Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy(전자 극저온 현미경에서 파생된 맵으로 리간드 모델링)

Summary

이 프로토콜은 거대분자의 CryoEM 맵에서 소분자 리간드를 모델링하는 데 사용할 수 있는 도구를 소개합니다.

Abstract

고분자 복합체에서 단백질-리간드 상호 작용을 해독하는 것은 분자 메커니즘, 근본적인 생물학적 과정 및 약물 개발을 이해하는 데 매우 중요합니다. 최근 몇 년 동안 극저온 시료 전자 현미경(cryoEM)은 거대분자의 구조를 측정하고 원자 분해능에 가까운 리간드 결합 모드를 조사하는 강력한 기술로 부상했습니다. CryoEM 맵에서 비단백질 분자를 식별하고 모델링하는 것은 관심 분자 전체의 이방성 분해능과 데이터에 내재된 노이즈로 인해 종종 어렵습니다. 이 기사에서 독자들은 현재 리간드 식별, 모델 구축 및 선택된 거대분자를 사용한 원자 좌표 미세화에 사용되는 다양한 소프트웨어와 방법을 소개합니다. 에놀라아제 효소로 예시된 바와 같이 리간드의 존재를 식별하는 가장 간단한 방법 중 하나는 리간드가 있는 경우와 없는 상태에서 얻어진 두 개의 맵을 빼는 것입니다. 리간드의 추가 밀도는 더 높은 임계값에서도 차이 맵에서 두드러질 수 있습니다. 대사성 글루타메이트 수용체 mGlu₅의 경우에서 볼 수 있듯이 이러한 간단한 차이 맵을 생성할 수 없는 경우가 있습니다. 최근에 도입된 Fo-Fc 생략 맵을 유도하는 방법은 리간드의 존재를 검증하고 입증하기 위한 도구 역할을 할 수 있습니다. 마지막으로, 잘 연구된 β-갈락토시다아제를 예로 들어 CryoEM 맵의 리간드 및 용매 분자 모델링에 대한 분리능의 효과를 분석하고 CryoEM이 약물 발견에 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 전망을 제시합니다.

Introduction

세포는 무수한 화학 반응을 동시에 독립적으로 수행함으로써 기능을 수행하며, 각 화학 반응은 환경 신호에 대한 반응으로 생존과 적응성을 보장하기 위해 세심하게 조절됩니다. 이는 생체 분자, 특히 단백질이 다른 거대분자 및 소분자 또는 리간드와 함께 일시적이거나 안정적인 복합체를 형성할 수 있도록 하는 분자 인식에 의해 달성됩니다¹. 따라서 단백질-리간드 상호 작용은 단백질 발현 및 활성의 조절, 효소에 의한 기질 및 보조 인자의 인식, 세포가 신호를 인식하고 전달하는 방법을 포함하는 생물학의 모든 과정에 기본이 됩니다 ^1,2. 단백질-리간드 복합체의 동역학적, 열역학적, 구조적 특성을 더 잘 이해하면 리간드 상호작용의 분자적 기초를 밝히고 약물 상호작용 및 특이성을 최적화하여 합리적인 약물 설계를 촉진할 수 있습니다. 단백질-리간드 상호 작용을 연구하는 경제적이고 빠른 접근 방식은 다양한 범위의 작은 분자를 가상으로 스크리닝하고 이러한 리간드의 결합 모드와 친화도를 예측하여 표적 단백질에 대한 친화도를 예측하는 계산 방법인 분자 도킹을 사용하는 것입니다³. 그러나 X선 회절(XRD), 핵 자기 공명(NMR) 또는 전자 초저온 현미경(cryoEM)으로 측정된 고해상도 구조의 실험적 증거는 이러한 예측에 대한 필수 증거를 제공하고 주어진 표적에 대한 새롭고 더 효과적인 활성제 또는 억제제의 개발을 지원합니다. 이 기사에서는 일반적으로 언급되는 기술인 'cryoEM'이라는 약어를 사용합니다. 그러나 올바른 명명법을 선택하는 것에 대한 논쟁이 진행 중이며, 최근에는 샘플이 극저온 온도에 있고 전자로 이미징되었음을 나타내기 위해 cryogenic-sample Electron Microscopy(cryoEM)라는 용어가 제안되었습니다⁴. 마찬가지로 CryoEM에서 파생된 맵은 전자 전위, 정전기 전위 또는 쿨롱 전위라고 하며 단순화를 위해 여기서는 CryoEM 맵 5,6,7,8,9,10을 사용합니다.

XRD는 단백질-리간드 복합체의 고분해능 구조 측정에서 황금 표준 기술이었지만, 지난 몇 년 동안 전자 현미경 데이터베이스(EMDB)^12,13에 기탁된 쿨롱 전위 맵 또는 cryoEM 맵의 급증에서 알 수 있듯이 분해능 혁명^{이후 11} cryoEM이 추진력을 얻었습니다 ¹⁴. 시료 전처리, 이미징 및 데이터 처리 방법의 발전으로 인해 2010년에서 2020년 사이에 CryoEM을 사용하는 PDB(Protein Data Bank)¹⁴ 증착의 수가 0.7%에서 17%로 증가했으며, 2020년에 보고된 구조의 약 50%가 3.5 Å 해상도 또는 그 이상의 해상도에서 측정되었습니다^15,16. CryoEM은 유연하고 비결정성 생물학적 거대분자, 특히 막 단백질 및 다중 단백질 복합체를 거의 원자 분해능으로 연구할 수 있게 해주어 결정화 과정을 극복하고 XRD에 의한 고해상도 구조 측정에 필요한 회절이 잘 되는 결정을 얻을 수 있기 때문에 제약 산업을 포함한 구조 생물학 커뮤니티에서 빠르게 채택되고 있습니다.

CryoEM 맵에서 리간드를 정확하게 모델링하는 것은 분자 수준에서 단백질-리간드 복합체의 청사진 역할을 하기 때문에 매우 중요합니다. 리간드를 전자 밀도^17,18,19,20에 맞추거나 구축하기 위해 리간드 밀도의 모양과 토폴로지에 의존하는 X선 결정학에 사용되는 몇 가지 자동화된 리간드 구축 도구가 있습니다. 그럼에도 불구하고, 해상도가 3 Å보다 낮으면, 이러한 접근법은 인식 및 구축을 위해 의존하는 위상학적 특징이 덜 정의되기 때문에 바람직하지 않은 결과를 생성하는 경향이 있습니다. 많은 경우에, 이러한 방법은 리간드를 CryoEM 맵으로 정확하게 모델링하는 데 효과적이지 않은 것으로 입증되었는데, 이는 이러한 맵이 일반적으로 3.5 Å-5 Ź⁷ 사이의 중저 분해능 범위에서 결정되었기 때문입니다.

CryoEM에 의한 단백질-리간드 복합체의 3D 구조 측정의 첫 번째 단계는 리간드를 단백질과 함께 공동 정제하거나(리간드가 단백질에 대한 결합 친화도가 높은 경우) 그리드 준비 전에 특정 기간 동안 단백질 용액을 리간드로 배양하는 것입니다. 그 후, 소량의 시료를 플라즈마로 세척된 구멍이 있는 TEM 그리드에 배치한 다음 액체 에탄에서 급속 동결하고 최종적으로 cryo-TEM으로 이미징합니다. 수십만 개에서 수백만 개의 개별 입자에서 얻은 2D 투영 이미지를 평균화하여 거대분자의 3차원(3D) 쿨롱 전위 맵을 재구성합니다. 이러한 맵에서 리간드와 용매 분자를 식별하고 모델링하는 것은 맵 전체의 이방성 분해능(즉, 분리능이 거대분자 전체에서 균일하지 않음), 리간드가 결합된 영역의 유연성 및 데이터의 노이즈로 인해 많은 경우에 심각한 문제를 제기합니다. XRD를 위해 개발된 많은 모델링, 개선 및 시각화 도구는 현재 동일한 목적으로 CryoEM에서 사용하도록 조정되고 있습니다 18,19,20,21. 이 기사에서는 현재 리간드를 식별하고, 모델을 구축하고, CryoEM에서 파생된 좌표를 미세 조정하는 데 사용되는 다양한 방법과 소프트웨어에 대한 개요를 제공합니다. 다양한 해상도와 복잡성을 가진 특정 단백질-리간드 복합체를 사용하여 리간드를 모델링하는 데 관련된 프로세스를 설명하기 위해 단계별 프로토콜이 제공되었습니다.

CryoEM 맵에서 리간드를 모델링하는 첫 번째 단계에는 맵에서 리간드 밀도(비단백질)를 식별하는 것이 포함됩니다. 리간드 결합이 단백질의 구조적 변화를 유발하지 않는 경우, 단백질-리간드 복합체와 apo-단백질 사이의 간단한 차이 맵을 계산하면 기본적으로 추가 밀도 영역이 강조되어 리간드의 존재를 암시합니다. 이러한 차이는 두 개의 맵만 필요하기 때문에 즉시 관찰할 수 있으며, 3D 정제 과정에서 중간 맵도 사용하여 리간드가 있는지 확인할 수 있습니다. 또한 분해능이 충분히 높으면(<3.0 Å) 차이 맵은 물 분자의 위치뿐만 아니라 리간드 및 단백질 잔류물과 상호 작용하는 이온에 대한 통찰력을 제공할 수도 있습니다.

apo-protein map이 없는 경우, 이제 독립형 도구로 사용할 수 있고 Refmac 개선의 일부로 CCP-EM 소프트웨어 제품군^23,24에 통합되었으며 CCP4 8.0 릴리스 ^25,26에서도 Servalcat²²를 사용할 수 있습니다. Servalcat을 사용하면 날카롭지 않은 half-map과 apoprotein 모델을 입력으로 사용하여 FSC 가중 차이(Fo-Fc) 맵을 계산할 수 있습니다. Fo-Fc 생략 맵은 실험 맵(Fo)과 모델에서 파생된 맵(Fc) 간의 차이를 나타냅니다. 모델에 리간드가 없는 경우, 실험적 EM 맵과 겹치는 Fo-Fc 맵의 양성 밀도는 일반적으로 리간드의 존재를 암시합니다. 여기서 가정은 단백질 사슬이 맵에 잘 맞고 나머지 양의 밀도가 리간드의 위치를 나타낸다는 것입니다. 그러나 양의 밀도가 단백질 곁사슬의 잘못된 로타머와 같은 모델링 부정확성에서 비롯된 것인지 여부를 꼼꼼하게 조사하는 것이 중요합니다.

