In Situ Fluorescent cAMP Difference Detector를 사용한 살아있는 세포의 실시간 cAMP 역학

Summary

이 연구에서 제시된 프로토콜은 두 가지 방법을 통해 cAMP를 측정하는 데 있어 cAMP Difference Detector In Situ 의 효과를 보여줍니다. 한 가지 방법은 HEK-293 셀이 있는 96웰 플레이트 판독 분광 광도계를 사용하는 것입니다. 다른 방법은 형광 현미경으로 개별 HASM 세포를 보여줍니다.

Abstract

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis)는 살아있는 세포의 cAMP 수준을 지속적으로 측정할 수 있는 새로운 바이오센서입니다. 바이오센서는 Epac2의 힌지 영역에 연결된 원형 치환 형광 단백질로 만들어집니다. 이것은 cAMP의 결합 시 증가하거나 감소된 형광을 표시하는 단일 형광단 바이오센서를 생성합니다. 바이오센서는 적색 및 녹색 상향 버전뿐만 아니라 녹색 하향 버전, 그리고 세포 내 위치를 대상으로 하는 여러 적색 및 녹색 버전으로 존재합니다. 바이오센서의 효과를 설명하기 위해, cAMP 결합시 형광이 감소하는 녹색 하향 버전이 사용되었습니다. 이 센서를 사용하는 두 가지 프로토콜, 즉 고처리량 스크리닝과 호환되는 96웰 플레이트 판독 분광 광도계를 사용하는 프로토콜과 형광 현미경에서 단일 세포 이미징을 사용하는 프로토콜이 시연됩니다. 플레이트 리더에서 96웰 플레이트에서 배양된 HEK-293 세포를 10μM 포스콜린 또는 10nM 이소프로테레놀로 자극하여 녹색 하향 버전에서 형광의 빠르고 큰 감소를 유도했습니다. 바이오센서는 형광 현미경으로 모니터링한 개별 인간 기도 평활근(HASM) 세포의 cAMP 수준을 측정하는 데 사용되었습니다. 녹색 하향 바이오센서는 포스콜린(forskolin) 또는 이소프로테레놀(isoproterenol)로 자극되었을 때 세포 집단에 유사한 반응을 보였습니다. 이 단일 세포 분석을 통해 20x 및 40x 배율로 바이오센서 위치를 시각화할 수 있습니다. 따라서 이 cAMP 바이오센서는 민감하고 유연하여 불멸화된 세포와 일차 세포 모두에서, 그리고 단일 세포 또는 세포 집단에서 cAMP를 실시간으로 측정할 수 있습니다. 이러한 특성으로 인해 cADDis는 살아있는 세포의 cAMP 신호 역학을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

Introduction

아데노신 3′,5′-고리형 일인산염(cAMP)은 세포 통신 및 다양한 생리적 과정의 조정에서 중심적인 역할을 합니다. cAMP는 호르몬, 신경전달물질 또는 기타 세포외 분자의 외부 신호를 전달하는 두 번째 메신저 역할을 하여 세포 내 사건의 연쇄 반응을 시작합니다¹. 또한 cAMP는 G-단백질 결합 수용체(GPCR) 및 아데닐릴 사이클라제와 관련된 경로를 포함하여 다양한 신호 전달 경로에 복잡하게 관여합니다. 세포 신호 전달에서 cAMP의 역할을 이해하는 것은 정상적인 세포 기능의 기초가 되는 복잡한 메커니즘을 밝히고 광범위한 의학적 상태에 대한 잠재적 치료법을 개발하는 데 필수적입니다².

과거에는 cAMP를 직접 또는 간접적으로 측정하기 위해 다양한 방법이 사용되었습니다. 여기에는 세포 ATP 풀의 방사선 표지와 컬럼 정제, HPLC, 방사성 면역 분석 및 효소 결합 면역 분석이 포함되었습니다 ^1,2. 이러한 레거시 분석은 종말점 측정이라는 사실에 의해 제한되며, 시간 종속 반응을 구성하기 위해 많은 수의 샘플이 필요합니다. 보다 최근에는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 센서가 개발되어 살아있는 세포에서 분석을 생성하여 실시간 동적 데이터를 생성하고 다양한 세포 내 위치에서 센서를 표적으로 할 수 있습니다³. FRET는 2개의 형광단, 1개의 형광 공여체 및 1개의 형광 수용체를 활용하여 근접할 때 수용체 형광단이 공여체 형광 출력에 의해 여기됩니다. 가장 많이 사용되는 두 가지 형광단은 청록색 형광 단백질(CFP)과 황색 형광 단백질(YFP)인데, 이는 두 가지가 서로 호환되는 여기 및 방출 특성을 가지고 있기 때문입니다. CFP 및 YFP 외에도 녹색 형광 단백질(GFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)의 활용은 일반적으로 FRET 바이오센서에 사용됩니다. cAMP FRET 바이오센서는 Epac2 cAMP 결합 단백질의 반대쪽 끝에 공여체와 수용체를 두고 작동합니다. cAMP 결합은 Epac의 확인을 변경하고 donor와 acceptor fluorophores 사이의 거리를 증가시킵니다 ^3,4. 이러한 구조적 변화는 FRET의 손실, 즉 donor fluorophore drops³에서 전달된 에너지에 의한 acceptor fluorophore의 excitation에 의해 감지됩니다. 겉보기에는 간단해 보이지만, cAMP 연구를 위한 FRET 바이오센서에는 많은 한계와 문제가 있다⁵. 그 중 하나는 형광 단백질, 예를 들어 GFP를 선택하는 것인데, 이는 자연적으로 이합체화될 수 있어 감도를 감소시킬 수 있습니다⁶. FRET 기반 cAMP 바이오센서는 특정 마이크로도메인(microdomain)⁷을 대상으로 되어 왔지만, 2개의 형광단(fluorophore)⁶을 가진 구조체의 크기가 크기 때문에 한계가 있을 수 있다. 또 다른 중요한 문제는 형광단의 여기(excitation)와 방출 사이의 중첩으로 인해 발생하는 FRET 신호의 낮은 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)로, 이로 인해 샘플링 빈도가 높아지고 결과 분석이 복잡해진다 ^4,5.

