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방법 논문

철을 킬레이트화하는 새로운 화합물의 능력을 확인하기 위한 정량화 가능하고 저렴한 cell-free 형광 방법

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/66421

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2024년 2월 23일

 ,  , 
1Department of Applied Sciences, Faculty of Health and Life Sciences, Northumbria University

이 논문에서

요약

우리는 철을 킬레이트화하는 새로운 화합물의 능력을 빠르고 저렴하게 확인할 수 있는 형광 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 약한 철 킬레이트 형광 프로브 Calcein의 철 결합 활성을 능가하는 화합물의 능력을 측정하여 킬레이트화가 발생할 때 형광을 정량화할 수 있는 증가를 초래합니다.

초록

암세포는 증식을 유지하기 위해 많은 양의 철분을 필요로 합니다. 철분 대사는 암의 특징으로 간주되므로 철분은 항암 접근법의 유효한 표적이 됩니다. 새로운 화합물의 개발과 추가 변형을 위한 리드를 식별하려면 메커니즘 분석의 증명을 수행해야 합니다. 확산에 미치는 영향을 평가하기 위한 많은 분석법이 있습니다. 그러나 철을 킬레이트화하는 능력은 높은 장비 비용과 킬레이트화의 강도를 빠르고 재현성 있게 정량화해야 하는 과제로 인해 중요하지만 때때로 간과되는 종점 측정입니다. 여기에서는 새로운 화합물이 철을 킬레이트화하는 능력을 확인하기 위해 정량화할 수 있고 저렴한 cell-free 형광 방법을 설명합니다. 당사의 분석은 상업적으로 이용 가능한 저렴한 형광 염료 Calcein에 의존하며, 대부분의 형광 마이크로타이터 플레이트 리더에서 형광을 정량화할 수 있습니다. Calcein은 약한 철 킬레이트제이며 형광은 Fe2 + / 3 +와 결합할 때 소멸됩니다. 형광은 새로운 킬레이트 레이터가 Fe2+/3+에 대해 Calcein을 능가할 때 복원됩니다. 형광 소광의 제거와 그에 따른 형광의 증가는 새로운 추정 킬레이트 ator의 킬레이트화 능력을 결정할 수 있게 합니다. 따라서 당사는 새로운 후보 킬레이터 화합물을 신속하게 스크리닝할 수 있는 저렴하고 처리량이 높은 분석을 제공합니다.

서론

공통된 생물학적 능력의 변화를 통해 암의 발병과 관련된 세포의 표현형 변화는 이제 일반적으로 암의 특징이라고 불립니다. 그 중에는 암세포 생물학에서 널리 퍼져 있는 에너지 대사의 재프로그래밍으로 인한 변화가 있습니다1. 이러한 대사 재프로그래밍에는 빠른 증식과 종양 성장을 지원하기 위한 철분 요구량 증가가 포함됩니다2. 철분에 대한 이러한 갈증은 철분 대사 조절 장애를 유발하며, 이는 그 자체로 암의 특징인것으로 간주되며3,4 모든 단계에서 조절 장애가 발생한다5. 웰치(Welch)와 허스트(Hurst)가 최근에 제안한 전이(metastasis)의 특징은 철분이 산화 스트레스를 유발할수 있기 때문에 철분(iron)6의 역할을 포함하며, 이는 유전체(genome), 후성유전체(epigenome) 및 단백질체(proteome)의 변화를 매개하여 전이의 가능성을 높일 수있다7. 철분 수치와 암 발병 증가 사이의 연관성은 역학 연구를 통해 입증되었다8.

암세포는 많은 양의 철분을 필요로 하기 때문에 철분 결핍에 취약하여 철분 킬레이트화가 발생합니다. 우리는 최근 NDRG1을 통해 암의 여러 특징을 역전시키는 철 킬레이트화의 잠재력을 강조하는 리뷰 논문을 발표했다9. 그러나 철분 킬레이트를 독립적인 암 치료법으로 사용하는 것은 독성, 짧은 반감기, 빠른 신진대사 및 새로운 내성 메커니즘으로 인해 임상 시험에서 긍정적인 결과를 얻지 못했습니다. 그럼에도 불구하고 철 킬레이트제는 in vitro 및 in vivo 연구에서 가능성을 보여주었으며, 이는 암 치료를 위한 효과적인 철 킬레이트제를 개발하기 위해 더 많은 연구가 필요하다는 것을 나타냅니다. 특정 철분 킬레이트화는 항암 약물 개발에서 검증된 전략이지만 현재까지 보고된 종류는 소수에 불과합니다10.

