방법 논문

A workflow for the quantitative assessment of the endophytic and epiphytic bacterial microbiomes of the Bark of Populus trichocarpa(Populus trichocarpa 껍질의 내생식물 및 착생식물 세균 마이크로바이옴의 정량적 평가를 위한 워크플로우)

DOI:

10.3791/66318

⸱

2025년 6월 27일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 Populus trichocarpa의 껍질에 존재하는 내생식물 및 착생식물 박테리아 마이크로바이옴을 프로파일링하기 위한 샘플 수집에서 데이터 분석에 이르기까지 신뢰할 수 있고 효율적인 워크플로우를 제공합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식물 표면과 내부 조직에 서식하는 미생물은 식물의 성장과 건강을 증진하는 데 유익한 기능을 가질 수 있습니다. 그러나 목본 식물의 껍질 조직의 미생물 군집에 대한 정보는 여전히 제한적이며, 특히 Populus 껍질의 내생 식물 및 착생 박테리아 미생물총(epiphytic bacterial microbiota)에 관한 정보는 여전히 제한적입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 Populus trichocarpa의 껍질에 서식하는 내생식물 및 착생균 미생물총(epiphytic bacterial microbiota)의 구성과 다양성을 정량화하는 워크플로우를 구축했습니다. 간단히 말해서, P. trichocarpa 의 줄기의 표피를 0.1% Tween 20에 담근 면봉으로 반복적으로 닦아 착생균 샘플을 획득했습니다. 벗겨진 표피를 멸균한 후 액체 질소와 비드 비터를 각각 사용하여 반복적으로 냉동 및 분쇄하여 내생식물 박테리아 샘플을 수집했습니다. 목화가 부착된 착생균 군집과 P. trichocarpa의 으깬 껍질에서 게놈 DNA를 추출하고, 박테리아 16S rRNA 유전자의 초가변 V5-V7 및 V4 영역을 표적으로 하는 프라이머로 플로이머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭을 진행했습니다. 각 내생식물 또는 착생식물 샘플의 수득된 PCR 생성물의 3가지 복제물을 동일한 농도로 혼합하여 앰플리콘 라이브러리를 구축한 후 염기서열을 분석했습니다. 얻어진 염기서열은 염기서열 접합(sequence splicing), 품질 필터링(quality filtering), 키메라 제거(chimera removal) 및 분류학적 주석(taxonomic annotations)에 의해 분석되었습니다. 요약하면, 16S rRNA 유전자 프로파일링을 통해 P. trichocarpa 껍질의 내생식물 및 착생균 마이크로바이옴을 결정하기 위한 샘플 수집에서 데이터 분석에 이르기까지 신뢰할 수 있고 효율적인 워크플로우를 구축했습니다. 이전 연구에서 확립된 나무껍질 군집의 미생물군을 탐색하는 방법과 함께, 우리의 방법론은 다른 목본 식물 종, 특히 경제적으로 중요한 숲의 나무의 껍질 미생물 군집을 조사하기 위한 프로토콜을 설계하기 위한 청사진 역할을 할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

나무 껍질은 목본 식물 줄기의 가장 바깥 쪽 층으로, 체관부와 주피 1,2를 포함하여 혈관 형성층 외부의 모든 조직을 나타냅니다. 광범위한 연구에 따르면 나무껍질은 물과 탄수화물의 이동, 화재와기계적 손상으로부터 나무를 보호3, 비생물적 스트레스4 및 생물적 스트레스에 대한 적응5에 중추적인 역할을한다. 더 중요한 것은 나무와 주변 공기 사이의 경계면으로서 나무 껍질은 미생물의 독특한 서식지 역할도 한다는 것입니다6. 특히, 나무껍질 관련 미생물은 숙주 성장을 촉진하고7, 나무의 영양분 획득을 돕고8, 식물 호르몬 합성을 강화하고9 식물 병원체 감염으로부터 숙주를 보호하는 기능을 가지고 있는 것으로 확인되었습니다5. 그러나 껍질에 서식하는 미생물 군집은 계통권(phyllosphere)과 뿌리줄기(rhizopshere) 미생물총(microbiota)에 비해 훨씬 적은 관심을 기울였습니다10,11. 나무 껍질의 마이크로바이옴의 생물학적 특징에 대한 지식은 제한적입니다. 본 방법론 논문의 목적은 연구자에게 목본 식물 껍질의 내생식물 및 착생식물 박테리아 마이크로바이옴의 다양성과 구성을 설명하기 위한 일련의 프로토콜을 제공하는 것입니다.

