철을 킬레이트화하는 새로운 화합물의 능력을 확인하기 위한 정량화 가능하고 저렴한 cell-free 형광 방법

요약

우리는 철을 킬레이트화하는 새로운 화합물의 능력을 빠르고 저렴하게 확인할 수 있는 형광 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 약한 철 킬레이트 형광 프로브 Calcein의 철 결합 활성을 능가하는 화합물의 능력을 측정하여 킬레이트화가 발생할 때 형광을 정량화할 수 있는 증가를 초래합니다.

초록

암세포는 증식을 유지하기 위해 많은 양의 철분을 필요로 합니다. 철분 대사는 암의 특징으로 간주되므로 철분은 항암 접근법의 유효한 표적이 됩니다. 새로운 화합물의 개발과 추가 변형을 위한 리드를 식별하려면 메커니즘 분석의 증명을 수행해야 합니다. 확산에 미치는 영향을 평가하기 위한 많은 분석법이 있습니다. 그러나 철을 킬레이트화하는 능력은 높은 장비 비용과 킬레이트화의 강도를 빠르고 재현성 있게 정량화해야 하는 과제로 인해 중요하지만 때때로 간과되는 종점 측정입니다. 여기에서는 새로운 화합물이 철을 킬레이트화하는 능력을 확인하기 위해 정량화할 수 있고 저렴한 cell-free 형광 방법을 설명합니다. 당사의 분석은 상업적으로 이용 가능한 저렴한 형광 염료 Calcein에 의존하며, 대부분의 형광 마이크로타이터 플레이트 리더에서 형광을 정량화할 수 있습니다. Calcein은 약한 철 킬레이트제이며 형광은 Fe^{2 + / 3 +}와 결합할 때 소멸됩니다. 형광은 새로운 킬레이트 레이터가 Fe^2+/3+에 대해 Calcein을 능가할 때 복원됩니다. 형광 소광의 제거와 그에 따른 형광의 증가는 새로운 추정 킬레이트 ator의 킬레이트화 능력을 결정할 수 있게 합니다. 따라서 당사는 새로운 후보 킬레이터 화합물을 신속하게 스크리닝할 수 있는 저렴하고 처리량이 높은 분석을 제공합니다.

서론

공통된 생물학적 능력의 변화를 통해 암의 발병과 관련된 세포의 표현형 변화는 이제 일반적으로 암의 특징이라고 불립니다. 그 중에는 암세포 생물학에서 널리 퍼져 있는 에너지 대사의 재프로그래밍으로 인한 변화가 있습니다¹. 이러한 대사 재프로그래밍에는 빠른 증식과 종양 성장을 지원하기 위한 철분 요구량 증가가 포함됩니다². 철분에 대한 이러한 갈증은 철분 대사 조절 장애를 유발하며, 이는 그 자체로 암의 특징인^것으로 간주되며^3,4 모든 단계에서 조절 장애가 발생한다⁵. 웰치(Welch)와 허스트(Hurst)가 최근에 제안한 전이(metastasis)의 특징은 철분이 산화 스트레스를 유발할^{수 있기 때문에} 철분(iron)6의 역할을 포함하며, 이는 유전체(genome), 후성유전체(epigenome) 및 단백질체(proteome)의 변화를 매개하여 전이의 가능성을 높일 수^있다7. 철분 수치와 암 발병 증가 사이의 연관성은 역학 연구를 통해 입증되었다⁸.

암세포는 많은 양의 철분을 필요로 하기 때문에 철분 결핍에 취약하여 철분 킬레이트화가 발생합니다. 우리는 최근 NDRG1을 통해 암의 여러 특징을 역전시키는 철 킬레이트화의 잠재력을 강조하는 리뷰 논문을 발표했다⁹. 그러나 철분 킬레이트를 독립적인 암 치료법으로 사용하는 것은 독성, 짧은 반감기, 빠른 신진대사 및 새로운 내성 메커니즘으로 인해 임상 시험에서 긍정적인 결과를 얻지 못했습니다. 그럼에도 불구하고 철 킬레이트제는 in vitro 및 in vivo 연구에서 가능성을 보여주었으며, 이는 암 치료를 위한 효과적인 철 킬레이트제를 개발하기 위해 더 많은 연구가 필요하다는 것을 나타냅니다. 특정 철분 킬레이트화는 항암 약물 개발에서 검증된 전략이지만 현재까지 보고된 종류는 소수에 불과합니다¹⁰.