두 번째 단계는 사용 가능한 화학 정보에서 잘 정의된 형상을 가진 리간드의 데카르트 좌표 파일을 얻거나 만드는 것입니다. CCP4 단량체 라이브러리에서 이미 사용할 수 있는 표준 리간드(예: ATP 및 NADP⁺)는 단량체 접근 코드를 통해 좌표 및 형상 파일을 검색하여 미세화에 사용할 수 있습니다. 그러나 알려지지 않았거나 비표준 리간드의 경우 다양한 도구를 사용하여 형상 파일을 생성할 수 있습니다. 일부 예로는 Phenix²⁸의 eLBOW²⁷ - (전자 리간드 빌더 및 최적화 워크벤치), Lidia - Coot²⁹의 내장 도구, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Schrodinger 제품군 내 Glide의 Ligprep^32-a 모듈이 있습니다. 그런 다음 리간드 좌표 파일은 실험용 cryoEM 맵과 Coot의 차이 맵에 의해 안내되는 밀도에 맞춰집니다. 그 다음에는 Phoenix²⁸의 실제 공간 미세 조정 또는 Refmac³³의 상호 미세 조정이 이어집니다. 좋은 그래픽 카드와 위에서 언급한 소프트웨어가 장착된 Linux 워크스테이션 또는 랩톱이 필요합니다. 이러한 프로그램의 대부분은 다양한 제품군에 포함되어 있습니다. CCP-EM²⁴ 및 Phoenix²⁸은 교육용 사용자가 무료로 사용할 수 있으며 Coot, Refmac5 ^33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine 등 이 기사에서 사용되는 다양한 도구가 포함되어 있습니다. 마찬가지로 Chimera³⁷ 및 ChimeraX³⁸은 교육용 사용자에게 무료 라이선스를 제공합니다.

Protocol

1. Mycobacterium tuberculosis의 에놀라아제에서 포스포에놀피루베이트(PEP) 모델링

1. PEP-enolase 복합체의 CryoEM 맵에서 리간드 밀도 식별
   1. EMDB의 추가 데이터에서 apo-enolase의 선명하지 않은 하프 맵(emd_30988_additional_1.map 및 emd_30988_additional_2.map)을 다운로드합니다( 재료 표 참조).
   2. ChimeraX를 엽니다( 재료 표 참조). 도구 모음에서 열기 를 클릭하고 파일 이름을 선택하여 apo-enolase의 하프 맵을 엽니다. 명령줄에 vop add #1 #2 를 입력하여 두 하프 맵을 결합하여 apo-enolase 선명하지 않은 맵을 얻습니다.
      참고: #1 및 #2는 1.1.1단계에서 언급한 바와 같이 apo-enolase 효소에 대한 두 개의 하프 맵을 나타냅니다.
   3. rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map을 입력하여 결합된 맵(ChimeraX 맵 ID: #3)의 이름을 바꿉니다. 모델 패널에서 맵을 회색으로 채색합니다. 이 맵은 에놀라아제가 D4 대칭성을 가진 용액에서 팔각형임을 나타냅니다.
   4. 다음 하프 맵 emd_30989_additional_1.map(맵 ID: 4) 및 emd_30989_additional_2.map(맵 ID: 5)을 사용하여 1.1.1-1.1.3 단계를 반복하여 PEP-enolase-unsharpened-map(맵 ID: #6)을 얻습니다.
   5. 차이 맵을 계산하려면 먼저 ChimeraX의 맵 패널(도구 모음)에서 Fit(맵 내 맵)을 클릭하여 두 맵(1.1.3단계 및 1.1.4단계의 PEP-enolase 및 apo-enolase 선명하지 않은 맵)을 서로 맞춥니다.
      참고: 두 맵 간에 정규화가 수행되지 않습니다. 경우에 따라 맵을 동일한 축척으로 가져오기 위해 정규화가 필요할 수 있습니다.
   6. 명령줄에 vop subtract #6 #3 을 입력하여 apo-enolase 맵에서 PEP-enolase 맵을 뺍니다.
      참고: #6 = PEP-enolase 선명하지 않은 맵, #3 = Apo-enolase 선명하지 않은 맵.
   7. 뺀 지도(지도 ID:7)를 녹색으로 표시하여 양의 밀도를 나타냅니다(X선 결정학의 규칙에 따라)³⁹.
   8. 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 M. tuberculosis octameric enolase(PDB: 7e4x)의 좌표를 다운로드하고 도구 모음에서 열기 를 클릭한 다음 파일 이름을 선택합니다.
   9. 명령행에 rename #8 Apo_enolase.pdb 를 입력하여 모델 이름을 7e4x.pdb로 바꿉니다. #8은 ChimeraX의 Apo_enolase.pdb를 나타냅니다.
   10. 모델 패널에서 모델을 선택합니다. 도구 모음에서 오른쪽 마우스 를 클릭합니다. Move molecule(분자 이동)을 클릭하여 PEP-enolase map(#6)에 근접하게 모델을 배치하고 map을 기준으로 모델을 정렬합니다. 명령줄에 fit #8 in #6 을 입력하여 이 모델을 PEP-enolase-unsharpened-map에 맞춥니다. 여기서 지도는 6으로 번호가 매겨지고 모델은 8로 번호가 매겨집니다.
       참고: 경우에 따라 ChimeraX의 로컬 맞춤이 모델을 정렬하기에 충분하지 않을 수 있습니다. 이러한 경우 Phenix에서 글로벌 피팅의 추가 단계(DockinMap, 재료 테이블 참조)를 수행할 수 있습니다.
   11. 명령줄에 save Apo-enolase.pdb #8 을 입력하여 적합 모델을 저장합니다.
2. PEP-enolase 복합체의 B-factor sharpened cryoEM 맵에서 PEP의 모델링 및 개선
   1. 터미널에서 ./Coot &를 입력하여 "coot"(재료 표 참조)를 엽니다.
   2. 파일을 클릭하여 "Apo-enolase.pdb"를 표시 > 좌표 Apo-enolase.pdb를 엽니다. 좌표 파일은 본드로 표시됩니다(원자별로 색상).
   3. EMDB에서 PEP 바운드 Enolase 선명화 맵(예: emd_30989.map)을 다운로드합니다. 파일 > Open Map > emd_30989.map 을 클릭하여 동일하게 표시합니다. 마우스 가운데 버튼을 스크롤하여 임계값을 7.00 σ 로 설정합니다.
   4. Validate > Unmodeled blobs(모델링되지 않은 blobs 유효성 검사) > Find Blobs(Blob 찾기)를 클릭하여 모델링되지 않은 Blob을 찾습니다.
   5. 에놀라아제 모델의 활성 부위 잔기, Ser 42, Lys-386 및 Arg-364 근처에서 모델링되지 않은 리간드 밀도를 찾습니다.
   6. 파일 > 단량체 가져오기를 클릭하고 PEP를 3글자 코드로 입력하여 Coot 단량체 라이브러리에서 PEP 단량체 모델 파일을 가져옵니다.
   7. 사이드바 메뉴의 Rotate/Translate- Zone/Chain/Molecule 옵션을 사용하여 PEP 분자를 밀도로 이동합니다. 사이드바 메뉴에서 Real Space Refine Zone을 클릭하여 Coot에서 real-space refinement를 사용하여 PEP 분자를 밀도에 맞춥니다. 편집 탭의 merge molecule 옵션을 사용하여 피팅된 리간드를 Apo-enolase.pdb와 병합합니다. 모델을 PEP-Enolase.pdb로 저장합니다.
      참고 : 리간드> Jiggle-Fit Ligand 옵션을 사용하여 리간드를 맞출 수도 있습니다.
   8. 좌표 파일의 나머지 단량체에 리간드를 추가하려면 NCS 도구 > NCS 리간드 계산> 클릭합니다. Find NCS-Related Ligands(NCS 관련 리간드 찾기)라는 별도의 창이 나타납니다. NCS가 있는 단백질 옵션의 경우 좌표 파일 Apo-enolase.pdb 를 선택하고 체인 ID A를 NCS 마스터 체인으로 선택합니다.
      1. 리간드를 포함하는 분자의 경우 좌표 파일로 Apo-enolase.pdb 를 선택하고 체인 ID, J 및 잔차 번호 1 에서 1을 선택합니다. Find Candidate Positions(후보 직위 찾기)를 클릭합니다. Fitted Ligands라는 창이 후보 위치 목록과 함께 나타납니다. 개별 후보 리간드를 클릭하여 피팅을 평가하고 피팅을 시각적으로 분석합니다.
         참고: Servalcat/Refmac에서는 단량체 모델만 제공할 수 있으며 재구성에 사용된 대칭을 제공하여 확장된 모델을 얻을 수 있습니다.
   9. 용매 분자에 대한 추가 밀도도 리간드 근처에서 관찰되었습니다. 다양한 상동체에서 추출한 에놀라아제의 고분해능 결정 구조는 두 개의 Mg²⁺ 이온^40,41의 존재를 시사하며, 이는 아마도 반응 중간체의 음전하를 안정화시킬 것입니다. 포인터에서 place atom을 클릭하고 Pointer Atom type 목록에서 MG를 선택하여 활성 부위 밀도에서 두 개의 Mg²⁺ 이온을 모델링합니다.
      참고: 결합 형상과 거리는 금속 이온을 선택하기 위한 가이드로 사용될 수 있습니다. 단백질 잔기의 산소 원자에 결합된 Mg²⁺ 의 경우, 결합 거리는 팔면체 기하학으로 2.1 Å -2.4 Å 사이에서 다양합니다. 그러나 저해상도 맵의 경우 좌표 영역이 불완전한 경우가 많으며 해상도의 제한으로 인해 거리도 달라질 수 있습니다.
   10. 대칭 관련 단량체에 Mg²⁺ 이온을 추가하려면 1.2.8단계를 반복합니다.
   11. 파일 > 좌표 저장을 클릭하고 파일 이름 > 선택을 > Enolase+PEP+Mg.pdb를 입력하여 모델을 저장합니다.
   12. Phoenix GUI를 엽니다(재료 표 참조). 기본 매개 변수를 사용하여 Enolase+PEP+Mg.pdb 및 emd_30989.map을 각각 입력 모델 및 맵으로 사용하여 실제 공간 미세 조정 작업을 실행합니다. 이 단계는 양호한 지도 모델 맞춤 및 형상을 얻기 위해 Coot를 사용하여 반복적으로 수행됩니다.
       참고: 선명하지 않은 차이 맵은 그림과 같은 리간드의 존재를 보여주는 데 사용됩니다. 모델링을 위해 B-factor 선명하게 한 맵이 사용되었으며 권장됩니다. B-factor sharpened map은 unsharpened map과 달리 데모 목적으로 difference map을 계산하는 데 사용할 수도 있습니다. 그러나 리간드가 결합된 영역에서 해상도가 더 낮으면 전체 맵을 선명하게 하는 데 사용되는 단일 B-factor가 리간드 밀도를 명확하게 나타내지 않을 수 있습니다.
3. 모델링된 리간드의 시각화 및 그림 생성
   1. 파일 > 열기를 클릭하고 파일 이름을 선택하여 PyMOL⁴²의 최종 Phoenix 미세 조정 작업에서 정제된 Enolase+PEP+Mg 모델을 엽니다(재료 표 참조).
   2. 파일 > 열기를 클릭하고 파일 이름을 선택하여 emd-30989.map(PEP 바운드 샤프닝 맵)을 로드합니다.
   3. emd_30989 개체에 대해 이름을 바꾼 작업을 클릭하고 PEP-sharpened를 입력하여 맵의 이름을 PEP-sharpened> 바꿉니다.
      참고: 대부분의 경우(예: enolase), pymol에서 열릴 때 맵은 pymol에서 기본적으로 map(맵 정규화) 옵션이 선택되어 있으므로 정규화됩니다. CryoEM 맵은 더 큰 상자의 중앙에 있기 때문에 정규화에는 상자 안의 모든 것이 포함됩니다. 따라서 pymol에서 열기 전에 정규화를 끌 수 있습니다.
   4. display > sequence를 클릭하여 리간드를 선택합니다.
   5. 명령행에 isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.
   6. mesh_ligand 개체 옆에 있는 마지막 상자인 C를 클릭하여 mesh_ligand 파란색으로 채색합니다.
   7. 활성 부위 잔기, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 및 Lys-386은 각각 스틱 및 구 표현으로 PEP 및 Mg²⁺ 와 상호 작용하고 에놀라아제 효소를 만화 표현으로 표시합니다.
   8. ray 3600, 3600을 입력하여 게시 품질의 이미지를 생성하고 파일 > 저장을 클릭하고 파일 이름으로 PEP.png를 선택하여 png 파일로 저장하여 레이 트레이싱합니다.