이 연구에서 발표된 껍질 미생물군 조사방법을 기반으로12,13 우리는 목본 식물 생물학14에 사용되는 중요한 모델 유기체인 Populus trichocarpa의 줄기 껍질 내부 조직 또는 표면에 침전하는 박테리아 마이크로바이옴을 탐색하기 위해 16S rRNA 유전자 앰플리콘 염기서열 분석을 기반으로 한 정교한 워크플로우를 설계하고 테스트했습니다. P. trichocarpa는 빠른 성장15, 실험적 조작의 상대적 용이성16, 유전적 변형이 용이한 특성을 가지고 있으며, 목재 생산에 광범위하게 적용되는 것으로 알려져 있다17. 특히, 이 연구에서 제시된 방법은 P. trichocarpa의 줄기 껍질의 내생식물 및 착생 미생물총(endophytic microbiota)의 샘플링에 대한 자세한 설명으로 시작합니다. 본 연구는 표면에 서식하는 마이크로바이옴을 채취한 후 알코올과 차아염소산나트륨으로 껍질을 표면 살균하는 단계를 포함하여, 껍질의 내부 구조에 존재하는 미생물(내생식물)과 껍질의 외부 표면에 서식하는 미생물(착생식물)을 동시에 별도로 수집하는 절차를 확립했습니다. 우리가 아는 한, 목본 식물 껍질 마이크로바이옴에 대해 발표된 연구 중 나무 껍질의 내부 및 외부 틈새를 명확하게 구분하기 위해 동일한 나무 껍질 샘플에서 수집된 내생 미생물 군집과 착생 미생물 군집에 대한 분석은 수행되지 않았습니다 18,19,20. 따라서 이 연구에서 개발된 방법을 통해 연구자들은 나무 껍질에 서식하는 박테리아 군집의 다양성과 구성을 정확하고 포괄적인 방식으로 조사할 수 있습니다. 또한 본 연구에서는 게놈 DNA 추출, 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭, 16S rRNA 유전자 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리21 준비 및 염기서열분석 데이터 분석 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 특히, 이 연구는 숙주 식물22의 미토콘드리아 및 엽록체 서열의 비특이적 증폭을 줄이기 위해 박테리아 16S rRNA 유전자의 초가변 V5-V7 영역을 표적으로 하는 한 쌍의 프라이머를 사용했으며, 이는 나무 껍질 관련 마이크로바이옴의 편향되지 않은 프로파일을 생성했습니다. α-다양성은 생태학 연구에 널리 사용되는 인기 있는 다양성 지수인 Shannon index23을 사용하여 평가되었으며, 문 수준의 분류학적 구성은 QIIME(Quantitative Insights into Microbial Ecology) 24및 R 소프트웨어25에서 계산 및 시각화되었습니다. 이전 연구에서 확립된 나무껍질 군집의 미생물군을 탐색하는 방법 1,6과 함께, 우리의 방법론은 다른 목본 식물 종, 특히 경제적으로 중요한 숲의 나무껍질 마이크로바이옴을 연구하기 위한 프로토콜을 설계하기 위한 청사진 역할을 할 수 있습니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 샘플 수집

  1. 생후 3개월 P를 키웁니다. 성장 챔버의 trichocarpa 묘목(21–25°C, 3밴드 선형 형광등[T5 28 W 6400 K]에서 약 300 μEm−2 s-1의 보조 광을 사용한 16-h light/8-h dark cycle, 및 60–80% 습도)26.
  2. P의 10cm 길이의 줄기 부분을 자릅니다. 살균된 가지치기를 사용하여 살균된 토양 표면(그림 1A) 위 2-12cm에서 트리코카르파. 줄기 부분을 멸균 된 사각형 페트리 접시 (13cm x 13cm)에 놓습니다.
    참고: 이 연구를 위해 동일한 크기의 나무 6그루를 선택했으며, 그 중 3그루는 각 프라이머 세트와 함께 PCR 증폭에 사용되었습니다.