새로운 철 킬레이트제의 식별 및 특성화에는 여러 종말점에 대한 효과를 측정할 수 있는 능력이 필요합니다. 이들 중 다수(예: 증식, 세포자멸사, 활성산소종 형성)는 일상적으로 측정되며, 암의 특징을 평가하기 위한 방법으로 문헌에 요약되고 검토되었다¹¹. 새로운 철 킬레이트제를 평가할 때, 많은 그룹에서 철 유입 또는 유출에 대한 효과뿐만 아니라 항증식 및 산화 환원 활성에 미치는 영향을 정기적으로 조사합니다. 인실리코(in silico ) 예측 기법⁽¹² )은 스크리닝할 수 있는 철 킬레이트제의 증가를 더욱 증가시킨다.

철 킬레이트의 S크리닝은 원리를 효과적으로 입증하기 위한 수단으로 철 수치에 미치는 영향을 측정할 수 있는 능력이 필요합니다. 현재 이를 위한 가장 일반적인 방법은 유세포 분석(flow cytometry)¹³인데, 이는 비용과 시간이 많이 소요되며 정량화가 잘 되지 않습니다. 분석법의 선택은 종종 실험 장비의 가용성, 분석 속도 및 비용에 따라 결정됩니다. 따라서 철을 킬레이트화하는 능력은 높은 장비 비용과 킬레이트화의 강도를 빠르고 재현성 있게 정량화해야 하는 과제로 인해 간과되는 종점 측정이 될 수 있습니다. 여기에서는 철을 킬레이트화하는 새로운 화합물의 능력을 확인하기 위해 정량화할 수 있고 저렴한 무세포 형광 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 원액 준비

1. Calcein 스톡 용액을 준비할 때 용액을 어두운 곳에 보관하여 사진 품질 저하를 방지하십시오. 마그네슘 또는 칼슘¹⁴가 없는 Dulbecco의 PBS에서 Calcein의 1mM 용액을 준비합니다. 5mM Calcein 용액 1mL의 경우 Dulbecco의 PBS 5mL에 Calcein 3.1mg(622.5g/M)을 추가합니다. Calcein의 1mM 양말을 사용하여 표 1에 자세히 설명된 대로 마이크로퓨지 튜브에 1mL 분취액의 2차 원액을 준비합니다.
2. 19mL의 Dulbecco의 PBS 5mL에 FAS 육수화물(392.1g/M) 10mg을 용해시켜 10mM 황산철암모늄(FAS) 용액을 얻어 황산철암모늄 육수화물 스톡을 준비합니다. 희석하여 FAS의 2차 재고를 준비합니다. 2mM FAS(fA) 스톡을 준비하려면 10mM FAS 스톡 200μL를 Dulbecco의 PBS 800μL로 PBS로 희석합니다. 100μM FAS(fB)의 스톡을 준비하려면 50μL의 스톡 fA를 950μL의 Dulbecco's PBS로 희석합니다.
3. 10mM의 Deferiprone 스톡을 준비하려면 Dulbecco의 PBS 2mL에 2.8mg(139.15g/M)을 녹입니다. 10mM 스톡 200μL를 Dulbecco의 PBS 800μL로 희석하여 2mM 철 킬레이트의 2차 스톡을 준비합니다.
   참고: 이 분석에서 선택한 철 킬레이트제는 마그네슘이나 칼슘 없이 Dulbecco의 PBS에 용해되어야 합니다. 작업 예로, 우리는 철 킬레이터 Deferiprone을 사용했습니다.

2. Calcein 형광의 선형 범위 측정을 통한 분석 검증

1. 원액 표에 설명된 대로 1mM - 1μM의 Calcein 스톡 범위를 준비합니다( 표 1 참조). 광화학적 분해를 방지하기 위해 원액을 어두운 곳에 보관하십시오.
2. 단일 채널 수동 피펫 또는 다중 채널 수동 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 웰 A에서 H 및 1 - 12에 90μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 피펫팅합니다.
3. 단일 채널 수동 피펫을 사용하여 10μL의 1mM Calcein 스톡을 96웰 플레이트의 열 12, 열 A에서 H에 추가합니다.
4. 사전 준비된 800μM Calcein 스톡(표 1) 10μL를 단일 채널 수동 피펫을 사용하여 열 11, 행 A에서 H까지의 96웰 플레이트에 추가합니다.
5. 표 1의 스톡으로 추가 절차를 반복하여 열 10에 400μM 스톡의 10μL가 포함되고 열 9에 200μM 스톡의 10μL가 포함되도록 합니다. 컬럼 2에 1μM 스톡의 10μL가 포함될 때까지 컬럼 전체에서 이 단계적 절차를 계속합니다.
   참고: 각 웰에서 Calcein의 최종 농도는 1:10 희석으로 인해 원액보다 10배 낮습니다.
6. 10μL의 PBS를 열 1, 행 A에서 E에 추가합니다.
7. 실온에서 30분 동안 배양하고 마이크로플레이트 리더의 분석기를 490nm의 여기와 530nm의 검출(또는 Calcien 형광에 적합한 필터 세트)로 설정합니다.

