술의 적용을 통해 획득되었습니다. 실험적 진화는 실험실 조건 ^2,3,4,5 하에서 진화적 변화를 관찰하는 것을 포함한다. 종종 여기에는 정의된 변화 환경(예: 온도, 염도, 독소 또는 경쟁 유기체의 ^도입)이 포함됩니다^7,8,9. 전체 게놈 염기서열 분석(whole-genome sequencing)과 결합했을 때, 실험적 진화는 평행성(parallelism), 반복성(repeatability), 적응을 위한 게놈 기반(genomic basis)을 포함한 진화 과정의 주요 측면을 테스트할 수 있게 해주었다. 그러나 현재까지 대부분의 실험적 진화는 중엽성 미생물(박테리아, 곰팡이 및 바이러스 2,3,4,5를 포함하지만 대부분 고세균은 제외)에 대해 수행되었습니다. 호열성 미생물에 적용할 수 있는 실험적 진화 방법은 그들이 어떻게 진화하는지 더 잘 이해할 수 있게 해주고 진화에 대한 보다 포괄적인 이해에 기여할 수 있게 해줄 것입니다. 이는 지구상의 호열성 생명체의 기원을 해독하는 것에서부터 고온 생물과정(hyper-temperature bioprocesses⁾¹⁰ 및 우주생물학 연구^{(astrobiological research)11}에 사용되는 '극한(extremozymes)'과 관련된 생명공학적 응용에 이르기까지 잠재적으로 광범위한 영향을 미칠 수 있다.

고세균 Sulfolobus acidocaldarius는 호열성을 위한 실험적 진화 기술을 개발하기 위한 모델 유기체로서 이상적인 후보입니다. S. acidocaldarius는 75 °C (55 °C에서 85 °C 범위)의 최적 성장 온도와 높은 산도 (pH 2-3) 4,6,12,13,14로 호기성으로 번식합니다. 놀랍게도, 극한의 성장 조건에도 불구하고 S. acidocaldarius는 중엽체 7,15,16,17,18에 필적하는 개체군 밀도와 돌연변이 비율을 유지합니다. 또한 상대적으로 작고 주석이 잘 달린 게놈을 가지고 있습니다(DSM639 균주: 2.2Mb, 36.7% GC, 2,347개 유전자)¹²; S. acidocaldarius는 또한 강력한 게놈 엔지니어링 도구의 이점을 활용하여 표적 유전자 knockout을 통해 진화 과정을 직접 평가할 수 있습니다¹⁹. 이에 대한 주목할 만한 예는 선택 가능한 마커 역할을 할 수 있는 MW001¹⁹ 및 SK-1²⁰의 우라실 보조영양 균주와 같은 S. acidocaldarius의 유전자 변형 균주의 가용성입니다.

S. acidocaldarius와 같은 호열성으로 실험적 진화를 수행하는 데는 상당한 어려움이 있습니다. 이러한 연구에 필요한 고온에서 장시간 배양은 액체 및 고체 배양 기술 모두에 상당한 증발을 부과합니다. 고온에서 장시간 작동하면 액체 매체의 실험적 진화에 일반적으로 사용되는 기존의 진탕 인큐베이터가 손상될 수도 있습니다. 여러 온도를 탐사하려면 여러 인큐베이터를 구입하고 유지하기 위해 상당한 재정적 투자가 필요합니다. 또한 높은 에너지 소비가 필요하기 때문에 심각한 환경 및 재정적 우려가 제기됩니다.

이 연구는 S. acidocaldarius와 같은 호열성으로 실험적 진화를 수행할 때 직면하는 문제를 해결하는 방법을 소개합니다. 열 충격 반응^14,21을 조사하기 위해 Baes et al.이 개발한 기술을 기반으로 여기에서 개발된 방법은 일관되고 신뢰할 수 있는 고온 배양을 위해 벤치탑 열혼합기를 사용합니다. 확장성을 통해 여러 온도 처리를 동시에 평가할 수 있으며 추가 배양 장비를 구입하는 데 드는 비용을 절감할 수 있습니다. 이는 실험의 효율성을 향상시켜 강력한 통계 분석과 호열성에서 진화 역학에 영향을 미치는 요인에 대한 광범위한 조사를 가능하게 합니다²². 또한 이 접근 방식은 기존 인큐베이터에 비해 재정적 초기 투자 및 에너지 소비를 크게 줄여 보다 지속 가능하고 환경 친화적인 대안을 제공합니다.

우리의 방법은 지구상의 생명체 다양화의 초기 단계에서 중요한 역할을 했을 수 있는 극한의 온도로 특징지어지는 환경에서 진화 역학을 실험적으로 조사하기 위한 토대를 마련합니다. 호열성 유기체는 고유한 특성을 가지고 있지만 극한의 성장 조건과 특수한 요구 사항으로 인해 모델 시스템으로서의 접근성이 제한되는 경우가 많습니다. 이러한 장벽을 극복하면 진화 역학을 조사하기 위한 연구 기회가 확장될 뿐만 아니라 과학 연구에서 모델 시스템으로서 호열성의 광범위한 유용성이 향상됩니다.

1. S. acidocaldarius 성장 배지(BBM⁺)의 제조

참고: S. acidocaldarius를 배양하기 위해 이 프로토콜은 Basal Brock Medium (BBM⁺)²³을 사용합니다. 이것은 먼저 아래에 설명된 무기 원액을 결합하여 BBM^-을 생성함으로써 준비되며, 이는 미리 준비될 수 있습니다. 그런 다음 BBM⁺ 는 BBM⁻에 유기 원액을 추가하여 필요에 따라 준비됩니다. 원액 레시피는 표 1에도 제시되어 있습니다. 모든 배지 및 스톡 용액은 이중 증류된 H₂O (ddH₂O)로 준비해야 합니다.