2. 대사성 글루타메이트 수용체 mGlu 5의 리간드 모델링

1. 작용제 및 길항제 결합 mGlu의 CryoEM 맵에서 리간드 밀도 식별 및 모델링₅
   1. 작용제 결합(EMD-31536, 7fd8.pdb) 및 길항제 결합(EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu₅ 복합체 각각에 대한 해당 좌표 파일과 함께 두 개의 하프맵을 다운로드합니다.
   2. 키메라X를 엽니다.
      1. 열기를 클릭하고 7fd8.pdb를 선택하여 좌표 파일 7fd8.pdb를 엽니다.
      2. 명령줄에 delete ligand 를 입력하고 Enter 키를 누릅니다.
      3. 마찬가지로 delete/B 명령을 사용하여 체인 B를 삭제합니다.
         참고: 리간드와 사슬은 상단의 드롭다운 메뉴에서 atoms/bond>s > select 및 action을 사용하여 삭제할 수 있습니다.
      4. 명령행에 save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1을 입력하여 unliganded pdb를 저장하십시오. #1은 모델 ID를 나타냅니다.
      5. 7fd9.pdb에 대해 2.1.2.1-2.1.2.4 단계를 반복합니다.
   3. CCP-EM을 엽니다. mGlu₅ 라는 새 프로젝트를 만들고 프로젝트 디렉터리와 사용자 이름을 지정합니다.
      1. 왼쪽 패널의 옵션에서 Relion 을 엽니다.
         1. 마스크 생성 탭으로 이동합니다.
         2. EMD-31536의 하프 맵 중 하나를 입력으로 제공합니다.
            참고: Relion은 .mrc가 접미사로 포함된 맵을 허용하며 EMD 맵에는 .map 접미사가 있습니다. 지도 파일은 검사를 위해 ChimeraX에서 열고 .mrc 형식으로 저장할 수 있습니다.
         3. 마스크 탭에서 픽셀 크기를 0.89 Å로, 초기 이진화 임계값을 0.007로 제공합니다.
         4. 별칭 31536(또는 쉽게 따를 수 있는 다른 이름)으로 작업을 실행합니다.
         5. 마찬가지로 EMD - 31537 하프 맵에 대한 마스크를 만듭니다.
      2. CCPEM의 왼쪽 패널에 있는 옵션에서 Refmac Servalcat 프로그램을 엽니다.
         1. 이름을 mGlu₅_agonist로 제공합니다.
         2. 모델 섹션 2.1.2.4에 설명된 대로 7fd8_noligand_chainA .pdb 파일을 가져옵니다. 두 개의 절반 맵의 위치와 Relion에서 생성된 해당 마스크를 제공합니다.
         3. 해상도를 3.8 Å로 지정합니다.
         4. 엄격한 대칭(Strict Symmetry)> 미세 조정 설정으로 이동하여 C2를 릴리온 포인트 그룹 대칭으로 언급합니다.
         5. 상단의 시작 버튼을 눌러 프로그램을 시작합니다.
   4. 작업이 완료되면 Coot 에서 결과를 엽니다(결과 섹션의 맨 위에서 사용 가능한 옵션). 그러면 기본적으로 Coot에 diffmap.mtz가 표시되며, 여기서 빨간색과 녹색은 각각 음수 및 양수 밀도를 나타냅니다.
      1. DELFWT PHDELWT라는 차이 맵의 속성을 > 표시 관리자 로 이동하여 등고선 수준을 4.0 (절대값)으로 변경합니다.
         참고: 임계값 선택은 맵과 해상도에 따라 다릅니다.
      2. FWT PHWT라는 맵과 refined.pdb라는 분자를 숨깁니다.
      3. 마우스를 사용하여 맵을 이동하여 양의 밀도(녹색)를 시각화하고 더 큰 블롭을 중앙으로 가져옵니다.
      4. 파일 > 단량체 가져오기로 이동하여 QUS를 입력하고 Enter 키를 누릅니다.
      5. Calculate > Modeling > Rigid Body Fit 분자로 이동하여 QUS 단량체를 두 번 클릭하여 Fo-Fc 밀도에 맞게 분자를 조정합니다.
      6. 편집 탭의 분자 병합 옵션을 사용하여 QUS 분자를 좌표 파일 refined.pdb에 추가합니다.
      7. 2.1.4.3-2.1.4.6 단계를 반복하여 단량체 코드 NAG 및 CHS가 있는 리간드를 각각 세포외 및 막관통 도메인 상단의 더 작은 블롭에 맞춥니다.
      8. 좌표를 refined_ligands.pdb로 저장합니다.
         참고: transmembrane(TM) 영역의 해상도가 낮으므로 여기서는 설명하지 않습니다.
2. mGlu₅ 리간드 구조의 개선
   1. CCPEM을 열고 이전 미세 조정 작업(2.1.3.2단계)을 복제하고 refined_ligands.pdb 및 선명한 맵(emd. 31536.mrc)를 입력으로 사용하여 기본 매개변수와 C2 대칭을 사용합니다.
      참고: 프로그램이 리간드를 인식하지 못하는 경우 CIF 파일을 제공해야 합니다. 이러한 CIF 파일은 PDB에서 다운로드하거나 다양한 프로그램을 사용하여 생성할 수 있습니다(자세한 내용은 3.1.1단계 참조).
3. PyMOL의 시각화 및 그림 생성
   1. PyMOL의 최신 Refmac 미세 조정 작업에서 refined_expanded.pdb 모델을 엽니다.
   2. 파일 > 열기로 이동하고 Refmac 작업 디렉토리로 이동하여 diffmap_normalised_fofc.mrc(2.1.3.2단계의 Servalcat 작업과의 차이 맵) 파일을 로드합니다.
      참고 : 탐색하는 동안 .mrc 확장자 파일이 표시되지 않으면 파일 형식을 모든 파일로 변경하고 찾아보십시오.
   3. 디스플레이 > 시퀀스를 사용하여 리간드를 선택합니다.
   4. Actions 버튼으로 이동하여 선택 항목의 이름을 ligands로 바꿉니다.
   5. 명령 줄에 다음을 입력하고 Enter 키를 누릅니다 : isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve = 2.5.
      알림: 메쉬 너비를 조정할 수 있습니다. 여기서는 0.2 메쉬 너비가 사용되며 set mesh_width=0.2 명령을 사용하여 설정합니다.
   6. 단량체 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 > 색상 연결로 이동하여 각 단량체의 색상을 지정합니다. 리간드와 mesh_ligands 개체에서 c로 표시된 마지막 상자를 사용하여 리간드와 메시를 채색합니다. mGlu₅ 수용체 이량체는 만화로 표현되었으며 단량체는 청록색과 밀로 착색되었습니다. 리간드는 스틱으로 표시되며 리간드를 윤곽을 그리는 메쉬는 녹색으로 표시됩니다.
   7. 개체에 대해 방향/중심/확대/축소 옵션> 작업을 사용하고 수동으로 조정하여 메쉬를 시각화하고 명확하게 만듭니다. 리간드와 상호 작용할 수 있는 인근 잔류물(예: QUS의 경우 Tyr64, Trp100)을 선택하고 필요에 따라 측쇄 또는 주쇄 또는 둘 다를 스틱 표현으로 표시합니다.
   8. 레이 트레이싱을 사용하여 고해상도 이미지를 생성하고 png 파일로 저장합니다.
      참고: 위의 단계는 길항제 바운드 맵 EMD-31537 및 해당 좌표 파일 PDB-7fd9에 대해 반복됩니다.