2. 샘플 처리

  1. 0.1% Tween 20에 적신 멸균 면봉을 사용하여 멸균된 사각형 페트리 접시에서 줄기의 표피를 반복적으로 닦아 껍질 표면에 서식하는 미생물을 보다 효율적으로 수집합니다(그림 1B).
    참고: 아습한 멸균 면은 줄기 표면에 부착된 미생물을 수집하는 데 사용됩니다. 줄기 표면을 닦을 때 너무 건조하거나 너무 젖은 면을 사용하지 마십시오. Tween 20은 표면 장력을 감소시킬 수 있는 계면활성제이며, 이는 식물 표면에서 더 많은 미생물 샘플을 얻는 데 유리한 특성입니다 27,28.
  2. 멸균 칼날을 사용하여 면봉에서 면봉을 자르고 착생 미생물 샘플이 들어 있는 각 면 팁을 멸균 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.
  3. 줄기 표면을 닦은 후 멸균 메스를 사용하여 착생 미생물을 샘플링한 껍질을 자르고 껍질을 벗겨낸 다음 사각형 페트리 접시에 담습니다.
  4. 2.3단계에서 줄기에서 벗겨낸 껍질을 멸균 메스로 약 1cm 조각(그림 1C)으로 자릅니다.
  5. 세그먼트를 70%(v/v) 알코올에 2분 동안 담가 살균합니다. 다음으로, 0.1% Tween 80이 보충된 차아염소산나트륨(2.5% 효과적인 염소 함량)에 세그먼트를 5분 동안 담급니다.
  6. 2.5단계에서 얻은 세그먼트를 70%(v/v) 알코올에서 30초 동안 살균합니다29. 그런 다음 모든 샘플을 멸균 증류수로 세 번 세척하고 깨끗한 벤치에 올려 자연 건조시킵니다.
    참고: 껍질 샘플은 충분한 표면 살균을 보장하기 위해 멸균 핀셋을 사용하여 앞뒤로 저어줍니다.
  7. 각 표면 멸균 줄기 껍질 세그먼트(내생 시료)를 -80°C의 멸균 2mL 원심분리 튜브에 보관합니다.

3. 게놈 DNA 추출

  1. DNA 추출을 위해 샘플을 전처리하려면 다음 단계를 수행하십시오.
    1. 2.7단계에서 얻은 표면 멸균 줄기 껍질 세그먼트를 멸균 5mL 하드 튜브에 넣고 각 튜브에 3개의 멸균된 강철 비드(4mm)를 추가합니다.
      알림: 미생물 오염을 방지하기 위해 깨끗한 벤치에서 이 단계를 수행하십시오. 2.2단계에서 제조된 면봉(epiphytic samples)은 전처리가 필요하지 않으며 genomic DNA 추출에 직접 사용됩니다.
    2. 샘플이 들어 있는 단단한 튜브를 액체 질소에 10분 동안 얼립니다.
    3. 비드 비터로 나무 껍질 샘플을 5분 동안 부수십시오. 그런 다음 단단한 튜브를 액체 질소에 다시 1분 동안 얼리고 비드 치팅 단계를 5분 동안 반복합니다.
  2. 게놈 DNA를 추출합니다.
    참고: 상용 DNA 추출 키트를 사용하여 내생 및 착생 샘플에서 게놈 DNA를 분리합니다.
    1. P의 으깬 줄기 껍질을 추가합니다 . trichocarpa 및 면이 부착된 epiphytic bacterial community(각 0.25g)를 각 비드 튜브에 부착합니다. 그런 다음 상용 키트에서 제공하는 60μL의 용액 C1을 추가하고 반전으로 부드럽게 혼합합니다.
    2. 다음으로, 비드 비터(bead beater)를 사용하여 1분 동안 4회 실행하여 내생식물 및 착생식물 샘플을 균질화합니다. 각 실행 후 샘플을 얼음 위에 30초 동안 놓습니다.
    3. 10,000 x g 에서 튜브를 1분 동안 원심분리합니다.
    4. 제조업체의 지침에 따라 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 내생식물 및 착생식물 샘플을 추출합니다.
    5. 흰색 필터 멤브레인의 중앙에 30μL의 용액 C6을 추가하고 25°C에서 5분 동안 배양합니다.
    6. 10,000 x g 의 원심분리기를 실온에서 1분간

