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살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석

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DOI:

10.3791/66436

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2024년 3월 1일

1Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 3Laboratory of Cell and Developmental Signaling, Center for Cancer Research, National Cancer Institute-Frederick

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF 키나아제의 상호 작용을 측정하기 위한 BRET 기반 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 셀 준비, BRET 배출량 판독 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다. 적절한 대조군을 식별하고 분석 최적화를 위한 문제 해결을 위한 결과의 예도 제시됩니다.

초록

CRAF는 RAS GTPase의 주요 효과자이며 여러 KRAS 기반 암의 종양 형성에 중요한 역할을 합니다. 또한 CRAF는 생식세포 돌연변이의 핫스팟이며, 이는 발달성 RASopathy, Noonan 증후군을 유발하는 것으로 나타났습니다. 모든 RAF kinase는 14-3-3 조절 단백질에 대한 여러 인산화 의존성 결합 부위를 포함합니다. 이러한 부위에 대한 14-3-3의 차등 결합은 신호 조건 하에서 원형질막에서 활성 RAF 이량체를 형성하고 정지 조건에서 RAF 자가억제를 유지하는 데 필수적인 역할을 합니다. 이러한 상호 작용이 어떻게 조절되고 어떻게 조절될 수 있는지 이해하는 것은 RAF 기능을 표적으로 하는 새로운 치료 접근법을 식별하는 데 중요합니다. 여기에서는 살아있는 세포에서 CRAF와 14-3-3 단백질의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석에 대해 설명합니다. 구체적으로, 이 분석은 나노 루시페라아제 공여체에 융합된 CRAF와 Halo 태그 수용체에 융합된 14-3-3의 상호 작용을 측정하며, 여기서 RAF와 14-3-3의 상호 작용은 공여체에서 수용체 간 에너지 전달 및 BRET 신호의 생성을 초래합니다. 이 프로토콜은 또한 이 신호가 고친화성 RAF 도킹 사이트 각각에 대한 14-3-3 결합을 방지하는 것으로 표시된 돌연변이에 의해 중단될 수 있음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 BRET 방출 판독, 데이터 분석 수행 및 단백질 발현 수준 확인에 대한 자세한 지침과 함께 세포의 파종, transfection, 재도금 절차를 설명합니다. 또한 최적화 및 문제 해결 단계와 함께 예제 분석 결과가 제공됩니다.

서론

RAF 키나아제(ARAF, BRAF 및 CRAF)는 RAS GTPase의 직접 효과자이며 pro-proliferative/pro-survival RAF-MEK-ERK kinase cascade의 초기 멤버입니다. 최근 연구에 따르면 CRAF 발현은 비소세포폐암 및 췌관 선암(pancreatic ductal adenocarcinoma) 1,2,3,4,5를 포함한 여러 KRAS 유발 암의 종양 형성에 중요한 역할을 합니다. 더욱이, 생식세포 CRAF 돌연변이는 특히 심각한 형태의 RASopathy, Noonan 증후군 6,7을 유발합니다. CRAF 조절을 이해하는 것은 세포에서 CRAF 기능을 표적으로 하는 성공적인 치료 접근법을 개발하는 데 매우 중요합니다.

모든 RAF 키나아제는 활성을 제어하는 C-말단 촉매(CAT) 영역과 N-말단 조절(REG) 영역의 두 가지 기능 도메인으로 나눌 수 있습니다(그림 1A)8. REG 영역은 RAS 결합 도메인(RBD), 시스테인 풍부 도메인(CRD) 및 세린/트레오닌 풍부 영역(S/T-rich)을 포함합니다. 주목할 만하게도, S/T-rich 영역은 인산화 의존적 방식으로 14-3-3에 결합하는 N' site를 포함한다(CRAF의 S259; 그림 1A) 8. CAT 도메인은 C' 사이트라고 하는 두 번째 고친화성 14-3-3 도킹 사이트와 함께 키나아제 도메인을 포함합니다(CRAF의 S621; 그림 1A) 8. CRD와 함께 N' 및 C' 위치에 대한 이합체 14-3-3 단백질의 차별적 결합은 RAF 활성화 및 억제 9,10,11,12,13 모두에서 중요한 역할을 합니다. 정상적인 신호 전달 조건에서 RAF 활성화는 RAS에 의한 원형질막으로의 모집에 의해 시작되어 활성 이량체를 형성할 수 있으며, 그 중 BRAF-CRAF 이종이량체가 우세한 활성 형태14,15입니다. 이합체 BRAF의 극저온 전자 현미경(Cryo-EM) 구조와 함께 BRAF 및 CRAF를 사용한 생화학 분석은 14-3-3 이량체가 두 RAF 양성체의 C' 부위에 동시에 결합하여 활성 RAF 이량체를 안정화한다는 것을 나타냅니다(그림 1B)9,13,16,17. 반대로, 연구에 따르면 정지 조건에서 RAF는 REG 도메인이 CAT 도메인에 결합하고 그 활성을 억제하는 세포소질, 자동 억제 확인을 채택합니다 12,18,19,20. 이 닫힌 상태는 REG 도메인의 CRD 및 N' 사이트와 CAT 도메인의 C' 사이트에 결합된 14-3-3 이량체에 의해 안정화됩니다(그림 1B)10,13,21. BRAF에서 이 모델은 자가 억제 BRAF 단량체의 최근 Cryo-EM 구조와 이전 생화학 연구 10,12,13,21,22에 의해 지원됩니다. 그러나, 14-3-3은 CRAF 규정23에서 억제 역할을 하는 것으로 나타났지만, BRAF와 같은 자가억제 상태는 CRAF 규정12에서 더 적은 역할을 할 수 있다; 따라서 14-3-3 단백질이 CRAF 활성을 조절하는 메커니즘을 명확히 하기 위해 추가 연구가 필요합니다. RAF kinase의 14-3-3-mediated regulation은 과다한 RAF 인산화 및 탈인산화 이벤트, 다양한 조절 단백질에 대한 결합, 원형질막과의 상호 작용을 필요로 한다8. 따라서 14-3-3-RAF 상호 작용은 생리학적으로 관련된 조건과 온전한 지질 이중층이 있는 상태에서 측정하는 것이 중요합니다.