1. 성장 매체를 위한 무기 재고 솔루션 준비
   1. 미량 원소 원액을 준비합니다.
      1. ddH₂O에 9g / L의 테트라 보산 나트륨 데카 하이드레이트 (Na₂B₄O₇·10H₂O)를 첨가 한 다음 1 : 1 H₂SO₄ 를 적가하여 용해 될 때까지 미량 원소 원액을 준비합니다.
      2. 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO₄·7H_2O) 0.44g/L, 염화구리(II) 이수화물(CuCl₂·2H_2O) 0.1g/L, 몰리브덴산 나트륨 이수화물(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.06g/L, 바나듐(IV) 황산염 이수화물(VOSO_{4.2H 2O}) 0.06g/L, 황산 코발트(II) 헵타하이드레이트 0.02g/L(CoSO₄·7H_2O)를 순차적으로 도입하고, 및 3.6g/L의 망간(II) 염화물 사수화물(MnCl₂·4H_2O). 용액을 고압멸균하고 4°C에서 보관합니다.
   2. ddH₂O에 육수화물제20철(FeCl₃·6H_2O) 20g/L를 용해시켜 Fe 원액(×)을 제조하고 0.22μm 필터로 여과하여 용액을 살균하고 4°C에서 보관합니다.
   3. 이중 증류수(ddH_2O)에 70g/L 염화칼슘(CaCl₂·2H_2O)을 용해시켜 Brock Solution I(1000×)을 제조합니다. 오토클레이브하고 4 °C에서 보관하십시오.
      주의: CaCl₂·2H₂O를 물에 용해시키는 것은 발열 과정입니다. 이 단계는 주의해서 수행해야 합니다. 부상을 방지하기 위해 EN407 등급의 열 위험 장갑을 착용하십시오. 압력이 증가할 수 있으므로 용기를 단단히 닫지 마십시오.
   4. 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 130g/L, 황산마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO₄·7H_2O) 25g/L, 인산이수소칼륨(KH₂PO₄) 28g/L 및 이전에 준비된 미량 원소 원액 50mL를 결합하여 Brock 용액 II/III를 제조합니다. 1 : 1 H₂SO₄를 사용하여 원액의 pH를 2-3으로 조정합니다. 용액을 고압멸균하고 실온(RT)에서 보관합니다.
2. 성장 매체를 위한 유기적 재고 솔루션 준비
   1. D-글루코스 원액(100×)을 ddH₃₀₀O에 D-글루코스 30g/L(2% w/v)를 용해시켜 제조하고 필터 멸균(0.22μm 필터를 통해)합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
      참고: 실험 요구 사항에 따라 D-포도당 대신 다른 탄소원을 사용할 수 있습니다(예: D-자일로스).
   2. 카제인 원액(100x)에서 카제인의 펩톤을 ddH₂O. 오토클레이브에 100g/L로 용해시켜 원액을 RT에서 살균 및 보관하여 펩톤을 준비합니다.
   3. 우라실 원액(100×)을_ddH2O에 우라실 2g/L를 용해시켜 제조하고 여과 멸균(0.22μm 필터를 통해)한다. -20 °C에서 보관하십시오.
3. 1x 작업 농도에서 BBM⁺ 성장 배지 준비
   1. 먼저 고압멸균으로 988mL의 멸균 ddH₂O를 준비합니다.
   2. 이전에 고압멸균한 988mL의 멸균 ddH₂O에 Brock 스톡 용액 I 1mL, Brock 스톡 용액 I 1mL, Brock 스톡 용액 II/III 1mL, Fe 스톡 용액 1mL를 첨가하여 1L BBM⁻을 준비합니다. 매체 pH를 2 : 3 : 1 H₁SO₄로 4-4 범위로 조정합니다.
      알림: BBM^- 은 미리 만들어 최대 1개월 동안 RT에 보관할 수 있습니다.
   3. 마지막으로, 1L BBM⁺를 생산하려면 D-Glucose Stock Solution, Casein Stock Solution의 Peptone 및 Uracil Stock Solution을 각각 10mL의 BBM^-과 결합합니다. 잘 섞고 매체 pH를 1 : 1 H₂SO₄로 2-3으로 조정하십시오.
      알림: BBM⁺ 는 필요에 따라 신선하게 만들어야 합니다.
4. BBM⁺ 고체 매체의 제조
   1. MgCl₂ 및 CaCl₂ 의 1M 스톡 용액을 준비하고; 이것들은 BBM 고체 매체의 응고에 도움이 될 것입니다. 1 M MgCl₂ 의 경우 9.5 g을 ddH₂O 100 mL에 첨가하십시오. 1 M CaCl₂ 의 경우 11 g을 100 mL의 ddH₂O. 오토클레이브를 첨가하여 멸균합니다.
      주의: CaCl₂·2H₂O를 물에 용해시키는 것은 발열 과정입니다. 이 단계는 주의해서 수행해야 합니다. 부상을 방지하기 위해 EN407 등급의 열 위험 장갑을 착용하십시오. 압력이 증가할 수 있으므로 용기를 단단히 닫지 마십시오.
   2. ddH₃O에 30%(w/v)의 젤란 검(예: 2g/L)을 혼합하고 오토클레이브를 살균합니다.
      참고: 겔란 검(예: 겔라이트)은 표준 세균 한천이 75°C에서 응고될 수 없기 때문에 여기에서 겔화제로 사용됩니다.
   3. 따로따로, 단계 1.4.1에서 준비된 메마른 gellan 실리콘껌과 1:1 비율로 섞일 단단한 매체를 위한 BBM⁺ 를 준비하십시오.
      1. 먼저 1단계와 같이 1L BBM^- 을 준비합니다.3.2. 887mL의 BBM⁻ 을 1mL의 Fe 스톡 용액과 D-Glucose 스톡 용액, 카제인 스톡 용액의 펩톤 및 Uracil 스톡 용액과 각각 20mL를 결합합니다.
      2. 40mL의 1m MgCl₂ 와 12mL의 1m CaCl₂를 추가합니다. 잘 섞고 매체 pH를 1 : 1 H₂SO₄로 2-3으로 조정하십시오.
         알림: 여기에 추가된 원액의 양은 1.3단계에서 액체 BBM⁺ 를 준비할 때보다 의도적으로 큽니다. 이것은 다음 단계에서 용융 겔란 검과 1:1 비율로 혼합하는 것을 설명하기 위한 것입니다.
   4. 고체 매체용 BBM⁺ 를 약 75°C로 예열하고 ddH₂O의 용융 젤란 검과 1:1 비율로 혼합합니다. 잘 섞고 열에 안정적인 플라스틱(예: 폴리프로필렌), 유리 페트리 접시 또는S. acidocaldarius의 성장을 위한 6웰 플레이트에 붓습니다. 한천은 빠르게 굳기 때문에 블렌딩한 즉시 사용하십시오.
      알림: 미생물학에 일반적으로 사용되는 일부 폴리스티렌 90mm 페트리 접시는 고온에서 장기간 배양하면 변형됩니다.
      주의 : 뜨거운 액체를 다룰 때 적절한 안전 예방 조치를 취하십시오. 부상을 방지하기 위해 EN407 등급의 열 위험 장갑을 착용하십시오.