3.Calcein 형광을 줄이기 위한 Fe²⁺ 이온 담금질에 의한 분석 검증

1. 10μM의 Calcein(cB) 스톡과 2mM의 FAS 스톡(fA)을 준비합니다( 재료 표 참조). 광분해를 방지하기 위해 Calcein 스톡을 어두운 곳에 보관하십시오.
2. 단일 채널 수동 피펫 또는 다중 채널 수동 피펫을 사용하여 50μL의 PBS를 열 2에서 10, 행 A에서 E에 추가합니다. 열 11에 PBS를 추가하지 마십시오.
3. 단일 채널 수동 피펫을 사용하여 2mM의 FAS(fA) 스톡 100μL를 열 11(행 A에서 E)의 96웰 플레이트에 추가합니다.
4. 멀티채널 수동 피펫을 사용하여 컬럼 11에서 50μL의 fA를 제거하고 이미 컬럼 10에 있는 PBS에 피펫팅하고 피펫팅으로 철저히 혼합합니다.
5. 96 웰 플레이트의 열 9-2, 행 A에서 E에 걸쳐 이 단계적 이중 희석 절차를 계속하고 피펫팅으로 혼합합니다.
6. 컬럼 2에서 피펫팅하여 50μL의 용액을 제거하고 용액을 폐기합니다.
7. 40μL의 PBS를 용액이 있는 모든 웰(열 2-12, 행 A에서 E)에 추가합니다.
8. 90μL의 PBS를 웰 1열 A-E행에 추가합니다. 이 웰은 1 μM Calcein 및 0 μM FAS의 양성 제어 역할을 합니다.
9. 10μL의 10μM 칼세인 스톡(cB)을 용액이 들어 있는 각 웰에 추가합니다(1-12열, A-E행). 그 결과 11열의 최고 농도는 1000μM FAS이며 10, 9, 8열의 FAS 농도는 2열로 절반으로 줄어듭니다. 컬럼에서 생성된 각 웰에는 1μM Calcein과 FAS 희석액이 포함되어 있습니다.
10. PBS 단독 컨트롤에 대해 1에서 5열까지의 F행에 100μL의 PBS를 추가합니다. FAS 단독 제어를 위해 100μL의 2mM FAS를 6-10열의 F행에 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
11. 490nm의 여기와 530nm의 검출로 설정된 마이크로플레이트 리더(또는 Calcein 형광에 적합한 필터 세트)에서 분석합니다.