이 문제를 해결하기 위해 NanoBRET(여기서는 N-BRET라고 함, 키트 세부 정보는 재료 표 참조) 기술을 활용하여 살아있는 세포에서 CRAF와 14-3-3 단백질의 상호 작용을 측정하기 위한 근접 기반 분석을 개발했습니다(그림 1C). 이 BRET 기반 시스템은 Halo618 에너지 수용체 리간드22,24로 라벨링하기 위해 한 단백질에는 나노루시페라아제(Nano) 공여체가 태그되고 다른 단백질에는 Halo 태그가 부착되는 두 관심 단백질(POI)의 상호 작용을 측정합니다. 관심 단백질의 상호 작용은 공여체에서 수용체로의 에너지 전달을 초래하며, 이는 다시 BRET 신호를 생성합니다(그림 1C). 매우 밝은 Nano donor 단백질(방출(em) 460nm) 및 Halo618 리간드(em 618nm)는 기존 BRET에 비해 더 큰 스펙트럼 분리 및 감도를 제공하므로 더 약한 상호 작용을 연구하고 결합24의 미묘한 변화를 감지하는 데 이상적인 플랫폼입니다. 실제로, 우리는 이전에 RAF REG 및 CAT 영역의 자가 억제 상호 작용을 측정하기 위한 N-BRET 기반 분석을 개발했으며, 이는 BRAF CRD에서 RASopathy 돌연변이 패널의 특성 분석에 필수적이었고 자가 억제를 유지하고 구성적 BRAF 활성화를 방지하는 데 이 영역의 중요한 중요성을 입증했습니다12.

여기에 설명된 분석은 N-말단 나노 태그(Nano-CRAF)에 융합된 CRAF와 C-말단 Halo 태그(14-3-3ζ-Halo; 그림 1C). 우리는 Nano-CRAF와 14-3-3ζ-Halo의 상호 작용이 강력한 BRET 신호를 생성하며, 이는 차례로 N' site(S259A) 및/또는 C' site(S621A)에 14-3-3 결합을 방지하는 돌연변이에 의해 중단될 수 있음을 보여줍니다. 다음 프로토콜은 이 분석을 수행, 최적화 및 문제 해결하기 위한 자세한 단계를 제공합니다.

프로토콜

참고: 이 분석은 293FT 세포에서 수행됩니다. 인간 배아 신장 세포에서 유래한 잘 특성화되고 쉽게 transfection할 수 있는 상피 라인. 이러한 세포의 단일 합류 10cm 배양 접시는 일반적으로 6웰 조직 배양 플레이트의 20웰을 파종하기에 충분한 세포를 제공합니다. 1-3단계는 생물 안전 작업대에서 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.

1. 세포 파종(1일차)

참고: 이 단계에서는 세포를 조직 배양 접시에서 분리하고, 계수하고, 2단계에서 transfection을 위해 6웰 조직 배양 플레이트에 파종합니다(그림 2).