2. 냉동고 스톡 배양에서 S. acidocaldarius 되살리기

1. 충분한 통기 및 산소 가용성을 보장하기 위해 환기되는 성장 튜브를 준비합니다.
   1. Sulfolobus 성장을 위해 피어싱된 2mL 미세 원심분리기 튜브를 미리 준비합니다. 뭉툭한 와이어(>0.7mm, 곧게 펴진 종이 클립 등)를 분젠 버너 불꽃을 사용하여 조심스럽게 가열하고 튜브 뚜껑을 뚫어 약 1mm의 작은 구멍을 만듭니다.
   2. 피어싱된 튜브를 오토클레이브 가능한 용기(예: 빈 피펫 팁 상자)에 넣고 오토클레이브하여 멸균합니다.
      주의 : EN407 등급의 열 위험 장갑을 착용하여 가열된 금속으로 인한 손의 열 부상을 방지하십시오. 과열을 방지하기 위해 와이어를 짧은 시간(1-2초) 동안만 가열하십시오. 용융 온도가 높은 금속(강철)만 사용해야 합니다.
2. S. acidocaldarius의 스타터 배양균을 접종합니다.
   1. 고압멸균된 피어싱 2mL 튜브에 1.5mL의 예열된 BBM⁺를 채웁니다(섹션 1에서 준비한 대로, 75°C에서 최소 15분 동안 사전 배양).
   2. 글리세롤 스톡(25% v/v 글리세롤, -80 °C에서 보관)에서 긁어내기(50 - 60 mg에 해당)하여 BBM⁺ 충전 튜브를 접종합니다. 여기서, S. acidocaldarius 균주 DSM639가 사용된다. 음성 대조군으로 추가 튜브에 1.5mL의 BBM+를 채웁니다.
3. 피어싱된 2mL 튜브 뚜껑에서 에어로졸이 빠져나가 성장 환경(및 기타 샘플)을 오염시키는 것을 방지하고 튜브 내 배양 증발의 변동성을 줄이기 위해 고온(65-85°C)을 견딜 수 있는 뚜껑 위에 가스 투과성 멤브레인을 놓고 미생물 탈출/침투를 차단합니다.
   참고: 튜브를 밀봉하기 위해 가스 투과성 멤브레인을 사용하면 증발이 크게 줄어듭니다. 75°C에서 48시간 동안 밀봉된 튜브는 평균 8.63%(범위: 3.29-16.45%, n = 24회 기술 반복, 2회 반복)의 부피 손실을 보인 반면, 밀봉되지 않은 튜브의 경우 25.05%(범위: 11.92-62.91%, n = 24회 기술 반복, 2회 반복)를 보였습니다.
4. 분광 광도계로 측정한 대로 0.3 - 0.8의 OD_600nm 에 도달할 때까지 48-72시간 동안 또는 분당 회전수(RPM)로 400회 일정하게 흔들면서 75°C의 열혼합기에 접종된 튜브를 배양합니다.
   참고: 2mL 튜브의 뚜껑을 뚫고 흔들면 최적의 성장을 위해 적절한 폭기가 가능합니다. 열교환기의 뚜껑은 일정한 온도가 유지되고 증발을 줄이기 위해 제자리에 있어야 합니다.
5. 배양 기간이 끝나면 되살아난 배양균에 두 번째 성장 단계(전처리)를 제공합니다.
   1. RT에서 2분 동안 5000 x g 에서 튜브를 회전시켜 배양액을 펠렛으로 펠릿합니다. 그런 다음 상층액을 버리고 세포 펠릿을 신선한 1.5mL의 따뜻한 BBM⁺에 재현탁시킵니다.
      참고 :이 실험은 S. acidocaldarius 야생형 균주 DSM639를 사용하지만 이러한 성장 및 실험 진화 방법은 모든 Sulfolobus 균주 및 잠재적으로 다른 호열성 균주에 적용 할 수 있습니다.

