Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

생체 분자 간의 상호 작용은 생물학적 현상의 가장 기본적인 부분입니다. 단백질-단백질 상호 작용은 이러한 상호 작용의 중요한 부분을 구성합니다. 따라서 관심 단백질의 상호 작용 파트너를 식별하는 것은 관심 단백질/유전자의 기능을 추가로 설명하는 데 중요합니다. Y2H(yeast two-hybrid) 분석법은 생체 내^단백질-단백질 상호작용을 식별하는 데 널리 사용되는 기법입니다 1. 이 시스템에서는 상호 작용을 테스트해야 하는 두 개의 단백질(X 및 Y)이 각각 DNA 결합(DB) 도메인과 전사 활성화 도메인(AD)에 융합됩니다. DB-X 융합 단백질은 DB 도메인의 인식 서열에 결합합니다. 따라서 단백질 X와 Y가 상호 작용할 때 AD-Y 융합 단백질은 인식 시퀀스의 근접성으로 들어옵니다. 결과적으로, 인식 서열의 다운스트림에 있는 리포터 유전자의 전사가 활성화됩니다. 따라서, 리포터 유전자 활성의 존재 또는 부재는 단백질-단백질 상호작용의 존재 또는 부재를 결정하는 데 사용될 수^{있다 1}.

관심 단백질의 특정 상호작용 파트너가 확인되면 상호작용의 생물학적 기능을 규명하기 위해 추가 분석을 수행해야 합니다. 이를 위해 특정 단백질-단백질 상호 작용을 손상시키거나 제거하는 단백질의 돌연변이를 분리할 수 있다면 강력한 도구가 될 것입니다. Y2H 시스템은 야생형 '상호작용 양성' 클론을 시작으로 '상호작용 음성' 클론을 스크리닝하여 이러한 돌연변이를 직접 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 과정을 가속화하기 위해 '역' Y2H(rY2H) 시스템이 개발되었습니다 ^2,3. rY2H 시스템에서 숙주 효모 균주는 리포터 유전자로 역선택 가능한 마커 유전자를 보유하며, 이는 효모 세포가 AD-Y 및 DB-X 단백질이 상호 작용하지 않을 때만 성장한다는 것을 의미합니다.

Y2H 및 rY2H 시스템 모두 상호 작용 음성 돌연변이의 분리를 허용하지만, 스크리닝을 통해 얻은 모든 후보 물질이 원하는 유형의 돌연변이(일반적으로 미센스 돌연변이)를 가지고 있지 않기 때문에 돌연변이를 분리하는 과정은 힘들다. 가장 심각한 문제는 후보 물질의 상당수가 프레임시프트 또는 말도 안 되는 돌연변이를 가지고 있다는 것이며, 원치 않는 클론을 배제하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행해야 한다는 것입니다. 이 문제를 극복하기 위해 새로운 플라스미드 벡터가 개발되었다⁴. 이러한 벡터에서 약물 내성 마커인 KanMX는 DB 도메인 또는 AD의 프레임 밖 다운스트림에 위치합니다. marker gene은 관심 유전자가 삽입된 경우에만 DB domain 또는 AD와 함께 in-frame이 됩니다. 관심 유전자에 무작위 돌연변이가 도입되면 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이와 같은 바람직하지 않은 돌연변이는 약물 내성 선별을 수행하여 쉽게 제거할 수 있으며, 바람직한 미센스 돌연변이를 가진 후보 물질은 Y2H 스크리닝⁴으로 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 기사에서는 이 전략을 사용하여 관심 단백질의 interaction-null/impaired 돌연변이를 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