4. PCR 확대

  1. 추출된 DNA 농도를 표준화합니다.
    1. 미량 분광 광도계를 사용하여 epiphytic 및 endophytic 샘플에서 추출한 게놈 DNA의 농도를 측정합니다.
    2. 각 DNA 샘플을 멸균 ddH2O에서 2 ng/μL로 희석하여 PCR 증폭을 위한 DNA 템플릿을 얻습니다.
  2. 이러한 DNA 샘플을 증폭합니다.
    1. 전방 프라이머 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') 및 역방향 프라이머 1193R (5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3')을 사용하여 박테리아 16S rRNA 유전자의 V5–V7 영역을 증폭 10. forward primer 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') 및 reverse primer 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')을 사용하여 박테리아 16S rRNA 유전자의 V4 영역을 증폭한다 30.
      참고: 각 샘플에서 추출한 게놈 DNA는 3회 PCR 증폭 반응 각각에 대한 주형으로 활용되며, DNA가 없는 추가 반응은 음성 대조군으로 설정됩니다. 모든 샘플에 대해 PCR 반응 혼합물 부피는 25μL입니다. 프라이머 쌍 799F/1193R의 경우, 각 반응에는 PCR 물 12μL, F/R 프라이머(10μM) 각 1μL, DNA 템플릿 1μL 및 혼합 용액 10μL가 포함됩니다. 프라이머 쌍 515F/806R의 경우, 각 반응에는 PCR 물 12μL, F/R 프라이머(10μM) 각 1μL, DNA 템플릿 1μL 및 혼합 용액 10μL가 포함됩니다. 프라이머 쌍 799F/1193R을 사용한 PCR 반응은 98°C에서 5분 동안 초기 변성, 98°C에서 30초 동안 25주기, 30초 동안 53°C, 72°C에서 45초 동안 최종 변성, 72°C에서 5분 동안 최종 연장. 프라이머 쌍 515F/806R을 사용한 PCR 반응은 다음과 같은 사이클 조건으로 수행됩니다: 94°C에서 3분 동안 초기 변성, 95초 동안 94°C, 60초 동안 50°C, 90초 동안 72°C에서 72°C의 35사이클, 72°C에서 10분 동안 최종 확장.
    2. 모든 샘플을 철저히 혼합하고 원심분리하여 기포를 제거합니다.
    3. 열 순환기에서 박테리아 16S rRNA 유전자의 V5–V7 또는 V4 영역을 증폭합니다.
  3. 증폭된 제품을 감지합니다.
    1. 1% 아가로스 겔에 각 앰플리콘 5μL를 로드하고 120V에서 30분 동안 전기영동을 수행합니다.
    2. 성공적인 PCR 증폭을 검증하기 위해 자외선 아래에서 겔을 봅니다. 프라이머 쌍 799F/1193R 및 515F/806R로 수득한 PCR 산물의 크기는 각각 대략 430 bp 및 400 bp여야 한다.

