이 프로토콜은 살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF 키나아제의 상호 작용을 측정하기 위한 BRET 기반 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 셀 준비, BRET 배출량 판독 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다. 적절한 대조군을 식별하고 분석 최적화를 위한 문제 해결을 위한 결과의 예도 제시됩니다.
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방법 논문
살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석
이 논문에서
요약
초록
CRAF는 RAS GTPase의 주요 효과자이며 여러 KRAS 기반 암의 종양 형성에 중요한 역할을 합니다. 또한 CRAF는 생식세포 돌연변이의 핫스팟이며, 이는 발달성 RASopathy, Noonan 증후군을 유발하는 것으로 나타났습니다. 모든 RAF kinase는 14-3-3 조절 단백질에 대한 여러 인산화 의존성 결합 부위를 포함합니다. 이러한 부위에 대한 14-3-3의 차등 결합은 신호 조건 하에서 원형질막에서 활성 RAF 이량체를 형성하고 정지 조건에서 RAF 자가억제를 유지하는 데 필수적인 역할을 합니다. 이러한 상호 작용이 어떻게 조절되고 어떻게 조절될 수 있는지 이해하는 것은 RAF 기능을 표적으로 하는 새로운 치료 접근법을 식별하는 데 중요합니다. 여기에서는 살아있는 세포에서 CRAF와 14-3-3 단백질의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석에 대해 설명합니다. 구체적으로, 이 분석은 나노 루시페라아제 공여체에 융합된 CRAF와 Halo 태그 수용체에 융합된 14-3-3의 상호 작용을 측정하며, 여기서 RAF와 14-3-3의 상호 작용은 공여체에서 수용체 간 에너지 전달 및 BRET 신호의 생성을 초래합니다. 이 프로토콜은 또한 이 신호가 고친화성 RAF 도킹 사이트 각각에 대한 14-3-3 결합을 방지하는 것으로 표시된 돌연변이에 의해 중단될 수 있음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 BRET 방출 판독, 데이터 분석 수행 및 단백질 발현 수준 확인에 대한 자세한 지침과 함께 세포의 파종, transfection, 재도금 절차를 설명합니다. 또한 최적화 및 문제 해결 단계와 함께 예제 분석 결과가 제공됩니다.
서론
RAF 키나아제(ARAF, BRAF 및 CRAF)는 RAS GTPase의 직접 효과자이며 pro-proliferative/pro-survival RAF-MEK-ERK kinase cascade의 초기 멤버입니다. 최근 연구에 따르면 CRAF 발현은 비소세포폐암 및 췌관 선암(pancreatic ductal adenocarcinoma) 1,2,3,4,5를 포함한 여러 KRAS 유발 암의 종양 형성에 중요한 역할을 합니다. 더욱이, 생식세포 CRAF 돌연변이는 특히 심각한 형태의 RASopathy, Noonan 증후군 6,7을 유발합니다. CRAF 조절을 이해하는 것은 세포에서 CRAF 기능을 표적으로 하는 성공적인 치료 접근법을 개발하는 데 매우 중요합니다.
모든 RAF 키나아제는 활성을 제어하는 C-말단 촉매(CAT) 영역과 N-말단 조절(REG) ....
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프로토콜
참고: 이 분석은 293FT 세포에서 수행됩니다. 인간 배아 신장 세포에서 유래한 잘 특성화되고 쉽게 transfection할 수 있는 상피 라인. 이러한 세포의 단일 합류 10cm 배양 접시는 일반적으로 6웰 조직 배양 플레이트의 20웰을 파종하기에 충분한 세포를 제공합니다. 1-3단계는 생물 안전 작업대에서 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.
1. 세포 파종(1일차)
참고: 이 단계에서는 세포를 조직 배양 접시에서 분리하고, 계수하고, 2단계에서 transfection을 위해 6웰 조직 배양 플레이트에 파종합니다(그림 2).
- 10cm 접시의 세포에서 배지를 흡입합니다. 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하고 흡입합니다.
- 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL를 넣고 37°C에서 3-5분 동안 배양하여 접시에서 세포를 분리합니다.
- 9mL의 완전한 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)을 세포에 추가하여 트립신을 중화하고 피펫팅을 위아래로 반복적으로 생성하여 균질한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.<....
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결과
이 프로토콜(그림 2)에 설명된 대로 수행할 때 Nano-CRAFWT 와 14-3-3ζ-Halo의 상호 작용은 50-60mBU(그림 3A; 보충표 1). CRAF에는 인산화 의존적 14-3-3 도킹 사이트, 즉 N' 영역과 C' 영역이 포함되어 있습니다(그림 1)8. 따라서, CRAF:14-3-3ζ 결합을 감소시키기 위한 적절한 제어는 S259A 및 S621A를 포함하며, 이는 인산화를 방지하고, 차례로 N' 및 C' 부위에 대한 14-3-3 결합을 각각 포함한다(25). 그림 3A에서 볼 수 있듯이 Nano-CRAFS259A 는 BRET 신호를 ~45%, Nano.......