3. S. acidocaldarius의 인구 밀도, 배가시간 및 기하급수적 성장 단계 결정

1. 선택한 선택 조건에 대한 인구 밀도와 기하급수적 성장 단계까지의 시간을 결정합니다. 테스트할 각 환경 조건에 대해 2.1-2.5단계에 따라 세 가지 스타터 배양물을 준비합니다.
2. BBM⁺ 의 세 가지 배양액을 0.01의 OD_600nm 로 희석합니다. 각 배양액에서 최소 20mL를 만드십시오. 이 세 가지 문화는 기술적 복제를 나타냅니다.
3. 파괴 샘플링을 사용하여 시간 경과에 따른 OD_600nm 의 반복 성장 곡선을 수행합니다.
   1. 2.1단계에서 24개의 피어싱된 2mL 튜브를 준비하고, 8개씩 3세트로 분리하고, 이러한 기술 복제 1, 2 및 3(예: 복제 1로 레이블이 지정된 8개의 튜브 등)에 레이블을 지정합니다.
   2. 3.2단계에서 희석된 3개의 배양액 각각에서 1.5mL를 7개의 준비된 튜브에 피펫팅합니다. 나머지 튜브에 음성 대조군으로 1.5mL의 BBM+를 채웁니다.
4. 75 °C 및 400 RPM의 열믹서에서 24개의 튜브를 모두 배양합니다. 가스 투과성 멤브레인으로 밀봉하십시오. 일정한 간격(예: 0, 4, 8, 12, 24, 36, 48시간)으로 3개의 반복 횟수 각각에서 하나의 튜브를 제거하고 분광 광도계를 사용하여 OD_600nm 를 측정한 다음 튜브를 폐기합니다. 튜브를 제거한 후 가스 투과성 멤브레인을 교체하십시오.
5. 동시에 OD_600nm와 인구 밀도 간의 관계를 결정합니다. BBM⁺ 매체에서 최소 3개의 시점(이상적으로는 시작, 중간 및 끝)에 대해 직렬 희석(1 x ^10-1에서 1 x ^10-6)을 수행합니다. 각 희석액 100μL를 고체 BBM⁺ 배지에 접종합니다(1.4단계에서 준비).
   참고: 일관된 콜로니 성장과 정확한 계수를 달성하려면 L자형 스프레더 또는 유리 비드를 사용하는 것과 같은 기계적 확산을 수행하지 않고 희석된 배양액을 고체 매체에 피펫팅하는 것이 가장 좋습니다. 기계적 확산은 군체 형성에 악영향을 미치는 것으로 보인다.
6. 콜로니가 나타날 때까지 75°C의 정적 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다(5-7일).
   1. 이 기간 동안 플레이트가 과도하게 건조되지 않도록 인큐베이터를 습하게 유지하지 않으면 콜로니가 형성되지 않습니다.
   2. 젖은 천을 깐 닫힌 폴리프로필렌 상자에 플레이트를 넣으면 됩니다. 통기를 가능하게 하기 위해 상자 뚜껑을 세 번 이상 뚫습니다.
   3. 인큐베이터에 물통을 넣어 습도를 높입니다. 매일 양동이를 보충하십시오.
7. 모든 OD_600nm 측정값이 수집되면 OD_600nm 와 시간 간의 관계에 로지스틱 곡선을 맞추어 기하급수적 성장 단계에 도달하는 데 걸리는 시간과 시간을 두 배로 결정합니다(예: R의 growthcurver 패키지에서 SummarizeGrowth 사용).
8. 고체 매체에 가시적인 콜로니가 형성되면 희석 계수에서 카운팅을 목표로 하는 콜로니 형성 단위(CFU)를 계산하여 최상의 정확도를 위해 50-100개의 콜로니를 생성합니다.
9. 다음 공식을 사용하여 배양 배지의 세포 밀도를 계산합니다: CFU/mL = 콜로니 수/(도금 부피 × 희석 계수).
10. 로그-로그 선형 회귀를 수행하여 log10(CFU)과 log10(OD_600nm) 간의 관계를 확인합니다. 따라서 회귀 모델의 기울기 및 절편에서 주어진 OD에 대해 예측된 CFU/mL을 계산합니다(예측된 CFU = 10^{[기울기 × log10(OD600nm) + 절편]}).
11. (선택 사항) 또한 진탕 인큐베이터에서 3.1-3.10단계를 수행하여 열혼합기에서 유사한 성장이 이루어지고 있는지 확인합니다.

4. 실험적 진화를 위한 독립적인 계보의 시작

1. 1일차: 단일 콜로니를 생성하려면 먼저 위 섹션 2의 모든 단계를 수행하여 시작 문화권을 생성합니다.
2. 3일차: 배양액의 OD_600nm 를 측정하여 지수 단계에서 충분한 밀도에 도달했는지 확인합니다(분광 광도계로 OD_600nm 0.3-0.8).
3. 1 x ^10-1-1 x ^10-6에서 S. acidocaldarius DSM639 배양액의 연속 희석액을 생성하고 각 1 x ^10-5 및 1 x ^10-6 희석액에서 100 μL를 고체 BBM⁺ 배지(섹션 1 및 표 1)가 포함된 6웰 플레이트의 웰에 여러 번 반복하여 퍼뜨립니다. 75 °C에서 3.5 단계와 같이 정적 인큐베이터에서 플레이트를 5-7 일 동안 배양하여 단일 콜로니가 나타납니다.
4. 8-10일(배양 후 5-7일):
   1. 단일 식민지에서 진화하는 혈통의 수를 설정합니다. 각 혈통에 대해 접종 루프를 사용하여 플레이트에서 무작위로 하나의 콜로니를 선택합니다. 1.5mL의 예열된 BBM⁺ 배지가 들어 있는 피어싱된 2mL 튜브에 콜로니를 재현탁시킵니다. 튜브에 적절하게 라벨을 붙입니다.
   2. 원하는 수의 계보에 대해 반복합니다. 여기에서 7 개의 계통이 확립되고 SA1-7로 표시되었습니다. 음성 대조군으로 추가 튜브에 1.5mL의 BBM+를 채웁니다.
   3. 통기성 있는 멤브레인으로 튜브의 상단을 밀봉하고 배양액이 탁해질 때까지 75°C, 400rpm에서 48-72시간 동안 열혼합기에서 배양합니다(분광 광도계에 의한 OD_600nm 0.3-0.8에 해당).
5. 10-12일(접종 후 7-9일):
   1. 벤치탑 원심분리기에서 클론 배양액을 5,000 x g 에서 RT에서 1분 동안 회전시킵니다. 상층액을 버리고 펠릿을 200μL의 액체 BBM⁺로 재현탁시킵니다.
   2. 200 μL 세포 현탁액을 200 μL의 50% 글리세롤(25% v/v 글리세롤)과 혼합하여 7개의 독립적인 계통의 글리세롤 스톡을 생성하고 -80 °C에서 보관합니다. 이들은 진화 실험을 위한 조상 집단이다.