1. 돌연변이 도서관의 구축

1. 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 설정합니다(아래 예시 참조). 일반적으로 50 μL의 반응액을 50 μL의 10개 부분 표본으로 나누어 PCR 기계에서 표적 유전자 절편을 증폭한다⁴.
   참고: 사용자는 돌연변이를 효율적으로 도입하기 위해 적절한 중합효소를 선택해야 합니다. 증폭할 DNA 단편이 짧으면 교정 활성이 부족한 Taq 중합효소와 같이 오류율이 더 높은 중합효소가 필요합니다. 증폭할 DNA 단편이 길면 돌연변이의 수를 줄이기 위해 더 높은 충실도의 중합효소가 필요합니다. 돌연변이는 일반 Taq 중합효소⁴로 30 사이클의 증폭 후 백 염기쌍마다 발생합니다. 대표적인 결과에서는 일반 Taq 중합효소보다 충실도가 높은 다른 Taq 중합효소를 사용하였으며( 재료 표 참조), 돌연변이율은 600 염기쌍 중 1개였습니다. PCR 혼합물의 예, 프라이머 세부 정보 및 반응 조건은 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.
2. PCR이 완료되면 반응의 모든 부분 표본을 결합하고 아가로스 겔 전기 영동 등을 사용하여 관심 DNA 단편이 증폭되었는지 확인하고 DNA⁵를 정제합니다.
3. 'seamless' 클로닝 전략을 사용하여 1.2단계에서 생성된 DNA 단편을 적절한 Y2H 벡터와 조립합니다(그림 1).
   참고: Gibson assembly⁶과 같은 Seamless cloning 시스템은 self-ligation을 통해 생성된 빈 벡터에 의한 구성된 mutant library의 오염을 최소화합니다. Y2H 벡터 목록은 표 1에 나와 있습니다. 조립 전에 BamHI 소화로 준비할 수 있습니다. 모든 플라스미드는 National BioResource Project - yeast에서 구할 수 있습니다( 재료 표 참조).
4. 단계 1.3에서 생성된 반응 혼합물을 고효율 E. coli 형질전환 프로토콜(예: Inoue et ^al.7)에 따라 제조된 Escherichia coli 유능한 세포에 도입합니다. 적절한 항생제가 포함된 여러 LB 플레이트(트립톤 1%, 효모 추출물 0.5%, NaCl 1%, 한천 2%)에 모든 유능한 세포를 펴 바릅니다(재료 표 참조). 이 시점에서 소량(전체 반응의 ~1/100)을 동일한 선택 플레이트에 펴서 라이브러리 역가를 계산합니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
5. 많은 수의 대장균 군집이 나타나면 일회용 플라스틱 고리를 사용하여 플레이트 표면의 모든 세포를 긁어냅니다. 알칼리 용해⁸과 같은 널리 사용되는 방법을 사용하여 이러한 세포에서 플라스미드 DNA를 회수합니다. 동시에, 변형 혼합물의 작은 부분 표본을 플레이트에 펴 넣은 후에 나타나는 콜로니의 수를 계산하십시오. 이 숫자를 사용하여 라이브러리에 있는 독립 클론의 총 수를 추정합니다.
   참고: 이 시점에서, 형질전환 반응의 작은 부분 표본이 퍼진 플레이트에 나타나는 몇 개의 독립적인 콜로니(4-6)를 선택하여 별도로 배양하고 플라스미드를 분리하여 거의 모든 클론이 원하는 DNA 단편을 운반하는지 확인합니다⁵. E. coli에서 플라스미드를 분리하기 위해 많은 상용 키트를 사용할 수 있습니다. 작은 부분 표본을 퍼뜨린 후 플레이트에 나타나는 콜로니의 수는 수동으로 계산할 수 있습니다.
6. 라이브러리 DNA 풀의 농도를 측정합니다. 보통, 라이브러리 DNA의 백 나노그램은 다음 단계에서 수 천 개의 형질전환체를 수득하기에 충분하다.
   참고: A₂₆₀ 의 측정은 종종 부정확하기 때문에 DNA에 결합하는 형광 염료를 사용하여 DNA 농도를 측정하는 것이 좋습니다.

