방법 논문

폭발로 인한 달팽이관 손상을 연구하기 위한 레이저 유도 충격파의 연구 응용

DOI:

10.3791/66396

⸱

2024년 3월 1일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National Defense Medical College, 2Division of Bioinformation and Therapeutic Systems, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 레이저 유도 충격파(LISW)를 사용하여 폭발로 인한 달팽이관 손상의 동물 모델을 만들기 위한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 측두골이 LISW에 노출되면 폭발에 의한 달팽이관 병태생리학이 재현될 수 있습니다. 이 동물 모델은 달팽이관 병리학을 밝히고 폭발 부상에 대한 잠재적 치료법을 탐색하기 위한 플랫폼이 될 수 있습니다.

초록

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귀는 폭발 과압에 가장 취약한 기관이며, 폭발 노출 후 달팽이관 손상이 자주 발생합니다. 폭발에 노출되면 삶의 질에 부정적인 영향을 미치는 돌이킬 수 없는 난청인 감각신경성 난청(SNHL)이 발생할 수 있습니다. 유모 세포의 손실, 나선형 신경절 뉴런, 달팽이관 시냅스, 입체섬모의 파괴와 같은 폭발로 인한 달팽이관 병리에 대한 자세한 설명이 이전에 문서화되었습니다. 그러나 폭발 부상 후 달팽이관 감각 신경 저하를 결정하는 것은 어려운 일인데, 폭발 과압에 노출된 동물은 일반적으로 고막 천공(TMP)을 경험하여 동시 전음성 난청을 유발하기 때문입니다. 순수 감각신경성 달팽이관 기능 장애를 평가하기 위해 레이저 유도 충격파를 사용하여 폭발로 인한 달팽이관 손상의 실험 동물 모델을 개발했습니다. 이 방법은 TMP 및 수반되는 전신 손상을 피하고 LISW 노출 후 에너지 의존적 방식으로 SNHL 구성 요소의 기능 저하를 재현합니다. 이 동물 모델은 병리학적 메커니즘을 규명하고 모세포로 인한 달팽이관 기능 장애에 대한 잠재적인 치료법을 탐색하기 위한 플랫폼이 될 수 있습니다.

서론

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난청과 이명은 가장 흔한 장애 중 하나이며, 재향 군인의 최대 62%가 보고하고 있습니다1. 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss, SNHL) 및 고막천공(tympanic membrane perforation, TMP)을 포함한 여러 폭발로 인한 청각 합병증이 폭발 과압에 노출된 사람들에게서 보고되었다2. 또한, 폭발에 노출된 개인에 대한 연구에 따르면 폭발에 노출되면 청력 역치가 정상 범위 내에 있는 경우에도 청각 시간 해상도에 결함이 발생하는 경우가 많으며, 이를 "숨겨진 청력 손실(HHL)"이라고 합니다3. 모세포 관련 달팽이관 병리학에서 내부 유모세포(IHC)와 청각 뉴런(AN) 사이의 달팽이관 시냅스가 크게 소실된다는 것은 잘 알려진 사실이다4. 시냅스 퇴행은 청각 처리 장애를 초래하며 HHL5의 발병에 기여하는 주요 요인입니다. 따라서 청각 기관은 복잡하고 고도로 조직화된 구조를 포함하는 깨지기 쉬운 구성 요소입니다. 하지만 돌파가 세포 수준에서 내이에 영향을 미치는 정확한 메커니즘은 아직 불분명합니다. 이는 실험실 환경에서 폭발 부상의 정확한 임상 및 기계적 복잡성을 복제하는 데 어려움이 있고 폭발로 인한 달팽이관 병리학의 복잡성 때문입니다.

폭발 부상의 주요 구성 요소는 충격파(SW)이며, 이는최고 압력(6)의 빠르고 높은 증가를 특징으로 합니다. 폭발 부상의 복잡성은 수많은 후향적 연구에서 광범위하게 조사되었습니다 7,8,9. 압축 가스(10), 충격관(11) 및 소형 폭발물(12)과 같은 폭발 발생을 위한 다양한 장치가 서로 다른 압력 수준에서 존재한다. 최근에 개발된 장치에서 발생하는 SW의 압력 파형은 실제 폭발 때와 매우 흡사했습니다. 모세포에 의한 감각신경성 난청의 동물 모델을 확립하는 데 있어 중요한 개념은 동물의 죽음을 줄이기 위해 청각 손상 이외의 동반 부상을 최소화하는 것입니다. 따라서 폭발 부상 연구가 개발되어 충격 튜브가 소형화되고 출력을 정밀하게 제어하여 노출된 동물이 거의 죽지 않도록 할 수 있습니다. 그러나 이러한 동물모델에서는 일반적으로 TMP와 같은 합병증이 발생하지만, 동시에 발생하는 전음성 난청으로 인해 달팽이관 기능 평가가 어렵다2. 우리는 이전에 귀마개를 사용한 폭발 부상에 대한 귀 보호 동물 연구를 수행했으며 TMP13의 발생률을 발견하지 못했습니다. 귀마개는 심각한 달팽이관 손상을 부분적으로 약화시킬 수 있지만 중추 청각 신경 퇴행이나 이명 발생은 완화할 수 없습니다. 따라서 귀마개는 달팽이관과 고막을 보호합니다. 그러나 폭발 손상으로 인한 달팽이관 병태생리를 연구하기 위해서는 TMP가 없는 폭발로 인한 순수 달팽이관 손상의 동물 모델이 필요합니다.

