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방법 논문

선충 Caenorhabditis elegans의 화학주축에서 연관 학습 측정

1.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66311

⸱

2025년 6월 17일

 ,  , 
1Institute for Mind Brain and Behavior, Faculty of Medicine, HMU Health and Medical University Potsdam

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 모델 유기체 C. elegans에서 고전적 조건화를 수행하여 연상 학습을 테스트하는 프로토콜을 제시합니다. 이 패러다임은 환경 내 염분의 농도를 음식의 유무와 짝을 이루는 것을 기반으로 하며, 이는 화학주축을 소금 쪽으로 또는 소금에서 멀어지게 합니다.

초록

행동을 적응시키기 위해 동물은 연상 학습을 통해 감각 정보에 원자가를 할당하고 환경 조건이 변할 때 이 연관성을 업데이트합니다. 염화나트륨에 대한 Caenorhabditis elegans 의 행동 반응은 연상 학습을 지배하는 메커니즘을 조사하기 위한 잘 정의된 패러다임을 제공합니다. 음식물의 유무와 짝을 이루는 특정 NaCl 수치에 기생충을 노출시키면 각각 이 NaCl 농도에 가까워지거나 멀어지는 화학주성이 유도됩니다. 연상 기억은 몇 시간 내에 형성되며 동물을 다른 NaCl 농도에 노출시킬 때 동일한 시간 내에 수정할 수 있습니다.

여기에서는 C. elegans salt chemotaxis를 기반으로 행동 가소성과 학습을 분석하는 방법을 설명합니다. 분석 균주는 성인이 될 때까지 동기화된 코호트에서 성장한 다음 음식의 유무에 관계없이 다른 NaCl 농도의 플레이트에서 몇 시간 동안 조건화됩니다. 그런 다음 NaCl 농도가 낮거나 중간 또는 높은 영역을 포함하는 분석 플레이트로 동물을 옮기고 각 영역의 기생충 수를 세기 전에 30분 동안 기어 다니게 합니다. 그런 다음 플레이트에 있는 기생충의 분포에서 화학주성 지수를 계산합니다. 이 분석은 학습에 영향을 미치는 다양한 요인의 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

환경과 의미 있게 상호 작용하고 적응 행동을 생성하기 위해 동물은 자신이 받은 감각 정보를 해석해야 합니다: 주어진 감각 신호가 그들의 생존에 유익한지 해로운지는 거의 항상 미리 결정되는 것이 아니라 상황에 따라 다릅니다. 따라서 감각 및 신경계의 핵심 임무는 연상 학습을 통해 환경 정보에 원자가를 할당하는 것입니다. 일부 자극은 음식과 같이 본질적으로 식욕을 자극하는 것이고, 다른 자극은 통각 신호와 같이 본질적으로 혐오감을 불러일으킵니다. 이러한 무조건적인 자극(미국)은 그들과 함께 제시된 다른 자극에 대한 반응을 변경할 수 있습니다. 그 결과, 동물들은 다른 조건화된 자극(CS)에 대한 매력이나 혐오감을 발달시킬 수 있다. 이것은 CS가 US 1,2,3에 신호를 보내거나 예측하는 방식으로 해석됩니다. 연상 학습의 모델을 연구하는 것은 근본적인 유전적, 세포적, 생리학적 메커니즘을 밝히는 데 필요합니다. 그러나 이는 생체 내 모델의 사용의 필요성, 행동의 가변성, 동물 취급에 필요한 라이선스 또는 연구자와 동물 모두를 교육하는 데 필요한 긴 일정으로 인해 어려울 수 있으며, 이는 일반적으로 연구 환경에서 학부생이 수행하는 것을 배제하며, 교육 환경에서는 더욱 그렇습니다.