2. mutant library 및 replica plating을 이용한 효모의 형질전환

1. 약 100ng의 DNA를 사용하여 Y2H 분석을 위해 돌연변이 라이브러리를 숙주 효모 균주(TAT-7(L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)_8-lacZ)에 도입합니다. 'bait' plasmid로 숙주 세포를 pre-transto-transform 합니다.
   1. 형질전환 절차 후, 효모 세포를 멸균수에 현탁시키고 적절한 플레이트에 다른 양의 분취액을 펴 바릅니다(일반적으로 류신 및 트립토판이 부족한 SC 배지: SC-LW[0.67% 효모 질소 염기, 2% 포도당, 1.546g/L SC 이중 탈락 혼합물-Leu -Trp, 2% 한천, 재료 표 참조]). 이 플레이트를 30°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: ~5 × 10⁶개의 대수적으로 성장하는 세포가 있는 리튬 아세테이트-PEG 방법¹¹과 같은 표준 프로토콜은 효모의 변형에 충분합니다. electroporation과 같은 높은 변형 효율을 가진 다른 방법도 사용할 수 있습니다.
2. 다음 날 작은 콜로니가 나타나면 적절한 수의 세포(500-2000)가 있는 플레이트를 선택하고 다음과 같이 복제합니다.
3. 복제본 블록에 두 장의 여과지를 놓고 여러 복제본을 만듭니다(매체는 카나마이신을 함유한 SC-LW 및 SC-LW임)( 재료 표 참조). 30 °C에서 1-2일 동안 배양합니다.
   참고: 카나마이신(G418)의 농도는 600μg/mL입니다. 콜로니의 해상도가 손실되기 때문에 복제 도금에 벨벳을 사용하지 마십시오.
4. 군체가 자라면 접시를 비교하고 후보를 선택하십시오. lacZ 가 리포터로 사용되는 경우 Y2H 색상 분석(3단계 참조)을 수행합니다.
   참고: Y2H 리포터의 경우 lacZ 는 일반적으로 HIS3보다 약한 상호 작용을 더 잘 감지합니다.

3. Y2H 색상 분석

1. 2단계를 사용하여 준비한 복제 플레이트에 적절한 크기로 미리 자른 여과지 한 장을 놓습니다. 여과지와 플레이트 사이에 기포가 생기지 않도록 주의하세요.
   알림: No. 4A 여과지 또는 50등급 여과지를 사용하십시오( 재료 표 참조). 복제 도금으로 만들어진 카나마이신 플레이트를 포함하는 모든 SC-LW 또는 SC-LW를 색상 분석에 사용할 수 있습니다.
2. 플레이트의 여과지가 완전히 젖었을 때(여과지의 색이 완전히 변할 때) 종이 타월 여러 장을 위에 놓고 여과지에 닿게 하여 과도한 수분을 제거합니다. 종이 타월이 물을 흡수하여 색이 변하면 제거하십시오. 이 과정을 두세 번 반복합니다.
3. 여과지의 가장자리를 핀셋으로 잡아 플레이트에서 빠르게 벗겨내고 액체 질소에 담가 얼립니다. 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 콜로니 면이 위로 향하게 하여 여과지를 플라스틱 트레이에 놓고 즉시 냉동고(-20 °C에서 -80 °C)에 넣어 완전히 얼립니다.
4. 얼린 여과지를 제거하고 콜로니 면이 위로 향하게 하여 마른 종이 타월에 올려 해동합니다. 해동 직후 플라스틱 트레이 또는 밀봉 가능한 용기에 놓고 X-gal(5-브로모-5-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토사이드) 및 2-메르캅토에탄올⁹(재료 표 참조)를 포함하는 Z-버퍼(60mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO4_, 10 mM KCl 및 1 mM MgSO₄, pH 7.0)에 담근 다른 여과지 위에 여과지를 놓습니다). 상단과 하단 여과지 사이에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.
5. 여과지가 들어있는 플라스틱 트레이를 덮고 밀폐 용기나 비닐 봉지에 넣습니다. 밀폐 용기나 비닐 봉지를 닫고 파란색이 나타날 때까지 37°C에서 배양합니다.
6. 파란색이 나타나면 깨끗한 플라스틱 트레이에 놓인 약 500μL의 정지 용액(1M Na₂CO₃)에 콜로니 면이 위로 향하게 하여 여과지를 놓습니다. 용액이 빠르게 스며드는 것을 중지하십시오. 따라서 필터를 즉시 제거하고 콜로니 면이 위로 향하게 하여 새 종이 타월에 놓고 건조시키십시오.
7. 종이 타월을 교체하고 필터를 충분히 건조시킨 후 스캐너나 다른 장치를 사용하여 데이터를 캡처합니다.