우리는 이전에 레이저 유도 충격파(LISW)를 사용하여 쥐와 생쥐에서 내이의 국소 폭발 손상 모델을 개발했습니다14,15. 이 방법은 표준 실험실 수준에서 안전하고 쉽게 수행 할 수 있으며 폐 및 두부 폭발 손상 모델을 생성하는 데 사용되었습니다16,17. LISW의 에너지는 레이저 유형과 출력을 변경하여 조정할 수 있으므로 달팽이관 손상 정도를 제어할 수 있습니다. LISW 유발 달팽이관 손상 모델은 폭발 손상으로 인한 인공와우의 메커니즘을 연구하고 잠재적인 치료법을 조사하는 데 유용합니다. 이 연구에서는 LISW를 사용하여 폭발로 인한 달팽이관 손상의 마우스 모델을 만들기 위한 자세한 실험 프로토콜을 설명하고 LISW 노출 후 마우스에서 에너지 의존적 방식으로 유모 세포(HC), 달팽이관 시냅스 및 나선형 신경절 뉴런(SGN)의 손실을 포함한 달팽이관 퇴행을 보여줍니다.

프로토콜

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모든 실험 절차는 국방 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 #18050)의 승인을 받았으며 국립 보건원과 일본 문부과학성의 지침에 따라 수행되었습니다. 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. 동물

  1. 이 프로토콜을 따르기 위해 8주 된 수컷 CBA/J 마우스를 사용하십시오. 실험 전에 쥐에게 청력 기능 검사와 고막의 내시경 관찰을 실시하여 정상성을 확인합니다.
  2. 27 CBA / J 마우스를 세 그룹으로 나눕니다 : (1) 2.0 J / cm2 노출 그룹 (n = 9 마우스); (2) 2.25 J/cm2 노출군(n=9마리 마우스); 및 (3) 2.5 J/cm2 노출군(n = 9 마우스). LISW 노출 후 1개월 후에 평가를 위해 모든 귀를 제거합니다.

2. LISW 노출의 실험 설정

  1. 레이저 타겟은 직경 10mm, 두께 0.5mm의 검은색 천연 고무 디스크입니다. LISW 임펄스를 높이려면 아크릴 수지 용접 접착제를 사용하여 1.0mm 두께의 투명한 폴리에틸렌 테레프탈레이트 시트(PET)를 대상 영역의 상단에 접착합니다. 532nm Q-switched Nd: YAG 레이저를 조사하여 대상 뒤에 LISW를 생성합니다(그림 1A).
  2. plano-convex lens를 사용하여 레이저 대상의 3.0mm 직경 스폿에 레이저 펄스의 초점을 맞춥니다.
  3. LISW 조사를 사용하여 두 재료의 결합 표면에서 플라즈마를 생성하고 고무를 기화(플라즈마 매개 절제)하여 기화된 고무를 캐비티에 남깁니다.
  4. 수중 청음기를 사용하여 생체 조직이 아닌 수중 1.0mm에서 LISW의 압력파를 측정합니다. 수표면 아래 0.25mm 아래의 검은색 고무 아래에 1.0mm 직경의 광섬유 수중 청음기를 배치하여 LISW 압력 파형을 기록하고 디지털 오실로스코프를 사용하여 측정합니다.
    참고: 압력 파형은 그림 1B와 같이 유사한 최대 압력 및 임펄스로 안정적인 특성을 보여주었습니다.
  5. 1mg/kg 메데토미딘 염산염 및 75mg/kg 케타민의 복강 내 주사를 사용하여 전신 마취 하에 모든 동물 시술을 수행합니다. 생쥐의 양쪽 눈에 안과 연고를 바르면 건조를 방지하고 열을 공급할 수 있습니다.
  6. 털에 갇힌 공기가 남지 않도록 귓바퀴 뒤쪽 부위를 조심스럽게 면도하십시오. 마우스를 플레이트에 고정하고 LISW의 초점 영역에서 후귓바퀴 영역을 수직으로 위쪽 방향으로 배치합니다.
  7. 검은색 고무 타겟을 마우스 귀의 귓바퀴 뒤쪽 부위에 경피적으로 부착합니다. 음향 임피던스 정합을 보장하려면 레이저 대상과 피부 표면 사이에 초음파 전도성 젤을 사용하십시오.
  8. 측두골을 통해 달팽이관에 단일 LISW 펄스를 적용합니다. 레이저 펄스의 출력을 2.0 J/cm2 , 2.25 J/cm2 및 2.5 J/cm2의 세 가지 에너지 밀도로 설정합니다.