5. 온도 진화 실험 수행

참고: 실험 프로토콜의 주요 측면을 설명하는 개념도가 그림 1에 나와 있습니다.

1. 섹션 4에서 생성된 7개의 조상 집단을 진화 실험에 사용하십시오.
   1. 투과성 멤브레인으로 밀봉된 멸균 피어싱된 2mL 튜브에서 모든 실험적 진화 분석을 수행합니다(위의 섹션 2 설명).
   2. 이러한 집단과 함께 1.5mL의 BBM⁺ 가 있는 별도의 피어싱된 2mL 튜브를 배양이 필요 없는 음성 대조군으로 유지하여 (교차) 오염을 모니터링하고 배양이 성장하지 않음을 나타내는 OD에 대한 임계값을 설정합니다.
2. 온도 처리 설정: 열혼합기를 사용하면 여러 온도 처리를 설정할 수 있습니다. 여기에서 75 °C로 일정하게, 65 °C로 일정하게 유지하고, 4일마다 1°C씩 온도를 낮추어 75-65 °C에서 서서히 떨어지는 온도 처리를 사용합니다('온도 강하 처리').
   참고: 이러한 치료법은 특정 실험 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다. 각 온도 처리에 대해 별도의 열혼합기가 필요합니다.
3. 1일차: 섹션 2에 설명된 단계에 따라 글리세롤 재고(4.5단계에서 준비)에서 조상 개체군을 되살립니다.
4. 3일차:
   1. 이러한 배양액을 0.01의 OD_600nm (분광 광도계로 측정)로 희석하여 총 부피 6mL 이상의 예열된 BBM⁺를 만듭니다. 7개의 희석된 조상 집단 배양액 각각에서 1.5mL를 5.2단계에서 설정된 각 온도 처리에 대해 하나씩 3개의 개별 피어싱된 2mL 튜브에 분취합니다.
      참고: 이 부분 표본 추출 단계는 각 조상 집단에 존재하는 모든 유전적 변이가 진화 실험이 시작될 때 모든 온도 처리에 존재하는지 확인합니다. 이러한 배양은 온도 진화 실험을 시작하기 위해 전달 0(Tx0)으로 작용합니다.
   2. 통기성 있는 멤브레인으로 튜브를 밀봉하고 7개의 조상 집단으로 구성된 각 세트를 별도의 열혼합기에 넣습니다. 각 열혼합기를 필요한 온도와 400rpm으로 설정하여 진화 실험을 시작합니다.
5. 5일차:
   1. 48시간 후 피어싱된 2mL 튜브에 1.5mL의 따뜻하게 데워진 BBM⁺ 배지에 각 Tx0 배양액에서 15μL의 배양액을 접종하여 전사 1(Tx1)을 수행합니다(1:100 희석). 속도를 높이기 위해 가변 폭 멀티채널 피펫을 사용하여 이 단계를 수행하여 단일 실험에서 여러 번의 전송을 동시에 완료하여 배양액이 열혼합기에서 나오는 시간을 줄입니다.
   2. 이전과 마찬가지로 튜브를 각각의 열믹서에 임의의 위치에 다시 넣기 전에 밀봉하십시오. 수동으로 또는 iMetaLab 96 well randomizers를 통해 무작위 추출을 수행합니다.
6. 플레이트 기반 분광 광도계(96웰 플레이트에서 200μL, 동일한 부피의 BBM⁺가 블랭크로 사용됨)에서 Tx0의 OD_600nm를 측정하여 독립 계통의 성장을 추적합니다.
   참고: OD_600nm 는 오염을 방지하기 위해 새로운 매체로 옮긴 후 측정해야 합니다. 광학 밀도는 표준 분광 광도계와 같은 다른 수단으로도 측정할 수 있습니다. 플레이트 기반 분광 광도계를 사용하면 여러 배양을 동시에 측정할 수 있어 프로세스를 간소화할 수 있습니다.
7. Tx2, Tx3 등에 해당하는 7, 9, 11일 등에 대해 5.5 및 5.6단계를 반복합니다. 75 °C 및 65 °C 처리를 위해 온도를 일정하게 유지하십시오. 온도 강하 처리의 경우 두 번째 전달마다 온도를 1°C씩 낮춥니다(즉, Tx2, Tx4, Tx6 등).
8. 10^번째 이동(즉, Tx10, Tx20 등) 후 개체군의 글리세롤 스톡(단계 3.2.3)을 준비하고, 조상 개체군 식별자(예: 1^차 독립 개체군의 경우 SA1) 및 이전 번호(예: 10^번째 이동의 경우 Tx10)로 튜브를 라벨링합니다. 나중에 이러한 글리세롤 스톡을 사용하여 개체군을 되살려 시간이 지남에 따라 개체군이 어떻게 변했는지 연구하거나 필요한 경우(예: 오염 또는 배양 손실을 초래하는 예기치 않은 사건으로 인해) 실험을 다시 시작할 수 있습니다.
9. 미리 결정된 수의 전송 동안 또는 미리 결정된 수의 세대가 경과할 때까지 실험을 진행합니다. 최종 전송시 모든 자손 계통의 글리세롤 스톡을 준비하십시오.
   참고: 여기서는 Tx22에서 발생한 온도 강하 처리가 65°C에 도달할 때까지 실험을 진행했습니다. 이는 약 150세대에 해당합니다(4.6에서 희석 계수 100을 기준으로 계산: log₂(100) = 전송당 6.64세대). 진화 실험의 길이는 실험 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.

6. 진화 후 실험 성장 분석: 조상 대 진화 혈통

참고: 성장/피트니스 분석 프로토콜을 설명하는 개념도는 그림 2에 나와 있습니다.