4. Fe 2+ 이온에 대해 약한 킬레이트 Calcein을 능가하는 철 킬레이트제의 능력을 정량화하기 위한 분석

1. 표 1에 나타난 바와 같이 10 μM의 Calcein stock(cB), 100 μM의 FAS stock(fB) 및 2 mM의 iron chelator stock을 준비한다. 광분해를 방지하기 위해 Calcein 재고를 어두운 곳에 보관하십시오.
2. 싱글채널 수동 피펫 또는 멀티채널 수동 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 열 2 - 10, 행 A에서 E에 50 μL의 PBS를 추가합니다. 열 11에 PBS를 추가하지 마십시오.
3. 철 킬레이트의 2mM 스톡(fA) 100μL를 단일 채널 수동 피펫을 사용하여 열 11, 행 A에서 E까지의 96웰 플레이트에 추가합니다.
4. 멀티채널 수동 피펫을 사용하여 11열에서 50μL의 fA를 제거하고 10열, A에서 E행의 PBS로 피펫팅하고 피펫팅으로 철저히 혼합합니다.
5. 플레이트의 나머지 열 9-2, 행 A에서 E에 대해 이 단계적 이중 희석 절차를 계속하고 피펫팅으로 각 웰을 혼합합니다. 컬럼 2에서 50μL를 제거하고 폐기합니다. 이렇게 하면 96개의 웰 플레이트 컬럼 11에서 2, A에서 E행에 걸쳐 철 킬레이터(Deferiprone) 2mM를 이중 희석할 수 있습니다.
6. 30μL의 PBS를 용액이 들어 있는 모든 웰에 피펫팅합니다(예: 열 2-11, A에서 E까지).
7. 다중 채널 피펫을 사용하여 10μL의 100μM FAS 스톡(fB)을 열 2-12, A에서 E행에 추가합니다. 그 결과 각 웰에서 1μM Calcein과 10μM FAS의 농도가 생성되고 킬레이트화가 이중 희석되어 농도가 플레이트 11-2를 가로지르는 각 컬럼을 절반으로 줄이고 컬럼 11 웰 A에서 E까지 1000μM에서 가장 높은 농도의 철 킬레이트를 사용합니다.
8. 멀티채널 피펫을 사용하여 10μL의 10μM 칼세인 스톡(cB)을 열 2-12, A에서 E행에 추가합니다.
9. 피펫을 사용하여 80μL의 PBS 및 10μL의 Calcein 스톡(cB) 및 10μL의 FAS 스톡(fB)을 열 1, 열 A-E에 피펫합니다. 피펫팅으로 샘플을 혼합합니다. 이를 통해 10μM FAS로 1μM Calcein을 제어하고 킬레이트제를 사용하지 않습니다.
10. PBS 100μL를 F열 1-5행에 피펫팅합니다. 이것은 PBS 네거티브 컨트롤을 제공합니다.
11. 100μL의 2mM 철 킬레이트(Deferiprone)를 F행, 6-10열에 추가합니다. 이것은 킬레이터 단독 제어를 제공합니다.
12. 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 490nm에서 여기(excitation) 및 530nm에서 검출(또는 Calcien 형광에 적합한 필터 세트)이 설정된 멀티모달 마이크로플레이트 리더에서 분석합니다.

5. 데이터 분석

1. Calcein 형광의 선형 범위 측정에 의한 분석 검증을 위한 분석.
   1. 1단계에서 96웰 플레이트의 열에 있는 Calcein의 각 농도에 대한 행 A-H의 평균 상대 형광 단위(RFU)를 계산하고 농도에 대해 플로팅합니다. y축의 평균 RFU에 대한 Calcein 농도의 x축에 대한 선 그래프를 플로팅하고 선형 회귀를 사용하여 최적선을 제공합니다.
   2. 각 열(2-11)의 Calcein 농도를 열 1 행 A에서 E까지의 PBS 대조군과 비교하여 통계적 유의성을 정량화합니다. 분산 분석(ANOVA)을 수행하고 임계값이 p <0.001인 LSD(Least Significant Difference)를 사용하여 사후 분석을 적용하여 통계적 유의성을 결정합니다( 그림 1에서 **로 표시).
2. Calcein 형광을 줄이기 위한 Fe²⁺ 이온 퀜칭에 의한 분석 검증을 위한 분석.
   1. 2-11열의 각 FAS 농도에 대해 A에서 E행까지의 평균 상대 형광 단위(RFU)를 계산합니다. y축에 각 FAS 농도에 대한 평균 RFU를 플로팅합니다. x축에서 데이터를 더 잘 분산시키는 Log2 척도를 사용하여 FAS의 농도를 플롯합니다. 선형 회귀를 사용하여 최적선을 플로팅합니다.
   2. PBS 대조군의 평균 RFU, 1μM Calcein, 0μM FAS(열 1 행 A에서 E까지)에 대한 각 열 평균을 비교하여 통계적 유의성을 정량화합니다. 통계적 유의성을 결정하기 위해 임계값 p <0.001로 LSD 사후 분석을 사용한 분산 분석을 수행합니다.
3. 분석을 위한 분석: Fe²⁺ 이온에 대해 약한 킬레이트 Calcein을 능가하는 철 킬레이트제의 능력을 정량화합니다.
   1. 2-11열의 각 킬레이터 농도에 대해 A에서 E행까지의 평균 상대 형광 단위(RFU)를 계산합니다. y축에 각 킬레이터 농도에 대한 평균 RFU를 플로팅합니다. x축에서 데이터를 더 잘 분포시키는 Log2 척도를 사용하여 킬레이터의 농도를 플롯합니다.
   2. PBS 1 μM Calcein 및 10 μM FAS(열 1, 행 A에서 E까지)의 통제에 대한 RFU의 평균 RFU에 대한 각 열 평균을 비교하여 통계적 유의성을 정량화합니다. 통계적 유의성을 결정하기 위해 임계값 p <0.001로 LSD 사후 분석을 사용한 분산 분석을 수행합니다.