따라서 무척추 동물 모델은 학부 또는 석사 학생과 함께 연관 학습 분석을 수행할 수 있는 기회를 제공합니다. 무척추 동물은 동물을 다루기 위해 동물 면허가 필요하지 않으며 비용 효율적일 수 있습니다. 연관 학습에 자주 사용되는 패러다임은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 염 화학주성 학습(salt chemotaxis learning) 4,5,6,7,8,9이다. 예쁜꼬마선충은 주변 환경에서 염화나트륨(NaCl)의 농도를 감지하고 특정 [NaCl]을 각각 음식의 유무와 연관시키는 방법을 배웁니다. 일반적으로 동물은 이전에 충분한 박테리아 먹이가 제공되었던 염분 농도로 이동하는 방법을 배우고, 박테리아 먹이가 없을 때 제공된 염분 농도에서 멀어지는 방법을 배웁니다. 따라서 소금은 조건화된 자극이고, 음식이나 굶주림은 무조건적인 자극이다3. 이 연관성은 한 시간 이내에 형성되며 단기 연상 기억의 예입니다. NaCl 화학주성의 연관 학습은 무엇보다도 칼슘/칼모듈린 의존성 키나아제(CaMK) 신호, 도파민 및 인슐린/포스파티딜이노시톨(PI) 3-키나아제 신호 전달 5,9,10에 의해 조절되며, 이는 동기 부여 시스템과 CaMK 의존성 시냅스 가소성을 포함하며 척추동물의 연상 학습을 지배하는 신호 경로와 유사한 방식으로 작동할 수 있음을 시사합니다.

염 화학주성 학습을 위해 확립된 프로토콜에서, 동물은 플레이트7에 각각 소금이 없거나 높은 두 개의 한천 플러그를 배치하여 생성된 한천 플레이트에서 소금의 공간적 구배로 이동합니다. 이러한 분석은 플러그의 NaCl이 한천 플레이트로 지속적으로 확산되기 때문에 시간과 공간에 따른 화학주성 분석 플레이트의 NaCl 농도의 동적 변화로 인해 학부생이 정량적 방식으로 수행하기 어렵습니다. 더 쉽게 수행할 수 있는 분석은 두 가지 다른 염 농도(예: 25mM NaCl 및 0mM NaCl)가 제시되고 플라스틱 장벽11으로 분리되는 사분면 플레이트를 사용하는 것입니다. 그러나 두 가지 다른 NaCl 농도만 제시되기 때문에 기준선 조건에 비해 NaCl이 낮아지거나 증가한 것을 유발 및/또는 회피하는 데 동시에 사용할 수 없습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans )은 일반적으로 50mM NaCl 및 대장균 OP50 박테리아12가 존재하는 NGM(Nematode Growth Media) 플레이트에서 자라므로 기본적으로 이 NaCl 농도와 식품의 긍정적인 연관성을 형성합니다.

여기에서는 연구자와 학부생 모두가 수행할 수 있는 적응형 염 화학주성 학습 프로토콜을 제시합니다. 동물은 먼저 음식의 유무에 따라 나타나는 다양한 NaCl 환경에 조건화됩니다. 그런 다음 Y-챔버 한천 플레이트에서 낮은, 중간 및 높은 염 농도를 선택하여 분석 플레이트로 옮깁니다. 이 환경에서 화학주성 학습은 유전자형, 환경적 맥락 또는 동물의 나이와 같은 이를 조절하는 다양한 요인의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 8개의 학생 그룹으로 나뉘어진 학부 실습 실험실 수업에 맞게 조정되었으며, 각 학생 그룹은 각 실험 시점에서 6개의 측정 세트를 수행합니다(실험 조건당 1개의 측정). 그러나 프로토콜은 단일 실험자 또는 여러 그룹/사람에 대해 작동하도록 조정할 수 있으며 시약 수량을 적절하게 변경할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 연관 학습 테스트 전에 예쁜꼬마선충을 동기화하기 위한 성장판(GP)을 준비하고, 시험 당일 [NaCl]-식품 결합을 유도하기 위한 컨디셔닝 플레이트(CP)를 준비합니다.