가장 최근에는 새로운 바이오센서(cAMP Difference Detector In Situ)인 cADDis가 cAMP 신호전달 조절을 연구할 때 이러한 한계와 기타 한계를 해결했다⁸. 한 가지 중요한 개선 사항은 단일 형광단에 대한 의존성입니다. 이를 통해 더 넓은 다이내믹 레인지와 높은 신호 대 잡음비로 빠르고 효율적인 신호를 얻을 수 있습니다. 결과적으로⁸을 통해 빗질할 파장 범위가 덜 넓기 때문에 정확도가 더 높을 수 있습니다. FRET 프로브와 마찬가지로 바이오센서는 세포 내 위치를 대상으로 하여 구획화 이론에 대한 연구와 지질 뗏목 및 비뗏목 및 기타 세포 내 영역에서의 탐색을 가능하게 했습니다⁹. 아마도 가장 중요한 것은 고처리량 스크리닝을 위한 단일 형광단 바이오센서의 적합성이며, 이는 FRET 기반 바이오센서에 비해 감도와 재현성이 향상되었습니다. 이 바이오센서는 다양한 세포 유형의 transduction을 쉽게 구현하고 단백질 발현을 정밀하게 제어할 수 있도록 BacMam 벡터로 패키징되어 있습니다.

BacMam 벡터를 통한 발현 제어는 동물 연구의 데이터 해석을 용이하게 하기 위해 다양한 종의 GPCR ortholog를 사용하는 분석에서 특히 유용할 수 있습니다. 또한, 수용체 발현에 대한 제어는 약물 효능의 다양한 정도(예: 역 작용제 및 부분 작용제)를 측정하는 데 중요하며, 낮은 수준의 수용체 발현은 동물 조직에서 발견되는 낮은 수준을 모방하는 데 유용합니다. BacMam은 1차 세포 배양 및 HEK-293 라인¹⁰과 같은 포유류 세포를 transduction하도록 변형된 baculovirus 벡터입니다. 우세한 선택 가능한 마커는 BacMam이 기존 플라스미드 감염에 비해 더 많은 안정성을 제공할 수 있도록 합니다¹¹. 이러한 선택적 프로모터는 보다 효율적인 유전자 전달 및 발현을 가능하게 한다. 또한 트리코스타틴 A(히스톤 탈아세틸화효소 억제제)를 추가하면 리포터 단백질 수치가¹¹ 향상됩니다. 발현 수준은 사용된 BacMam 바이러스의 역가를 통해 제어할 수 있으며 각 세포 유형에 맞게 최적화해야 합니다. 이 바이오센서의 경우, 적색 또는 녹색 형광 단백질이 N- 및 C-말단에서 Epac에 연결됩니다. cAMP가 결합할 때, 바이오센서의 구조적 변화는 형광 단백질에 인접한 아미노산을 이동시킵니다. 이러한 이동은 흡광도를 400nm에서 음이온 상태에서 중성 상태로 이동시켜 형광을 감소시킵니다.

단일 세포에서 발현되는 90-120개의 GPCR이 있으며, 이들은 다양한 신경체액 신호에 반응한다¹². 따라서, 세포당 적어도 수십 개의 GPCR이 각각 Gs 또는 Gi 커플링을 통해 cAMP를 자극하거나 억제할 수 있다는 가설을 세울 수 있다. FRET와 같이 이 두 번째 메신저를 실시간으로 모니터링하는 데 진전이 있었지만 보다 효율적인 방법이 필요합니다. cADDis를 사용하여 실시간으로 cAMP 신호의 합성 및 저하를 모니터링하는 방법론이 여기에 나와 있습니다. 고처리량 분석을 위해 형광 플레이트 리더를 사용하거나 단일 세포 분석을 위해 형광 현미경을 사용하여 형광의 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 이러한 방법은 cAMP를 통한 GPCR 신호전달과 관련된 다양한 생물학적 질문에 유용합니다.

Protocol

연구에 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 플레이트 판독 분광 광도계, 고처리량 분석