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토론
이전 연구에 따르면 14-3-3 단백질은 RAF 키나아제의 활성화와 억제 모두에 중요한 역할을 합니다. 이러한 결합 이벤트가 어떻게 조절되는지, 그리고 이러한 상호작용을 조절하는 것이 RAF 신호전달 및 RAF 주도 종양발생에 미치는 영향을 이해하면 CRAF 기능을 표적으로 하는 새로운 치료 취약성을 발견할 수 있습니다. 그러나, Raf 활성화 주기는 과다한 관련 단백질, 번역 후 변형(posttranslational modification) 및 세포 내 국소화(subcellular localization)의 변화에 의해 지원되므로8, 따라서 이러한 조건을 완전히 재현하기 위해서는 RAF와 그 조절인자의 상호작용을 살아있는 세포 조건에서 측정해야 한다. 이 프로토콜은 살아있는 세포에서 14-3-3ζ 및 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위해 nanoluciferase-Halo N-BRET 쌍의 우수한 신호 대 잡음 비율 및 스펙트럼 분해능을 활용하는 새로운 근접 기반 분석을 설명합니다.<.......
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공개 사항
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감사의 글
이 프로젝트는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립암연구소(National Cancer Institute, National Institutes of Health)의 연방 기금으로 일부 자금을 지원받았으며, 프로젝트 번호는 ZIA BC 010329입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강한>항체 | |||
| HaloTag® 마우스 단클론 항체 | Promega | G9211 | 면역블롯에 의한 HaloTag 태그 단백질 검출용 항체 |
| NanoLuc® 마우스 단클론 항체 | R& D Systems | MAB10026 | 에 의한 나노 태그 단백질을 검출하기 위한 항체 |
| Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | 에 의해 CRAF 단백질을 직접 감지 | |
| 2차 HRP 접합 마우스 항체(양에서 추출) | |||
| 시약 | |||
| X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
| NanoBRET; 키트 | 프로메가 | N1661 | Halo 618 리간드와 NanoGlo (나노루시페라제) 기질을 포함하는 NanoBRET 키트 |
| DPBS, Ca++ 및 Mg++ 없음 | 품질 생물학제 | 114-057-101 | |
| 트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드 | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM 세포 배양 매체 | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, 10% FBS, 2 mM L-glutamine 및 100U penicillin-streptomycin |
| L-Glutamine (200 mM)이 함유된 공급 매체 | Life Technologies | 25030164 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) | 라이프 테크놀로지 | ||
| Opti-MEM & 무역; 나는 혈청 매체를 줄였습니다 | Gibco | 31985062 | 세포 transfection |
| Opti-MEM 감소 혈청 배지, 페놀 레드 | 없음 Gibco | 11058021 | 3일차 세포 재생용. 2 mM L-글루타민과 100U 페니실린-스트렙토마이신을 보충하며, 10% FBS와 함께 (표시된 경우)을 |
| Invitrogen Trypan 블루 스테인 | 써모 사이언티픽 | T10282 | |
| NP40 용해 완충액 | N/ | A N/A | 20 mM 트리스 (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% 글리세롤, NP40 대안(Milipore, Cat# 492016). 4°C에서 보관하십시오. 사용 직전에 다음의 프로테아제와 포스파타아제를 첨가하십시오: 20 µ M 류펩틴, 0.5mM 오르토바니데이트나트륨, 0.15U/mL, 1mM PMSF. |
| 5x 겔 샘플 버퍼 | N/A | N/A | 240mM 트리스(pH 8.0), 9.5% SDS, 30% 글리세롤, 500mM DTT, 3mM 브로모페놀 블루. -20°C에서 보관하십시오. |
| <강>세포주 | |||
| 293FT 세포 (인간) | Thermo Scientific | R70007 | |
| DNA 벡터 | |||
| pCMV5-Nano-CRAF WT 및 돌연변이 | 해당 사항 | 없음 | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| Equipment | |||
| EnVision 2104 멀티모드 플레이트 리더 | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP 나노브렛 및 M460/50nm NanoBRET 이미터 필터, 발광 404 거울, 6.5mm 측정 높이 및 0.1초 측정 시간 |
| Invitrogen Countess™ II 자동 세포 계수기 | 써모 사이언티픽 | AMQAX1000 | |
| 써모피셔 E1-ClipTip™ 멀티채널 피펫터 | 써모 사이언티픽 | 4672070 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism (버전 10.0.3) | 그래프패드 | www.graphpad.com | |
| other | |||
| ThermoFisher ClipTip 멀티채널 피펫 팁 | 써모 사이언티픽 | ||
| 시약 저장소, 25 mL 분할, 멸균 | 토마스 사이언티픽 | 1228K16 | |
| 퍼킨 엘머 384-웰 CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | 화이트, 폴리스티렌, 조직 배양 처리 |
| Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 | Thermo Scientific | C10228 |
참고문헌
- Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
- Blasco, M. T., et al. ....
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재인쇄 및 허가