5. 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리의 준비

  1. 증폭된 산물을 혼합하고 농도를 측정합니다.
    1. PCR 튜브의 각 샘플에 대해 PCR 증폭의 3회 반복에서 생성된 산물을 혼합합니다.
    2. 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 PCR 산물 5μL와 작업 용액 195μL를 96웰 마이크로플레이트의 웰에 추가합니다( 재료 표 참조). 다음으로, 10 μL의 표준 DNA(키트에서 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 및 100 ng/μL 농도의 DNA 시약)와 190 μL의 작업 용액을 동일한 마이크로플레이트의 웰에 추가합니다. 이 단계에 따라 PCR 산물과 표준 DNA의 형광 강도를 측정합니다.
    3. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다.
      참고: 표준 플루오레세인 파장의 여기/방출은 각 샘플에서 이중 가닥 DNA의 양을 측정하기 위해 480/530nm로 설정됩니다.
    4. 표준 DNA 용액(0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 및 100ng/μL)의 표준 DNA 농도와 각 표준 DNA 용액의 형광 강도를 사용하여 DNA 농도 및 형광 강도의 표준 곡선을 설정합니다. PCR 산물 각각의 형광 강도 값을 표준 곡선에 대입하여 PCR 산물의 DNA 농도를 계산합니다.
  2. 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리를 구축합니다.
    1. 5.1.4단계에서 검출된 농도에 따라 동일한 프라이머 쌍으로 증폭된 나머지 PCR 산물을 동일한 농도로 혼합하여 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리를 구축합니다.
      참고: 형광 강도를 측정하여 이중 가닥 DNA의 농도를 정량화하는 데 사용되는 각 샘플의 PCR 산물 분획은 동일한 샘플의 나머지 PCR 산물로 구축된 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리에 포함되지 않습니다.
  3. 젤 추출을 수행합니다.
    1. 전기영동 장치를 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행합니다. 간단히 1.3% 아가로스 젤(즉, 1 x TAE 완충액 100mL에 아가로스 분말 1.3g)을 준비합니다.
      참고: 겔에 있는 웰의 양이 각 PCR 산물과 DNA 사다리를 유지하기에 충분한지 확인하기 위해 주의를 기울입니다. 이 연구에서는 1.3% 아가로스 젤을 1 x TAE 완충액 100mL에 아가로스 분말 1.3g을 용해하여 제조합니다.
    2. 겔 응고 후 빗을 제거하고 1 x TAE 버퍼가 있는 전기영동 탱크에 겔을 넣습니다. 다음으로, 6 x 주황색 로딩 버퍼의 1 부피 단위를 각 PCR 산물의 5 부피 단위에 추가하고, 후자의 100 μL를 각 웰에 로드합니다. 30 μL의 DNA ladder를 하나의 웰에 추가합니다. 양극선과 음극선을 연결한 후 80V에서 50분 동안 전기영동을 수행합니다.
      참고: 이 연구에서는 겔 추출을 사용하여 프라이머 쌍 515F/806R 또는 799F/1193R로 각각 증폭된 400bp 또는 430bp의 밴드로 표시되는 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리를 정제합니다.
    3. 깨끗하고 날카로운 메스를 사용하여 아가로스 겔에서 DNA 조각을 절제합니다.
    4. 젤 슬라이스의 무게를 측정하고 무색 튜브에 옮깁니다. 젤 슬라이스를 담그기 위해 버퍼를 추가합니다.
      참고: 스핀 컬럼당 젤의 최대 양은 400mg입니다. 3 부피 단위의 완충액이 주어진 겔 슬라이스의 1 부피 단위에 추가됩니다.
    5. 제조업체의 지침에 따라 Gel Extraction Kit( 재료 표 참조)를 사용하여 겔 추출을 수행합니다.
      참고: 내생식물 및 착생식물 박테리아 군집의 염기서열분석에 사용되는 박테리아 16S rRNA 유전자를 표적으로 하는 PCR 산물로 구성된 앰플리콘 라이브러리는 이 방법을 사용하여 얻어집니다.
  4. 정제된 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리의 품질을 확인합니다.
    1. 제조업체의 프로토콜(그림 2)에 따라 상용 키트(재료 표 참조)를 사용하여 형광계를 사용하여 5.3.5단계에서 얻은 정제된 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리에서 이중 가닥 DNA의 농도를 측정합니다.
    2. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 칩 및 키트( 재료 표 참조)와 함께 핵산 품질 관리 분석 시스템을 사용하여 5.3.5단계에서 얻은 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리의 표적 DNA 단편 크기를 측정합니다.
      참고: 단편 크기가 예상 범위 내에 있고 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리에 프라이머 이량체가 없는지 확인합니다.
    3. 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트( 재료 표 참조)와 함께 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 5.3.5단계에서 얻은 염기서열분석 라이브러리의 유효 농도를 측정합니다.
    4. 염기서열분석 플랫폼에 권장되는 로딩 농도를 충족하기 위해 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리를 희석합니다.