3. β-갈락토시다아제의 고해상도 선명도 맵에서 억제제, 디옥시갈락토-노지리마이신(DGN) 및 용매 분자 모델링

1. cryoEM의 half-map을 사용한 리간드, DGN 식별
   1. 모델링을 위한 미지의 Ligand 사전 준비 [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]
      참고: Deoxygalacto-nojirimycin 사전 파일은 CCP4 단량체 라이브러리에 DGJ(3글자 리간드 ID)로 포함되어 있습니다. 그럼에도 불구하고 여기서는 알려지지 않은 리간드에 대한 사전 파일을 생성하는 과정을 설명하기 위해 새롭고 알려지지 않은 리간드로 간주되며 DGN은 3자 코드로 사용됩니다.
      1. PubChem 웹페이지에서 deoxygalacto-nojirimycin(DGN)에 대한 화합물 요약을 열고 화합물 deoxygalacto-nojirimycin에 대한 미소 문자열을 복사합니다.
      2. Phoenix > 리간드 > eLBOW를 엽니다.
      3. smiles 문자열을 입력으로 지정합니다.
      4. 적절한 리간드 구축 최적화 방법을 지정합니다. 여기서는 간단한 최적화가 사용됩니다.
      5. 리간드 정의 섹션에 chemical smiles 문자열을 붙여넣습니다.
      6. 작업 제목, 출력 파일 접두사 및 리간드 ID를 적절하게 제공하고 실행을 누릅니다.
         참고: 작업 출력에는 좌표 파일인 DGN.pdb와 사전 파일인 DGN.cif 파일이 포함되어 있습니다. Jligand²⁹ 를 사용하여 cif 파일을 만들 수도 있습니다.
   2. PDB에서 β-갈락토시다아제 좌표 파일(6tsh.pdb)을 다운로드하고 텍스트 편집기 또는 Coot의 사슬/영역 삭제 옵션을 사용하여 단백질 사슬(B, C, D), 리간드, DGN 및 기타 용매 분자의 좌표를 제거합니다. 좌표 파일을 apo-betaGal_chainA.pdb로 저장합니다.
      참고: ChimeraX 또는 Pymol을 사용하여 리간드/용매 분자를 제거할 수도 있습니다.
   3. EMDB의 EMD-10563 항목에 대한 추가 데이터에서 하프 맵(emd_10563_half_map_1.map 및 emd_10563_half_map_2.map)을 다운로드합니다.
   4. CCPEM을 열고 Relion 을 사용하여 임계값 0.01 에서 맵에 대한 마스크를 생성합니다(2.1.3.1.1-2.1.3.1.4단계 참조).
   5. 3.1.3단계에서 얻은 하프맵과 3.1.2단계의 apo-model 및 D2 대칭을 사용하여 Servalcat(2단계에서 설명한 대로 CCPEM 제품군 내)을 실행합니다.
      참고: 모델은 리간드 밀도를 찾기 위해 half-map 또는 full map 중 하나에 정렬되어야 합니다. 이것은 ChimeraX를 사용하여 모델을 맵에 맞춘 다음 하프 맵에 상대적인 좌표를 저장하여 수행할 수 있습니다. 이 예에서 EMDB의 하프 맵과 기본 맵은 상자 크기/그리드가 다르며 모델을 하프 맵에 배치해야 합니다.
   6. 쿠트를 엽니다.
      1. Phoenix eLBOW를 사용하여 3.1.1단계에서 생성된 리간드 딕셔너리에 대한 DGN.cif 를 엽니다. 이 작업은 파일 > 가져오기 CIF 사전 으로 이동하여 eLBOW 작업 디렉토리를 탐색하여 수행됩니다.
      2. 단백질 및 리간드 좌표 파일(3.1.2단계의 apo-betaGal_chainA.pdb와 3.1.6단계의 DGN.pdb)을 각각 엽니다.
      3. Servalcat 작업(3.1.5단계)에서 diffmap.mtz 파일을 자동으로 열고 Coot에서 DELFWT PHDELWT로 레이블이 지정된 맵을 시각화합니다. ~ 4 절대 값의 임계값에서 맵의 윤곽을 잡습니다.
         참고: 헤더 map.mrc 를 입력하거나 Chimera의 도구를 사용하여 지도 통계를 확인하는 것이 중요합니다. 픽셀 크기, 상자 크기, 최소, 평균 및 최대 밀도, 평균 밀도와의 rms 편차에 필요한 모든 정보를 얻을 수 있습니다. CryoEM 맵의 픽셀 크기와 상자 크기를 확인하는 것이 중요합니다. 3D 맵은 3D 복셀 그리드의 단백질-리간드 맵 부피를 나타냅니다. 각 복셀에는 전자 전위 값 또는 해당 위치에서 전자를 찾을 확률이 저장됩니다. 특정 임계값을 선택하면 지정된 값보다 낮은 밀도를 가진 복셀이 0으로 설정됩니다. 이는 맵의 실험 노이즈를 최소화하고 맵 피처를 더 잘 시각화하는 데 도움이 됩니다⁴³. 따라서 지도는 지도 기능이 쉽게 보이고 지도의 노이즈가 최소화되는 임계값에서 윤곽을 그려야 합니다.
      4. 리간드> 이동하여 리간드를 찾습니다. 새 창이 나타나면 ligand, 차이 맵 및 apo-betaGal_chainA.pdb 모델을 선택합니다. 다른 옵션은 기본 설정으로 두고 Find Ligands(리간드 찾기)를 클릭하여 검색을 시작합니다.
      5. 잠재적인 리간드 밀도를 보여주는 상위 히트 목록이 각 밀도에 배치된 복사본과 함께 표시됩니다. 리간드가 배치된 모든 히트를 수동으로 확인합니다. 가장 가능성이 높은 히트를 유지하고 모호한 히트를 제거합니다.
         참고: 높은 임계값에서 map 밀도의 차이는 활성 부위에 리간드가 존재함을 명확하게 시사합니다.
2. 리간드 DGN 및 용매 분자 모델링
   1. 차이 밀도 맵에서 리간드(DGN.pdb)에 맞게 Coot에서 실제 공간 미세 조정 을 수행한 다음 리간드 좌표를 apo-betaGal_chainA.pdb와 병합 하고 betaGal_chainA+ligand.pdb로 저장합니다.
      참고: 다른 체인의 영역에 배치된 리간드는 제거할 수 있으며 병합된 좌표 파일을 저장하는 동안 병합되지 않습니다. 다른 사슬의 리간드는 예제 1, 단계 1.2.8과 같이 NCS 리간드에 의해 생성되거나 대칭 확장을 사용하여 Refmac/Servalcat에서 생성될 수 있습니다.
   2. betaGal_chainA+ligand.pdb를 입력 모델로 사용하고 D2 대칭을 사용하여 하프 맵(3.1.3단계)을 사용하여 위와 같이 다른 Servalcat 작업(3.1.5단계)을 실행합니다.
   3. 모델링된 리간드를 둘러싼 차이 밀도(단계 3.2.2의 Servalcat 작업에서)는 리간드 분자와 조화를 이루는 용매 분자의 존재를 시사합니다. 리간드에 가까운 중심 밀도는 물 분자에 비해 너무 큰 것으로 보입니다.
   4. 해당 위치에 Mg^{2 +}의 존재를 나타내는 이전의 생화학 및 구조 데이터를 기반으로 Mg^{2 +} 이온은 원자 배치 옵션을 클릭하고 원자를 MG로 지정하여 여기에서 모델링됩니다.
   5. 포인터에 있는 원자를 클릭하고 물을 선택하여 용매 분자의 존재를 나타내는 활성 부위의 밀도 차이에서 물 분자를 모델링합니다.
      알림: Coot에는 물 분자를 자동으로 선택하는 옵션도 있습니다. 여기서는 초점이 활성 부위에만 있기 때문에 물 분자를 수동으로 추가합니다.
   6. Mg²⁺ 와 물의 좌표를 betaGal+ligand.pdb 파일과 병합하고 betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb로 저장합니다.
   7. betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb를 사용하여 D2 대칭을 가진 Servalcat에서 Refmac 미세 조정을 수행합니다.
      참고: 이 작업의 출력 차이 맵은 차이 맵이 최소 잔류 양수 또는 음의 밀도를 표시해야 하므로 리간드가 정확하게 모델링되었는지 여부를 검증하는 수단으로 사용될 수 있습니다.
3. PyMOL을 사용한 시각화 및 그림 생성
   참고: 아래에 설명된 단계는 리간드와 용매의 존재를 설명하는 데 사용할 수 있는 모델 및 맵을 사용하여 그림을 만드는 몇 가지 예를 제공합니다.
   1. 리간드와 용매가 모델링된 마지막 Servalcat 작업(단계 3.2.6)의 refined_expanded.pdb를 엽니다.
   2. 다른 체인을 개별적으로 선택하여 예제 2에 설명된 대로 자홍색, 노란색, 녹색 및 청록색으로 지정합니다.
   3. > 시퀀스 표시로 이동하여 물 분자, 마그네슘 및 DGN에 대해 별도로 선택하고 오브젝트의 이름을 각각 물, MG 및 DGN으로 바꿉니다.
   4. 개체를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 MG와 물 분자를 구로 표시하고 구를 표시>. 마찬가지로, 리간드를 스틱 표현으로 표시하고 리간드와 용매를 적절하게 착색합니다. 이 경우 리간드는 헤테로 원자에 의해 노란색으로, 마그네슘 이온은 자주색으로, 물 분자는 빨간색으로 착색됩니다.
   5. DGN, MG 및 물 분자를 선택합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 개체를 복사> 작업을 선택하고 이름을 ligands로 지정합니다.
   6. 3.2.6단계에서 Servalcat 작업의 diffmap_normalised_fo.mrc를 열고 이름을 ligand_fo.mrc로 바꿉니다. isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2 명령을 입력합니다.
      참고: 2 Å의 carve 옵션은 원자 주위에 적용되며 맵의 해상도와 품질에 따라 3-5 값을 사용할 수 있습니다. 또한 PyMOL에서 cryoEM 맵을 열 때 normalize_ccp4_maps off로 설정하는 것이 좋습니다.
   7. 방향 지정/확대/축소 옵션> 작업을 사용하고 수동으로 조정하여 2.3.7단계와 같이 리간드 및 근처의 상호 작용 잔류물(해당되는 경우)을 시각화합니다.
   8. ray 3600, 3600 명령을 사용하여 이러한 장면을 추적하여 고해상도 이미지를 저장합니다.
   9. 장면을 .png 파일로 저장합니다.
      참고: 다음 단계는 선택 사항이며 (1) 모델링되지 않은 리간드, DGN에 대한 차이 밀도(Fo-Fc), (2) 모델링된 리간드, DGN의 밀도(Fo), 모델링되지 않은 용매에 대한 차이 밀도(Fo-Fc), 마지막으로 (3) 모델링된 리간드, DGN 및 활성 부위의 용매 분자에 대한 밀도(Fo)를 시각화하는 프로세스를 간략하게 설명합니다.
   10. 차이 맵을 사용하여 리간드, DGN 및 주변 용매 분자의 존재를 입증하려면 3.1.5단계의 Servalcat 작업에서 diffmap_normalised_fofc.mrc 를 엽니다. 맵 개체 옆에 있는 작업 > 이름 바꾸 기를 클릭하여 맵 파일의 이름을 unliganded_fofc.mrc로 바꿉니다. 명령행에 isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2를 입력합니다.
   11. 모델링된 리간드, DGN 및 주변의 모델링되지 않은 용매 밀도의 밀도를 시연하려면 3.2.2단계의 servalcat 작업에서 diffmap_normalised_fo.mrc 및 diffmap_normalised_fofc.mrc 를 엽니다. diffmap_normalised_fo.mrc의 이름을 DGN_fo 로, diffmap_normalised_fofc.mrc의 이름을 DGN_unmodelled_solvents_fofc로 바꿉니다.
   12. 디스플레이 > 시퀀스에서 MG와 물을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 개체에 복사> 작업을 선택한 다음 솔벤트로 이름을 지정합니다.
   13. 명령행에 isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2, isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvents, level=6, carve=2를 입력합니다.
       참고: mesh_DGN_fo에는 리간드의 밀도가 표시되고 mesh_solvent_fofc에는 MG와 물에 대한 생략 밀도가 표시됩니다.
   14. 마지막으로, 활성 부위의 주변 용매 분자뿐만 아니라 모델링된 리간드를 시각화하려면 3.2.6단계의 Servalcat 작업에서 diffmap_normalised_fo.mrc 를 열고 이름을 ligand_fo.mrc로 바꿉니다.
   15. 명령행에 isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2를 입력합니다.
       참고 : 여기서는 diffmap_normalised_fo.mrc를 사용했지만 최종 선명도지도를 사용하여 리간드와 주변 잔류 물의 밀도를 표시 할 수 있습니다. 사용된 맵의 유형, 그림 범례에서 B-factor 선명화 값을 언급하는 것이 좋습니다.
   16. 메쉬 너비와 구 크기는 다음 명령을 입력하여 설정할 수 있습니다: mesh_width=0.2 설정 및 sphere_scale=0.25 설정하여 구 크기를 더 작게 만듭니다.
   17. fo 메쉬를 파란색으로, fofc 메쉬를 녹색으로 채색합니다.
   18. 방향 지정/확대/축소 옵션> 작업을 사용하고 수동으로 조정하여 2.3.7단계와 같이 리간드 및 인근 상호 작용 잔류물(해당되는 경우)을 시각화합니다.
   19. ray 3600, 3600 명령을 사용하여 이러한 장면을 추적하여 고해상도 이미지를 저장합니다.
   20. 개별 장면을 .png 파일로 저장합니다.