4. 후보 클론의 회수 및 확인

1. 복제본의 원래 플레이트(또는 색상 분석에 사용되지 않는 복제된 플레이트)에서 흰색 및 Kan^R 후보 클론을 선택합니다. 그림 1C에 예가 나와 있습니다. 카나마이신이 함유된 SC-LW 배지에 작은 패치로 다시 스트리킹하고 30°C에서 1-2일 동안 배양하여 후보 클론이 흰색이고 Kan^R 인지 확인합니다. 적어도 두 세트를 만들거나 다음 날 반복하십시오.
   참고: 옅은 파란색 콜로니는 상호 작용을 유지할 수 있으므로 흰색 콜로니를 선택해야 합니다.
2. 후보 클론이 다시 잘 성장하면 3단계에서 설명한 대로 4.1단계에서 생성된 플레이트를 하나 이상 사용하여 색상 분석을 반복하고 플레이트가 흰색으로 유지되고 파란색으로 변하지 않는지 확인합니다(그림 2A).
   참고: 후보를 다시 스트리킹할 때 많은 양의 셀을 이월하지 마십시오. 세포가 너무 많으면 Kan^R 과 Kan^S 클론을 구별할 수 없습니다.
3. 플레이트 잔재에서 4.2단계에서 생성된 여전히 흰색이고 Kan^R 인 클론을 취하고 30°C에서 하룻밤 동안 1mL의 선택 배지(라이브러리 구성에 사용되는 벡터에 따라 SC-L 또는 SC-W)에서 독립적으로 성장시킵니다.
4. 배양액을 마이크로튜브로 옮기고 원심분리(~15,000 × g, 실온에서 10-30초 동안)로 세포를 수집합니다. 다음과 같이 세포 펠릿에서 전체 DNA를 분리합니다.
5. 2-메르캅토에탄올 각각 1μL와 20mg/mL Zymolyase 100T( 재료 표 참조)를 함유한 400μL의 용해 완충액(2% Triton X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM Tris-Cl(8.0) 및 1mM EDTA)에 세포 펠릿을 현탁시키고 37°C에서 30분 동안 배양하여 세포벽을 분해합니다. 이때 5-10분마다 튜브를 뒤집어 부드럽게 섞습니다.
6. 세포 현탁액이 불투명해지거나 반투명해지면 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(25:24:1)의 혼합물을 동일한 부피로 추가하고 10-20초 동안 적당한 속도로 소용돌이치면서 잘 혼합합니다.
7. 마이크로 원심분리기에서 마이크로 튜브를 최고 속도(실온에서 ~15,000 × g)로 5분 동안 원심분리하고 새 마이크로튜브에서 DNA가 포함된 수성상을 복구합니다. 0.8 부피의 이소프로판올을 넣고 튜브를 뒤집어 잘 섞는다.
8. 튜브를 실온에서 2-3분 동안 방치한 다음 마이크로 원심분리기에서 최고 속도(실온에서 ~15,000× g)로 4-5분 동안 원심분리하여 DNA를 침전시킵니다.
9. 상층액을 제거하고 약 500μL의 70% 에탄올로 침전물을 세척합니다. 에탄올을 완전히 제거하고 침전물을 잠시 건조시킵니다.
10. 20μL의 TE 완충액(10mM Tris-Cl(8.0) 및 1mM EDTA)을 침전물에 넣고 짧게 혼합한 다음 튜브를 실온에서 밤새 방치하여 침전물을 용해시킵니다.
    알림: 사용자가 급한 경우 튜브를 37-50 °C로 유지하십시오. DNA 침전물은 몇 시간 안에 용해됩니다.
11. 펠릿이 완전히 용해되면 소량의 이 DNA 용액으로 E. coli 를 형질전환시킵니다.
    NOTE: 형질전환 효율이 높은 E. coli 를 사용하는 경우 약 0.5μL의 DNA 용액으로 충분합니다.
12. E. coli colony가 나타나면 여러 개의 독립적인 colony를 선택하여 배양하고 알칼리 용해와 같은 표준 방법으로 플라스미드를 회수합니다.
13. 단계 4.12에서 얻은 플라스미드 DNA를 bait 플라스미드를 품고 있는 Y2H 숙주 세포에 도입합니다. 형질전환체가 나타나면 color assay(흰색으로 보여야 함) 및 western blotting⁴ (원하는 크기의 단백질을 발현해야 함)로 확인합니다.
    참고: 포스트 알칼리성 방법¹² 는 효모에서 전체 세포 추출물을 준비하는 쉽고 빠른 방법입니다.
14. 위의 두 가지 기준이 충족되면 뉴클레오티드 시퀀싱⁴에 의해 클론의 돌연변이 부위를 결정합니다.