  1. 10cm 접시의 세포에서 배지를 흡입합니다. 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하고 흡입합니다.
  2. 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL를 넣고 37°C에서 3-5분 동안 배양하여 접시에서 세포를 분리합니다.
  3. 9mL의 완전한 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)을 세포에 추가하여 트립신을 중화하고 피펫팅을 위아래로 반복적으로 생성하여 균질한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
  4. 즉시 20μL의 세포를 1.7mL 튜브에 옮기고 20μL의 트리판 블루 염색과 혼합합니다. 자동 세포 계수기(Table of Materials) 또는 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
  5. 완전한 DMEM 배지에서 세포를 2 x 105 cells/mL로 희석하고 6-well 조직 배양 플레이트(4 x 105 cells/well)의 각 웰에 2mL를 추가합니다. 37 ° C 및 10 % CO2 에서 밤새 세포를 배양합니다.
    알림: 293x 미만으로 통과된 20FT 셀을 사용하는 것이 좋습니다. 우리는 이전에 더 큰 통로 수를 가진 셀을 사용하면 BRET 비율이 감소하고 well-to-well 신호 변동성이 증가할 수 있음을 발견했습니다.

2. 세포 transfection(2일차)

참고: 여기서 세포는 pCDNA3.1 빈 벡터와 함께 pCMV5-NanoLuc-CRAF 및 pCMV5-14-3-3ζ-Halo 발현 구조로 transfection됩니다(그림 2).

  1. transfection에 앞서 N-BRET 플라스미드를 5 ng/μL로, pCDNA3.1을 100 ng/μL로 희석하고 멸균 1.7 mL 튜브 세트에 번호를 매깁니다.
  2. 각 튜브에 100μL의 transfection 배지(자세한 내용은 재료 표 참조)를 pCMV5-NanoLuc-CRAF 5ng, pCMV5-14-3ζ 10ng 및 PCDNA3.1 200ng과 함께 추가합니다.
  3. 2 μL의 transfection 시약(자세한 내용은 재료 표 참조)을 추가하고 부드럽게 와류하여 혼합합니다. 마이크로 원심분리기에서 튜브를 잠시 펄스 회전시켜 모든 액체가 튜브 바닥에 수집되도록 한 다음 약 25°C에서 15분 동안 배양합니다.
  4. transfection 복합체를 세포에 적가하고 37°C/10%CO2 에서 16-20시간 동안 배양하여 Halo- 및 Nano- 태그 단백질이 발현될 수 있도록 합니다.
    참고: 빈 벡터(pCDNA3.1) 캐리어 DNA의 추가는 N-BRET 발현 구조체의 높은 transfection 효율을 달성하는 데 필수적입니다. 빈 벡터를 추가하지 않으면 14-3-3ζ-Halo 및 Nano-CRAF 단백질의 발현 수준이 감소하고 이전에 논의된 바와 같이 BRET 비율이 약하고 일관성 없는 결과를 초래합니다22.

3. 셀 재도금(3일차)

참고: 이 단계에서 셀은 384웰 플레이트와 Halo 618 리간드(+리간드; 재료 목차) 또는 4단계에서 BRET 배출량을 읽기 위해 DMSO(+vehicle)가 추가됩니다. 나머지 세포는 5단계에서 웨스턴 블롯 분석을 위해 새로운 6웰 배양 플레이트로 옮겨집니다(그림 2).