3. 인공와우 기능 검사

참고: 청각 뇌간 반응(ABR) 검사는 이전에 보고된대로 수행되었습니다 14,15.

  1. LISW 노출 1일 전과 1일 및 1개월 후에 ABR 측정을 수행합니다.
  2. ABR은 청각 자극에 대한 반응으로 청각적으로 유발되는 전위이며 일반적으로 4가지 주파수(12.0kHz, 16.0kHz, 20.0kHz 및 24.0kHz)에서 청력 임계값을 평가하는 데 사용됩니다.
  3. 작은 이어폰을 통해 자극음을 제시하고 이어폰 근처에 위치한 작은 마이크를 사용하여 마우스의 고막 부근의 음압 레벨을 측정합니다. 사운드 제너레이터에서 37 cycles/s로 버스트 자극을 출력하고 5dB SPL 단계로 20dB 음압 레벨(SPL)에서 80dB SPL로 음압을 증폭합니다.
  4. 귀의 외이도와 전두부 아래에 뇌파 기록을 위한 스테인리스강 바늘 전극을 삽입하고 꼬리의 꼬리 부분 아래에 접지 전극을 삽입합니다.
  5. ABR 피크 I(P1) 진폭을 측정하여 달팽이관 기능을 평가합니다. 이전에 보고된 바와 같이 ABR 피크 분석 소프트웨어를 사용하여 청력 임계값 및 ABR P1 진폭에 대한 ABR 파형을 자동으로 분석합니다18.
  6. 노출 전에 얻은 임계값을 빼서 ABR 임계값 이동을 계산합니다. 노출된 3개 그룹의 ABR 역치 이동을 노출되지 않은 반대측 귀(대조군)의 역치 이동과 비교합니다. 80dB SPL 자극 중 ABR 파형을 사용하여 ABR 진폭을 측정합니다.

4. 조직학적 평가

참고: 조직학적 평가는 앞서 설명한 바와 같이수행하였다 14,15.