1. 96웰 플레이트에서 cADDis BacMam 벡터를 사용하여 HEK-293 세포 파종(1일)
   1. 바이러스 후드에서 세포를 분리하고 감염시킵니다.
      1. 37°C 수조에서 HEK 매체(표 1)와 0.25% 트립신-EDTA를 데웁니다.
      2. 후드와 재료를 EtOH에 적신 티슈로 닦아 소독하십시오.
      3. 혈청학적 피펫을 사용하여 플라스크에서 HEK 매체를 제거하고 폐기합니다.
      4. 혈청학적 피펫으로 Mg²⁺ 및 Ca²⁺ 유리 DPBS(37°C) 5mL를 추가합니다. 플라스크를 앞뒤로 기울여 DPBS로 바닥을 세척합니다. 혈청학적 피펫으로 DPBS를 제거하고 폐기합니다.
      5. 혈청학적 피펫으로 따뜻하게 데워진 0.25% 트립신-EDTA 3mL를 첨가하여 세포를 트립신화합니다. 시약이 플라스크 바닥을 완전히 코팅하도록 플라스크를 기울입니다. 플라스크에 뚜껑을 덮고 세포가 플라스크에서 분리될 수 있도록 시약을 3-5분 동안 그대로 둡니다.
         참고: 이 실험은 75cm² 플라스크에 최적화되어 있습니다. 다른 크기의 배양 장치를 사용하는 경우 시약의 부피를 조정해야 할 수 있습니다.
      6. 항생제가 함유된 신선한 배지 5mL를 그립니다. 플라스크의 부피를 배출하고 당겨 플라스크의 벽을 세척하고 세포를 물리적으로 분리합니다.
      7. 플라스크(8mL)와 원심분리기(25°C)의 총 부피를 15mL 튜브에 넣고 200 x g 에서 5분 동안 수집합니다.
      8. 원심분리 후 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
      9. 펠릿을 방해하지 않고 세포를 세척하려면 15mL 튜브 측면에 Mg²⁺ 및 Ca²⁺ DPBS가 없는 DPBS 500μL를 추가합니다. DPBS를 부드럽게 첨가한 후 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 버퍼를 제거하고 폐기하십시오. 한 번 더 반복합니다.
      10. 세포 수를 세고 250,000 cells/mL cell의 세포 밀도로 조정합니다.
      11. 검은색의 투명한 바닥 96웰 플레이트의 웰당 필요한 시약 부피에 따라 마스터 믹스를 만듭니다. 이를 "조직판"이라고 합니다. 아래 볼륨을 참조하십시오.
          참고: 1웰(총 부피 200 μL)의 예: 바이오센서 BacMam 벡터 40 μL(2 x 10¹⁰ 바이러스 유전자 스톡/mL), 2 μL 트리코스타틴 A(스톡 100 μM, 최종 농도 1 μM), 250,000 cells/mL 세포 밀도의 158 μL. 10웰(총 부피 2mL)의 예: 바이오센서 BacMam 벡터 400μL(2 x 10¹⁰ 바이러스 유전자 스톡/mL), 트리코스타틴 A 20μL(스톡 100μM), 250,000 cells/mL 세포 밀도의 1,580 μL 배지.
      12. 웰당 200μL의 마스터 믹스를 추가합니다. 플레이트 판독 분광 광도계에서 실행하기 전에 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 24 시간 동안 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
2. 플레이트 리더에서 실행
   1. 벤치탑에서 각 웰의 모든 매체를 조심스럽게 제거하고 37°C에서 Mg²⁺ 및 Ca²⁺ 가 포함된 180μL의 DPBS로 교체합니다.
   2. 현미경으로 세포를 검사하여 세포 건강을 확인합니다.
   3. 플레이트를 알루미늄 호일로 싸고 37°C에서 30분-1시간 동안 배양합니다.
   4. 배양하는 동안 원하는 최종 용량에 대해 1:10 희석(10배라고도 함)으로 판독할 수 있도록 약물을 준비합니다. 따라서 100μM 포스콜린과 100nM 이소프로테레놀을 준비합니다.
   5. 각 약물의 60μL를 원주 방식으로 투명한 96웰 플레이트("약물 플레이트"라고 함)에 추가합니다.
      참고: 적절한 약물 희석을 통해 판독을 최적화하기 위해 약물을 "약물 플레이트"라고 하는 투명한 96웰 플레이트에 첨가하여 판독 시 96-멀티 피펫터를 사용하여 "조직 플레이트"로 전송하여 약물을 모든 웰에 동시에 추가하고 형광 분광 광도계로 빠르게 판독할 수 있습니다.
3. 형광 플레이트 리더 설정
   1. 형광판 판독기의 설정을 조정합니다.
      1. 읽기 모드: 형광. 읽기 유형: kinetic. 파장 판독 : 494 nm 및 522 nm.
      2. 판독 시간: 기준선 형광 판독에는 3분 을, 약물 첨가 후에는 7분을 입력합니다." 간격"은 각 읽기 사이에 30초 동안 00:00:30 으로 입력됩니다.
         알림: 읽기 시간은 필요한 시간에 따라 최적화하고 늘릴 수 있습니다.
4. 데이터 수집
   1. 인큐베이터에서 티슈 플레이트를 제거하고 알루미늄 호일과 플레이트 뚜껑을 제거한 다음 티슈 플레이트를 플레이트 리더에 놓습니다. 리더 서랍을 닫아 티슈 플레이트가 휴식을 취하고 리더의 온도(37°C)와 평형을 이룰 수 있도록 합니다.
   2. 약물 희석액이 있는 투명한 96웰 플레이트(약물 플레이트)를 96-멀티 피펫 아래에 놓고 웰에서 20μL를 추출하는 연습을 합니다. 피펫터 팁에 균일한 양의 약물이 당겨져 있는지 확인하십시오.
   3. "기준선" 측정 실행을 시작합니다.
      참고: 40RFU 이상은 실행 가능한 데이터로 간주됩니다. 데이터가 이 값보다 작으면 실험을 중지하고 삭제해야 합니다.
   4. 조직판은 기준선 실행이 끝날 때 리더에서 배출됩니다. 투명 약물 플레이트에서 검은색 조직 플레이트로 20μL를 빠르고 조심스럽게 추가합니다. 그런 다음 "치료" 실행을 빠르게 시작합니다. 약물을 첨가한 후 조직판이 리더에서 30초 이상 떨어져 있지 않아야 합니다.
      참고: 약물을 너무 빨리 첨가하면 세포가 조직판에서 분리되어 사용할 수 없는 실험이 됩니다. 또한, 세포는 빛에 민감한 녹색 형광 단백질에 감염되어 있습니다. 따라서 신속하고 신속하게 약물을 추가하고 두 번째 판독을 시작하는 것은 반응의 초기 부분을 놓치지 않도록 하는 데 필수적입니다.
   5. 두 번째 판독이 완료되면 리더에서 조직판이 배출되고 데이터 수집이 완료되었는지 확인합니다.
      알림: 티슈 플레이트를 폐기하기 전에 세포가 여전히 플레이트에 부착되어 있는지 확인하는 것이 가장 좋습니다. 현미경으로 세포를 관찰합니다. 셀이 분리되면 결과가 유효하지 않으므로 삭제해야 합니다. 실험을 반복해야 합니다.
   6. 결과 데이터를 Excel 파일로 내보냅니다.
   7. 플레이트 리더에서 내보낸 Excel 판독 가능 데이터를 열고 관련 정보를 복사하여 Excel 변환 템플릿에 붙여넣습니다. 데이터는 플레이트 리더 세트에서 단일 웰로 변환되며, 복사된 데이터의 오른쪽에 컬럼 판독값이 표시됩니다.
      참고: 시간이 지남에 따라 형광 열은 RFU(열 변환이라는 제목)와 초기 판독값(t₀ , Delta F)에서 RFU 판독값을 기준으로 한 소수 변화로 나열됩니다. Excel 템플릿에서 Delta F 테이블은 약물 추가 전의 마지막 기준선 판독값으로 설정됩니다. 이것은 6^번째 데이터 수집 지점입니다.
   8. 데이터 변환 후 Delta F에서 데이터를 복사하여 시간 경과에 따른 형광의 붕괴 또는 상대 붕괴로 데이터 분석 소프트웨어에 붙여넣습니다.
   9. 상대 10진수 값에 대해 X-제목을 "시간(s)"으로, Y-제목을 "ΔF/F₀"으로 변경합니다.