새로운 철 킬레이트제의 식별 및 특성화에는 여러 종말점에 대한 효과를 측정할 수 있는 능력이 필요합니다. 이들 중 다수(예: 증식, 세포자멸사, 활성산소종 형성)는 일상적으로 측정되며, 암의 특징을 평가하기 위한 방법으로 문헌에 요약되고 검토되었다11. 새로운 철 킬레이트제를 평가할 때, 많은 그룹에서 철 유입 또는 유출에 대한 효과뿐만 아니라 항증식 및 산화 환원 활성에 미치는 영향을 정기적으로 조사합니다. 인실리코(in silico ) 예측 기법(12 )은 스크리닝할 수 있는 철 킬레이트제의 증가를 더욱 증가시킨다.

철 킬레이트의 S크리닝은 원리를 효과적으로 입증하기 위한 수단으로 철 수치에 미치는 영향을 측정할 수 있는 능력이 필요합니다. 현재 이를 위한 가장 일반적인 방법은 유세포 분석(flow cytometry)13인데, 이는 비용과 시간이 많이 소요되며 정량화가 잘 되지 않습니다. 분석법의 선택은 종종 실험 장비의 가용성, 분석 속도 및 비용에 따라 결정됩니다. 따라서 철을 킬레이트화하는 능력은 높은 장비 비용과 킬레이트화의 강도를 빠르고 재현성 있게 정량화해야 하는 과제로 인해 간과되는 종점 측정이 될 수 있습니다. 여기에서는 철을 킬레이트화하는 새로운 화합물의 능력을 확인하기 위해 정량화할 수 있고 저렴한 무세포 형광 방법을 설명합니다.

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프로토콜

1. 원액 준비

  1. Calcein 스톡 용액을 준비할 때 용액을 어두운 곳에 보관하여 사진 품질 저하를 방지하십시오. 마그네슘 또는 칼슘14가 없는 Dulbecco의 PBS에서 Calcein의 1mM 용액을 준비합니다. 5mM Calcein 용액 1mL의 경우 Dulbecco의 PBS 5mL에 Calcein 3.1mg(622.5g/M)을 추가합니다. Calcein의 1mM 양말을 사용하여 표 1에 자세히 설명된 대로 마이크로퓨지 튜브에 1mL 분취액의 2차 원액을 준비합니다.
  2. 19mL의 Dulbecco의 PBS 5mL에 FAS 육수화물(392.1g/M) 10mg을 용해시켜 10mM 황산철암모늄(FAS) 용액을 얻어 황산철암모늄 육수화물 스톡을 준비합니다. 희석하여 FAS의 2차 재고를 준비합니다. 2mM FAS(fA) 스톡을 준비하려면 10mM FAS 스톡 200μL를 Dulbecco의 PBS 800μL로 PBS로 희석합니다. 100μM FAS(fB)의 스톡을 준비하려면 50μL의 스톡 fA를 950μL의 Dulbecco's PBS로 희석합니다.
  3. 10mM의 Deferiprone 스톡을 준비하려면 Dulbecco의 PBS 2mL에 2.8mg(139.15g/M)을 녹입니다. 10mM 스톡 200μL를 Dulbecco의 PBS 800μL로 희석하여 2mM 철 킬레이트의 2차 스톡을 준비합니다.
    참고: 이 분석에서 선택한 철 킬레이트제는 마그네슘이나 칼슘 없이 Dulbecco의 PBS에 용해되어야 합니다. 작업 예로, 우리는 철 킬레이터 Deferiprone을 사용했습니다.