  1. HC와 달팽이관 시냅스
    1. LISW 노출 후 1개월 후에 달팽이관의 병리학적 검사를 수행합니다.
    2. 관류 전에 발가락 꼬집을 통해 마취 깊이를 확인합니다. 젖산 링거 용액으로 혈액 관류 후 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL/g으로 심장 경관류를 수행합니다. 참수 후 달팽이관을 제거하고 4% PFA를 직접 관류한 다음 밤새 4°C에서 고정합니다.
    3. 고정 후 0.5mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 2일 동안 흔들어 달팽이관을 제거합니다.
    4. 탈염된 달팽이관을 네 조각으로 나눕니다. 달팽이관의 각 조각을 드라이아이스에 10분 동안 얼린 후, 투과성을 위해 0.3% Triton X와 간단히 결합된 5% 일반 말 혈청에서 실온에서 1시간 동안 차단을 수행합니다.
    5. anti-myosin 7a(Myo7A), anti-C-terminal binding protein(CtBP2) 및 anti-neurofilament(NF) 항체를 1차 항체로 사용하고 37°C에서 밤새 배양합니다. Myo7A, CtBP2 및 NF 항체를 사용하여 각각 HC, 시냅스전 리본 및 달팽이관 신경 섬유를 평가합니다.
    6. 결합되지 않은 1차 항체를 인산염 완충 식염수(PBS)로 5 x 3분 동안 씻어냅니다. 적절한 2차 항체로 37°C에서 2시간 동안 검체를 배양합니다. 염색 후 PBS로 3 x 5분 동안 표본을 세척하고 커버 유리를 사용하여 수용성 캡슐화제로 슬라이드 유리에 표본을 캡슐화합니다.
    7. 평가를 위해 10x 배율로 달팽이관의 전체 이미지(4개 조각으로 나뉘어짐)를 획득하고 참조된 ImageJ 소프트웨어 플러그인을 사용하여 달팽이관 주파수 맵을 계산하여 12.0kHz, 16.0kHz, 20.0kHz 및 24.0kHz 주파수에서 특정 달팽이관 영역의 위치를 정확하게 파악합니다.
    8. HC 생존율과 각 주파수에서 시냅스의 수를 계산합니다.
      1. HC 생존율을 계산하려면 각 주파수에서 200μm 길이당 생존 및 누락된 HC의 수를 세고 아래 표시된 방정식 (1)을 사용하여 HC의 생존율을 계산합니다.
        HC 생존율(%) = (생존 HC의 수 / 생존 및 누락된 HC의 수) × 100 (1)
      2. 시냅스 수를 계산하려면 컨포칼 형광 현미경 검사에서 3.1x 디지털 줌 및 0.25μm 단계 크기의 오일 이멀젼 대물렌즈(63×)를 사용하여 내부 HC 영역의 고해상도 z-stack 이미지를 얻습니다. 이미지 스택을 ImageJ로 가져오고 각 이미지 스택에서 50μm 범위 내에서 IHC당 CtBP2 점을 자동으로 계산합니다. 방정식 (2)를 사용하여 시냅스 리본 생존율을 계산합니다.
        시냅스 리본 생존율(%) = (LISW 노출된 귀의 시냅스 리본 수 / 대조 귀의 시냅스 리본 수) × 100 (2)
    9. 주사전자현미경(SEM)의 경우 앞에서 설명한 대로 달팽이관을 제거한 다음 4°C에서 밤새 2% PFA와 2.5% 글루타르알데히드로 고정합니다. 4°C에서 0.5mol/L EDTA 용액을 7일 동안 흔들어 달팽이관을 석회화한 후 달팽이관을 4조각으로 절개하여 전체 산 준비를 합니다.
    10. 4°C에서 30분 동안 1% 사산화오스뮴으로 조직을 고정하고, 실온에서 50% 에탄올로 10분 동안 탈수하고, 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올로 반복하고, 오스뮴으로 스퍼터 코팅하고, 이전에 보고된 바와 같이 5.0kV에서 전자 현미경으로 검사합니다14.
    11. SEM 이미지14를 사용하여 각 에너지 그룹에서 파괴된 입체섬모의 비율(파괴된 OHC 입체섬모의 수/OHC 입체섬의 총 수)을 계산하여 외부 유모 세포(OHC)의 입체섬모 파괴에 대한 정량적 분석을 수행합니다. 16.0kHz 및 24.0kHz 영역의 중심에서 100μm당 입체섬모의 수를 계산합니다. 측면으로 구부러져 있거나, 얽혀 있거나, 밑면이 없는 OHC 다발을 하나 이상 끊어진 것으로 지정합니다.
  2. SGN (영문)
    1. LISW 노출 후 1개월에 SGN 수를 정량적으로 평가하려면 위에서 설명한 것과 동일한 조건에서 4% PBS로 심장 경관류를 수행하고, 목을 자르고, 달팽이관을 제거하고, 후방 고정을 수행합니다. 1주일 동안 0.5M EDTA에서 달팽이관을 석회질화합니다.
    2. 석회질을 제거한 후, 달팽이관을 30% 자당에 밤새 담그고, 이를 동결 절제 화합물에 매립시키고, 액체 질소에 동결하여 15μm 두께의 Rosenthal's canal 근처 절편을 준비하고, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고, 광학 현미경으로 관찰합니다14.
    3. SGN 밀도 측정의 경우, Rosenthal's canal의 중간 회전에 있는 SGN의 수를 세고 대조군당 SGN 생존을 계산합니다.

5. 통계 분석

  1. 선택한 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
  2. 양방향 반복 측정 ANOVA["빈도 또는 달팽이관 부분(정점/중간/기저)" × "동물 그룹"], 양방향 분산 분석(ANOVA)을 사용한 후 사후 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 ABR 임계값 이동, HC, SGN 및 시냅스 수의 통계적 차이를 분석합니다.
  3. 모든 데이터를 평균 ± 표준 오차로 표시하고 통계적 유의수준을 p < 0.05로 설정합니다.

결과

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LISW 파형
LISW 압력 파형의 재현성은 다음과 같이 2.0 J/cm2 에서 5배 측정하였다. 파형은 대체로 유사하고 안정적이었으며, 시간 폭, 피크 압력 및 임펄스가 0.43±0.4μs, 92.1 ± 6.8MPa, 14.1 ± 1.9 Pa∙s(중앙값 ± SD)로 급격히 증가했으며, 이는 SW 특성에 해당합니다(그림 1B). LISW는 빠른 상승 시간, 높은 피크 압력, 짧은 지속 시간 및 양압 우세가 특징입니다. 생체조직에 적용하는 경우, 타겟을 젤리를 통해 생체 조직에 직접 배치하며, SW는 측정된 SW가 조직에 적용된 것과 거의 동일한 특성을 갖는다고 볼 수 있다. LISW에 노출된 후 소형 디지털 내시경을 사용하여 TMP의 발생을 평가했습니다. LISW 에너지 그룹의 마우스 중 어느 것도 노출 후 TMP를 나타내지 않았습니다(그림 1C).