6. 시퀀스 처리 및 통계 분석

  1. 염기서열분석 후 5.4.4단계에서 얻은 앰플리콘 라이브러리를 염기서열분석 플랫폼( 재료 표 참조)을 사용하여 31. 작업 디렉터리에 emp-paired-end-sequences라는 폴더를 만든 다음, 압축된 염기서열분석 파일을 이 폴더에 fastq 형식으로 저장합니다. 그런 다음 Ubuntu를 열고 conda 환경과 QIIME2(Microbial Ecology 2)에 대한 정량적 통찰력을 활성화합니다(v2021.2)32.
  2. 매핑 파일을 작성하여 텍스트 파일로 저장합니다. 파일 내용은 표 2에 나와 있습니다.
  3. 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리로 얻은 염기서열분석 데이터를 분할하고 매핑 파일을 사용하여 염기서열분석 데이터에서 프라이머를 제거합니다.
    1. time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza 명령을 사용합니다.
    2. 다음 명령을 사용하여 프라이머를 제거합니다: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F 또는 515F --p-front-r 1193R 또는 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. DADA2 파이프라인33을 사용하여 키메라를 스크리닝하고 제거합니다. 필터링된 염기서열을 99% 유사성으로 앰플리콘 염기서열 변이체(ASV)로 클러스터링합니다.
    1. 다음 명령을 사용하여 키메라 및 클러스터 시퀀스를 ASV로 스크리닝하고 제거합니다. time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. 참조 시퀀스34를 기반으로 SILVA 데이터베이스(v138)를 사용하여 분류학적 주석을 만듭니다.
    1. 다음 명령을 사용하여 6.4단계에서 얻은 ASV에 주석을 추가합니다. time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. 다음 명령을 사용하여 QIIME2(v2021.2)에서 ASV 테이블을 만듭니다.
    qiime tools export --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    qiime tools export --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID, 분류 --sc-separated 분류
    biom 변환 -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key 분류
    참고: 이러한 명령은 각 샘플에 대한 모든 ASV의 읽기 수를 포함하는 테이블을 생성합니다.
  7. 프라이머 쌍 799F/1193R 및 515F/806R로 각각 생성된 내생식물 및 착생식물 박테리아 군집의 ASV 및 판독 수를 계산합니다.
    1. 6.6단계에서 얻은 ASV 테이블의 각 샘플에서 각각 phylum, class, order, family 및 genus 수준에서 ≥ 1 판독을 갖는 ASV의 총 수를 계산하여 계산합니다.
    2. 계산을 통해 6.6단계에서 얻은 ASV 테이블에 있는 모든 ASV의 판독 횟수의 합계를 기준으로 각 샘플의 총 판독 수를 계산합니다.
    3. 6.6단계에서 얻은 ASV 테이블에서 엽록체 또는 미토콘드리아로 주석이 달린 ASV의 판독 횟수를 사용하여 각 샘플의 식물 판독 수를 계산합니다.