2. Calcein 형광의 선형 범위 측정을 통한 분석 검증

  1. 원액 표에 설명된 대로 1mM - 1μM의 Calcein 스톡 범위를 준비합니다( 표 1 참조). 광화학적 분해를 방지하기 위해 원액을 어두운 곳에 보관하십시오.
  2. 단일 채널 수동 피펫 또는 다중 채널 수동 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 웰 A에서 H 및 1 - 12에 90μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 피펫팅합니다.
  3. 단일 채널 수동 피펫을 사용하여 10μL의 1mM Calcein 스톡을 96웰 플레이트의 열 12, 열 A에서 H에 추가합니다.
  4. 사전 준비된 800μM Calcein 스톡(표 1) 10μL를 단일 채널 수동 피펫을 사용하여 열 11, 행 A에서 H까지의 96웰 플레이트에 추가합니다.
  5. 표 1의 스톡으로 추가 절차를 반복하여 열 10에 400μM 스톡의 10μL가 포함되고 열 9에 200μM 스톡의 10μL가 포함되도록 합니다. 컬럼 2에 1μM 스톡의 10μL가 포함될 때까지 컬럼 전체에서 이 단계적 절차를 계속합니다.
    참고: 각 웰에서 Calcein의 최종 농도는 1:10 희석으로 인해 원액보다 10배 낮습니다.
  6. 10μL의 PBS를 열 1, 행 A에서 E에 추가합니다.
  7. 실온에서 30분 동안 배양하고 마이크로플레이트 리더의 분석기를 490nm의 여기와 530nm의 검출(또는 Calcien 형광에 적합한 필터 세트)로 설정합니다.

3.Calcein 형광을 줄이기 위한 Fe2+ 이온 담금질에 의한 분석 검증

  1. 10μM의 Calcein(cB) 스톡과 2mM의 FAS 스톡(fA)을 준비합니다( 재료 표 참조). 광분해를 방지하기 위해 Calcein 스톡을 어두운 곳에 보관하십시오.
  2. 단일 채널 수동 피펫 또는 다중 채널 수동 피펫을 사용하여 50μL의 PBS를 열 2에서 10, 행 A에서 E에 추가합니다. 열 11에 PBS를 추가하지 마십시오.
  3. 단일 채널 수동 피펫을 사용하여 2mM의 FAS(fA) 스톡 100μL를 열 11(행 A에서 E)의 96웰 플레이트에 추가합니다.
  4. 멀티채널 수동 피펫을 사용하여 컬럼 11에서 50μL의 fA를 제거하고 이미 컬럼 10에 있는 PBS에 피펫팅하고 피펫팅으로 철저히 혼합합니다.
  5. 96 웰 플레이트의 열 9-2, 행 A에서 E에 걸쳐 이 단계적 이중 희석 절차를 계속하고 피펫팅으로 혼합합니다.
  6. 컬럼 2에서 피펫팅하여 50μL의 용액을 제거하고 용액을 폐기합니다.
  7. 40μL의 PBS를 용액이 있는 모든 웰(열 2-12, 행 A에서 E)에 추가합니다.
  8. 90μL의 PBS를 웰 1열 A-E행에 추가합니다. 이 웰은 1 μM Calcein 및 0 μM FAS의 양성 제어 역할을 합니다.
  9. 10μL의 10μM 칼세인 스톡(cB)을 용액이 들어 있는 각 웰에 추가합니다(1-12열, A-E행). 그 결과 11열의 최고 농도는 1000μM FAS이며 10, 9, 8열의 FAS 농도는 2열로 절반으로 줄어듭니다. 컬럼에서 생성된 각 웰에는 1μM Calcein과 FAS 희석액이 포함되어 있습니다.
  10. PBS 단독 컨트롤에 대해 1에서 5열까지의 F행에 100μL의 PBS를 추가합니다. FAS 단독 제어를 위해 100μL의 2mM FAS를 6-10열의 F행에 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
  11. 490nm의 여기와 530nm의 검출로 설정된 마이크로플레이트 리더(또는 Calcein 형광에 적합한 필터 세트)에서 분석합니다.