결과

2단계에 표시된 방법의 경우, 이 첫 번째 실험(그림 1)은 Calcein 형광 방출을 감지할 때 마이크로타이터 형광 플레이트 리더의 선형 범위를 설정했습니다. 당사의 대표적인 결과는 0-100 μM의 광범위한 Calcein 형광 범위를 보여줍니다. LSD 사후 분석을 통한 ANOVA는 0 μM의 Calcein 대조군과 비교할 때 모든 Calcein 농도에 대한 평균 RFU에서 통계적으로 유의한 차이가 있음을 보여줍니다. 추가 실험에서는 1μM Calcein이 사용되었는데(단계 3 및 4), 이는 0μM 대조군과 통계적으로 유의한 차이를 생성하고 유세포 분석법⁽¹³)에서 Calcein AM 형태로 세포에 일반적으로 적용되는 범위 내에 속합니다.

3단계에 표시된 방법의 경우 Fe²⁺ 형태의 철을 0-1000μM(FAS)에서 1μM Calcein 범위에 첨가하면 Fe²⁺ 이온이 Calcein 형광(RFU)이 선형 감소함을 보여줍니다. 이를 통해 Calcein 형광의 Fe²⁺ 기반 퀜칭을 관찰할 수 있습니다. 약한 철 킬레이트제인 칼세인은 철과 결합하여 형광 출력을 감소시킵니다. 그림 2에서 8.9μM FAS 이상의 농도는 1μM Calcein 단독과 비교할 때 Calcein 형광에서 p<0.001로 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 8.9μM의 FAS를 사용하면 Calcein 형광(평균 RFU)이 33% 감소했습니다. 추가 실험(단계 4)을 위해 10μM FAS가 Calcein의 형광 소광 범위 내에 있으므로 사용되었습니다.

4단계에서 보여준 방법의 경우, 철 킬레이터에 의한 Fe²⁺ 이온에 대한 Calcein의 경쟁을 그림 3에서 관찰할 수 있습니다. Fe²⁺ 형태의 철은 1μM 대조군에서 Calcein 형광을 감소시키고 철 킬레이터 deferiprone은 이 형광을 피크까지 증가시켜 Calcein의 철 소멸을 방출하고 형광(평균 RFU)을 증가시킵니다. 0.97-512 μM 범위의 농도에서 Deferiprone(예시로 사용됨)은 ANOVA 및 LSD 사후 분석(p<0.001)에서 관찰된 바와 같이 형광의 통계적으로 유의한 증가를 초래했습니다. 가장 큰 폴드 변화는 1μM calcein AM 및 10μM FAS의 대조군과 비교할 때 62.5μM의 킬레이터에서 평균 RFU의 3배 변화였습니다. 512μM 이상의 deferiprone에서는 킬레이터와 1μM의 Calcein 및 10μM의 FAS의 대조군 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었습니다.