4. β-갈락토시다아제에서 리간드 모델링에 대한 분리능의 효과

1. 터미널을 열고 두 개의 하프 맵이 들어있는 디렉토리로 이동합니다.
2. ChimeraX에서 .map 형식의 두 하프 맵(3.1.3단계)을 열고 시각화한 다음 emd10563_half1_1_unfil.mrc 및 emd10563_half2_1_unfil.mrc로 저장합니다.
3. 3.1.4단계에서 만든 마스크를 입력으로 사용할 수 있습니다.
4. 기본 파라미터와 함께 4.2-4.3단계의 하프맵과 마스크를 사용하여 Relion에서 PostProcessing 작업을 실행합니다.
5. 이제 Skip FSC-weighting 을 활성화하고 애드혹 저역 통과 필터를 3 Å로 지정하여 4.4단계를 반복합니다.
6. 3.5Å의 임시 저역 통과 필터를 사용하여 4.4단계를 반복합니다.
7. 4.4-4.6 단계에서 맵(postprocess.mrc)을 열고, 다른 해상도로 필터링하고, PyMOL의 3.1.2 단계에서 모델 좌표 6tsh.pdb(ChimeraX의 하프 맵에 정렬됨) 파일을 필터링합니다. 해상도에 정의된 대로 다른 맵의 이름을 3.0, 3.5 및 2.3으로 바꿉니다.
   참고: 지도의 저역 통과 필터링은 ChimeraX 또는 Coot에서 시각화하여 확인할 수 있습니다.
8. 3.3.6단계에서 설명한 대로 다른 해상도로 필터링된 맵을 사용하여 6σ의 임계값에서 리간드 및 용매 분자 주위에 2 Å의 메시를 생성하여 리간드 및 용매 분자의 밀도에 대한 분리능의 효과를 시각화합니다.

Results

예제 1
결핵균(M. tuberculosis)의 효소 에놀라아제는 해당작용의 끝에서 두 번째 단계를 촉매하고 2-포스포글리세레이트를 여러 대사 경로에 필수적인 중간체인 포스포에놀피루베이트(PEP)로 전환합니다^44,45. apo-enolase 및 PEP-bound enolase 샘플에 대한 CryoEM 데이터는 1.07 Å의 동일한 픽셀 크기에서 수집되었으며 이미지 처리는 Relion 3.1^46,47로 수행되었습니다. 아포-에놀라아제 및 PEP-에놀라아제 구조는 각각 3.1 Å 및 3.2 Å에서^{측정하였다 48}. 맵과 모델은 EMDB 및 PDB^49,50(EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x 및 PDB-7e51)에 저장되었습니다. 효소의 cryoEM 맵은 효소가 용액 내의 옥타머임을 보여줍니다(그림 1A). PEP-enolase map에서 리간드 밀도를 확인하기 위해 apoenzyme과 PEP-bound enzyme의 선명하지 않은 map을 선택하고, apoenzyme map에서 PEP-enolase map을 빼서 ChimeraX에서 difference map을 계산했습니다. 높은 임계값에서 뚜렷한 밀도(녹색)가 관찰되었으며, 이는 리간드의 존재를 시사합니다(그림 1B). 선명하지 않은 맵에서 단백질 사슬을 모델링하면 단백질의 활성 부위에 추가 밀도가 존재한다는 것을 명확하게 나타냈습니다(그림 1C). 그런 다음 Coot를 사용하여 B-factor sharpened map에서 리간드(PEP)를 모델링하고 Phenix를 사용하여 실제 공간에서 단백질+리간드 모델을 개선했습니다. 두 개의 Mg²⁺ 이온이 리간드 부근에서 관찰된 밀도로 모델링되었습니다(그림 1D). 리간드, PEP는 다른 에놀라아제 상동체에서 관찰되는 것과 유사한 방향을 채택하며, Lys-386, Arg-364와 같은 여러 활성 부위 잔기는 리간드 PEP와 수소 결합 상호 작용을 형성합니다. Mg²⁺ 이온은 Asp-241, Glu-283, Asp-310 및 PEP의 인산염과 금속 배위 결합을 형성합니다(그림 1D).

예제 2
이용 가능한 apo-protein 구조가 없거나 단백질이 큰 구조적 변화를 겪는 경우, 위에서 설명한 바와 같이 차이 맵을 계산하는 것은 불가능합니다. 2021년 케임브리지 분자생물학 연구소의 Garib Murshudov 그룹은 Refmac을 사용하여 미세 조정 워크플로를 구현하고 미세 조정 후 Fo-Fc 차이 맵을 계산하는 Servalcat²²를 도입했습니다. 양의 Fo-Fc 차이 밀도는 미세 조정 중에 모델에 포함되지 않은 분자/리간드의 존재를 의미하며, 본질적으로 생략 맵입니다. 그러나 먼저 일반적으로 맵에 대한 모델의 적합성을 평가한 다음 차이 밀도 맵을 평가하는 것이 좋습니다.