참고: 성장 및 컨디셔닝을 위한 페트리 접시는 0mM NaCl CP 및 100mM NaCl CP 플레이트에서 NaCl 농도가 다양하다는 점을 제외하고는 표준 선충 성장 매체(NGM) 플레이트(12)와 동일합니다.

  1. 깨끗한 500mL 유리병 4개를 준비하고 다음을 추가합니다.
    1. 펩톤 1.25g, 한천 8.5g, 증류수 487.5mL 및 자석 교반기를 1병(0mM NaCl CP용)에 추가합니다.
    2. NaCl 1.5g, 펩톤 1.25g, 한천 8.5g, 증류수 487.5mL 및 자석 교반기를 두 병 각각에 추가합니다(각각 50mM NaCl CP 및 GP용).
    3. 병 1병(100mM NaCl CP용)에 NaCl 3g, 펩톤 1.25g, 한천 8.5g, 증류수 487.5mL, 자석 교반기를 추가합니다.
  2. 4개의 병을 121°C에서 15분 동안 오토클레이브한 다음 수조에서 55°C에서 30분 동안 병을 식힙니다.
  3. 가열된 자석 교반기에 병(한 번에 하나씩)을 놓습니다. 각 병에 12.5mL의 1M KPO4 (실온[RT]에서 pH = 6.0)를 추가합니다. 2분 동안 완전히 혼합한 다음 에탄올에 0.5mL의 1M CaCl2, 0.5mL의 5mg/mL 콜레스테롤, 0.5mL의 1M MgSO4 를 추가합니다(모든 용액은 멸균되어야 함). 자기 교반으로 혼합하십시오.
    참고 : KPO4 를 첨가 한 후 완전히 혼합하면 CaCl2 첨가시 인산 칼슘이 침전되는 것을 방지 할 수 있습니다.
  4. 각 플레이트 유형(0 mM CP, 50 mM CP, 100 mM CP, GP)에 대해 거의 멸균 조건(플로우 후드 또는 분젠 버너 옆)에서 각 55mm x 10mm 페트리 접시에 8mL의 각 배지를 분취합니다.
    참고: 이 단계에서 각 유형의 약 62개의 NGM 플레이트를 만들 수 있습니다.
  5. 플레이트를 약 3시간 동안 RT에 두어 식힌 다음 사용할 때까지 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오.
  6. 각 NGM GP에 200μL의 E. coli OP50 현탁액을 추가하고 인큐베이터에서 20°C에서 하룻밤 동안 건조시킵니다.
    알림: 플레이트는 사용하기 전에 최대 1주일 동안 RT에서 보관할 수 있습니다.

2. 예쁜꼬마선충의 유지 및 시간 지정 알을 낳는 13을 통한 연관 학습 테스트 준비 (분석 3일 전)

참고: 제안된 형식의 화학주성 분석을 한 차례에 수행하려면 성장(GP)을 위해 최소 24개의 플레이트, 분석을 위해 48개의 플레이트(Assay Plates, AP) 및 컨디셔닝 그룹당 8개의 플레이트(Conditioning Plates, CP)가 필요합니다. 8개의 학생 그룹으로 나뉜 학급의 경우, 이는 각 학생 그룹이 3 GP, 6 CP 및 6 AP(즉, 각 실험 조건에 대해 1 CP 및 1 AP)를 받는다는 것을 의미합니다.

  1. 20°C에서 살아있는 E. coli OP50을 공급하는 NGM 한천 플레이트에서 C. elegans N2(var. Bristol)를 유지합니다. 플레이트에서 수분 손실을 최소화하기 위해 유지 보수 내내 플레이트를 거꾸로 보관하십시오.
  2. 30명의 젊은(2일차) N2 성인을 각 GP로 이송합니다.
  3. 동물이 20 ° C에서 약 8 시간 동안 알을 낳을 수 있도록합니다.
  4. 접시에서 모든 성인을 제거하고 20 ° C에서 3 일 동안 거꾸로 배양합니다.