  1. 다음 자료를 수집하고 아래 설명에 따라 작업 영역을 준비합니다.
    1. 37°C 수조를 사용하여 무혈청 분석 배지 및 10% FBS 보충 분석 배지와 함께 트립신-EDTA를 사전 데웁니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
    2. 측정할 샘플의 수에 따라 멸균 1.7mL 튜브 3세트(세트 1-3)와 멸균 15mL 코니컬 바닥 튜브 1세트를 사전 라벨링합니다. 스윙 버킷 원심분리기에 15mL 튜브 인서트를 장착하고 4°C로 사전 냉각합니다.
    3. 시약 저장소, 384웰 조직 배양 플레이트, 6웰 조직 배양 플레이트, 멀티채널 피펫 및 팁, 세포 계수 슬라이드/챔버 및 트리판 블루 염색(Table of Materials)과 1.7mL 튜브 세트 1-3을 함께 조직 배양 후드에 넣습니다.
  2. 아래 설명된 대로 세포를 수집하고 계산합니다.
    1. 6웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 250μL의 트립신-EDTA를 세포에 추가합니다. 세포가 분리되기 시작할 때까지 37°C에서 6웰 플레이트를 배양합니다(3-5분).
    2. 각 웰에 10% FBS 보충 분석 배지 1mL를 추가하여 트립신을 중화하고 피펫을 위아래로 세게 하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
    3. 세포 현탁액 1mL를 사전 라벨링된 15mL 튜브로 옮깁니다. 15mL 튜브 각각에 10% FBS 보충 분석 배지 1mL를 더 추가합니다.
    4. 튜브를 5배 반전시켜 혼합하고 즉시 20μL의 세포 현탁액을 튜브 세트 1로 옮깁니다.
    5. 사전 냉각된 스윙 버킷 원심분리기에서 ~250 x g에서 5분 동안 원심분리기. 원심분리 단계에서 20μL의 트리판 블루 세포 염색을 튜브 세트 1의 세포와 혼합한 다음 자동 세포 카운터 또는 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 수율은 6-8 x 105 cells/mL가 일반적입니다.
    6. 원심분리기에서 15mL 튜브를 제거하고 세포 펠릿에서 배지를 흡입합니다. 무혈청 분석 배지 및 피펫에서 세포 펠릿을 2 x 105 cells/mL로 재현탁시켜 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
      참고: 무혈청 Assay Media의 사용은 정상 세포 신호 전달 경로를 정지시키는 데 사용됩니다.
  3. 아래 설명된 대로 384-well 및 6-well 플레이트에 셀을 재플레이트합니다.
    1. 15mL 튜브를 여러 번 반전시켜 균일한 세포 현탁액을 보장하고 500 μL를 1.7 mL 튜브 세트 2 및 세트 3으로 옮깁니다.
    2. 세트 2에 0.5μL의 DMSO(+vehicle)를 추가하고 튜브 세트 3에 0.5μL의 Halo 618 리간드(+리간드)를 추가하고 피펫을 혼합합니다.
    3. +vehicle 및 +ligand cell suspensions를 시약 reservoir의 분리된 well로 옮깁니다. 멀티채널 피펫(Table of Materials)을 사용하여 시약 저장소에서 +vehicle cell suspension 40 μL를 384-well culture plate의 4배 웰로 옮깁니다. +리간드 세포 현탁액에 대해 이 단계를 반복합니다.
    4. 나머지 세포를 새로운 6웰 배양 플레이트에 옮깁니다. 384웰 및 6웰 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 밤새 배양합니다.

4. BRET 배출량 판독(4일차)

참고: 이 단계에서는 나노루시페라아제 기질(자세한 내용은 재료 표 참조)을 384웰 배양 플레이트의 세포에 추가하고 N-BRET 수용체(618nm) 및 공여체(460nm) 방출을 판독합니다(그림 2). 그런 다음 수정된 BRET 비율이 계산됩니다.

  1. 무혈청 분석 배지를 37°C 수조에서 사전 데우고 나노루시페라아제 기질을 25°C에서 해동합니다. 나노루시페라아제 기질을 무혈청 분석 배지에 1:100으로 희석하고 시약 저장소로 옮깁니다. 384웰 플레이트의 각 웰에 10μL를 추가하고 10%-15%의 추가 부피를 추가하기에 충분한 이 혼합물을 준비합니다.
  2. 멀티채널 피펫(Table of Materials)을 사용하여 10μL의 기질 혼합물을 384웰 배양 플레이트의 세포가 포함된 각 웰로 옮깁니다. 수동으로 또는 오비탈 셰이커를 사용하여 플레이트를 1분 동안 부드럽게 회전시킵니다.
  3. 384웰 플레이트를 멀티모드 플레이트 리더에 삽입하고 셀이 포함된 모든 웰에 대한 460nm 및 618nm 방출을 기록합니다.
    참고: 이 단계에 사용된 다중 모드 플레이트 리더의 경우(자세한 내용은 재료 표 참조) 6.5mm의 판독 높이와 0.1초의 판독 시간 측정이 사용되었지만, 다른 플레이트 리더를 사용하는 경우 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
  4. 다음 방정식을 사용하여 +vehicle 및 +ligand에 대한 원시 BRET 비율을 밀리BRET 단위(mBU)로 개별적으로 계산합니다.
    figure-protocol-1
  5. +Ligand의 BRET 비율에서 +vehicle BRET 비율을 빼서 보정된 BRET 비율을 계산합니다(보충 표 1).
    참고: 여러 실험의 결과를 비교할 때 보정된 BRET 비율은 Nano-CRAFWT 및 14-3-3ζWT-Halo로 구성된 Wildtype(WT) N-BRET 쌍의 평균으로 통합되고 정규화될 수 있습니다(보충 표 1).

5. 단백질 발현 수준 확인(4일차 및 5일차)

참고: 이 단계에서는 6-well plates의 세포를 용해하고 Nano-CRAF 및 14-3-3ζ-Halo 단백질의 단백질 발현 수준을 Halo 및 Nano 태그에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 결정합니다. (그림 2).