    4. 다음 공식을 사용하여 각 샘플의 박테리아 판독 수를 계산합니다.
      박테리아 판독 횟수 = 총 판독 횟수 - 식물 판독 수.
    5. Excel(2019) 및 Prism(v8.0) 소프트웨어를 사용하여 프라이머 쌍 799F/1193R 및 515F/806R에 의해 생성된 내생식물 및 착생균 군집의 평균 ASV 수(각각 문, 클래스, 목, 과 및 속 수준에서) 또는 읽기(각각 총 또는 식물 및 박테리아 수준에서)를 계산하고 시각화합니다.
    6. Prism(v8.0) 소프트웨어에서 Student's t-test를 사용하여 프라이머 쌍 799F/1193R 및 515F/806R로 생성된 ASV(각각 문, 클래스, 목, 과 및 속 수준) 또는 읽기(각각 총 또는 식물 및 박테리아 수준) 간의 차이의 중요성을 평가합니다.
  8. time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitochondria, chloroplast --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza 명령을 사용하여 엽록체 및 미토콘드리아로 주석이 추가된 읽기를 필터링합니다.
  9. 다음 명령을 사용하여 계통발생 트리를 생성합니다: time qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. QIIME2(v2021.2) 및 R(v4.0.5)의 'ggplot2' 패키지를 사용하여 내생식물 및 착생식물 박테리아 군집의 Shannon index로 표시되는 알파 다양성을 계산하고 시각화합니다35.
    1. 다음 명령을 사용하여 알파 다양성을 계산합니다: time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth 모든 샘플 중 가장 낮은 읽기 값 --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. 내생식물(endophytic) 및 착생식물(epiphytic) 박테리아 군집의 문(phylum) 수준에서 개체군의 상대적 풍부도를 계산합니다. QIIME2(v2021.2)의 다음 명령을 사용하여 "taxa-bar-plots"라는 qzv 형식의 파일을 생성합니다. time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. https://view.qiime2.org/ 에서 온라인으로 taxa-bar-plots.qzv 파일을 엽니다. level2에서 새로 생성된 파일을 다운로드하여 저장합니다. R을 사용하여 다음 공식으로 상대적 풍부도를 계산합니다(v4.0.5).
      각 박테리아 문의 상대적 풍부도(%) = (각 샘플에서 각 박테리아 문의 판독 횟수 / 각 샘플의 총 판독 수) x 100 %.
      R(v4.0.5)의 ggplot2, RColorBrewer, reshape 및 ggalluvial 패키지를 사용하여 데이터를 시각화합니다.
  12. STAMP 소프트웨어36에서 0.05의 유의 수준에서 Tukey의 사후 검정과 함께 단방향 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 프라이머 쌍 799F/1193R로 염기서열분석된 내생식물 및 착생균 군집(> 0.5%의 상대적 풍부도를 가진 문으로 정의됨)에서 각 우성 문( phyla)의 상대적 풍부도 간의 상대적 풍부도 간의 차이의 중요성을 분석합니다.