최근에는 Pol2 단백질(Pol2-C)의 C-말단 절반이 MCM10과 상호 작용하는 것이 밝혀졌습니다. 두 단백질 모두 DNA 복제의 시작에 필수적이며, 따라서 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae 13,14,15의 세포 성장에 필수적입니다. 이 상호 작용의 생물학적 중요성을 이해하는 데 도움이 되도록 MCM10과 상호 작용이 없거나 감소한 Pol2-C 돌연변이를 여기에 설명된 방법을 사용하여 분리했습니다.

돌연변이 라이브러리는 1단계에서 설명한 방법에 따라 구성되었습니다. Pol2-C DNA 단편을 GoTaq 중합효소로 증폭하고 In-Fusion 효소를 사용하여 Gal4AD(pST2525) 벡터로 클로닝했습니다. 라이브러리에 있는 독립적인 클론의 수는 5000개로 추정되었습니다.

단계 2에서 설명한 바와 같이, 라이브러리 플라스미드의 DNA를 Y2H 숙주 균주 TAT-7에 도입하고, 이는 LexA-MCM10 플라스미드로 사전 형질전환되었습니다. 세포를 SC-LW 플레이트에 펴고 다음 날 SC-LW 및 SC-LW+G418 플레이트에 복제했습니다. 반복실험은 단계 3에 설명된 대로 색상 분석을 실시했습니다. 색상 분석의 일부 결과는 그림 1C에 나와 있습니다.

색상 분석에서 백색이고 G418 내성인 47개의 콜로니는 약 8500개의 형질전환체로부터 첫 번째 후보로서 분리되었습니다. 그들은 색상 분석으로 다시 테스트되었고, 47개의 클론 중 25개가 흰색으로 확인되었습니다(그림 2A). 이 25개의 클론은 후보로 유지되었습니다. 후보 플라스미드 DNA는 단계 4에서 설명한 바와 같이 25개의 후보 물질 각각으로부터 회수하였다. 이들을 LexA-MCM10을 함유하고 있는 Y2H 효모 숙주 세포에 다시 도입하고 색상 분석으로 테스트한 결과, 색상이 없는 16개의 클론을 선택했습니다. 이들이 Pol2-C 미센스 돌연변이임을 추가로 확인하기 위해, Pol2-C 단백질의 발현을 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 확인하였다. 12개의 후보 물질은 양성 대조군과 거의 동일한 위치에서 띠를 나타냈습니다(Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX 융합 단백질, m.w.로 계산: 158.8kDa)(그림 2B). 색상 분석 결과, 이들 12개의 클론은 MCM10과 상호작용하지 않는 것으로 나타났습니다(그림 2C). 이들 클론의 뉴클레오티드 서열을 결정한 후, 이들 모두가 미센스 돌연변이(missense mutation)를 가지고 있음이 확인되었다. 미센스 돌연변이의 수는 1개에서 5개까지 다양했다(데이터는 표시되지 않음). 평균적으로, 약 1000개의 염기에서 약 1개의 미센스 돌연변이가 발생했다.