3. 분석 준비(분석 1일 전)

  1. 시드(+) 및 시드되지 않은(-) CP를 준비합니다.
    1. 플레이트당 200μL OP50(각각 CP0+, CP50+ 및 CP100+)으로 0mM NaCl CP, 50mM NaCl CP 및 100mM NaCl CP 각 배치의 절반을 시딩합니다.
      참고: CP0+에 OP50 현탁액을 추가하면 소량의 NaCl(<2mM NaCl)이 이월될 수 있으며, 이는 화학주성 거동에 실질적으로 영향을 미칠 것 같지 않습니다. 소량의 NaCl이 관련된 상황에서는 CP0- 플레이트에 2mM NaCl을 추가하고 분석 플레이트의 '무염' 섹터를 추가하여 이를 수용할 수 있습니다.
    2. 플레이트를 인큐베이터에서 20°C에서 파종되지 않은 CP(각각 CP0-, CP50- 및 CP100-)와 함께 하룻밤 동안 건조시킵니다.
  2. 분석 플레이트(AP)를 준비합니다.
    1. 깨끗한 1L 유리병 3개를 준비하고 다음을 추가합니다.
      1. 한 병에 펩톤 2.5g, 한천 17g, 증류수 975mL, 자석 교반기를 추가합니다(0mM NaCl의 경우).
      2. 병 1병에 NaCl 3g, 펩톤 2.5g, 한천 17g, 증류수 975mL, 자석 교반기를 추가합니다(50mM NaCl의 경우).
      3. 병 1병에 NaCl 6g, 펩톤 2.5g, 한천 17g, 증류수 975mL, 자석 교반기를 추가합니다(100mM NaCl의 경우).
    2. 3개의 병을 121°C에서 15분 동안 오토클레이브한 다음 수조에서 55°C에서 30분 동안 병을 식힙니다.
    3. 한편, Y-Petri 접시(내부 벽으로 3개의 구획으로 나뉜 90mm x 10mm Petri 접시)의 각 섹션 바닥에 부을 매체의 해당 NaCl 농도를 표시합니다. 세 개의 벽이 만나는 플레이트 중심을 중심으로 반경이 5mm인 원을 그립니다(그림 1).
      참고: 원 안의 영역은 벽 자체와 함께 계산 목적의 제외 영역을 나타냅니다: 계산하는 동안 이 영역 내에서 발견된 벌레는 어떤 부문의 총계에도 포함되지 않습니다.
    4. 가열된 자석 교반기에 병(한 번에 하나씩)을 놓습니다. 각 병에 1M KPO4 (상온에서 pH = 6.0) 25mL를 추가합니다. 2분 동안 완전히 혼합한 다음 1M CaCl2 1mL, 5mg/mL 콜레스테롤 1mL를 에탄올에 넣고 1M MgSO4 1mL를 추가합니다(모든 용액은 멸균되어야 함). 자기 교반으로 혼합하십시오.
    5. 매체가 내부 벽의 상단에 도달할 때까지 0mM 매체를 90mm x 10mm Y-Petri 접시의 한 구획으로 분취한 다음 약 5분 동안 응고되도록 합니다.
    6. 배지가 인접한 응고된 0mM NaCl 섹션에 닿을 때까지 100mM 배지를 Y-Petri 접시의 두 번째 구획으로 분주합니다. 인접한 빈 섹션으로의 유출을 방지하려면 100mM 섹션을 내부 Y-벽의 가장자리까지 채운 다음 멸균 10μL 피펫 팁을 사용하여 Y-벽을 따라 매체의 표면 장력을 끊고 0mM NaCl 섹션에 연결합니다. 그런 다음 굳을 때까지 약 5분 정도 기다립니다.
    7. 배지가 응고된 0mM NaCl 및 100mM NaCl 인접 섹션에 닿을 때까지 50mM 배지를 Y-Petri 접시의 나머지 빈 구획에 분주합니다. 매체가 인접한 섹션으로 흘러 넘치지 않도록주의하십시오. 그런 다음 굳을 때까지 약 5분 정도 기다립니다.
    8. 플레이트를 인큐베이터에서 20°C에서 밤새 보관하십시오.
      참고: 이 방법으로 약 50개의 AP를 만들 수 있습니다.
  3. 멸균 M9 버퍼 1L를 준비합니다14.