2. 도립 형광 현미경을 사용한 단세포 분석

1. 35mm 접시에서 cADDis BacMam 벡터를 사용한 세포 파종(HASM)(1일)
   1. 바이러스 후드에서 세포를 분리하고 감염시킵니다.
      1. 따뜻한 HASM 매체(표 1), 37°C 수조에서 0.25% 트립신-EDTA.
      2. 후드와 재료를 소독하고 EtOH에 적신 티슈로 후드를 닦습니다.
      3. 혈청학적 피펫을 사용하여 플라스크에서 HASM 매체를 제거하고 폐기합니다.
      4. 새로운 혈청학적 피펫으로 Mg²⁺ 및 Ca²⁺ free DPBS(37°C) 5mL를 추가하고 플라스크를 기울여 DPBS로 바닥을 세척합니다.
      5. 혈청학적 피펫으로 따뜻하게 데워진 0.25% 트립신-EDTA 3mL를 첨가하여 세포를 트립신화합니다. 시약이 플라스크 바닥을 완전히 코팅하도록 플라스크를 기울입니다. 세포가 플라스크에서 분리될 수 있도록 시약을 3-5분 동안 그대로 두십시오.
      6. 항생제가 포함된 새 배지 5mL를 뽑고 피펫을 배출하여 플라스크 바닥에서 세포를 제거합니다.
      7. 플라스크(8mL) 원심분리기의 총 부피를 200 x g의 원심분리기 튜브에 5분 동안 수집합니다.
      8. 원심분리 후 혈청학적 피펫으로 상층액을 제거하고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
      9. 펠릿을 방해하지 않고 Mg²⁺ 및 Ca²⁺ DPBS가 없는 500μL의 DPBS를 원심분리기 튜브 측면에 추가합니다. 가능한 한 많은 액체를 제거하고 버리고 한 번 더 반복하십시오.
         참고: 이 실험은 75cm² 플라스크에 최적화되어 있습니다. 다른 크기의 배양 장치를 사용하는 경우 시약의 부피를 조정해야 할 수 있습니다.
      10. 세포 수를 세고 40,000 cells/mL 세포 밀도로 조정합니다.
      11. 35mm 접시의 웰당 필요한 시약 부피에 따라 마스터 믹스를 만듭니다. 아래 볼륨을 참조하십시오.
          참고: 웰 1개(총 부피 500 μL)의 예: 바이오센서 BacMam 벡터 20 μL(2 x 10¹⁰ 바이러스 유전자 스톡/mL), 5 μL 트리코스타틴 A(스톡 100 μM, 최종 농도 1 μM), 40,000 cells/mL 세포 밀도의 500 μL. 4웰의 예(총 부피 2mL): 바이오센서 BacMam 벡터 80μL(바이러스 유전자 스톡/mL), 트리코스타틴 A 20μL(스톡 100μM, 최종 농도 1μM), 2000μL 배지 40,000cells/mL 세포 밀도.
      12. 웰당 500μL의 마스터 믹스를 추가합니다. 실험을 계속하기 전에 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다.
          알림: 세포 번호는 세포주에 따라 다를 수 있습니다. 분석을 위해 셀이 겹치지 않도록 하려면 낮은 셀 번호를 사용합니다.
2. 약리제제 준비(2일차)
   1. 각 웰에서 매체를 조심스럽게 제거하고 37°C에서 Mg²⁺ 및 Ca²⁺ 가 포함된 450μL의 DPBS로 교체합니다.
   2. 플레이트를 알루미늄 호일로 싸고 35mm 디스크를 37°C에서 30분-1시간 동안 배양합니다.
   3. 현미경으로 세포를 검사하여 세포 건강을 확인합니다.
   4. 그 동안, 원하는 최종 농도(1배 이상)보다 높은 판독값 1로그 단위에 대한 약물을 준비합니다. 따라서 100μM 포스콜린과 100nM 이소프로테레놀을 준비합니다.
   5. 로그 용량 역가의 경우 10mM에서 약물을 준비하고 연속 희석을 사용하여 100μM의 포스콜린과 100nM의 이소프로테레놀을 달성합니다.
3. 데이터 수집
   알림: 다음 설정은 형광 도립 현미경에 대한 것입니다. 각 현미경과 함께 제공되는 소프트웨어는 다를 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 사용되는 일반 설정은 여기에 설명되어 있습니다.