1. 피어싱된 2mL 튜브에 1.5mL BBM⁺를 준비합니다. 모든 후손 혈통과 각 조상 혈통을 성장시킬 수 있는 충분한 튜브를 준비하십시오.
2. 2.2-2.5 단계에서 설명 된 방법을 사용하여 진화 실험의 최종 전달 후 5.9 단계에서 저장된 조상 개체군과 각 자손 개체군을 되살리되, 진화 실험의 마지막 두 전달에 대해 각 개체군이 경험 한 온도, 즉 75 °C 일정한 처리의 경우 75 °C, 65 °C 일정한 및 온도 강하 실험의 경우 65 °C에서 배양합니다. 비슷한 인구 밀도를 달성하려면 72시간 동안 75°C 배양을, 120시간 동안 65°C 배양을 수행합니다.
3. 플레이트 기반 분광 광도계를 통해 성장된 배양물의 OD_600nm 를 측정합니다.
4. 세 번의 반복으로 두 온도(즉, 75°C 및 65°C)에서 각 하위 개체군과 각 조상 균주에 대한 성장 분석을 수행합니다. 2mL의 BBM⁺로 피어싱된 1.5mL 원심분리기 튜브를 준비합니다. 각 진화된 혈통과 각 조상 계통에 대해 6개의 튜브를 준비합니다. 계통 이름(SA1-7 또는 조상), 성장 온도(75 °C 또는 65 °C) 및 복제 ID(1, 2 또는 3)로 튜브에 레이블을 지정합니다.
   참고: 6개 미만의 열혼합기를 사용할 수 있는 경우 성장 분석을 여러 실험 블록에 걸쳐 여러 날에 걸쳐 복제할 수 있습니다. 이 경우 블록 효과를 통계적으로 추정하고 설명할 수 있도록 각 실험 블록에서 각 계통과 조상을 측정하는 것이 중요합니다.
5. 준비된 6개의 튜브에 있는 신선한 배지에 각 후손 혈통 및 조상 계통의 15μL의 배양액을 접종합니다.
6. 3개의 열혼합기를 75°C로, 3개의 열혼합기를 65°C로 설정하여 각 열혼합기를 복제 ID로 지정합니다. 온도에 해당하는 열혼합기에 튜브를 넣고 ID를 복제합니다. 각 thermomixer 내에서 계통과 조상이 이질성을 제어하기 위해 무작위로 배치되도록 합니다.
7. 24개의 튜브로 구성된 각 세트를 투과성 멤브레인으로 밀봉합니다. 48시간 동안 배양합니다.
8. 각 배양액에서 200μL를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 분광 광도계를 사용하여 OD_600nm 를 측정합니다.
   참고: 가변 너비 다중 채널 피펫을 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브와 96웰 플레이트 간의 이동을 용이하게 할 수 있습니다.
9. 통계 소프트웨어(예: R)를 사용하여 데이터를 플롯하고 분석합니다.

7. 진화된 계통의 전체 게놈 염기서열 분석 및 돌연변이 식별

1. 섹션 5.9, 48-72 시간의 75 ° C에서 사전 예열 된 BBM ⁺ 에서 5.9 단계로 저장된 하위 혈통을 되살려 각 냉동 개체군의 얼음 조각을 BBM ⁺ 에 접종합니다. 섹션 2, 2.2-2.5 단계와 같이 충분한 양의 게놈 DNA를 얻기 위해 1-10mL의 배양량을 준비합니다. 필요한 정확한 부피는 7.2 또는 7.3 단계 (아래)에서 시퀀싱을 위해 선택한 옵션에 따라 다릅니다.
   참고: 조상 개체군을 시작하는 데 사용되는 균주를 염기서열화하는 것도 좋은 습관입니다. 이것은 후손 계통에서 발견되는 어떤 돌연변이가 진화 실험 중에 발생했는지, 그리고 그 이전에 발생했는지를 정확하게 결정하기 위함이다.
2. (옵션 1) 게놈 DNA를 추출하고 Illumina 염기서열분석을 위한 Illumina 염기서열분석 라이브러리를 준비합니다.
   1. 박테리아용 상업용 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고 정제합니다.
   2. 추출된 게놈 DNA가 제공자가 권장하는 상용 키트를 사용하여 염기서열 분석 제공자의 수량 및 품질 요구 사항을 충족하는지 확인합니다.
   3. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 게놈 DNA 라이브러리 준비를 수행합니다. 250bp 페어드 엔드 프로토콜이 권장됩니다. 추출된 게놈 DNA는 시퀀싱 제공자에게 샘플을 제출할 준비가 될 때까지 -20°C에서 보관합니다.
3. (옵션 2) 또는 DNA 추출, 게놈 DNA 품질 검사, Illumina 라이브러리 준비 및 Illumina 염기서열 분석을 통합 서비스로 수행하는 상용 제공업체에 샘플을 보냅니다.
4. 염기서열 분석된 게놈을 분석하여 돌연변이를 식별합니다.
   1. FASTQ 파일을 수신하고, 시퀀싱 공급자가 아직 수행하지 않은 경우 Q15의 슬라이딩 윈도우 품질 컷오프와 함께 Trimmomatic을 사용하여 어댑터 트리밍을 수행합니다.
   2. 트리밍된 FASTQ 파일을 사용하여 breseq 파이프라인(버전 0.38.1)을 실행하여 돌연변이를 감지하고 게놈 DNA 판독값을 선택한 균주에 대한 참조 서열과 비교합니다. S. acidocaldarius DSM639의 경우 RefSeq ID NC_007181입니다.

8. (선택 사항) 열혼합기 대 인큐베이터 에너지 소비량 평가

1. 성장을 위해 인큐베이터와 열혼합기를 사용할 때의 에너지 소비를 비교하려면 에너지 모니터링 플러그를 사용하여 24시간 동안 각 장치의 에너지 소비를 측정하십시오.
2. 두 개의 플러그를 사용하여 두 장치의 에너지 소비를 동시에 측정하십시오. 또는 연속된 날짜에 에너지 소비를 측정합니다.
3. 전기 소켓에서 인큐베이터 또는 열믹서를 분리합니다. 에너지 모니터링 플러그를 소켓에 꽂고 모니터링 및 제어 소프트웨어 설치를 포함하여 제조업체의 지침에 따라 초기화합니다.
4. 인큐베이터 또는 열혼합기를 에너지 모니터링 플러그에 꽂고 최소 2시간(이상적으로는 24시간 이상) 동안 작동시켜 일반적인 에너지 소비를 잘 추정할 수 있습니다. 각 장치의 에너지 소비를 기록합니다.