4. Fe 2+ 이온에 대해 약한 킬레이트 Calcein을 능가하는 철 킬레이트제의 능력을 정량화하기 위한 분석

  1. 표 1에 나타난 바와 같이 10 μM의 Calcein stock(cB), 100 μM의 FAS stock(fB) 및 2 mM의 iron chelator stock을 준비한다. 광분해를 방지하기 위해 Calcein 재고를 어두운 곳에 보관하십시오.
  2. 싱글채널 수동 피펫 또는 멀티채널 수동 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 열 2 - 10, 행 A에서 E에 50 μL의 PBS를 추가합니다. 열 11에 PBS를 추가하지 마십시오.
  3. 철 킬레이트의 2mM 스톡(fA) 100μL를 단일 채널 수동 피펫을 사용하여 열 11, 행 A에서 E까지의 96웰 플레이트에 추가합니다.
  4. 멀티채널 수동 피펫을 사용하여 11열에서 50μL의 fA를 제거하고 10열, A에서 E행의 PBS로 피펫팅하고 피펫팅으로 철저히 혼합합니다.
  5. 플레이트의 나머지 열 9-2, 행 A에서 E에 대해 이 단계적 이중 희석 절차를 계속하고 피펫팅으로 각 웰을 혼합합니다. 컬럼 2에서 50μL를 제거하고 폐기합니다. 이렇게 하면 96개의 웰 플레이트 컬럼 11에서 2, A에서 E행에 걸쳐 철 킬레이터(Deferiprone) 2mM를 이중 희석할 수 있습니다.
  6. 30μL의 PBS를 용액이 들어 있는 모든 웰에 피펫팅합니다(예: 열 2-11, A에서 E까지).
  7. 다중 채널 피펫을 사용하여 10μL의 100μM FAS 스톡(fB)을 열 2-12, A에서 E행에 추가합니다. 그 결과 각 웰에서 1μM Calcein과 10μM FAS의 농도가 생성되고 킬레이트화가 이중 희석되어 농도가 플레이트 11-2를 가로지르는 각 컬럼을 절반으로 줄이고 컬럼 11 웰 A에서 E까지 1000μM에서 가장 높은 농도의 철 킬레이트를 사용합니다.
  8. 멀티채널 피펫을 사용하여 10μL의 10μM 칼세인 스톡(cB)을 열 2-12, A에서 E행에 추가합니다.
  9. 피펫을 사용하여 80μL의 PBS 및 10μL의 Calcein 스톡(cB) 및 10μL의 FAS 스톡(fB)을 열 1, 열 A-E에 피펫합니다. 피펫팅으로 샘플을 혼합합니다. 이를 통해 10μM FAS로 1μM Calcein을 제어하고 킬레이트제를 사용하지 않습니다.
  10. PBS 100μL를 F열 1-5행에 피펫팅합니다. 이것은 PBS 네거티브 컨트롤을 제공합니다.
  11. 100μL의 2mM 철 킬레이트(Deferiprone)를 F행, 6-10열에 추가합니다. 이것은 킬레이터 단독 제어를 제공합니다.
  12. 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 490nm에서 여기(excitation) 및 530nm에서 검출(또는 Calcien 형광에 적합한 필터 세트)이 설정된 멀티모달 마이크로플레이트 리더에서 분석합니다.