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결과

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P의 껍질의 내생식물 및 착생식물 박테리아 마이크로바이옴의 고품질 게놈 DNA. 트리초카르파는 최적화된 프로토콜을 사용하여 얻었습니다(표 1). 12개 샘플 모두의 PCR 증폭은 올바른 크기의 단일 강한 밴드를 생성했습니다(그림 3). 두 프라이머 쌍 799F/1193R 및 515F/806R은 각각 약 400 및 430 bp에서 내생 식물 또는 착생 껍질 조직 샘플의 표적 산물을 성공적으로 증폭했습니다. 앰플리콘 라이브러리는 단일 피크, 적격한 DNA 단편 크기, 프라이머 이량체 없음, 농도 22.16nM, 부피 100μL로 추가로 구축되어 사전 염기서열분석 요구 사항을 충족했습니다(그림 4).

염기서열분석 프로파일링을 통해 P. 껍질...

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토론

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껍질 미생물총(bark microbiota) 7,18을 조사하기 위해 발표된 방법론에서 개발된 본 연구연구에서 제안된 워크플로우는 목본 식물 껍질의 내생식물 및 착생식물 마이크로바이옴을 식별하고 특성화하기 위한 일반적인 지침을 제공합니다. 이 방법은 샘플 수집 및 처리, 게놈 DNA 추출, PCR 증폭, 앰플리콘 염기서열분석 라이브러리 준비 및 염기서열분석 데이터 분석을 위한 프로토콜로 구성되며, 목본 식물 종의 껍질 마이크로바이옴을 연구하기 위한 프로토콜을 설계하기 위한 잠재적인 청사진 역할을 합니다.

껍질 마이크로바이옴 연구의 일반적인 문제는 껍질의 착생식물 미생물 샘플과 내생식물 미생물 샘플의 구분이 종종 간과된다는 점에서 수집 접근 방식입니다1. 이것은 목본 식물의 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

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비디오 내레이션을 제공해 주신 David Anthony Atherton씨와 귀중한 조언을 해주신 B.N. 연구소 직원들에게 감사드립니다. 이 작업은 중국 국립과학재단(National Science Foundation of China, BN에 대한 보조금 번호 32071741), 신장 위구르 자치구의 핵심 R&D 계획 프로젝트(보조금 번호 2022B02014), "톈치 인재(Tianchi Talents)" 도입 계획(BN에), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(보조금 번호 2021YFD2200203 [GQ]), 나무 유전학 및 육종의 국가 핵심 연구소(Northeast Forestry University) 혁신 프로젝트(보조금 번호 2019A01 [BN에])의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
장비:
드 비터DHS 생명 과학401265
1.5mL 튜브용 원심분리기 PCRThermo Scientific75002440
심분리기 마이크로
플레이트 리더BioTek8040528
NanodropDHS 생명 과학 및 테크놀로지 주식회사2010/2020 마이크로볼륨 분광 광도계
큐비트 3.0 형광계 invitrogenQ33216형광계 
냉장고(-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
T100 열 순환기Bio-Rad1861096열 순환기
Tanon EPS-600 - TanonA-179047-2313전기영동용
LabChip GX Touch HTPerkinElmerCLS138625라이브러리 DNA 단편 분포 검출, 핵산 품질 관리 분석
Applied Biosystems QuantStudio 12KApplied Biosystems4485694정량화 라이브러리
Illumina Novaseq6000Illumina 라이브러리 시퀀싱
재료:
장갑모든NA
에어로졸 장벽 팁 10 & LAxygenTF-300-RS
에어로졸 배리어 팁 20μ LAxygenTF-20-RS
에어로졸 배리어 팁 200μ LAxygenTF-200-R-S
에어로졸 배리어 팁 1000μ LAxygenTF-1000-RS
원심분리기 튜브 1.5mlAxygenMCT-150-C
Corning 96-well Black/Clear Flat Bottom MicroplateCorning3631
면봉ZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil 키트QIAGEN 12888-100DNA 추출
소 프리 원심분리기 튜브 1.5mlUSA SCIENTIFIC1415-2600
에탄올Tianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited64-17-5
하드 튜브 (5 ml)DHS 생명 과학0401261-17
핫 마스터 믹스  Quanta Bio2200400
미세 원심분리기 튜브 2.0mlAxygenMCT-200-CS
PCR 물QIAGEN 17000-10
QIAquick 젤 추출 키트 QIAGEN28704겔 추출용
Quant-iT dsDNA 분석 키트, 광범위한InvitrogenQ33130증폭된 제품 및 정제된 앰플리콘 라이브러리의 농도 측정용
각 페트리 접시Changde Bkman Biotechnology Co., Ltd110301014
스틸 비드Shangyu Yixin Ball Industry Co., Ltd.YXB36985
차아염소산나트륨 용액Tianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd 7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
이중 프로토콜 DNA High Sens 시약 키트PerkinElmerCLS760672DNA 라이브러리 검출
Vazyme Biotech Co., Ltd용 VAHTS 라이브러리 정량 키트NQ104정량화 라이브러리
비 튜브용 원 효 사Illumina

참고문헌

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