4. C. elegans 연관 학습 분석(여기서는 8개 그룹이 병렬로 수행)

  1. 1mL의 멸균 M9 버퍼를 GP에 피펫팅하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 OP50과 한천에서 벌레(대부분 1일 성인)를 제거하여 현탁액을 형성합니다.
  2. 플레이트를 기울이고 1mL 플라스틱 피펫 팁으로 M9 버퍼에 웜 현탁액을 모은 다음 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    알림: 피펫 팁의 상단 부분은 개구부의 직경을 늘리기 위해 가위를 사용하여 다듬을 수 있습니다. 이는 웜이 팁을 통과할 때 전단 응력과 물리적 손상을 줄이며 200 μL 피펫 팁으로 작업할 때 특히 유용할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 웜이 사용 된 튜브 유형에 달라 붙지 않도록하는 것이 중요합니다. 이것은 웜 현탁액을 제거한 후 해부 현미경으로 튜브를 관찰하여 수행할 수 있습니다.
  3. 모든 GP에 대해 이 과정을 반복한 다음 웜이 약 60초 동안 미세 원심분리기 튜브 바닥에 가라앉도록 하여 펠릿을 형성합니다.
  4. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 9mL 피펫을 사용하여 상등액/초과 M9 버퍼를 제거합니다.
  5. 1mL의 멸균 M9 버퍼로 펠릿을 두 번 더 세척하여 잔류 OP50을 제거합니다. 펠릿이 세탁 사이에 약 60초 동안 가라앉도록 합니다. 펠릿을 M9 버퍼로 300μL로 세척한 후 다시 현탁시킵니다.
  6. 50 μL의 웜 현탁액(약 200-300마리)을 각 컨디셔닝 플레이트(CP0-, CP0+, CP50-, CP50+, CP100- 및 CP100+)로 천천히 옮깁니다. 웜이 고르게 매달려 있도록 부분 견적을 하기 전에 매번 서스펜션을 휘젓습니다. OP50이 파종된 접시의 경우 벌레 방울을 박테리아 먹이 잔디밭에서 멀리 떨어뜨립니다. 현탁액이 한천에 흡수되도록 합니다.
  7. 플레이트를 20°C의 인큐베이터에 약 4시간 동안 거꾸로 보관하여 벌레가 돌아다닐 수 있도록 합니다.
    참고: 컨디셔닝 단계는 학부 과정 일정을 수용하기 위해 2시간으로 단축할 수 있습니다.
  8. 1mL의 멸균 M9 버퍼를 CP에 피펫팅하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 기생충을 제거하여 현탁액을 형성합니다.
  9. 플레이트를 기울이고 1mL 플라스틱 피펫 팁으로 M9-웜 현탁액을 수집한 다음 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  10. 벌레가 약 60초 동안 마이크로 원심분리기 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.
  11. 웜 펠릿을 방해하지 않고 1mL 피펫을 사용하여 상등액/초과 M9 버퍼를 제거합니다.
  12. 1mL의 멸균 M9 버퍼로 기생충을 두 번 더 세척합니다. 펠릿이 세탁 사이에 약 60초 동안 가라앉도록 합니다.
  13. 마이크로 원심분리기 튜브에 M9 버퍼를 1mL 표시까지 채우고 웜 펠릿이 약 60초 동안 침전되도록 합니다.
  14. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 1mL 피펫을 사용하여 960μL의 상등액을 제거합니다.
  15. 마이크로 원심분리기 튜브를 부드럽게 휘젓거나 흔들어 웜을 다시 부유시킨 다음 20μL 피펫을 사용하여 20μL의 웜 펠릿(약 100-150마리 포함)을 Y-wall의 모든 세그먼트가 만나는 AP 중앙으로 이동합니다. 다른 AP에 대해 이 단계를 반복합니다.
  16. 웜이 20°C에서 30분 동안 돌아다니도록 한 다음 실체 현미경으로 AP의 각 섹션(각각 0mM NaCl, 50mM NaCl 및 100mM NaCl)에 존재하는 웜의 수를 계산합니다. 모든 섹션 또는 섹션 사이의 경계에서 플레이트 중앙에서 5mm 이내에 존재하는 모든 벌레를 제외합니다(그림 1).
  17. 웜이 20°C에서 30분 더 로밍하도록 한 다음 AP의 각 섹션에 있는 웜 수를 다시 계산합니다. 모든 섹션에서 플레이트 중앙에서 5mm 이내에 존재하는 모든 벌레를 제외합니다.
  18. 공식15,16을 사용하여 시점별로 플레이트당 화학주성 지수(CI)를 계산합니다.
    figure-protocol-1