성장 곡선 측정
S. acidocaldarius DSM639의 성장 곡선은 그림 3A에 나와 있습니다. 성장은 열혼합기를 사용한 배양과 기존 인큐베이터를 사용한 배양을 비교할 때 유사한 것으로 나타났습니다. 평균 성장률 매개변수는 로지스틱 곡선을 각 반복된 성장 곡선에 맞추고 평균 및 표준 오차를 계산하여 추정했습니다. 열혼합기와 인큐베이터에서 중간 지수 단계까지의 시간은 각각 27.2시간 ± 1.1시간 및 31.1시간 ± 1.9시간이었습니다. 75°C에서 열혼합기와 인큐베이터의 예상 초기 증식 시간은 각각 4.29시간 ± 0.28시간 및 4.19시간 ± 0.44시간이었으며, 이는 이전에 발표된 값24와 일치합니다. 로그10(OD600nm)과 로그10(CFU) 사이의 관계는 선형 모델(조정된 R2 = 0.82, F(1,22) = 104, p < 0.00001, 기울기 = 1.73 ± 0.17, 절편 = 9.73 ± 0.14)에 의해 잘 특성화되었습니다. 따라서 OD600nm와 CFU의 관계는 CFU = 10(1.73 × log10(OD600nm) + 9.73) 공식으로 주어집니다. 따라서 0.3의 OD600nm는 약 6.7 × 108 CFU/mL에 해당합니다(그림 3B).

온도 진화 실험
S. acidocaldarius DSM639에서 파생된 7개의 독립적인 계통을 사용하여 일정한 75°C, 일정한 65°C 및 온도 강하(75-65°C, 두 번의 전달마다 1°C씩 감소)의 세 가지 온도 조건이 시작되었습니다. OD600nm 측정은 실험의 45일(75°C에서 약 150세대) 동안 각 전달 후 수행되었으며 그림 4에 나와 있습니다. 며칠에 걸쳐 수행된 OD600nm 측정은 성장 기간, 온도 등과 같은 미묘한 차이의 영향을 받을 수 있기 때문에 본질적으로 잡음이 있습니다. 그러나 며칠에 걸쳐 수행된 측정은 개체군의 생존 가능성을 평가하는 데 여전히 유용할 수 있을 뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 체력이 향상되고 있는지에 대한 지표를 제공할 수 있습니다. 일정한 75 ° C 조건에서의 계통은 실험이 끝날 때까지 0.125-0.3의 초기 범위에서 0.248-0.471의 범위로 OD600nm에서 증가했습니다. 이것은 이 치료로 체력이 향상되었음을 시사합니다. 대조적으로, 일정한 65 ° C 처리의 계통은 초기 0.018-0.087 범위에서 최종 시점에서 0.008-0.04로 OD600nm의 감소를 나타 냈습니다. 이는 개체군이 65°C의 일정한 온도에 적응할 수 없었음을 시사하지만, 생존 가능한 유기체를 회수할 수 있다는 사실은 개체군이 연속적인 희석을 통해 씻겨 나가지 않았음을 보여주며, 이는 어느 정도의 적응을 시사합니다. 마지막으로, 온도 강하 처리의 모집단은 초기 OD600nm 범위인 0.099-0.279에서 Tx6에서 0.3-0.39(이 처리에서 288시간 및 73°C에 해당)로 증가한 후 최종 시점에서 0.003-0.024 범위로 꾸준히 감소했습니다.

성장/피트니스 분석
진화 실험에 따른 각 후손 집단에 대해 적합성 분석을 수행했습니다. OD600nm 는 7개의 독립적인 계통 모두에 대해 48시간 성장 후 분석한 후 '선택 환경'을 주요 효과로, '복제/열혼합기'를 블록 효과로 사용하여 각 분석 온도에 대해 R에 선형 모델을 피팅했습니다. 조상 균주의 성장은 치료 대조를 위한 기준 수준으로 사용되었습니다. 데이터는 그림 5에 나와 있습니다.

75 °C에서 분석했을 때, 일정한 75 °C (t-test: t210=3.64, p=0.0003) 및 일정한 65 °C(t-test: t210=2.8, p=0.005) 처리로부터의 계통에 대한 조상 변형에 대한 적합성이 평균적으로 유의하게 증가했지만, 온도 강하 처리(t-test: t210=−0.87, p=0.38)입니다. 65 °C에서 분석했을 때, 평균적으로 모든 처리의 계통은 적합성의 증가를 나타냈다(일정한 75 °C 계통; t- 검정 : t210 = 4.68, p<0.0001, 일정한 65 ° C 계통; T- 테스트 : T210, = 4.24, P< 0.0001, 온도 강하 계통; t-검정: t210=3.15, p=0.002). 그러나 두 분석 온도 모두에서 계통 간에 적합성에 상당한 차이가 있었습니다(그림 5). 어떤 혈통들은 조상의 혈통과 크게 다르지 않았거나 체력이 감소하였다; 이는 특히 온도 강하 처리로 인한 계통에서 분명했습니다.

OD600nm 와 CFU/mL 사이의 관계가 진화 실험 중에 변경되었을 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 이것은 진화된 계통에 대한 성장 매개변수를 결정하여 평가할 수 있습니다(3.1-3.10단계 참조).