청각 평가
청각 기능을 결정하기 위해 ABR 검사를 수행했습니다. ABR은 청각 경로에서 소리가 유발하는 전위를 측정한 것이며, ABR P1은 달팽이관 신경에 축적된 신경 활동을 나타냅니다. LISW 노출 하루 후, 노출된 귀는 서로 다른 LISW 그룹 간의 ABR 역치 이동에서 유의한 차이를 보였다(two-way ANOVA, p < 0.0001; 그림 2A). ABR 역치 이동의 이러한 증가는 2.25 및 2.5 J/cm2 그룹(two-way ANOVA, 2.25 J/cm2, p < 0.0001; 2.5 J/cm2, p < 0.0001)에서 LISW 노출 후 최대 1개월 동안 지속되었습니다. 특히, 고주파 영역에서는 ABR 임계값 이동이 눈에 띄게 증가했습니다. 그러나 ABR 임계값은 2.0 J 그룹(two-way ANOVA, 2.0 J/cm2, p = 0.76)의 방사선 조사와 크게 다르지 않은 수준으로 회복되었으며, 이는 임계값 상승이 에너지 의존적임을 나타냅니다. ABR P1 진폭과 관련하여, 모든 LISW 조사 그룹은 LISW 노출 후 1일 및 1개월 후 모든 주파수에서 ABR P1 진폭이 유의하게 감소한 것으로 나타났다(양방향 ANOVA, p < 0.0001; 그림 2B). 노출되지 않은 귀(대조군, 왼쪽 귀)는 LISW 노출 후 ABR 청력 역치에서 눈에 띄는 변화를 보이지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음).

HC와 SGN의 생존
LISW에 노출된 귀를 현미경으로 관찰한 결과, LISW 노출 후 이소골의 골절 및 탈구, 둥근 창막 파열 또는 달팽이관 내 출혈과 같은 달팽이관의 기계적 손상이 나타나지 않았으며(데이터는 표시되지 않음), 이는 이전 연구 결과와 일치합니다 6,14.

HCs와 Myo7A, 시냅스 리본과 CtBP2, 달팽이관 신경과 NF의 형광 면역염색이 그림 3A에 나와 있습니다. HC 또는 신경 섬유의 손실과 같은 심각한 달팽이관 손상은 어떤 그룹에서도 관찰되지 않았습니다. 그러나 Myo7A 양성 OHC 생존에 대한 정량적 평가는 그룹 간에 유의한 차이를 보였다(two-way ANOVA, p=0.002; 그림 3B). 2.5 J/cm2 그룹은 특히 고주파 영역(양방향 ANOVA, 2.5 J/cm2, p = 0.0002)에서 대조군보다 OHC의 생존율이 현저히 낮았습니다. 그러나 IHC의 생존율은 그룹 간에 비슷했으며, 이는 OHC가 고에너지 LISW에 취약하다는 것을 나타냅니다(two-way ANOVA, p=0.76). 시냅스 리본 생존의 정량적 평가는 그림 3C에 나와 있습니다. 시냅스 리본은 대조군에 비해 2.25 및 2.5 J/cm2 그룹 모두에서 유의하게 감소했으며(양방향 ANOVA, 2.25 J/cm2, p < 0.0001; 2.5 J/cm2, p < 0.0001), 주파수가 높을수록 ABR 임계값 이동 및 OHC 생존과 유사하게 더 강한 감소 경향을 보였습니다.

다음으로, 그림 3D와 같이 SGN 밀도를 평가하였다. 두 그룹 간 SGN 밀도에는 유의한 차이가 있었으며(two-way ANOVA, p=0.76), 2.5 J/cm2 그룹은 대조군에 비해 SGN 생존율이 유의하게 낮았다(two-way ANOVA, 2.5 J/cm2, p=0.007). 그러나 2.0 및 2.25 J/cm2 그룹은 대조군과 비교하여 유사한 SGN 생존을 보였다. 이 결과는 달팽이관 변성 및 청력 기능 장애의 심각성이 LISW 에너지 노출에 따라 달라진다는 것을 나타내며, 이는 ABR 및 HC 생존 결과와 일치합니다.

입체섬모 번들
20kHz 이상의 주파수에서 2.25 및 2.5 J/cm2 그룹 모두에서 ABR 임계값(약 30dB)이 눈에 띄게 증가했으며, 이는 LISW 노출 후 최대 1개월까지 지속되었습니다( 그림 2A 참조). 그러나 우리가 관찰한 30dB 임계값 변화는 OHC의 손실, 달팽이관 시냅스의 퇴화 또는 SGC의 수 감소에만 기인할 수 없습니다(그림 3). 이전 연구에 따르면 시냅스 리본의 수가 50% 감소했을 때 ABR 임계값 이동이 최소화되었습니다19. 따라서 ABR 임계값 상승의 원인을 조사하기 위해 SEM을 수행했습니다. 2.5 J/cm2의 강도에서 LISW 노출 후, OHC의 일부 입체 섬모 다발은 특히 고주파 영역(그림 4A)에서 중단된 것으로 나타났으며, 이는 LISW 노출 후 ABR 임계값이 향상되는 원인 중 하나일 수 있습니다. 입체섬모 파괴에 대한 정량적 평가는 에너지 의존적 방식으로 고주파 영역에서 파괴 비율이 더 높은 경향이 있음을 보여주었습니다(그림 4B).