  1. 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제를 NP40 용해 완충액(재료 표)에 추가하면 시료당 200μL의 용해 완충액을 사용할 수 있습니다.
  2. 세포가 들어 있는 6-well 플레이트에서 배지를 흡입합니다. 1mL의 차가운 PBS로 세포를 한 번 세척하고 흡인합니다.
  3. 각 웰에 125μL의 NP40 용해 완충액을 추가하고 4°C의 로킹 플랫폼에서 15분 동안 6웰 플레이트를 배양하여 세포를 용해합니다.
  4. 용해물을 얼음 위의 1.7mL 튜브로 옮기고 4°C에서 10분 동안 20,000 x g 으로 원심분리합니다. 세척된 용해물을 얼음 위에 다시 놓고 Bradford 또는 Bicinchoninic acid(BCA) 분석과 같은 상업적으로 이용 가능한 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
  5. 적절한 부피의 용해물 및 NP40 용해 완충액을 신선한 1.7mL 튜브로 총 부피 100μL로 옮겨 모든 시료에서 단백질 농도를 정상화합니다.
  6. 5x 단백질 시료 완충액(재료 표)을 1분 동안 끓이고 각 시료에 25μL를 추가합니다. 샘플을 5-6분 동안 끓인 다음 튜브를 잠시 펄스 원심분리하여 모든 샘플이 튜브 바닥에 모이도록 합니다.
  7. 25μL의 샘플을 중복 단백질 겔(겔 1 및 겔 2)의 각 웰에 로드한 다음 이전에 설명한 대로 표준 웨스턴 블로팅 절차를 사용하여 단백질을 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인으로 전달합니다22.
  8. 25°C에서 3% BSA-PBS로 30분 동안 멤브레인을 차단한 다음 Halo 항체(1:1,000 희석)로 밤새 멤브레인을 배양합니다. Gel 1) 및 나노루시페라아제 또는 CRAF 항체(1:500 희석; 겔 2)를 트리스 완충 식염수에 넣고 0.2% Tween-20(TBST; Table of Materials)를 참조하십시오.
  9. TBST 10mL에서 멤브레인을 5분 동안 1회 세척한 다음 TBST에서 1:10,000으로 희석한 항마우스 HRP 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  10. 25°C에서 각각 5분 동안 10mL의 TBST에 로킹 플랫폼에서 멤브레인을 3회 세척합니다. TBST를 제거하고 ECL 시약과 X선 필름 프로세서 또는 기타 적절한 이미징 시스템을 사용하여 단백질 띠를 시각화합니다.

결과

이 프로토콜(그림 2)에 설명된 대로 수행할 때 Nano-CRAFWT 와 14-3-3ζ-Halo의 상호 작용은 50-60mBU(그림 3A; 보충표 1). CRAF에는 인산화 의존적 14-3-3 도킹 사이트, 즉 N' 영역과 C' 영역이 포함되어 있습니다(그림 1)8. 따라서, CRAF:14-3-3ζ 결합을 감소시키기 위한 적절한 제어는 S259A 및 S621A를 포함하며, 이는 인산화를 방지하고, 차례로 N' 및 C' 부위에 대한 14-3-3 결합을 각각 포함한다(25). 그림 3A에서 볼 수 있듯이 Nano-CRAFS259A 는 BRET 신호를 ~45%, Nano-CRAFS621A 는 ~25%까지 감소시키는 반면, S259A/S621A(SS/AA) 이중 돌연변이는 CRAF:14-3-3 BRET 신호를 거의 완전히 제거합니다. 또한, 여러 독립적인 실험의 결과를 먼저 각 실험의 결과를 평균 보정된 BRET 비율로 정규화한 다음(보충 표 1) 세 가지 실험 모두의 데이터 포인트를 함께 합산하여 비교할 수 있습니다(그림 3B). 태그된 단백질의 상대적 발현 수준은 웨스턴 블롯 분석으로도 확인해야 합니다(그림 3). 돌연변이 단백질의 발현 수준은 WT의 발현 수준과 다를 수 있으므로 돌연변이 DNA 벡터의 형질주입된 양이 그에 따라 조정되어야 합니다(보충 표 1).