전체 게놈 염기서열 분석 결과
전체 게놈 분석은 S. acidocaldarius DSM639(RefSeq accession NC_007181.1)의 참조 게놈을 사용하여 일정한 75°C 조건에서 7개 계통에 대해 breseq(버전 0.38.1)25를 사용하여 수행되었습니다. 모든 후손 계통의 게놈에 걸쳐 삽입, 결실 및 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)과 관련된 다양한 돌연변이가 밝혀졌습니다(표 2). 단백질 코딩 유전자에서 다중 삽입 및 비동의어 돌연변이가 발생했으며, 유전자 프로모터 영역의 프레임 시프트로 인해 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 유전자 간 영역에서도 발생했습니다. 일부 돌연변이는 세포벽 생합성, 전사, 대사, 세포 수송 및 촉매 활성과 같은 다양한 기능에 관여하는 유전자의 여러 후손 계통에 걸쳐 일관되었습니다(표 2). 이러한 돌연변이 중에는 7 개 계통 중 5 개 계통에서 54,667 개의 염기쌍이 대량으로 결실되었습니다. 이는 각 모집단에 대한 누락된 커버리지 증거 플롯(빈도 93.2%에서 100% 범위)에 의해 확인되었습니다. 삭제된 영역은 53개의 유전자가 손실되는 것과 같습니다. 적응에서 이러한 유전자의 역할은 향후 연구에서 조사될 것입니다. DSM639의 사용된 분리체와 발표된 참조 서열(보충 표 1 참조) 간에 몇 가지 차이점이 확인되었습니다.

쉐이킹 인큐베이터와 열믹서의 에너지 소비 비교
진탕 인큐베이터의 에너지 소비는 일반적인 배양 온도 범위와 여기에 사용된 75°C 온도에서 상업적으로 이용 가능한 에너지 모니터링 스마트 플러그를 사용하는 열혼합기와 비교되었습니다. 75°C에서 열혼합기는 기존 진탕 인큐베이터의 약 1/40 에너지를 소비했으며(그림 6), 이는 열혼합이 실험적 진화와 관련된 탄소 발자국을 줄일 수 있는 잠재적 수단임을 시사합니다.

그림 1: 세 가지 온도 처리에 걸친 진화 실험 프로토콜을 보여주는 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 성장/적합성 분석 프로토콜의 단계를 보여주는 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: S. acidocaldarius DSM639에 대한 주요 성장 파라미터 결정 및 배양 장치 비교. 3개의 복제 배양물을 7개의 개별 튜브에서 75°C에서 성장시켰습니다. 파괴 샘플링은 (A) OD600nm 를 측정± 데 사용되었습니다( n=3 기술 반복의 표준 오차를 의미하며, 일부 오차 막대는 플로팅 기호보다 작음). 곡선은 적합한 로지스틱 성장 모델 및 (B) 콜로니 형성 단위(CFU)를 나타냅니다. 선은 적합된 로그-로그 선형 회귀 모델을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 진화 실험 중에 얻은 광학 밀도(OD600nm)에 대한 대표적인 결과. 약 150세대에 걸쳐 수행된 세 가지 온도 처리(일정 65°C, 일정 75°C, 강하 75°C-65°C)에서 진화 실험 중에 측정된 독립적인 계통의 광학 밀도. 곡선은 각 독립적인 계보에 대해 시간이 지남에 따라 황토가 매끄럽게 변하는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 성장 분석의 대표적인 결과. 조상 균주와 비교하여 온도 진화 실험(일정 65°C, 일정 75°C, 강하 75°C-65°C)에 따라 S. acidocaldarius DSM639에서 파생된 독립적인 계통에 대한 성장 분석. 모든 계통에 대해 성장은 65 °C 및 75 °C에서 분석되었습니다. 컬러 포인트는 기술 복제의 평균 ± 표준 오차를 보여줍니다 (회색으로 표시, 조상에 대해 n = 12, 진화 된 각 계통에 대해 n = 3). 회색 막대는 조상 적합성의 평균 ± 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 기존 인큐베이터와 열혼합기 장치의 에너지 소비. 에너지 소비는 시중에서 판매되는 에너지 모니터링 스마트 플러그를 사용하여 2시간 동안 기록되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: S. acidocaldarius를 성장시키는 데 필요한 배지 레시피 및 원액. 모든 매체 및 원액은 이중 증류된 H2O (ddH2O)로 만든 다음 표시된 대로 0.22 μm 필터를 통해 고압멸균 또는 필터 멸균으로 멸균해야 합니다. 모든 미디어 및 스톡 솔루션을 준비하는 방법에 대한 자세한 설명은 프로토콜의 섹션 1을 참조하십시오. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 후손 계통의 전체 게놈 염기서열 분석에 대한 대표적인 결과 . 일정한 75 °C 처리에서 S. acidocaldarius DSM639의 후손 혈통에서 발견되는 돌연변이. 돌연변이는 S. acidocaldarius DSM639에 대한 참조 서열에 비해 몇 가지 변화를 가지고 있는 계통의 직계 조상에 대한 상대적인 변화를 나타냅니다(RefSeq NC_007181; 조상에서의 돌연변이는 보충 표 1에 나와 있음). n 은 돌연변이가 발견된 계통의 수를 나타냅니다. '전방 판독 프레임'에 → 유전자; '역판독틀(reverse reading frame)'에 ← 유전자가 있다. †이러한 변화는 S. acidocaldarius DSM639의 분리체에 존재하는 (A)10→11 프레임시프트에 상대적이다(보충 표 1). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 참조 서열에 대한 S. acidocaldarius DSM639의 분리에 존재하는 돌연변이(RefSeq accession NC_007181.1). '전방 판독 프레임'에 → 유전자; '역판독틀(reverse reading frame)'에 ← 유전자가 있다. ‡SACI_RS04020는 NC_007181.1에서 pseudogene으로 주석이 추가되었지만, 여기에서 관찰된 Δ1 bp frameshift 돌연변이는 돌연변이와 마찬가지로 기능을 복원하는 것으로 추정되며, rgy reverse gyrase 유전자에 100% 동일성을 가진 단백질을 암호화합니다(RefSeq accession WP_176586667.1). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.