신경전달물질에 결합하는 이합체 G-단백질 결합 수용체인 Servalcat/Refmac, mGlu₅의 사용을 설명하기 위해 L-글루타메이트를 선택했습니다. 작용제인 L-퀴스쿠알레이트(L-quisqualate)가 결합하면 세포외 도메인이 방향을 바꾸어 7TM의 회전을 유발하여 활성화된 상태를 안정화하기 위해 더 가깝게 만듭니다. 따라서, apo/antagonist 대 사이에 큰 구조적 변화가 관찰됩니다. 작용제 결합 상태(⁵¹)(도 2A 및 도 2E). 작용제(EMD-31536) 및 길항제(EMD-31537) 결합 복합체에 대한 두 개의 하프 맵은 EMDB에서 얻었으며 cryoEM 맵은 분자와 더 잘 분해된 세포외 도메인에 걸쳐 다양한 해상도를 보여줍니다. 그 후, 이들은 각 데이터 세트에 대한 차이 또는 Fo-Fc 맵을 계산하기 위한 모델로 apo-protein과 함께 Servalcat에서 입력으로 활용되었습니다. 이 지도는 다양한 리간드 분자(비단백질)의 존재를 뚜렷하게 보여주었습니다. 작용제 및 길항제 결합 복합체에 대해 FSC(Fourier Shell correlation)에 의해 추정된 분해능은 각각 3.8 Å 및 4.0 Å였습니다. 작용제 결합 mGlu₅의 경우, Servalcat Fo-Fc 차이 맵은 수용체의 ECD에서 작용제(L-퀴스쿠알레이트)(그림 2B)와 N-아세틸글루코사민(NAG)(그림 2C)의 존재를 보여주었습니다(TMD의 분해능이 낮기 때문에 여기서는 ECD와 TMD의 상단에만 초점을 맞춥니다). Tyr-64, Trp-100, Ser-151 및 Thr-175를 포함한 단백질 잔기가 작용제와 상호 작용하는 것으로 보입니다. Asn-210 잔기 근처의 밀도는 N-아세틸 글루코사민의 존재를 시사합니다(그림 2C). mGlu₅ 의 정제 중에 첨가된 콜레스테릴 헤미숙시네이트와 일치하는 밀도가 막관통 나선 1의 상단 근처에서 관찰되었습니다(그림 2D). 분해능이 적당하고 리간드인 L-quisqualate를 다른 방향으로 배치할 수 있기 때문에 리간드(PDB-6N50)와 함께 세포외 도메인의 사전 구조를 리간드 모델링을 위한 가이드로 사용했습니다. 길항제 결합은 수용체의 개방 또는 휴지 상태를 안정화합니다(그림 2E). 길항제 LY341495와 일치하는 밀도가 ECD의 금성 파리 트랩 영역의 로브 I 및 로브 II의 힌지에서 관찰되었습니다. 길항제는 작용제와 유사한 잔류물과 상호 작용합니다. 로브 II의 Tyr-223과 길항제 사이의 적층 상호 작용은 수용체를 열린 상태에서 안정화시킵니다(그림 2F). 작용제 구조와 유사하게, 당화(glycosylation) 또는 N-아세틸글루코사민 부분의 존재가 Asn-210 근처에서 관찰되었다(그림 2G).

예제 3
세 번째 예는 고해상도 CryoEM 맵에서 단편 크기 또는 작은 크기의 리간드 및 용매 분자를 모델링하는 프로토콜을 설명합니다. 단편 기반 약물 발견(FBDD)은 다양한 질병 분야에서 표적 기반 새로운 치료법 개발에서 강력하고 혁신적인 방법으로 부상하여 제약 R&D^52,53에서 유망한 방안이 되었습니다. FBDD는 특정 표적 단백질 또는 관심 생체 분자에 결합하는 분자의 작고 용해성이 높으며 분자량이 적은 단편을 스크리닝하고 신중하게 선택하는 것으로 시작됩니다. 이러한 단백질-단편 복합체의 구조를 결정하는 것은 이들 단편의 결합 방식을 드러내며, 이는 표적 단백질(⁵⁴)에 대한 친화력 및 특이성이 증가하는 더 크고 복잡한 약물-유사 분자를 설계하기 위한 가이드 역할을 한다. 그러나, 이 방법은 자세를 정확하게 결정하고 리간드⁽¹⁵)의 작용기를 정확하게 배치하기 위해 고분해능 리간드 밀도를 요구한다.

β-갈락토시다아제는 CryoEM 기술의 발전으로 밝혀진 최초의 고분해능 구조 중 하나로, 유당의 포도당^{및 갈락토스 55}로의 가수분해를 촉매하는 잘 연구된 450kDa 호모테트라머 효소입니다. FBDD에서 CryoEM의 사용을 보여주기 위해 영국 Astex는 활성 부위(EMDB-10563, PDB:6tsh)⁵⁶에 결합된 단편 크기의 억제제인 deoxygalacto-nojirimycin(DGN)을 사용하여 β-갈락토시다아제의 구조를 확인했습니다. 이 데이터 세트는 고해상도 맵에서 리간드와 용매를 명확하게 모델링하는 프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다. 리간드 모델링 및 시각화에 대한 해상도의 효과를 보여주기 위해 Relion의 후처리 단계에서 맵을 3.0 Å 및 3.5 Å로 필터링했습니다. 이는 다양한 해상도에서 map 밀도의 품질을 강조하고 리간드 및 용매 모델링을 위한 더 높은 해상도의 필요성을 강조합니다.

효소는 용액에서 D2 대칭을 갖는 사량체입니다(그림 3A). Servalcat이 계산한 차이 맵(맵과 모델 간)은 효소의 활성 부위에 DGN과 여러 용매 분자가 있음을 시사했습니다(그림 3B). 2.3 Å의 추정 분해능에서, 밀도는 단백질 활성 부위에서 억제제의 정확한 모델링에 도움이 되는 고해상도 특징을 보여주었습니다. DGN과 Tyr-503 및 His-540 사이의 상호 작용이 관찰되었습니다(그림 3C). 밀도의 차이는 또한 단백질 잔기뿐만 아니라 DGN과 상호 작용하는 용매 분자의 존재를 시사했습니다. Mg²⁺ 및 여러 물 분자를 밀도로 모델링했습니다(그림 3D). Mg²⁺ 와 Glu-416, Glu-461 및 여러 물 분자 사이의 금속 배위 결합이 관찰됩니다(그림 3D). Mg²⁺ 는 물 분자를 통해 DGN과 상호 작용하는 것으로 나타났습니다.

3.5 Å 및 3.0 Å의 낮은 분해능에서 리간드 밀도는 블롭과 유사하며 리간드의 정확한 모델링에 중요한 고분해능 기능이 없습니다(그림 4A, B). 물 분자의 밀도는 이러한 해상도에서 거의 존재하지 않았습니다. 요약하면, 특히 3.0 Å보다 높은 분해능이 증가함에 따라 밀도는 더 많은 수의 물 분자를 모델링할 수 있게 했습니다(그림 4C, D). 리간드의 키랄 중심의 올바른 위치는 ~ 2.3 Å (그림 4C, D)에서 배치를 안내하는 맵에 뚜렷한 특징이 존재하고 물 분자 및 Mg^{2 +}의 모델링으로 인해 달성 가능해졌습니다. 이에 비해 Mg²⁺의 밀도는 분해능 범위 전체에서 식별 가능한 상태로 유지되었습니다(그림 4A-C).

