여기에서는 쥐 교근에서 체적 근육 손실(VML) 손상을 외과적으로 생성하기 위한 프로토콜을 설명하며, 새로운 하이드로겔과 같은 생체 재료를 사용하여 두개안면 근육 손상 및 그 치료 연구를 위한 재현 가능하고 접근 가능한 모델을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
두개안면 용적 근육 손실(VML) 손상은 심각한 외상, 외과적 절제, 염증 및 선천적 또는 기타 후천적 조건의 결과로 발생할 수 있습니다. 두개안면 VML의 치료에는 외과적 기능적 근육 이식이 포함됩니다. 그러나 이러한 절차는 정상적인 기능, 감각 또는 표현을 회복할 수 없으며 더 일반적으로 이러한 상태는 치료되지 않습니다. 두개안면 VML의 동물 모델에서 골격근 재생에 대한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. 이 원고는 두개안면 VML 손상 연구를 위한 쥐 모델과 이러한 부상 치료에서 생체 재료의 조직학적 평가를 위한 프로토콜을 설명합니다. 액체 하이드로겔 및 동결 건조 골격은 외과적 VML 생성 시 적용되며, 교근은 잔류율이 높고 합병증이 무시할 수 있는 최대 12주까지 말기 시점에 절제됩니다. Hematoxylin 및 eosin(HE), Masson의 Trichrome 및 면역조직화학 분석은 골격근 재생, 생체 적합성 및 면역 조절의 매개변수를 평가하는 데 사용됩니다. 히알루론산 기반 하이드로겔에 대한 연구를 시연하는 동안, 이 모델은 VML 부상에서 물질의 후속 반복을 평가하기 위한 수단을 제공합니다.
서론
심각한 외상, 외과적 절제, 염증 및 기타 후천적 상태는 내인성 골격근 복구 메커니즘을 압도하는 정도의 조직 손실을 초래할 수 있습니다. 1차 재생 과정을 촉진하는 상주 세포 및 구조의 손실은 병리학적 리모델링 및 조직 섬유화를 초래할 수 있으며, 이로 인해 장기적으로 기능과 감각의 결핍이 발생할 수 있으며 이를 용적 근육 손실(VML)이라고 합니다1,2,3. VML 손상에 대한 염증 반응은 대식세포, 사이토카인 및 근육 세포를 포함하는 잘 문서화되고 복잡한 메커니즘을 포함하며, 이는 재생 의학에서 많은 이론적 목표를 제시합니다4. 많은 시험관 내 연구가 사지 VML 치료의 동물 모델에서 이러한 표적을 활용했지만, 두개안면 VML 5,6,7의 동물 모델에서 골격근 재생에 대한 연구는 부족합니다.
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프로토콜
이 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드에 설명된 권장 사항 준수를 포함하여 모든 해당 규정에 따라 수행되었습니다. UCSF 기관 동물 관리 및 사용 프로그램은 모든 동물 절차 및 수술 후 관리를 승인했습니다(IACUC 프로토콜 #AN195944-01).
1. VML 수술
- 생후 12주령에 체중이 276-300g인 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 무균 수술 분야로 옮기기 전에 1%-5%의 비율로 이소플루오란 전신 마취를 사용하여 밀봉된 용기에 마취합니다.
- 설치류를 왼쪽에 위치시켜 목이 중립 위치로 확장되고 코가 마취제 노즈콘에 끼워져 얼굴의 오른쪽에 노출되도록 합니다.
- 인덕션에서 유지 유속까지 테이퍼 이소플루오란 유속(약 2%).
- 설치류의 눈에 안과 연고를 바르십시오.
- 제모 크림을 사용하여 입의 오른쪽 모서리, 오른쪽 귀 아래쪽의 아래쪽 하악 각도 사이에 선으로 둘러싸인 수술 부위를 청소합니다.
- 에탄올과 베타딘 스크럽을 사용하여 원을 그리며 수술 부위를 여러 번 소독합니다.
참고: 이 프로토콜에서....
- 에탄올과 베타딘 스크럽을 사용하여 원을 그리며 수술 부위를 여러 번 소독합니다.
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결과
생체 재료를 사용한 두개안면 VML 및 조직 재생 평가에 대한 결과에는 양적 및 질적 결과가 모두 포함됩니다.
그림 2 는 앞서 설명한 모델을 사용한 정성적 평가의 예를 보여줍니다. 당사의 하이드로겔 내에서 새로운 근육 섬유 성장에 대한 관찰은 질적으로 긍정적인 결과이며(그림 2A) 생체 재료가 충분한 구조적 지원과 성장 인자 또는 영양소 전달을 제공할 수 있음을 시사합니다. 상처 부위 내 하이드로겔의 잔류(그림 2B)는 HE 염색에서 볼 수 있습니다. HE(그림 2C) 및 Masson의 트리크롬(그림 2D)을 사용한 혈관 식별과 같은 생체 재료 내의 다른 조직에 대한 정성적 평가가 수행될 수 있습니.......
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토론
프로토콜에는 최적의 결과를 얻기 위해 특별한 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 1.4단계는 표재성 교근막에서 피부의 초기 절개 및 둔탁한 분리를 설명합니다. 둔기 절제는 피부를 따라 직접 절단해야 하며, 가위로 밑에 있는 근육과 근막에서 멀어지는 곳을 가리켜 흠집이 나거나 의도치 않게 근막을 통해 창문이 생기는 것을 방지해야 합니다. 표재성 교근의 꼬리 측면은 턱밑 정맥 또는 외부 경동맥에 대한 의도하지 않은 손상을 방지하기 위해 피해야 합니다. 1.5단계와 1.6단계에서는 각각 근막 창과 VML 결함의 생성에 대해 설명합니다. 근막은 절개 부위에서 멀어지는 경향이 있고 너무 크게 절개하면 1.8단계에서 가장자리를 찾기 어려울 수 있으므로 근막 절개가 펀치 생검을 통과하기 위해 필요한 최소한의 크기인지 확인해야 합니다. 다시 말하지만, 근막 아래의 둔기 절개는 펀치 생검이 창 안에 들어갈 수 있을 만큼만 수행되어야 하며 하악골에 수직이 되도록 적절하게 각.......
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공개 사항
저자는 공개할 내용이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 UCSF Yearlong Research Fellowship Program 및 C-Doctor Interdisciplinary Translational Project Program의 지원을 받습니다. 캘리포니아 대학교 샌프란시스코(University of California San Francisco)의 포메란츠 연구소(Pomerantz Lab)와 두개안면 생물학 프로그램(Craniofacial Biology Program)의 회원들에게 감사의 뜻을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| F1.652 Myosin Heavy chain (embryonic) monoclonal 항체 | DSHB | F1.652 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsobed secondary 항체, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Integra 표준 생검 펀치, 일회용 표준 생검 펀치; 5mm, 직경: 0.19인치, 0.5cm | Integra | 12460411 | |
| 장착 매체(DAPI 포함) - 수성, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | |
| 토끼 안티 마우스 IgG H& L(Alexa Fluor 647) 사전 흡착된 | Abcam | ab150127 | |
| Sulfamethoxazole/Trimethoprim 구강 현탁액, 체리 맛, 473mL | Med-Vet International | SKU: RXBAC-SUSP |
참고문헌
- Gilbert-Honick, J., Grayson, W. Vascularized and innervated skeletal muscle tissue engineering. Adv Healthc Mater. 9 (1), 1900626(2020).
- Aguilar, C. A., et al. Multiscale analysis of a regenerative therapy for treatment of volumetric muscle los....
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재인쇄 및 허가