   1. 중앙 허브를 켠 다음 도립 형광 현미경을 켭니다.
   2. 캡처에 사용할 소프트웨어를 열고 타임랩스 캡처 옵션을 선택합니다.
   3. 35mm 접시 샘플 홀더를 현미경에 놓습니다.tag이자형.
   4. 대물 렌즈를 x20으로 설정합니다.
   5. 자동 초점을 사용하여 가능한 한 선명한 사진을 얻으십시오. 개별 세포를 찾기 어렵다면 4x 목표에서 시작한 다음 20x 목표로 이동합니다. 현미경에 자동 초점 기능이 없는 경우 수동으로 샘플의 초점을 맞춥니다.
      참고: 40배의 배율은 더 중요한 세포 형태학적 세부 정보가 필요한 경우 사용할 수 있습니다.
   6. 최적의 데이터 수집을 위해 다음 설정을 조정하십시오: Auto Brightness (노출), Excitation Wavelength, Black Balance (배경 소음 감소), Auto Focus.
   7. 여러 세포질 형광 셀이 있는 시야 영역을 찾은 후 30초마다 20분 동안 타임랩스 캡처를 사용하여 데이터를 획득합니다.
   8. 읽기를 시작하려면 이동 을 클릭하십시오.
   9. 기준선을 수집하기 위해 3분 동안 실행합니다. 3분 캡처가 완료되자마자 약물의 50μL를 적절한 웰에 부드럽게 추가합니다. 약물이 첨가되면 접시의 최종 농도는 10μM 포스콜린과 10nM의 이소프로테레놀입니다.
      참고: 약물을 신중하게 추가해야 합니다. 피펫 팁으로 플레이트를 만지지 마십시오., 이렇게 하면 만들어진 시야가 이동하고 샘플을 분석할 수 없게 될 수 있습니다.
   10. 30초마다 데이터를 캡처하여 17분 더 실행하도록 실험을 그대로 둡니다.
   11. 테스트가 완료되면 데이터를 분석할 준비가 되었는지 확인합니다.
       알림: 현재 프로토콜에는 초점 드리프트에 대한 컨트롤이 포함되어 있지 않지만 실험에 하나를 포함하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 핵 염료를 사용하면 현미경 분석 중, 특히 장기간에 걸쳐 살아있는 세포의 이미지를 캡처할 때 초점 드리프트를 관리하는 데 도움이 될 수 있습니다. cADDis 바이오센서는 일반적으로 세포 내에 광범위하게 분포되어 있어 넓은 초점면을 가장 효과적으로 포착하고 초점 드리프트를 제어할 필요성을 줄여^{줍니다 9}.
4. 데이터 분석
   참고: 각 현미경과 함께 제공되는 소프트웨어는 다를 수 있으므로 캡처된 이미지를 분석하는 데 사용해야 하는 일반 설정이 여기에 설명되어 있습니다.
   1. 실험 중에 캡처된 이미지 파일을 엽니다.
   2. 다각형 또는 원 도구를 사용하여 분석을 수행할 각 셀의 관심 영역을 선택합니다. 분석은 각 시점에서 각 셀의 밝기를 제공해야 합니다.
      알림: 가장 좋은 방법은 접시 벽이나 다른 셀에 닿는 셀이 아닌 개별 셀을 선택하는 것입니다. 이렇게 하면 최상의 데이터 수집이 보장됩니다. 각 조건 내에서 분석할 세포를 최소 5개 이상 선택하고 실험을 3회 이상 반복합니다.
   3. 데이터를 분석한 후 엑셀 시트에서 데이터를 열고 약리제나 차량을 첨가하기 직전의 그림부터 시작하여 각 사진의 각 조건에 대한 평균 밝기를 계산합니다. 이 예에서는 3분 표시 또는 현미경으로 촬영한 6^번째 사진에서 각 사진이 30초마다 촬영되기 때문입니다.
   4. 각 조건의 각 평균값에 대해 ΔF/F₀ 을 계산합니다.
   5. 통계 분석 소프트웨어에 불러오고 s의 시간에 대해 ΔF/F₀ 을 플로팅합니다.
      참고: 그림 1 은 프로토콜의 주요 단계에 대한 개략적인 개요를 제공합니다.

Results

본 연구는 플레이트 리더와 현미경 분석 모두에서 세포질 바이오센서를 검증했습니다. 세포가 바이오센서를 발현하면 10μM 포스콜린(아데닐릴 사이클라아제의 직접 활성제), 10nM 이소프로테레놀(ß₁AR 및 ß₂AR의 작용제) 또는 비히클로 자극했습니다(그림 1). cAMP 생성을 나타내는 형광의 후속 변화는 30초마다 캡처되었습니다.