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그림 1: LISW의 실험 설정 및 압력 프로파일. (A) 동물에서 LISW를 생성하기 위한 실험 설정. (B) 2.0J/cm로 설정된 LISW 압력 파형의 특성2. (C) 고막의 대표 이미지. TMP는 LISW에 노출된 귀에서 관찰되지 않았다. 참고로, 대표적인 폭발 유도 TMP(노란색 화살촉)는 발파관을 사용하여 표시됩니다. 약어: LISW = 레이저 유도 충격파; PET = 폴리에틸렌 테레프탈레이트; TMP = 고막 천공; YAG = 이트륨 알루미늄 가닛; SHG = 2차 고조파 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: LISW에 노출된 후 ABR 결과. (A) LISW에 노출된 후 1일 후 모든 그룹에서 유의미한 ABR 임계값 변화가 관찰되었습니다. 2.25 및 2.5 J/cm2 그룹의 ABR 역치 변화는 LISW에 노출된 후 최대 1개월 동안 유의하게 상승된 상태를 유지했습니다. (B) LISW에 노출된 후 1일 및 1개월 후의 ABR P1 진폭은 모든 그룹에서 유의하게 감소하였다. 별표는 사전 노출 값(**p < 0.001, ****p < 0.0001)과 비교하여 그룹 간에 유의미한 차이를 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 약어: ABR = 청각 뇌간 반응; LISW = 레이저 유도 충격파; P1 = 피크 1; SPL = 음압 레벨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: LISW에 노출된 후의 달팽이관 병리학. (A) LISW에 노출된 후 Myo7A(파란색), CtBP2(빨간색) 및 NF(녹색)로 염색된 20kHz 영역에서 Corti 장기의 컨포칼 형광 이미지. (B) 생존하는 HC의 평균 비율은 세포코클로그램에 표시되어 있습니다. 정량적 평가는 2.5 J/cm2에서 OHC의 유의한 손실을 보여주었지만 그룹 간 IHC 생존에는 유의한 차이가 없었습니다. (C) 노출 전 값과 비교한 시냅스전 리본의 생존율은 2.25 및 2.5 J/cm2 그룹에서 유의하게 감소했다. (D) LISW에 노출된 후 1개월 후 모든 그룹의 SGN의 대표 현미경 사진. SGN 생존율은 2.5 J/cm2에서 유의하게 감소하였다. 별표는 노출 전 값(**p < 0.001, ****p < 0.0001)과 비교하여 상당한 차이를 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 스케일 바 = 5 μm(A), 100 μm(D). 약어: LISW = 레이저 유도 충격파; IHC = 내부 유모 세포; NF = 신경 필라멘트; OHC = 외부 유모 세포; SGN = 나선형 신경절 뉴런. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4 : OHC의 표면 구조. (A) LISW에 노출 된 지 1 개월 후 Corti 장기의 16kHz 및 24kHz 영역에서 OHC 입체 섬모의 대표적인 주사 전자 현미경 이미지. 입체섬모 파괴는 2.5 J/cm2 (24 kHz area) 그룹의 박스형 영역의 확대 이미지에서 볼 수 있습니다. 눈금 막대 -= 2 μm. (B) 입체섬모 파괴율은 LISW 과압이 증가함에 따라 더 높았습니다. 약어: LISW = 레이저 유도 충격파; OHC = 외부 유모 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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이 연구는 LISW를 사용하여 폭발로 인한 달팽이관 손상의 마우스 모델을 검증하는 것을 목표로 했습니다. 우리의 발견은 측두골을 통해 LISW를 적용한 후 노출된 쥐의 귀가 달팽이관에서 일관된 병리학적 및 생리학적 감소를 보였으며 이는 LISW 과압의 증가를 동반했음을 보여주었습니다. 이러한 결과는 이 마우스 모델이 LISW 출력을 조정하여 다양한 달팽이관 병리학을 복제하는 데 적합하다는 것을 나타냅니다. 특히, 이 LISW 유도 달팽이관 기능 장애 마우스 모델은 통제되고, 재현 가능하고, 정량화 가능한 특성뿐만 아니라 통제된 조건에서 병태생리학적 달팽이관 감소를 재현할 수 있는 능력으로 인해 우수한 달팽이관 손상 모델이 될 수 있습니다.