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결과

음식의 유무에 관계없이 다양한 양의 NaCl(0 mM, 50 mM, 100 mM)이 함유된 플레이트에서 4시간 동안 컨디셔닝하는 것은 야생형(N2) C. elegans의 행동에 상당한 영향을 미쳤습니다. 분석 플레이트에서 30분 후, NaCl 농도가 높은 플레이트와 음식(CP100+)을 조건화한 웜과 NaCl이 없고 음식이 없는 플레이트를 조건화한 웜(CP0-)은 양성 CI를 보였으며, 이는 더 높은 NaCl 농도에 대한 선호를 나타냅니다(그림 2, 표 1, 표 2 및 보충 표 1). 반대로, NaCl이 높고 음식이 없는 기생충(CP100-), 중간 NaCl과 음식이 없는 상태(CP50-), 음식이 없는 NaCl이 없는 기생충(CP0+)은 CI가 음성이었으며, 이는 낮은 NaCl 농도를 선호함을 나타냅니다(

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토론

이 기사에서는 화학주성을 실험 패러다임으로 사용하여 선충 C. elegans의 연관 학습 평가를 설명합니다. 이 예에서는 6개의 실험 조건을 사용했습니다. 구체적으로, N2 야생형 예쁜꼬마선충은 표준 선충 식품(E. coli OP50 박테리아 균주)으로 파종되거나 파종되지 않은 상태로 남겨진 낮은(0 mM), 중간(50 mM) 또는 높은(100 mM) NaCl 농도의 플레이트에 조건화되었습니다. 그런 다음, 예쁜꼬마선충은 3개의 NaCl 농도 각각과 함께 한천 절편을 포함하는 파종되지 않은 분석 플레이트를 돌아다닐 수 있었습니다. 분석 플레이트의 100mM NaCl 섹터를 배회하는 동물 수에서 분석 플레이트의 0mM NaCl 섹터를 배회하는 동물의 수를 빼고 결과를 분석 플레이트의 총 동물 수15,16...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

우리는 이 논문을 요하네스 베르톨트(Johannes Berthold)를 기리기 위해 바칩니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)에서 제공했습니다. E.I.B.는 Studienstiftung des deutschen Volkes의 재정적 지원에 감사드립니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아가르Chemsolute9972-2KG
박토-펩톤Gibco211677
CaCl2 1M 용액 Merck2389
Caenorhabditis elegans 균주Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
콜레스테롤 Roth8866.1
E. coli OP50 액체 배양N/AN/A
에탄올Chemsolute22731000
KH2PO4 Roth P018.2
KPO4 (KH2PO4, K2HPO4) 1 M 용액 Chemsolute16341000
MgSO4 1 M 용액 RothT888.2
마이크로센트리퓨지 튜브 1.5 mLEppendorfN/A
Na2HPO4 RothT877.1
NaClChemsolute13671000
Y-페트리 접시 90 x 10 mmMoonlab4-0033
```

참고문헌

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