또한 이 프로토콜의 최적화가 필요할 수 있으며, 특히 대체 플레이트 리더, 세포주 또는 transfection 시약을 사용할 때 더욱 그러하다는 점에 유의해야 합니다. 그림 4A 는 pCMV5-14-3-3ζ-Halo 수용체 플라스미드의 transfection된 양을 늘리고 pCMV5-NanoLuc-CRAF donor의 양을 일정하게 유지하면 투여량에 따라 BRET 신호가 증가하고, 이는 14-3-3-binding 결핍 CRAFSS/AA 돌연변이의 존재에 의해 감소하는 최적화 실험의 예시 결과를 보여줍니다. 그러나 acceptor 대 donor 비율이 너무 높으면 Nano-CRAFWT 에 대한 14-3-3ζ-Halo 결합과 Nano-CRAFSS/AA negative control 간의 신호 차이가 감소하여 Nano-CRAFWT의 결합 포화를 반영할 수 있습니다. 또한, 낮은 표준 오차로 재현 가능한 값을 생성하는 BRET 비율이 달성되면 수용자 대 공여자 비율의 추가 증가는 필요하지 않습니다. 실제로, 이러한 분석의 주요 장점 중 하나는 생리학적 발현 수준에서 단백질의 상호 작용을 측정할 수 있다는 것입니다. 새로운 N-BRET 어세이를 개발할 때 또 다른 중요한 고려 사항은 태그 배치입니다. 그림 4B 는 Nano-CRAFWT 및 Nano-CRAFSS/AA에 대한 14-3-3ζ 결합에 의해 생성된 보정된 BRET 비율에 대해 C-말단에서 14-3-3ζ의 N-말단으로 Halo 태그를 전환하는 효과를 보여줍니다. 이를 위해, 가능한 태그 위치 각각에 대한 DNA 발현 구조를 생성해야 하고(그림 4C), WT 쌍과 결합에 대한 알려진 음성 대조군의 BRET 비율에 미치는 영향을 평가해야 합니다.

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그림 1: 14-3-3 단백질에 의한 RAF 조절. (A) 보존된 14-3-3 도킹 위치가 표시된 RAF 키나아제 도메인 구조 개략도. (B) 14-3-3 단백질에 의한 RAF 조절 모델. (C) C-말단 Halo 태그 수용체에 융합된 14-3-3ζ와 N-말단 나노 공여체에 융합된 CRAF의 상호 작용을 측정하는 N-BRET 분석. 도너에서 수용체로의 에너지 전달은 BRET 신호를 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: CRAF:14-3-3 라이브 셀 BRET 기반 분석을 수행하기 위한 주요 단계. 이 프로토콜에 요약된 5가지 주요 단계에는 세포 seeding, transfection, replating, BRET 신호를 판독하고 Halo- 및 Nano 태그 단백질의 발현 수준을 확인하는 방법이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: CRAF:14-3-3 BRET 기반 분석. 14-3-3ζ-Halo와 Nano-CRAF -WT 또는 -S259A, -S621A 및 -S259A/S621A(SS/AA) 돌연변이 형태와 상호 작용을 비교하는 N-BRET 분석법, 이전에 CRAF:14-3-3 결합25를 손상시키는 것으로 나타났습니다. 14-3-3ζ-Halo(MW: 64kDa.) 및 Nano-CRAF 변이체(MW: 93kDa.)의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 검사했습니다. (A) 표준 편차(SD)를 ± 단일 실험에서 4개의 반복 웰에서 수정된 BRET 판독값. (B) 3개의 독립적인 실험에서 보정된 BRET 판독값을 통합하고 Nano-CRAFWT (100으로 설정) ± SD로 정규화했습니다. 통계적 유의성은 Student's t test(양측, 등분산 가정)에 의해 계산되었습니다. 피<0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 분석 최적화 단계. BRET 신호 ± SD에 대한 일정량의 Nano-CRAF -WT 또는 -SS/AA(S259A/S621A)와 증가하는 (A) 14-3-3ζ-Halo 또는 (B) Halo-14-3-3ζ의 동시 형질주입의 효과. (C) 관심 단백질(A 및 B)의 N-말단 또는 C-말단에 Halo 또는 Nano 태그를 배치하여 생성된 모든 가능한 N-BRET 쌍의 개략도. n = 4입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: CRAF:14-3-3 BRET 기반 분석의 예제 데이터. 지시된 발현 구조체는 2일차(상단 절편)에 세포로 transfection되었습니다. 원시, 수정 및 정규화된 BRET 판독값은 4일차(하단 섹션)에 측정 및 계산되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이전 연구에 따르면 14-3-3 단백질은 RAF 키나아제의 활성화와 억제 모두에 중요한 역할을 합니다. 이러한 결합 이벤트가 어떻게 조절되는지, 그리고 이러한 상호작용을 조절하는 것이 RAF 신호전달 및 RAF 주도 종양발생에 미치는 영향을 이해하면 CRAF 기능을 표적으로 하는 새로운 치료 취약성을 발견할 수 있습니다. 그러나, Raf 활성화 주기는 과다한 관련 단백질, 번역 후 변형(posttranslational modification) 및 세포 내 국소화(subcellular localization)의 변화에 의해 지원되므로8, 따라서 이러한 조건을 완전히 재현하기 위해서는 RAF와 그 조절인자의 상호작용을 살아있는 세포 조건에서 측정해야 한다. 이 프로토콜은 살아있는 세포에서 14-3-3ζ 및 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위해 nanoluciferase-Halo N-BRET 쌍의 우수한 신호 대 잡음 비율 및 스펙트럼 분해능을 활용하는 새로운 근접 기반 분석을 설명합니다.