이전 연구에서는 쥐 모델을 사용하여 청력 역치 상승, 시냅스 리본 손실, 입체섬모 다발 파괴를 포함한 LISW 유발 달팽이관 변성을 관찰했다14. 또 다른 연구에서는 서로 다른 특성을 가진 두 가지 유형의 폭발, 즉 폭발관을 사용하는 저주파 우세와 LISW15를 사용하는 고주파 우성의 폭발을 사용하여 쥐의 폭발 손상 후 병태생리학적 달팽이관 퇴행을 조사했습니다. 그들은 폭발력 스펙트럼의 지배적인 주파수가 이전에 보고된 바와 같이 달팽이관 손상 영역을 결정하는 주요 요인이라고 결정했습니다15. 우리가 아는 한, 이것은 LISW 달팽이관 노출과 에너지 및 주파수 의존적 LISW 유발 달팽이관 변성에 대한 자세한 방법론을 입증한 최초의 연구입니다.

우리는 LISW 노출을 활용하여 외이도를 통하지 않고 귀 후 측두골을 통해 달팽이관을 손상시켜 TMP 또는 이소골 사슬 중단 없이 달팽이관 손상만 포함하는 모델을 만들었습니다. 우리의 발견은 이 연구에서 입증된 청각 손상이 청각 경로의 감각 신경 구성 요소의 저하 때문임을 암시합니다. 최근 연구에 따르면 TMP는 SW 에너지 2,20,21을 흡수하여 달팽이관 손상에 대한 완충 역할을 할 수 있습니다. 이 LISW 모델은 SW가 고막을 통하지 않고 내이에 직접 조사되었기 때문에 고강도 LISW로도 TMP를 유도할 수 없었습니다. 따라서 TMP 및 SNHL을 사용한 혼합성 난청을 분석하려면 실제 폭발 또는 충격관을 사용하여 생성된 고강도 폭발이 이상적입니다. 폭발 유형의 선택은 연구의 특정 용도 또는 목표에 따라 다릅니다. 따라서 이 LISW 기반 동물 부상 모델은 전음성 난청을 유발하는 TMP 없이 순수 폭발 유발 달팽이관 병태생리를 설명하는 데 유용합니다. 또 다른 관점에서 볼 때, LISW 조사는 장비 설정 및 방사선 조사 후 고막(tympanic membrane) 점검을 포함하여 1마리당 1시간이 필요했습니다. 따라서 1일 이내에 여러 동물이 연속으로 LISW에 노출된 경우, 한 번의 마취량으로 LISW 조사와 ABR을 같은 날에 측정하기 어렵다. 마취량을 늘리면 동물이 죽을 위험이 있기 때문에 이 연구에서는 당일 방사선 조사 직후가 아닌 다음 날에 ABR 측정을 수행하기로 결정했습니다.

폭발 손상에서, 1차 단계는 폭발의 물리적 힘과 조직-공기 접합부(22)와 같은 조직 밀도의 현저한 변화와 함께 빠른 SW 전달에 의해 발생한다. 따라서 대부분의 폭발로 인한 달팽이관 손상은 1차 단계6 동안 SW에서 발생하는 것으로 간주되며, 이는 폭발로 인한 달팽이관 기능 장애의 메커니즘을 이해하는 데 SW에 노출된 달팽이관 손상에 대한 연구가 중요하다는 것을 시사합니다. 고체 물질에 고에너지 레이저 펄스를 사용하여 SW를 생성하는 것을 LISW라고 합니다. 이전 연구에서는 LISW를 사용하여 폭발로 인한 외상성 뇌 및 폐 손상의 동물 모델을 개발했습니다16,17. 폭발 관련 연구에 LISW를 사용하면 LISW가 대상 영역 밖의 영역에 영향을 미치지 않기 때문에 레이저 강도에 따른 반복 가능한 손상 모델과 손상된 장기의 특정 표적화라는 이점이 있습니다.

이 연구에서 우리는 LISW가 달팽이관 HC, SGN, 시냅스 및 입체섬모 다발에서 실제 폭발 부상으로 인한 손상과 유사한 병리학적 변화를 유도한다는 것을 발견했습니다12. 소음성 난청과 같은 다양한 형태의 달팽이관 모욕으로 인한 피해는 직접적인 기계적 스트레스와 이차적 대사 장애라는 두 가지 기본 요인에 기인할 수 있습니다. 우리는 입체섬모 다발의 파괴가 LISW의 직접적인 기계적 스트레스로 인한 주요 병리학이라고 제안합니다. 입체섬모 장애는 노화 관련 및 소음 유발 청력 기능 장애와 관련된 일반적인 병리학입니다23,24. 이 입체섬모 붕괴의 기저에 있는 정확한 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 이전 연구에서는 폭발 노출 후 1주일 후에 입체섬모 붕괴가 관찰되었다고 밝혔다12. 이러한 독특한 형태학적 변화의 가능한 이유는 교란된 가장 바깥쪽 줄 입체섬모와 중간 열 입체섬모(14) 사이의 팁 링크 및 사이드 링크의 단절일 수 있다. 더욱이, 액틴(actin)과 TRIOBP와 같은 번들링 단백질(bundling protein)로 구성된 입체섬모(stereocilia)의 가장 바깥쪽 줄의 뿌리도 기계적으로 손상된다15.