그림 1: M. tuberculosis enolase에서 리간드 포스포에놀피루베이트 모델링. (A)는 PEP-결합 에놀라아제 효소의 B-인자 선명화 맵을 보여줍니다. 지도는 enolase가 용액에서 팔각형이며 지도의 각 단량체는 다르게 색상이 지정된다는 것을 시사합니다. (B)는 apo-Enolase 효소의 선명하지 않은 cryoEM 맵을 회색으로 표시하고 차이 맵(PEP 결합 맵과 apo-Enolase 선명하지 않은 맵 사이)을 녹색으로 오버레이하여 리간드, PEP의 존재를 암시합니다. 이것은 리간드의 존재를 보여주는 데모 맵입니다. (C)는 날카롭지 않은 cryoEM 맵에서 에놀라아제 모델의 적합성을 표시하여 단백질에 대한 차이 밀도의 위치를 강조합니다. 단백질 모델은 만화 표현으로 표시되며 Chainbow에서 색상이 지정됩니다. 이 그림은 추가 밀도(녹색)가 각 단량체의 활성 부위에 존재한다는 것을 보여줍니다. (D)는 파란색으로 표시된 B-factor sharpened map에 둘러싸인 리간드, PEP를 보여줍니다. 또한 2개의 Mg²⁺ 이온에 대한 밀도도 관찰되었으며, 이는 Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 및 리간드 원자를 포함한 여러 활성 부위 잔기와 금속 배위 결합을 형성합니다. 리간드는 Lys-386, Lys-335 및 Arg-364와 수소 결합 상호 작용을 합니다. 단백질 잔기는 스틱 표시로 표시되고 Mg²⁺ 이온은 자주색 구로 표시됩니다. 패널(A-D)의 수치는 Pymol로 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: mGlu₅ 수용체에서 다양한 리간드의 식별, 모델링 및 시각화. Fo-Fc 생략 맵은 Servalcat을 사용하여 얻었습니다. (A)는 mGlu₅ 수용체 이량체 구조(PDB-7fd8)를 만화 표현으로 보여주며, 각 단량체는 각각 청록색과 밀색으로 착색되고 작용제 L-퀴스쿠알레이트에 결합되어 있습니다. 세포외 및 수용체의 막관통 도메인 상단에서 확인된 모든 리간드는 Fo-Fc 생략 맵에 싸여 있고 녹색으로 표시되며 6σ로 윤곽이 잡혀 있습니다. (B)는 차동 맵에 둘러싸인 작용제인 L-quisqualate의 적합성을 강조합니다. L-퀴스쿠칼레이트는 Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 및 Gly-280을 포함한 여러 mGlu₅ 잔기와 상호 작용합니다. H-bond 교호작용은 빨간색 점선으로 표시됩니다. (C)에서는 수용체의 세포외 도메인에 존재하는 Asn-210 근처에서 추가 밀도가 분명하며, N-아세틸글루코사민 분자(NAG)는 이 밀도에서 모델링되었습니다. 명확성을 위해 NAG는 현재 그림의 Asn에 연결되어 있지 않습니다. (D)는 수용체의 지질 노출 표면 부근에서 녹색으로 표시된 콜레스테롤 헤미석시네이트(CHS)의 밀도 차이를 보여줍니다. 막대기에 표현된 CHS 분자는 이 밀도로 모델링되었습니다. (E)는 만화 표현에서 길항제 LY341495에 결합된 mGlu₅ 수용체 구조(PDB-7fd9)를 보여줍니다. (F)에서, 세포외 도메인의 로브 I과 로브 II 사이의 힌지에 위치한 Fo-Fc 차이 맵의 추가 밀도는 길항제의 존재를 나타냅니다. 길항제 주변의 주요 잔류물(Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 및 Tyr-223)은 스틱 표시로 표시되며 길항제와의 잠재적인 수소 결합 상호 작용은 빨간색 점선으로 표시됩니다. (G)는 길항제 결합 구조에서 Asn-210 근처의 NAG 분자의 존재를 암시하는 밀도의 차이를 보여줍니다(참고, NAG는 명확성을 위해 Asn과 연결되어 있지 않음). 수치는 Pymol로 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: β-갈락토시다아제(EMD-10563)의 고해상도 맵에서 작은 억제제 및 용매 분자의 식별, 모델링 및 정제. (A)는 만화 표현에서 2.3 Å (PDB: 6tsh)로 분해된 β-갈락토시다아제 모델을 보여주며, 각 단량체는 뚜렷하게 착색되어 있습니다. 회색 상자는 리간드 결합 부위를 강조 표시합니다. (B)는 효소의 활성 부위에서 녹색 메쉬로 Fo-Fc 차이 밀도(Servalcat에서)를 표시합니다. 밀도의 차이는 활성 부위에 억제제(DGN)와 여러 용매 분자가 존재함을 시사합니다. (C)는 Fo-Fc 맵에 의해 유도되는 억제제 DEOXYGALACTO-nojirimycin(DGN)이 활성 부위에서 모델링됨을 보여줍니다. 이 모델링된 리간드는 스틱 형태로 표시되며 blue_mesh으로 착색된 Fo 밀도(Servalcat에 의해)로 둘러싸여 있습니다. DGN과 Tyr-503 및 His-540을 포함한 여러 단백질 잔기 간의 수소 결합 상호 작용이 관찰됩니다. 리간드 주변의 추가적인 Fo-Fc 차이 밀도(녹색)는 용매 분자를 나타냅니다. (D) 맵은 물과 Mg²⁺를 포함한 여러 용매 분자가 각각 빨간색 및 자주색 구로 표시되며, 각 용매 분자가 단백질(Glu-416, His-418 및 Glu-461) 또는 리간드 잔기에 결합되어 있는지 확인한 후 활성 부위에서 모델링되었음을 보여줍니다. 물 분자와 Mg^{2 +}는 Fo 밀도 (파란색 메쉬)로 둘러싸여 있습니다. Mg²⁺는 물 분자를 통해 리간드, DGN과 상호 작용하는 것으로 보입니다. 패널 (B, C)의 Fo-Fc 맵 (녹색 메쉬)은 6σ에서 윤곽선이 그려지는 반면, C 및 D의 Fo 밀도 - 파란색 메쉬 (모델링 후 Servalcat 미세 조정에서)는 3σ에서 윤곽선이 그려집니다. 패널(A-D)의 수치는 Pymol로 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: β-갈락토시다아제의 리간드 모델링에 대한 분리능의 효과. EMD-10563의 하프 맵은 Relion 후처리 단계에서 입력으로 사용되었으며, 결합된 후처리 맵은 서로 다른 B-팩터를 가진 해상도 2.3 Å, 3.0 Å 및 3.5 Å로 필터링되었습니다. 모든 패널에 표시된 맵은 6σ로 윤곽이 잡혀 있습니다. 명확성을 위해 패널 A, B 및 C에 곁사슬, 리간드 또는 용매 분자 없이 단백질 골격만 표시됩니다. (A) 맵은 3.5 Å로 필터링되고 β-갈락토시다아제의 활성 부위가 표시됩니다. 리간드와 유사한 블롭 DGN이 이 해상도에서 보이며 주변에 몇 개의 작은 블롭이 함께 표시됩니다. 올바른 방향으로 리간드를 모델링하는 것은 맵에 뚜렷한 특징이 없기 때문에 어려운 것으로 판명되었습니다. (B) 3.0 Å 해상도로 필터링된 맵이 표시됩니다. 여기서 리간드 블롭은 약간 더 명확해지지만 일반적으로 여전히 특징이 부족합니다. 용매 분자를 암시하는 몇 개의 작은 얼룩도 더 관찰됩니다. (C) 2.3 Å 해상도로 필터링된 맵은 뚜렷한 특징을 가진 리간드 밀도를 나타내며, 특히 이미노설탕의 의자 형태를 드러냅니다. 물 분자에 해당하는 상당한 수의 작은 얼룩이 이 해상도에서 관찰됩니다. Relion 포스트 프로세스의 자동 B-팩터 추정/샤프닝은 3 Å 및 3.5 Å로 필터링된 맵에 대해 -18 Ų 값을 제공하는 반면, 2.3 Å로 필터링된 맵에 대해 -52 Ų 값을 제공합니다. EM 맵의 다양한 B-팩터 샤프닝도 Coot를 사용하여 수행할 수 있으며 모델 구축에 유용합니다. (D) 패널은 활성 부위에서 모델링된 리간드 DGN(스틱 표현), Mg²⁺ 및 물 분자(구)와 2.3 Å의 선명한 맵이 이러한 원자를 둘러싼 파란색 메쉬로 표시됨을 보여줍니다. 패널(A-D)의 수치는 Pymol로 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

현미경 하드웨어 및 소프트웨어의 개선으로 최근 몇 년 동안 CryoEM 구조의 수가 증가했습니다. 단일 입자 cryoEM에서 현재 달성된 최고 분해능은 1.2 Å 57,58,59이지만 대부분의 구조는 약 3-4 Å 분해능으로 결정되고 있습니다. 중해상도에서 저해상도 맵의 리간드를 모델링하는 것은 까다로울 수 있으며 종종 모호성이 발생할 수 있습니다. 중개 연구 및 약물 발견을 위해 학계와 제약 산업 모두에서 CryoEM이 널리 사용됨에 따라 리간드가 모호성 없이 올바르게 모델링되도록 하는 것이 필수적입니다. 따라서 Q-점수⁶⁰을 계산하여 리간드 원자의 분해 가능성을 정량화하는 것이 현명하며, 이는 현재 EMDB에서 맵의 품질과 모델의 적합성을 평가하기 위한 메트릭으로 사용할 수 있으며 Chimera에서도 사용할 수 있습니다.

첫 번째 예에서 ChimeraX는 M. tuberculosis enolase 효소의 apo와 리간드 결합 맵 사이의 실제 공간에서의 차이 맵을 계산하는 데 사용되었습니다. 높은 임계값에서의 추가 밀도는 활성 부위에 리간드인 phosphoenolpyruvate가 존재하고 리간드에 결합된 Mg²⁺가 있음을 시사합니다. 이 경우 맵은 중간 해상도(3.2 Å)이며 물 분자는 자신 있게 모델링할 수 없다는 점에 유의해야 합니다(그림 1). 이 방법과 관련된 제한 사항은 리간드 결합이 단백질에서 중요한 구조적 변화를 유도하지 않는 경우에만 적용될 수 있다는 것입니다. 이 경우 apo 및 리간드 바운드 데이터 세트가 모두 동일한 픽셀 크기로 획득되고 Relion에서 동일한 매개변수로 처리되었기 때문에 맵 정규화가 수행되지 않았습니다. 그러나 Relion ^46,47 및 CryoSparc⁶¹과 같은 다른 재구성 프로그램에 의해 생성된 지도 또는 다른 품질로 생성된 지도를 비교할 때 의미 있는 비교를 하기 전에 지도의 정규화가 필수적이라는 점에 유의할 가치가 있습니다.

다음 예는 mGlu₅이며, 이는 cryoEM 구조^51,62에서 알 수 있듯이 작용제 결합 시 큰 분자 재구성을 겪습니다(그림 2). 이 시나리오에서는 unbound(apo)와 ligand-bound receptor 간의 상당한 차이로 인해 간단한 difference map을 계산할 수 없습니다. 여기에서는 역수 공간에서의 미세 조정을 위한 입력으로 선명하지 않고 가중치가 없는 하프맵을 사용하고 이후 실험 맵과 모델에서 파생된 맵 간의 차이 맵을 계산하는 Servalcat이 활용되었습니다. 높은 임계값에서는 차이점을 시각화하고 모델의 수정 및 개선을 위한 가이드 역할을 할 수 있습니다. 세포외 및 mGlu₅의 막관통 도메인 근처에서 모델링되지 않은 여러 블롭이 관찰되어 리간드 모델링을 위한 가이드로 사용되었습니다(그림 2).