데이터는 초기 형광(ΔF/F₀)에서 형광의 변화로 변환되었습니다. 다양한 조건에서 cAMP 수준의 시간적 변화를 정량화하기 위해 단일 사이트 붕괴 모델을 형광 데이터에 적용했습니다(그림 2 및 그림 3). 이러한 붕괴 곡선의 매개변수는 주어진 약물 농도에 대한 반응을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 약물 반응을 정량화하는 단일 값인 붕괴율(k)과 고원의 곱을 사용하였으며, 이를 사용하여 동일한 약물의 농도를 여러 번 가할 때 농도-반응 곡선을 생성하였다¹³.

플레이트 리더에서 10μM 포스콜린으로 자극한 결과, 세포질 센서는 몇 초 내에 형광 강도가 크게 감소했으며 HEK-293 세포에서 몇 분에 걸쳐 진행되었습니다(200초에서 기준선 0 ΔF/F_o에서 600초에서 -0.7 ΔF/F_o까지). 녹색 센서의 디자인을 감안할 때, 형광의 감소는 cAMP 생산의 증가를 나타내며, 이는 포스콜린이 세포질의 cAMP 농도를 균일하게 증가시켰다는 것을 나타냅니다. 최대 이하의 농도인 이소프로테레놀(10nM)로 HEK-293 세포를 자극하면 바이오센서 형광이 빠르지만 더 작게 감소했습니다(600초에서 -0.3 ΔF/F_o, 그림 2A). 이러한 낮은 농도의 이소프로테레놀(10nM 및 100nM)을 시간이 지남에 따라 단일 세포 웰에서 검사했을 때 HEK-293 세포에서 cAMP 수준의 진동이 관찰되었습니다(그림 2B). 이러한 진동의 주기성은 일관되게 약 200초였습니다. 일상적인 데이터 분석에는 이러한 진동을 평균화하는 단일 사이트 붕괴 모델에 응답을 맞추는 것이 포함됩니다(연결선 참조). 여러 실험을 함께 평균화하면 일반적으로 이러한 진동이 데이터에서 모호해집니다. 그럼에도 불구하고 바이오센서는 cAMP 진동을 관찰할 수 있는 감도와 빠른 동역학을 표시합니다.

cADDis는 형광 현미경을 사용하여 측정할 수도 있습니다. 이 접근 방식을 통해 단일 세포에서 cAMP를 모니터링할 수 있으며 다양한 세포 내 위치를 대상으로 하는 바이오센서를 시각화하도록 조정할 수도 있습니다. 본 연구에서 바이오센서는 일차 인간 기도 평활근(HASM) 세포에 사용되었습니다. 비히클, 10μM 포스콜린 또는 10nM 이소프로테레놀로 HASM을 자극하면 시간이 지남에 따라 형광 강도가 눈에 띄게 감소합니다(120초에서 기준선 0ΔF/F_o 에서 410초에서 -0.9ΔF/F_o까지)(그림 3)(비디오 1, 비디오 2 및 비디오 3). 형광은 세포의 세포질 전체에 고르게 분포되어 있으며 핵을 제외합니다(타임랩스 비디오 참조). 따라서, forskolin와 isoproterenol는 형광 HASM 세포에 있는 유사한 급속하고 상당한 감소를 일으켰다. 이 데이터는 1차 세포 배양에서 바이오센서를 사용할 수 있는 능력을 보여줍니다.

그림 1: 바이오센서 프로토콜 단계의 개략도. 처음에는 배양 세포를 분리하여 새로운 배지로 재현탁한 다음 cADDis 센서를 운반하는 BacMam 바이러스에 감염시킵니다. transfection 후 세포는 cAMP를 변경하는 세포 경로를 유발하는 약리학적 물질로 자극됩니다. 다양한 cAMP 농도에 대한 반응으로 형광 강도의 변화는 플레이트 판독 분광 광도계(A) 또는 형광 현미경(B)을 사용하여 캡처되어 cAMP 역학의 실시간 정량화를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 플레이트 판독 분광 광도계에서 살아있는 HEK-293 세포의 cAMP를 실시간으로 모니터링합니다. 바이오센서를 발현하는 96웰 플레이트에서 HEK-293 세포의 형광은 시간이 지남에 따라 측정되었습니다. 기준선 형광이 확립된 후, 형광 붕괴를 7분 동안 모니터링했습니다. (A) 10μM 포스콜린 또는 10nM의 이소프로테레놀을 첨가한 후의 형광 붕괴는 10-15회 실험의 평균 ± SEM으로 표시됩니다. (B) 형광 붕괴 진동은 10nM 또는 100nM의 이소프로테레놀을 첨가한 후 단일 실험을 플로팅하여 표시됩니다. 두 그래프의 데이터는 단일 사이트 붕괴 모델(연결선)에 적합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 형광 현미경에서 살아있는 HASM 세포의 cAMP를 실시간으로 모니터링. 바이오센서를 발현하는 도금된 35mm 접시에서 HASM 세포의 형광은 시간이 지남에 따라 측정되었습니다. 기준선 값이 설정된 후 20분 동안 30초마다 형광 붕괴를 측정했습니다. 표시된 에이전트는 120초(화살표)에 추가되었습니다. 바이오센서 형광 붕괴는 비히클, 10μM 포스콜린 또는 10nM 이소프로테레놀에 반응하여 곡선을 이룹니다. 단일 실험의 데이터는 연결선으로 표시됩니다. 비히클(대조군), 포스콜린 또는 이소프로테레놀로 처리된 세포의 타임랩스 비디오가 포함되어 바이오센서의 형광 반응을 시각적으로 표현합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: 차량에 대한 반응으로 라이브 HASM 셀에서 cAMP를 실시간으로 모니터링하는 타임랩스 비디오. 차량에 반응하는 바이오센서의 형광 붕괴 곡선(제어). 각 프레임은 20분 동안 30초마다 캡처되었습니다. 척도 막대: 40 μM. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2: 10μM 포스콜린에 대한 반응으로 라이브 HASM 세포에서 cAMP의 실시간 모니터링에 대한 타임랩스 비디오. 10 μM 포스콜린에 대한 반응으로 바이오센서의 형광 붕괴 곡선. 각 프레임은 20분 동안 30초마다 캡처되었습니다. 척도 막대: 40 μM. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 3: 10nM 이소프로테레놀에 대한 반응으로 라이브 HASM 세포에서 cAMP를 실시간으로 모니터링하는 타임랩스 비디오. 10 nM 이소프로테레놀에 반응하는 바이오센서의 형광 붕괴 곡선. 각 프레임은 20분 동안 30초마다 캡처되었습니다. 척도 막대: 40 μM. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