이 분석은 생리학적으로 관련된 조건에서 14-3-3 및 CRAF의 복잡한 상호 작용을 연구하는 데 매우 필요한 플랫폼을 제공하지만 고려해야 할 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 14-3-3이 RAF 자가억제 및 이합체화8 모두에서 역할을 하는 것으로 나타남을 감안할 때, 이러한 상태를 구별하기 위해 추가 제어 및 실험적 접근법이 통합될 수 있습니다. 예를 들어, 이 분석은 RAF 자가억제12,22의 변화를 직접 판독하는 이전에 개발된 N-BRET 자가억제 분석과 함께 수행할 수 있습니다. 더욱이, 다른 RAF 프로토머(15,26)와의 CRAF의 이합체화를 방해하는 것으로 나타난 CRAF R401H 돌연변이와 같은 대조군도 이러한 기능을 해부하는데 유용한 것으로 입증될 수 있다. 마지막으로, Halo 및 Nano 태그의 배치는 CRAF:14-3-3 상호 작용을 측정하는 데 최적화되어 있지만 CRAF 또는 14-3-3과 다른 단백질의 상호 작용이 결과적으로 영향을 받지 않는다고 보장할 수 없으며, 이 분석은 CRAF:14-3-3 결합의 친화도, 이러한 상호 작용이 CRAF 활성에 미치는 영향 또는 이러한 상호 작용이 발생하는 세포 내 위치를 결정할 수 없습니다. 따라서, in vitro binding assay, CRAF kinase assay 및 subcellular localization studies 12,27,28,29와 같은 다른 보완적 접근법을 통합하는 것이 또한 필요할 수 있다.

이 분석 또는 실제로 N-BRET 기반 분석을 수행할 때 고려해야 할 여러 가지 요소가 있습니다. 이 원고와 이전 연구22에서 볼 수 있듯이, POI의 결합을 방해하는 것으로 알려진 돌연변이와 같은 적절한 음성 대조군과 함께 pCMV5-Halo(수용체) 및 pCMV5-Nanoluciferas제(공여체) 구성물의 올바른 transfection 비율은 이러한 분석을 최적화하고 테스트하는 데 중요합니다. Nano 태그가 지정된 POI의 수준을 일정하게 유지하면서 Halo 태그가 지정된 POI의 발현을 늘리면 BRET 비율이 증가합니다. 그러나 결합이 포화되면 신호가 평준화되고 WT와 결합 손상 POI 사이의 델타가 감소하여 수용체-공여체 최적화가 필요합니다. 분석 최적화의 또 다른 중요한 요소는 pCDNA3.1과 같은 빈 벡터 캐리어 DNA를 사용하는 것입니다. 200ng의 pCDNA3.1 포함. transfection 혼합물에서 Halo- 및 Nano- 태그된 POI의 발현 수준을 크게 증가시키고 복제 웰과 실험22 사이의 변동성을 감소시킨다. 그러나, transfection 효율이 시약과 세포주 간에 다를 수 있다는 점을 감안할 때, 앞서 설명한 바와 같이 N-BRET 쌍의 최적 발현을 달성하기 위해 carrier DNA의 양도 적정해야 할 수도 있습니다22. BRET 비율에 큰 영향을 미치는 또 다른 요소는 태그 배치입니다. 실제로, 어떤 POI가 Halo 태그와 Nano 태그에 융합되는지, 그리고 이 태그가 단백질의 N- 또는 C-말단에 배치되는지 여부는 BRET 비율의 진폭과 이 신호를 줄이는 음성 대조군의 능력에 모두 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 새로운 분석을 개발할 때 가능한 각 N-BRET 쌍을 테스트하는 것도 중요합니다.

기존 BRET에 비해 N-BRET가 달성한 향상된 감도 및 스펙트럼 분해능은 살아있는 세포에서 더 약한 상호 작용과 결합의 미묘한 변화를 측정할 수 있습니다. 그러나 세포 신호 이벤트를 연구하기 위한 이러한 분석의 유용성은 완전히 실현되지 않았습니다. 특히, 이 분석은 14-3-3과 동료 RAF 키나아제 ARAF 및 BRAF와 같은 다른 키나아제의 상호 작용을 연구하는 데 적합할 수 있으며, RAS:RAF 결합 및 RAF 자가억제22,30을 연구하기 위해 이전에 발표된 N-BRET 분석과 결합할 때 라이브 셀 조건에서 RAF 조절을 측정하기 위한 도구 키트의 기초를 형성할 것입니다. 또한, N-BRET는 생세포 약물 스크리닝 플랫폼(30)으로서의 가능성을 보여주었으며, 따라서 이 분석은 14-3-3 및 RAF의 상호 작용으로 억제제를 안정화시키거나 RAF 활성화에 관여하는 화합물을 방해하는 화합물을 식별하는 데에도 유용할 수 있습니다. 나노루시페라아제 신호의 높은 안정성과 수용체 및 공여체 방출을 동시에 검출할 수 있는 최신 플레이트 리더의 능력을 감안할 때, 이러한 분석법은 신호 단백질의 상호 작용을 실시간으로 측정하는 데 적용할 수 있으며, 이는 업스트림 자극 또는 약물 치료에 대한 반응으로 이러한 상호 작용의 역학을 이해하는 데 중요합니다.