달팽이관 손상은 일반적으로 며칠 또는 몇 달 동안 지속될 수 있는 대사 과정의 추가 중단으로 이어질 수 있습니다19. 특히, 청각적 소리 처리를 담당하는 달팽이관의 시냅스는 폭발 노출에 매우 취약하다25. 우리의 동물 모델은 ABR P1 진폭의 감소로 입증된 바와 같이 AN 기능의 퇴화가 LISW에 의한 달팽이관 손상에 의해 발생한다는 것을 보여주었습니다. LISW 유발 달팽이관 시냅토병증의 가능한 기전 중 하나는 IHC에 의한 과도한 글루타메이트 방출이며, 이에는 글루타메이트 이독성이 있다26. LISW 노출은 기저막이 격렬하게 진동하여 IHC에서 글루타메이트가 과도하게 방출되도록 하여 AN 변성을 일으킵니다. LISW는 달팽이관에 영향을 미치는 글루타메이트 독성 유형을 복제할 수 있으며, HC를 손상시키지 않으면서 달팽이관 시냅스병증과 시냅스 수의 감소를 유발할 수 있습니다. 또 다른 가능한 메커니즘은 LISW 노출이 달팽이관 지원 세포를 손상시킬 수 있다는 것인데, 이는 neurotrophins27의 방출에 따라 ANF의 생존에 기여한다. 또한 LISW는 ANF로 직접 전달되어 신경 손상을 일으킬 수 있습니다. 결과적으로, LISW 유도 달팽이관 손상 모델은 폭발 연구와 달팽이관 시냅토병증과 관련된 다양한 형태의 달팽이관 변성 검사 모두에 유용할 수 있습니다.

모세포로 인한 난청을 해결하기 위한 치료적 개입이 시급히 필요하며, OHC에서 달팽이관 시냅토병증 또는 입체섬모 다발 파괴에 초점을 맞춘 치료 전략의 중요성을 강조합니다. 이러한 접근법은 유사한 병리학적 기전을 가진 다른 유형의 청각 장애에도 적용될 수 있습니다. 인공와우 유발 달팽이관 기능 장애 모델에서 달팽이관 시냅토병증이 관찰되었으며, 이는 유망한 치료 표적이 될 수 있음을 시사합니다. LISW는 폭발로 인한 달팽이관 병태생리학을 정확하게 복제하는 마우스 모델을 만드는 데 사용할 수 있으며, 이러한 모델은 다양한 유형의 달팽이관 기능 장애를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

본 연구에는 몇 가지 한계가 있다. 먼저 12-24kHz에서 ABR 임계값을 측정했습니다. 이전 연구에 따르면, LISW에 의한 달팽이관 손상은 SW의 특성과 달팽이관 기저부의 취약성으로 인해 동물에서 고주파 난청을 초래합니다. 더 넓은 주파수 영역(>24kHz)에서 추가 ABR 연구가 필요합니다. 둘째, 본 연구에서는 달팽이관에 대한 조직학적 평가만 실시하고 중추 청각 경로는 평가하지 않았다. 폭발 사고로 인한 청력 손상은 달팽이관에만 국한되지 않고 뇌간과 중추 청각 시스템의 복잡한 손상입니다. 앞으로는 LISW에 노출된 동물 모델에서 청각 중추를 평가하는 것이 바람직할 것입니다.

공개 사항

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 JSPS KAKENHI의 두 가지 보조금(보조금 번호 21K09573 (K.M.) 및 23K15901 (T.K.))의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
532 nm Q-스위치 Nd:YAG 레이저 QuantelBrilliant b
ABR 피크 분석 소프트웨어Mass Eye and EarN/AEPL Cochlear Function Test Suite
아크릴 수지 용접 접착제 Acrysunday Co., LtdN/A
컨포칼 형광 현미경 LeicaTCS SP8
동결 절제 화합물SakuraTissue-Tek O.C.T
CtBP2 항체BD Transduction#612044
유전체 다층 거울SIGMAKOKI CO.,LTDTFMHP-50C08-532M1-M3
디지털 오실로스코프TektronixDPO4104B
이어폰CUICDMG15008-03A
수중청음기RP 음향
Image J 소프트웨어 플러그인NIH측정 라인https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
광학 현미경Keyence CorporationBZ-X700
Myosin 7A 항체Proteus Biosciences#25– 6790년 
신경필라멘트 항체Sigma#AB5539
Plano-convex lensSIGMAKOKI CO.,LTDSLSQ-30-200PM
프리즘 소프트웨어GraphPadN/Aver.8.2.1
주사전자현미경JEOL LtdJSM-6340F
소형 디지털 내시경AVS Co. LtdAE-C1
초음파 젤리히타치 알로카 메디컬N/A
가변 감쇠기Showa Optronics Co.현재사용 가능한 후계자: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
수용성 캡슐화제 다코#S1964
FOPH2000

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