매체 제형
HASM 매체
이름	음량
햄스 F-12K	419.65 밀리리터
증권 시세 표시기	50mL
헤페스(1M)	12.5 mL
수산화나트륨 용액	6mL
L-글루타민 200 mM (100X)	5mL
염화칼슘(1M)	0.850 mL
항생제-항진균제(100X)	5mL
프리모신	1mL
HEK 매체
이름	음량
드멤 (1x)	444mL
증권 시세 표시기	50mL
항생제-항진균제(100X)	5mL
프리모신	1mL

표 1: HASM 배지 및 HEK 배지의 매체 제형.

Discussion

cAMP의 정확하고 감도 높은 측정은 다양한 세포 과정에서 cAMP의 역할을 이해하고 cAMP 의존성 신호 경로의 활성을 연구하는 데 매우 중요합니다. ELISA, 방사성 면역 분석법, FRET 바이오센서 및 GloSensor cAMP 분석 14,15,16,17,18을 포함하여 cAMP 수준을 측정하는 데 일반적으로 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다. 각 cAMP 분석에는 강점과 약점이 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 포스포디에스테라아제 억제제를 포함할 필요 없이 몇 분에서 몇 시간에 이르는 실시간 감지 및 모니터링과 살아있는 세포 내 cAMP 역학 측정이 가능합니다. 이 후자의 요점은 cAMP 신호전달을 조절하는 포스포디에스테라아제 동형의 역할을 연구하는 데 관심이 있는 연구자들에게 매우 중요하다¹⁹. 바이오센서는 cAMP 결합 시 형광을 감소시키는 녹색 형광단, cAMP 결합 시 증가된 형광을 나타내는 적색 형광단, cAMP 결합 시 증가된 형광을 나타내는 녹색 형광단과 같은 여러 버전으로 상업적으로 이용 가능합니다(재료 표 참조). 바이오센서의 하향 버전은 주요 제한 요인이 바이오센서의 발현 수준이기 때문에 가장 유용하며, 이 버전은 실험을 시작하기 전에 기준선에서 최대 형광을 표시하여 최대 cAMP 자극을 추가하여 바이오센서 발현을 평가할 필요성을 완화합니다. 이 바이오센서는 멤브레인 마이크로도메인(membrane microdomains), 일차 섬모(primary cilia) 또는 핵(nucleus)을 대상으로 하는 버전으로도 제공됩니다. 이러한 다양한 버전을 통해 동일한 세포 내의 세포질 및 막/섬모 구획에서 동시에 cAMP를 측정할 수 있습니다. 이 새로운 도구는 다양한 세포 구성 요소에 걸친 cAMP 역학의 시각화 및 정량화에 매우 능숙하며, 이는 빠르게 발전하고 중요한 연구 영역입니다²⁰.

이 바이오센서는 실시간 cAMP 역학을 효과적으로 모니터링할 수 있는 간단한 방법을 제공하여 연구원들이 탁월한 시간적 분해능으로 cAMP 수준의 급격한 변화를 관찰할 수 있도록 합니다. 바이오센서의 주요 강점 중 하나는 높은 감도에 있으며, 이를 통해 cAMP 농도⁸의 미묘한 변화와 중요한 변화를 모두 감지할 수 있습니다. cAMP 진동에서 이러한 예는 포스포디에스테라아제 억제제가 존재하지 않는 HEK-293 세포의 낮은 수준의 이소프로테레놀 자극에서 관찰됩니다(그림 2B). 이러한 진동 거동은 이해되지 않으며 이러한 세포에만 고유한 것으로 보이지만 바이오센서의 감도와 빠른 동역학으로 인해 검출이 가능합니다. 그러나, 바이오센서는 쉽게 포화될 수 있으므로, 이 바이오센서는 중형 및 대형 cAMP 신호 사이의 차이를 정량화하는 데 제한될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 이러한 제한 특징은 수용체 자극이 또한 존재할 때 cAMP 수준의 전반적인 증가를 유발하는 포스포디에스테라아제 억제제를 사용할 때 특히 관련이 있습니다. 이 연구에서는 HASM의 감염을 제시하지만, BacMam 벡터를 사용하여 일차 세포를 감염시키는 것과 관련된 문제를 인식하는 것이 중요합니다. 조건은 바이오센서의 충분한 발현을 달성하기 위해 개별 세포 유형에 맞게 최적화되어야 합니다. 그럼에도 불구하고 바이오센서의 감도와 확장성은 고처리량 분석에 매우 적합합니다.