세 번째 예는 분해능(2.3 Å)이 β-갈락토시다아제에서 단편 크기 억제제의 지도 해석 및 모델링에서 어떻게 중요한 역할을 하는지 보여줍니다. 여기서 과제는 데이터에 내재된 노이즈 속에서 Servalcat 차이 맵에서 매우 작은 리간드(<200 Da)를 식별하고 정확하게 모델링하는 것이었습니다. 푸리에 쉘 상관관계(FSC)를 사용하여 측정된 높은 전체 분해능 외에도 리간드에 특이적인 국소 분해능도 리간드의 키랄 중심을 정확하게 배치할 수 있을 만큼 충분히 높았습니다(그림 3). 용매 분자에 대한 밀도는 효소 전체와 특히 리간드를 둘러싼 차이 맵에서 관찰되었습니다. 리간드와 용매 원자 모델링에 대한 분리능의 효과도 입증되었습니다(그림 4). 물 또는 용매 분자를 모델링할 때 주의하는 것이 중요한데, 때때로 낮은 임계값에서의 노이즈가 물 또는 용매 분자와 유사하여 잠재적인 오해로 이어질 수 있기 때문입니다.

또 다른 중요한 고려 사항은 CryoEM 맵만으로는 금속 이온을 정확하게 식별하기에 충분하지 않을 수 있다는 것입니다. 금속 이온의 존재와 정체를 확인하기 위해 EXAFS(Extended X-ray Absorption Fine Structure) 또는 EDX(Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy)와 같은 추가적인 생물물리학적 방법이 필요한 경우가 많습니다. 에놀라아제 및 β-갈락토시다아제 효소 모두에서 Mg²⁺ 는 이러한 단백질에 대해 이미 사용 가능한 풍부한 정보로 인해 모델링되어 금속 이온의 정체성을 확인했습니다. 또한, 고전적인 팔면체 기하학적 구조와 Mg²⁺의 거의 이상적인 배위 거리로 예시된 이러한 경우 금속 이온의 배위는 이들의 정체에 대한 실질적인 증거를 제공했습니다.

일반적으로 CryoEM 맵에서 리간드를 모델링하는 동안 몇 가지 중요한 고려 사항을 고려해야 합니다. 우선, 리간드 식별 및 모델링을 위한 올바른 맵을 선택하는 것이 중요합니다. 모든 경우에, 리간드 밀도를 시각화하기 위해 선명하게 작성되지 않고 가중치가 부여되지 않은 맵 또는 하프 맵을 사용하는 것이 좋으며, 이는 선명화 및 가중치로 인해 맵에서 덜 선명하거나 과도하게 선명하게 된 (시리즈 종료로 인한 노이즈) 영역이 발생할 수 있기 때문입니다. 이로 인해 최적이 아닌 리간드 밀도가 발생할 수 있으며 Coot에서 모델을 구축하는 동안 밀도를 평가하기 위해 다른 B 인자 샤프닝을 사용할 수 있습니다. CryoEM 맵에서 리간드를 식별하기 위해 선명하게 된 맵을 사용하는 데는 위험이 있지만, 선명하지 않은 맵은 리간드 밀도의 전체 세부 정보를 보여주지 않을 수 있지만 그림 1B, C와 같이 시연 목적으로 사용할 수 있습니다.

모델링된 리간드의 자세는 특히 데이터가 약한 경우에 검증해야 합니다. mGlu₅에 대해 여기에서 볼 수 있듯이 국소 분리능은 CryoEM 맵에 따라 다르며 리간드의 편향되지 않은 모델링이 어려울 수 있습니다. Servalcat은 단백질 및 리간드 모델링에서 잠재적인 부정확성을 감지하기 위한 유용한 도구로 사용할 수 있습니다²².

조성 이질성은 특정 집단만이 리간드를 가질 수 있는 단백질-리간드 복합체에 존재할 수 있습니다(리간드의 분자량이 낮은 경우 분류 단계에서 이질성이 제거되지 않을 수 있음). 그럼에도 불구하고 리간드 모델링 전에 이미지 처리 중에 3D 분류⁶³ 단계를 반복적으로 수행하고 리간드의 밀도가 향상되는지 확인하는 것이 중요합니다. 단백질의 여러 복사본이 존재하는 경우, 초기 모델 생성 및 정제 중에 맵 전체에 대칭을 적용할 때 주의를 기울여야 하며, 이는 모든 대칭 관련 분자의 리간드 밀도를 평균화할 수 있습니다. 대칭성은 모든 단백질 사슬에서 리간드 밀도의 존재를 확인하기 위해 맵을 철저히 검사한 후에만 적용해야 합니다.

상태(결정 또는 용액)와 위치(매립 또는 표면)에 따라 원자는 동적일 수 있으며 모델 미세화에서는 이를 원자 변위 매개변수(ADP)라고 합니다. 모델에서 가능한 부정확성에 대한 시각적 단서를 제공하는 차이 맵과 함께 ADP 값을 사용하여 64,65,66,67 정제 후 리간드의 정확도를 평가할 수 있습니다. 일반적으로 리간드는 주변 잔기와 유사한 ADP 값을 가져야 합니다(즉, 안정적으로 결합되고 정확하게 모델링되는 경우). 그러나 거대분자에서 멀리 떨어진 리간드의 주변부 또는 리간드 원자(예: 지질)는 더 높은 ADP 값을 가질 수 있습니다. 좌표를 미세 화하는 것 외에도 Refmac^33,34와 Phoenix 모두 ADP 값^28,68을 미세 조정할 수 있습니다. Refmac에서 Mott-Bethe 근사는 맵 계산 중에 개별 원자의 전자 산란 계수를 계산하는 데 사용됩니다. Phoenix 최신 버전에서는 원자 무질서를 설명하기 위해 결정학과 유사한 개별 B-factor 미세화가 도입되었습니다. 매우 자주, cryoEM에서 파생된 정제된 모델에서는 광범위한 ADP 값(때로는 0에 가까운 값)이 관찰되며, 맵과 모델의 적합성을 평가하기 위해 EMDB에서 사용되는 Q-점수조차도 증착된 기본 맵과 B-팩터 샤프닝⁽⁶⁰)의 특성에 따라 달라집니다. cryoEM 모델 구축에서는 여러 맵이 자주 사용되며, 따라서 많은 거대분자의 이방성 분해능으로 인해 하나의 맵만으로는 모든 세부 사항을 설명하기에 충분하지 않을 수 있으므로 모델링 및 개선에 사용되는 맵을 방법에서 명확하게 언급해야 합니다. 

거대분자의 리간드 모델링에서 CryoEM 맵(예: 결정학)의 주요 한계 중 하나는 리간드 결합 부위의 해상도가 낮거나 결합된 리간드가 동적인 경우 올바른 형태를 확인하기 어려울 수 있다는 것입니다. 또한 대부분의 CryoEM 구조는 분해능이 3Å 미만이고 맵에서 물 분자의 표현이 제한되어 리간드 또는 약물 결합에서 수화의 역할을 평가하기 어렵습니다(여기에 에놀라아제 및 mGluR의 예가 표시됨). 계산 방법은 이러한 제한 사항을 해결하기 위해 CryoEM 데이터와 함께 사용할 수 있습니다⁶⁹. 결정학(crystallography)과 달리, 맵이 아닌 모델만 미세 조정됩니다. 현재 리간드의 존재를 표시하거나 정확한 모델링을 보장하는 유일한 방법은 생략 맵을 생성하는 것입니다(Servalcat과 같은 도구 사용). 따라서 연구자가 모델을 구축하고 평가하는 데 도움이 되는 여러 도구가 있지만, 가까운 장래에 새로운 접근 방식이나 현재 접근 방식의 수정을 기대할 수 있는 모델 개선 영역이 여러 개 있습니다.

이 기사에서는 리간드 밀도의 수동 검사, 리간드 기하학 파일 생성, CryoEM 맵에서 리간드 모델링을 포함하는 리간드 모델링을 위한 현재 접근 방식에 중점을 두었습니다. 이 시기는 구조 생물학 및 약물 발견에 있어 흥미로운 시기로, 프레임 속도가 더 빠른 직접 전자 검출기와 더 빠른 데이터 수집⁽⁷⁰ )을 통해 비교적 짧은 시간에 종종 소분자 리간드로 결합된 여러 거대분자의 고해상도 지도(<2.8 Å)를 얻을 수 있게 되었습니다. 최근 도입된 Schrodinger 제품군의 GEMspot⁶⁹ 및 Rosetta 제품군의 EMERALD¹⁷ 과 같은 자동화된 리간드 모델링 도구는 실험용 cryoEM 데이터를 고려하면서 리간드의 가장 가능성 있는 결합 자세를 찾으려고 시도하며, 이 프로세스를 간소화하고 자동화할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다. X선 결정학과 유사하게, cryoEM으로 저분자 리간드의 결합 모드를 식별하는 것이 하루에 두 개 이상 가능할 것으로 예상됩니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	여러 기관의 컨소시엄	https://www.ccp4.ac.uk	학술 사용자에게 무료이며 Coot 및 X-ray 결정학을 위해 개발된 도구 목록을 포함합니다
CCP-EM	컨소시엄은 여러 기관의	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	학계 사용자에게 무료이며 Coot, Relion 및 기타 많은 Coot를 포함합니다
.	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	모델 구축을 위한 일반 소프트웨어이지만 위에서 설명한 다른 제품군에서도 사용 가능
DockinMap (Phenix)	여러 연구소의 컨소시엄	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	모델을 cryoEM 맵에 도킹하기 위한 Phoenix 제품군 내부의 소프트웨어
전자 현미경 데이터 뱅크	여러 기관의 컨소시엄	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	광고, Thermo Fisher의 카메라
피닉스	여러 기관의 컨소시엄	https://phenix-online.org/download	학계 사용자에게 무료이며 여러 기관의 Coot
Protein Data Bank	컨소시엄	https://rcsb.org	거대 분자 구조의 공개 데이터베이스
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization 도구를 포함합니다. 교육용 버전은 무료이지만 제한이 있습니다. 정식 버전은 약간의 비용으로 얻을 수 있습니다.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	소프트웨어는 cryoEM 이미지 처리용이며, CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Thermo Fisher의 상업용, cryoTEM
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	디스플레이, 분석 등을 위한 범용 소프트웨어
UCSF Chimera X	UCSF, USA		https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/디스플레이, 분석 등을 위한 범용 소프트웨어