5. 데이터 분석

  1. Calcein 형광의 선형 범위 측정에 의한 분석 검증을 위한 분석.
    1. 1단계에서 96웰 플레이트의 열에 있는 Calcein의 각 농도에 대한 행 A-H의 평균 상대 형광 단위(RFU)를 계산하고 농도에 대해 플로팅합니다. y축의 평균 RFU에 대한 Calcein 농도의 x축에 대한 선 그래프를 플로팅하고 선형 회귀를 사용하여 최적선을 제공합니다.
    2. 각 열(2-11)의 Calcein 농도를 열 1 행 A에서 E까지의 PBS 대조군과 비교하여 통계적 유의성을 정량화합니다. 분산 분석(ANOVA)을 수행하고 임계값이 p <0.001인 LSD(Least Significant Difference)를 사용하여 사후 분석을 적용하여 통계적 유의성을 결정합니다( 그림 1에서 **로 표시).
  2. Calcein 형광을 줄이기 위한 Fe2+ 이온 퀜칭에 의한 분석 검증을 위한 분석.
    1. 2-11열의 각 FAS 농도에 대해 A에서 E행까지의 평균 상대 형광 단위(RFU)를 계산합니다. y축에 각 FAS 농도에 대한 평균 RFU를 플로팅합니다. x축에서 데이터를 더 잘 분산시키는 Log2 척도를 사용하여 FAS의 농도를 플롯합니다. 선형 회귀를 사용하여 최적선을 플로팅합니다.
    2. PBS 대조군의 평균 RFU, 1μM Calcein, 0μM FAS(열 1 행 A에서 E까지)에 대한 각 열 평균을 비교하여 통계적 유의성을 정량화합니다. 통계적 유의성을 결정하기 위해 임계값 p <0.001로 LSD 사후 분석을 사용한 분산 분석을 수행합니다.
  3. 분석을 위한 분석: Fe2+ 이온에 대해 약한 킬레이트 Calcein을 능가하는 철 킬레이트제의 능력을 정량화합니다.
    1. 2-11열의 각 킬레이터 농도에 대해 A에서 E행까지의 평균 상대 형광 단위(RFU)를 계산합니다. y축에 각 킬레이터 농도에 대한 평균 RFU를 플로팅합니다. x축에서 데이터를 더 잘 분포시키는 Log2 척도를 사용하여 킬레이터의 농도를 플롯합니다.
    2. PBS 1 μM Calcein 및 10 μM FAS(열 1, 행 A에서 E까지)의 통제에 대한 RFU의 평균 RFU에 대한 각 열 평균을 비교하여 통계적 유의성을 정량화합니다. 통계적 유의성을 결정하기 위해 임계값 p <0.001로 LSD 사후 분석을 사용한 분산 분석을 수행합니다.

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결과

2단계에 표시된 방법의 경우, 이 첫 번째 실험(그림 1)은 Calcein 형광 방출을 감지할 때 마이크로타이터 형광 플레이트 리더의 선형 범위를 설정했습니다. 당사의 대표적인 결과는 0-100 μM의 광범위한 Calcein 형광 범위를 보여줍니다. LSD 사후 분석을 통한 ANOVA는 0 μM의 Calcein 대조군과 비교할 때 모든 Calcein 농도에 대한 평균 RFU에서 통계적으로 유의한 차이가 있음을 보여줍니다. 추가 실험에서는 1μM Calcein이 사용되었는데(단계 3 및 4), 이는 0μM 대조군과 통계적으로 유의한 차이를 생성하고 유세포 분석법(13)에서 Calcein AM 형태로 세포에 일반적으로 적용되는 범위 내에 속합니다.

3단계에 표시된 방법의 경우 Fe2+ 형태의 철을 0-1000μM(FAS)에서 1μM Calcein 범위에 첨가하면 Fe<...

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토론

암이 신진대사를 촉진하기 위해 철분에 과도하게 의존하기 때문에 철분 킬레이트화는 치료 요법에 잠재적으로 추가될 수 있다4. 그러나 철 이온과 결합하는 능력에 대해 새로운 금속 이온 킬레이터를 신속하게 스크리닝하는 능력은 제한적입니다. 일반적으로 사용되고 널리 사용 가능한 형광 프로브 Calcein은 약한 철 킬레이터로 작용하는 것으로 알려져 있으며 철 이온에 의한 결합은 Calcein 형광을 소멸시킵니다. 그런 다음 더 강한 철 킬레이트제를 사용하여 철에 결합하기 위해 경쟁하여 형광을 회수할 수 있습니다. 칼세인(Calcein)이 철과 결합할 때 관찰되는 형광의 감소와 더 강력한 킬레이트제에 비해 경쟁력이 없을 때 형광이 복원되는 것은 철 킬레이트화 잠재력을 가진 새로운 화합물을 빠르고 간단하게 스크리닝할 수 있는 방법을 제공합니다. Calcein 기반 기법(13 )은 세포에서 철을 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

노섬브리아 대학교의 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
암모늄 철 (II) 황산염 육수화물시그마 알드리치215406FAS
Calcein시그마 알드리치C0875
Deferiprone시그마 알드리치379409
Dulbecco & 프라임; s 인산염 완충 식염수Sigma-AldrichD5652마그네슘 및 칼슘 프리
Greiner CELLSTAR 96 웰 플레이트Sigma-AldrichM0812광학적으로 투명한 96 웰 플레이트가 작동합니다
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참고문헌

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재인쇄 및 허가

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