FRET 기반 센서에 비해 이 바이오센서를 사용하는 또 다른 개선 사항은 광표백의 최소화입니다. 많은 형광 바이오센서는 장시간 반복적인 여기 후에 광표백이 발생합니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 30초 간격으로 배치된 단기간 여기(excitation)가 포함됩니다. 또한 바이오센서는 매우 밝기 때문에 이러한 유형의 분석에서 잠재적인 광표백을 제한합니다. 광표백은 드리프트로 읽히는 초기 기준선 동안 관찰됩니다. 기준선 드리프트가 발생하는 경우 곡선을 피팅하기 전에 데이터에서 드리프트 기준선을 빼거나 샘플링 간격을 늘려 여기 빈도를 줄일 수 있습니다.

다른 cAMP 바이오센서와 마찬가지로, 이 바이오센서는 cAMP에 결합하기 위한 높은 특이성을 가지고 있습니다. 결과적으로, 이 분석에서 생성된 신호는 cAMP 수준과 직접적인 상관 관계가 있어 다른 세포 구성 요소의 잠재적 간섭을 크게 줄이고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다. 또한 바이오센서의 다양성은 강조할 가치가 있습니다. GloSensor 분석은 이 분야에서 널리 사용되지만 특정 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 일시적인 transfection에 의존하면 특정 세포 유형에서 비효율성이 발생할 수 있으며, 동일한 세포 내에서 여러 파라미터 또는 프로세스를 분석하는 것은 어려운 일입니다. 또한 이 분석은 특정 화합물의 영향을 받을 수 있는 루시페라아제 효소에 의존하여 잠재적으로 결과 정확도를 저하시킬 수 있습니다²¹. 다른 한편으로, 바이오센서는 부착 및 부유 세포를 포함한 다양한 세포 유형 및 실험 시스템에 사용될 수 있습니다. 다양한 세포 맥락과의 호환성을 통해 연구원은 다양한 생물학적 시스템 22,23,24에 걸쳐 cAMP 역학을 조사할 수 있습니다. 이 바이오센서 분석과 형광 현미경 검사의 통합은 세포 형태학적 정보도 수집할 수 있기 때문에 유용성을 더욱 향상시킵니다 25,26,27.

이 분석은 연구자에게 실험 설계에 뛰어난 유연성을 제공하여 cAMP 신호와 관련된 광범위한 조사를 가능하게 합니다. 이는 기초 cAMP 수치 측정, 다양한 자극 또는 치료에 대한 반응으로 cAMP 변동 연구, 다양한 생리학적 또는 병리학적 조건에서 cAMP 역학 탐색을 허용하는 다양한 목적을 제공합니다. 이 분석의 주요 강점 중 하나는 다른 기법과의 호환성으로, 이를 통해 cAMP 신호전달에 대한 보다 포괄적인 이해를 할 수 있습니다. 바이오센서를 면역형광 염색 또는 유전자 조작(genetic manipulation)¹⁰과 같은 방법과 결합함으로써, 연구자들은 특정 세포 구획 또는 신호 전달 경로 내에서 cAMP의 정확한 공간적 및 시간적 조절에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 통합을 통해 연구자들은 다양한 맥락에서 cAMP의 다양한 기능을 조사할 수 있으며, 이를 통해 cAMP 매개 세포 과정의 복잡성에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이러한 기술을 사용하면 연구원은 개별 세포와 집단 수준 모두에서 cAMP 수준을 시각화하고 정량화할 수 있으므로 cAMP 풀 식별을 포함하여 세포 내 분포에 대한 포괄적인 이해를 제공할 수 있습니다. 결과적으로 이러한 방법의 조합을 통해 정확한 데이터를 획득할 수 있어 cAMP 신호에 대한 지식에 크게 기여합니다.

전통적인 방법이 cAMP 분석에 유용했지만 cADDis의 도입은 이 분야에서 유망한 발전을 나타냅니다. 특이성, 감도 및 실시간 기능은 특히 살아있는 세포와의 호환성으로 인해 연구자의 툴킷에 귀중한 추가 기능이 됩니다. cAMP 수준을 실시간으로 모니터링할 수 있는 능력과 높은 감도를 갖춘 이 바이오센서는 다양한 실험 환경에서 상당한 이점을 제공합니다. 이러한 진전은 cAMP 신호전달의 동적 특성과 생리학적 및 병리학적 과정 모두에서 기능적 의미에 대한 더 깊은 이해에 기여합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fisherbrand		21-377-203
35 mm 접시	Greiner Bio-One	627870	가 있는 세포 배양 접시
	Corning	3904	Black with clear flat bottom
항생제-항진균제(100x)	Gibco	15240062	HEK 및 HASM 매체용
BZ-X 형광 현미경	Keyence
염화칼슘(IM)	Quality Biological Inc	E506	HASM 매체용
원심분리기 튜브(15mL)	Thermo Scientific	339651
DMEM( 1x)	Gibco	11965092	HEK 미디어
DPBS 및 Mg2+ 및 Ca2+	Gibco	14040-133
DPBS Mg2+ 및 Ca2+	Corning	14040-133
소 태아 혈청(FBS)	R& D 시스템	S11195	HEK 및 HASM 매체용
Forskolin	Millipore	344270	약물
그린 다운 cADDis cAMP 분석 키트	몬타나 분자	#D0200G	시약
햄의 F-12K	Gibco	21127022	HASM 배지용
HEPES (1M)	Gibco	15630080	HASM 배지용
Isoproterenol	Sigma	I6504	약물
L-글루타민 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	HASM 배지용
마이크로 원심분리기 튜브 (2 mL)	Eppendorf	22363352
Primocin	Invitrogen	ant-pm-1	HASM 매체 용 항생제
RNAse away	Thermo Scientific	700511	시약
수산화 나트륨 용액	Sigma	S2770	HASM 매체
용 Spectrmax M5 플레이트 리더	분자 장치
Trichostatin A	TCI America	T2477	시약
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	시약