공개 사항

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감사의 글

이 프로젝트는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립암연구소(National Cancer Institute, National Institutes of Health)의 연방 기금으로 일부 자금을 지원받았으며, 프로젝트 번호는 ZIA BC 010329입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강한>항체 
HaloTag® 마우스 단클론 항체PromegaG9211 면역블롯에 의한 HaloTag 태그  단백질 검출용 항체
NanoLuc® 마우스 단클론 항체R& D SystemsMAB10026에 의한 나노 태그 단백질을 검출하기 위한 항체
 Santa Crus Biotechnologysc-7267에 의해 CRAF 단백질을 직접 감지
2차 HRP 접합 마우스 항체(양에서 추출)
시약
X-tremeGENE™ 9Roche/Sigma6365809001
NanoBRET; 키트 프로메가N1661 Halo 618 리간드와 NanoGlo (나노루시페라제) 기질을 포함하는 NanoBRET 키트 
DPBS, Ca++ 및 Mg++ 없음 품질 생물학제 114-057-101
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드 Life Technologies25300120
DMEM 세포 배양 매체Life Technologies11995073High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium  pyruvate; without HEPES, 10% FBS, 2 mM L-glutamine 및 100U penicillin-streptomycin
L-Glutamine (200 mM)이 함유된 공급 매체   Life Technologies25030164
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) 라이프 테크놀로지   
Opti-MEM & 무역; 나는 혈청 매체를 줄였습니다 Gibco31985062세포 transfection 
Opti-MEM 감소 혈청 배지, 페놀 레드없음 Gibco110580213일차 세포 재생용. 2 mM L-글루타민과 100U 페니실린-스트렙토마이신을 보충하며, 10% FBS와 함께 (표시된 경우)을
Invitrogen Trypan 블루 스테인 써모 사이언티픽 T10282 
NP40 용해 완충액 N/A N/A20 mM 트리스 (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% 글리세롤,  NP40 대안(Milipore, Cat# 492016). 4°C에서 보관하십시오. 사용 직전에 다음의 프로테아제와 포스파타아제를 첨가하십시오: 20 µ M 류펩틴, 0.5mM 오르토바니데이트나트륨, 0.15U/mL, 1mM PMSF.
5x 겔 샘플 버퍼N/AN/A240mM 트리스(pH 8.0), 9.5% SDS, 30% 글리세롤, 500mM DTT, 3mM 브로모페놀 블루. -20°C에서 보관하십시오. 
<강>세포주 
293FT 세포 (인간)Thermo Scientific R70007 
DNA 벡터 
pCMV5-Nano-CRAF WT 및 돌연변이 해당 사항없음
pCMV5-14-3-3ζ-Halo   N/AN/A
Equipment
EnVision 2104 멀티모드 플레이트 리더PerkinElmer 21042104-0010 600LP 나노브렛 및 M460/50nm NanoBRET 이미터 필터,  발광 404 거울, 6.5mm 측정 높이 및 0.1초 측정 시간
Invitrogen Countess™ II 자동 세포 계수기 써모 사이언티픽AMQAX1000 
써모피셔 E1-ClipTip™   멀티채널  피펫터 써모 사이언티픽   4672070
Software
GraphPad Prism (버전 10.0.3) 그래프패드 www.graphpad.com
other 
ThermoFisher ClipTip 멀티채널 피펫 팁 써모 사이언티픽 
시약 저장소, 25 mL 분할, 멸균 토마스 사이언티픽1228K16
퍼킨 엘머 384-웰 CulturPlate™PerkinElmer6007680화이트, 폴리스티렌, 조직 배양 처리 
Countess 세포 계수 챔버 슬라이드Thermo Scientific C10228
immunoblot CRAF 마우스 단클론 항체(E10) 항체는 면역블롯 ECL 안티-마우스 HRP 보조 항체 Amersham NA931-1ML ;15140163 첨가하십시오.94410153

참고문헌

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BRETCRAF 14 3 3RAFRAS MAPHalo
살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석
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