그림 1: 형광 마이크로타이터 플레이트 리더를 사용하여 측정한 칼세인 농도 및 형광(RFU). 30분 동안 배양하고 측정된 형광(RFU)을 0-100μM의 Calcein 농도가 여기에 나와 있습니다. 데이터는 실험당 8번의 반복실험과 3번의 독립적인 실험의 평균을 보여주며, 오차 막대는 평균에 대한 95% 신뢰 구간을 보여줍니다. 통계적 유의성은 **로 표시되며, 여기서 p<0.001은 ANOVA 및 LSD 사후 분석(그래프 패드 프리즘을 사용하여 계산)을 사용하여 결정됩니다. 각 농도의 평균 Calcein RFU는 PBS 및 0μM Calcein의 대조군과 비교됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: FAS 농도가 증가하면 Calcein 형광이 선형적으로 감소합니다. FAS의 농도는 0-1000 μM에서 증가하여 PBS에서 30 분 배양 후 1 μM Calcein 형광의 선형 감소를 초래했다 표시된 데이터는 실험 당 5 회 반복 및 3 개의 독립적 인 실험의 평균이며, 오차 막대는 평균에서 95 % 신뢰 구간을 보여줍니다. 통계적 유의성은 **로 표시되며, 여기서 p<0.001은 ANOVA 및 LSD 사후 분석(그래프 패드 프리즘을 사용하여 계산)을 사용하여 결정됩니다. FAS와 Calcein 1μM의 각 농도의 평균 Calcein RFU는 PBS에서 1μM Calcein 0μM의 FAS 대조군과 비교됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 데페리프론의 농도 증가. deferiprone의 농도는 PBS에서 1 μM Calcein, 10 μM FAS의 배양으로 0-1000 μM에서 증가시켰다. 형광은 멀티모달 마이크로플레이트 리더에서 측정했습니다. 표시된 데이터는 실험당 5번의 반복실험과 3번의 독립적인 실험의 평균이며, 오차 막대는 평균에서 95% 신뢰 구간을 보여줍니다. 통계적 유의성은 **로 표시되며, 여기서 p<0.001은 ANOVA 및 LSD 사후 분석(그래프 패드 프리즘을 사용하여 계산)을 사용하여 측정됩니다. 10 μM FAS 및 0 μM Deferiprone이 있는 PBS의 1 μM Calcein과 비교한 평균 RFU. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

농도 (μm)	부피 (1 mM 재고)	PBS의 볼륨	총 볼륨
800	800 마이크로리터	200 마이크로리터	1mL
400	400 마이크로리터	600 마이크로리터	1mL
200	200 마이크로리터	800 마이크로리터	1mL
100	100 μL	900 마이크로리터	1mL
50	50 마이크로리터	950 마이크로리터	1mL
25	25 마이크로리터	975 마이크로리터	1mL
10	10 마이크로리터	990 마이크로리터	1mL
6	6 마이크로리터	994 마이크로리터	1mL
2	2 μL	998 마이크로리터	1mL
1	1 μL	999 마이크로리터	1mL

표 1: Calcein 2차 스톡 준비.

토론

암이 신진대사를 촉진하기 위해 철분에 과도하게 의존하기 때문에 철분 킬레이트화는 치료 요법에 잠재적으로 추가될 수 있다⁴. 그러나 철 이온과 결합하는 능력에 대해 새로운 금속 이온 킬레이터를 신속하게 스크리닝하는 능력은 제한적입니다. 일반적으로 사용되고 널리 사용 가능한 형광 프로브 Calcein은 약한 철 킬레이터로 작용하는 것으로 알려져 있으며 철 이온에 의한 결합은 Calcein 형광을 소멸시킵니다. 그런 다음 더 강한 철 킬레이트제를 사용하여 철에 결합하기 위해 경쟁하여 형광을 회수할 수 있습니다. 칼세인(Calcein)이 철과 결합할 때 관찰되는 형광의 감소와 더 강력한 킬레이트제에 비해 경쟁력이 없을 때 형광이 복원되는 것은 철 킬레이트화 잠재력을 가진 새로운 화합물을 빠르고 간단하게 스크리닝할 수 있는 방법을 제공합니다. Calcein 기반 기법(¹³ )은 세포에서 철을 결합하는 킬레이트제의 능력을 시각화하는 데 이미 사용되고 있지만, 이러한 기법은 값비싼 유세포 분석 장치를 필요로 하고, 반정량적이며, 광범위한 직원 교육과 더 비싼 세포 투과 형태인 Calcein, Calcien-AM의 사용을 필요로 합니다. 더욱이, 이 기법은 재현성이 낮고 통계 분석을 통한 데이터 유의성 결정을 쉽게 촉진하지 않습니다. 그러므로, 우리는 비발한 화합물 철 킬레이트화 능력의 첫번째 통행 스크린으로 작용할 수 있는 간단한 저렴한 생체외 방법을 창조했습니다. 이 Cell Free assay는 철 킬레이트화 능력에 대한 1차 통과 고스루풋 스크리닝으로서 값비싼 세포 배양 방법에 대한 요구 사항을 폐지합니다.

암의 대사 적응을 촉진하기 위해 철분에 의존하기 때문에 암을 표적으로 삼는 데 사용될 수 있는 새로운 철분 킬레이트제의 스크리닝 또는 개발에 대한 관심이 증가하고 있다². 이 논문에서는 약한 킬레이트 물질인 Calcein을 능가하여 새로운 화합물이 철을 킬레이트화하는 능력을 확인하는 데 사용할 수 있는 시험관 내 기술에 대해 설명합니다. 이를 통해 철 킬레이트화 능력에 대한 새로운 화합물을 간단하고 정량적이며 저렴하게 스크리닝할 수 있습니다.