그림 1: interaction-null/impaired mutants를 스크리닝하기 위한 Y2H 기반 접근법의 개략도. (A) Y2H 시스템. (B) 상호작용 무효/손상된 돌연변이를 격리하기 위한 전략. 1: 새로 구성된 Y2H 벡터에는 Y2H 태그, DB 도메인 및 AD의 다운스트림에 있는 KanMX 유전자의 복사본이 포함되어 있습니다. 중요한 것은 이 KanMX 유전자에는 시작 코돈이 없고 Y2H 태그와 함께 프레임을 벗어난다는 것입니다. 따라서 KanMX 유전자는 이 벡터에서 발현되지 않을 것으로 예상됩니다. PCR 증폭 DNA 단편이 벡터에 삽입되면 KanMX 유전자는 Y2H 태그와 함께 프레임 내에 배치되어 발현됩니다. 결과적으로, 야생형 삽입체 또는 미센스 돌연변이가 있는 삽입체를 가진 플라스미드만이 KanMX 유전자를 발현할 수 있으며, 이는 G418에 대한 내성을 부여합니다. 넌센스(nonsense) 또는 프레임시프트(frameshift) 돌연변이가 있는 플라스미드는 KanMX 유전자를 발현할 수 없습니다. 2: 1단계에서 구축한 돌연변이 라이브러리가 Y2H 숙주 효모 세포에 도입됩니다. 트랜스포머트가 나타나면 복제본이 만들어집니다. 리포터 유전자의 발현과 G418에 대한 내성을 비교함으로써 interaction-null/impaired mutant의 후보를 선택할 수 있습니다. (C) 심사의 예. Gal4-AD 및 PCR-돌연변이 유발된 Pol2-C DNA 단편이 있는 플라스미드 라이브러리를 Y2H 숙주 균주 TAT-7에 도입하고, 이 균주는 LexA-MCM10 플라스미드로 사전 형질전환되었습니다. 색상 분석 전(왼쪽)과 후(가운데)의 세포와 SC-LW+G418 플레이트에서 성장한 세포(오른쪽)의 이미지가 표시됩니다. interaction-null/impaired mutants 및 false candidate의 후보의 예는 각각 흰색 및 검은색 화살촉으로 표시됩니다. (D) Y2H 벡터, AD(상단) 및 DB(하단) 벡터의 클로닝 부위 주변의 DNA 염기서열. Y2H 태그(빨간색)의 마지막 10개 아미노산(aa)에서 KanMX(녹색)의 처음 10개 aa에 해당하는 부분까지의 순서가 표시됩니다. SmaI 및 BamHI의 인식 사이트도 표시됩니다. PCR 프라이머의 위치는 BamHI site를 클로닝 site로 사용할 때 하단에 표시됩니다. 관심 유전자를 다른 플라스미드(pST2303/2523)에 클로닝하는 데에도 동일한 프라이머가 적용됩니다. 이 그림은 Tanaka et al.4에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: interaction-null/impaired mutants의 스크리닝 과정의 예. (A) 그림 1C에 나타난 바와 같이, 후보 클론으로서 분리된 47개의 콜로니를 G418을 함유하는 SC-LW 배지에서 다시 성장시키고 색상 분석을 실시하였다. +: 포지티브 컨트롤(Wt Pol2-C), -: 네거티브 컨트롤(벡터). 1 - 25 번호가 매겨진 후보 클론을 배양하여 플라스미드를 회수하였다. (B) (A)의 각 후보 클론에서 플라스미드를 회수하여 Y2H 숙주 세포에 도입하고 다시 색상 분석을 실시했습니다. 그 중 16개는 흰색(색깔 없음)이었습니다. 이들로부터 전세포 추출물을 제조하고, 항-HA 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 실시하였다. 패널의 숫자는 (A)의 숫자에 해당합니다. 분석은 #6을 제외한 각 후보물질에서 회수된 여러 독립적인 플라스미드 클론에 대해 수행하였다. (C) 최종 12개의 클론에 대한 색상 분석 결과. 숫자는 (A)의 숫자에 해당합니다. MCM10과의 상호작용을 유지한 #16은 색상 분석에서 양성 대조군으로 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: Y2H 태그가 있는 KanMX out-of-frame을 포함하는 Y2H 벡터 목록.

보충 파일 1: PCR 혼합물, 프라이머 세부 정보 및 반응 조건의 예. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.