프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 형광 마이크로타이터 플레이트 리더의 선형 범위를 설정하는 것입니다(그림 1). Calcein은 501 nm의 여기 피크와 521 nm의 방출 피크를 중심으로 하는 넓은 형광 여기 및 방출 스펙트럼을 가지고 있습니다. 그러나 Calcein의 선형 범위는 Calcein 형광 방출을 여기시키고 감지하는 데 사용되는 필터에 따라 달라질 수 있으며, 감지에 사용되는 광전자 증배관의 선형 범위도 부분적으로 선형 범위를 결정합니다. 따라서 먼저 Calcein 형광이 선형인 농도 범위를 설정하여 형광 플레이트 리더에서 calcein의 선형 범위 내에서 분석이 작동하는지 확인하는 것이 중요합니다. 0에서 100mM Calcein 사이의 선형성을 관찰한 것을 감안할 때, 이는 Calcein이 넓은 선형 범위를 가지고 있음을 보여줍니다. 또한 형광 마이크로타이터 플레이트 리더에는 일반적으로 가장 일반적으로 사용되는 일부 녹색 발광 형광단과 유사한 스펙트럼을 가지고 있기 때문에 Calcein 형광을 측정할 수 있는 필터 세트가 있습니다. 따라서 이 분석은 광범위한 사용자에게 널리 적용할 수 있습니다.

FAS를 철 이온 공여체로 사용하는 것은 세포의 불안정한 철 풀에서 주요 철 이온인 Fe²⁺ 이온을 제공하기 때문에 선호됩니다. 그러나 여기에 표시된 것과 유사한 결과(그림 2)는 Fe³⁺ 를 제공하는 FAC(Ferric Ammonium Chloride)를 사용하여 달성되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 따라서 이 분석은 철 이온의 두 산화 환원 상태와 호환되어 이러한 산화 환원 상태 중 하나를 선호하는 킬레이트제에 대한 적용 가능성을 확대합니다.

이 연구에서는 철 킬레이트 Deferiprone에 대한 데이터를 제시하지만, 이 분석을 사용하여 Mimosine을 포함한 다른 철 킬레이트제가 철 이온 결합에 대해 Calcein을 능가하는 능력도 평가했습니다(데이터는 표시되지 않음). 이 분석의 한계 중 하나는 킬레이터 데페리프론이 512mM 이상에서는 1μM 칼세인 및 10μM FAS의 대조군과 비교할 때 형광이 통계적으로 유의하게 증가하지 않았다는 것입니다. 더 높은 농도의 킬레이트제가 형광 증가를 초래하지 않는 이유는 불분명하지만 이는 다른 킬레이트제에서 관찰되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 그러나 선도 치료제 화합물은 <100μM로 작용하여 분석이 선도 화합물 효능에 필요한 농도 범위에서 작동해야 합니다.

따라서 이 분석을 통해 모든 잠재적인 철 킬레이트제는 메커니즘의 증거로서 철을 킬레이트화할 수 있는 능력을 신속하게 스크리닝할 수 있습니다. 이는 새로운 킬레이트제를 비용이 많이 들고 힘든 세포 기반 또는 in vivo 분석에서 스크리닝하기 전에 중요한 첫 번째 단계입니다. 이 분석의 한계는 수성 용매를 사용하여 수행되므로 킬레이터가 수성 완충액에 용해되어야 한다는 것입니다. 그러나 본 연구에서 사용된 최고 농도가 10mM Deferiprone(¹⁵)이라는 점을 감안할 때, 수용성이 제한된 킬레이트제는 여전히 시험할 수 있다.

결론적으로, 여기에 설명된 분석법은 암 치료 개발의 지속적인 초점인 새로운 철 킬레이트제의 스크리닝에 가치가 있음을 입증할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
암모늄 철 (II) 황산염 육수화물	시그마 알드리치	215406	FAS
Calcein	시그마 알드리치	C0875
Deferiprone	시그마 알드리치	379409
Dulbecco & 프라임; s 인산염 완충 식염수	Sigma-Aldrich	D5652	마그네슘 및 칼슘 프리
Greiner CELLSTAR 96 웰 플레이트	Sigma-Aldrich	M0812	광학적으로 투명한 96 웰 플레이트가 작동합니다