반자동 8팔 방사형 미로에서 마우스를 위한 식욕을 유발하는 공간 작업 기억 작업, 미로에서 두려운 기억 연관성 감소

요약

설치류에 대한 대부분의 행동 실험은 원래 쥐를 위해 고안되었습니다. 쥐와 생쥐의 행동 차이로 인해 때때로 생쥐에 대한 수정이 필요합니다. 우리는 생쥐의 공간 작업 기억을 테스트하여 작업 기억 작업 중 스트레스를 최소화하는 방법을 제시합니다.

초록

이 방법 논문은 반자동 방사형 8팔 미로(RAM)를 사용하여 마우스의 공간 작업 기억을 테스트하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. RAM은 중앙 허브에서 방사되는 8개의 수평 동일 간격의 암이 있는 부분적으로 밀폐된 장치로, 서보 제어 전동 도어로 각 암에 대한 액세스를 개별적으로 제어할 수 있습니다. 동물은 중앙 허브에서 시작하여 각 팔 또는 선택한 팔 끝에서 음식 보상을 위해 미로를 탐험할 수 있습니다. RAM 작업은 원래 쥐를 위해 설계되었지만 예를 들어 더 많은 습관화 단계를 포함하여 생쥐에 대한 프로토콜을 조정했습니다. 우리 프로토콜에서 모든 팔은 처음에 가당 연유로 미끼를 먹고, 쥐는 무작위로 선택된 4개의 의사 팔에 순차적으로 들어가 보상을 수집하고("강제 실행") 모든 문을 함께 열어 쥐가 자유롭게 달리고 나머지 4개의 보상을 찾을 수 있도록 합니다("자유 실행"). 작업 기억에 도전하기 위해 강제 실행과 자유 실행 사이에 5초 지연이 도입됩니다. 마우스가 자유 실행 중에 이전에 방문한 팔에 들어가면 오류가 기록됩니다. 모든 보상이 회수되면 작업이 완료됩니다. 6일간의 습관화와 9일간의 미로 훈련 후, 수컷 C57BL/6 마우스는 4/(4+E)로 정의되는 80%≥의 일일 성공률 점수를 정기적으로 달성합니다. 이 반자동 작업은 원칙적으로 전기생리학, 다중 광자 현미경 또는 칼슘 이미징과 같은 생체 내 모니터링 방법과 결합될 수 있습니다.

서론

작업 기억¹ 은 짧은 기간 동안 제한된 양의 정보를 보유할 수 있는 인지 과정으로, 전화번호나 다른 위치에서 목적지로 가는 경로를 암기하는 것과 같은 정신적 작업의 계획 및 실행에 조작 및 사용됩니다. 이는 빠르게 추론하고 추상적으로 생각하는 능력인 유동 지능과 밀접한 관련이 있습니다. 작업 기억 훈련은 유체 지능을 향상시킬 수 있다고 믿어집니다². 따라서 작업 기억은 연구에 매우 중요합니다.

설치류에 대한 가장 인기 있는 행동 실험은 원래 1980년대에 쥐를 위해 고안되었으며 오늘날 연구자들은 종종 이러한 프로토콜을 쥐에게 적용합니다. 그러나 쥐와 생쥐 사이에는 일관된 행동 차이가 있습니다 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . 특히 쥐는 쥐에 비해 스트레스를 받기 쉽기 때문에 공포 관리는 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 중요한 요소입니다 3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,^18,19. 따라서 이러한 프로토콜을 마우스에 적용할 때 차이점을 고려하는 것이 중요합니다. 우리 프로토콜에서 우리는 방사형 팔 미로에서 작업 기억 작업 중 스트레스 요인을 최소화하려고 노력했습니다. 이는 마우스 추적 및 미로 제어 소프트웨어를 사용하여 도어 클로저 타이밍을 신중하게 측정하여 수행되었습니다. 또한 중앙 허브에서 세션이 끝날 때 쥐를 잡는 것을 피했습니다. 이 접근 방식을 통해 쥐는 위치를 잡힐 것이라는 두려움과 연관시키지 않고 다음 팔을 선택할 수 있었습니다. 미로에서 모든 보상이 수집될 때까지 쥐를 포획하는 것을 연기하면 마지막 보상이 잡히는 경험과 연결되지 않도록 했습니다.

육상 방사형 팔 미로(RAM)는 설치류의 공간 및 비공간 학습 및 기억을 평가하고 작업 및 참조 기억을 테스트하는 데 널리 사용되고 일반적으로 사용되는 장치입니다. 마우스^20,21,22에서 공간 학습 및 기억을 위한 가장 인기 있는 장치 중 하나입니다. RAM은 먹이 찾기 외에도 미로를 탐험하고, 참신함을 찾고, 시행착오를 통해 공간 정보를 배우는 설치류의 자연스러운 경향을 이용합니다. 이러한 경향은 식단을 제한하고 미로에서 선호하는 음식으로 보상함으로써 강화될 수 있습니다. 현재, RAM 장치의 여러 변형, 예를 들어, 6, 8, 12 또는 16 암 및 부분적으로 밀폐되거나 개방/상승된 장치⁽23,24,25)가 사용된다. 대부분의 현재 프로토콜은 Olton et ^al.20,26의 프로토콜을 기반으로 하지만 더 단순한(6팔 또는 8팔) 미로 ^{9,24,27,28,29}를 사용합니다. 방사형 팔 미로(6개 또는 8개의 팔)에서 작업 기억을 테스트하는 것은 동물이 탐색할 수 있는 팔의 옵션이 더 많기 때문에 T 미로(2개의 팔)보다 더 강력합니다.

원래 RAM은 Olton과 Samuelson²⁰에 의해 설계되었으며, 음의 강화, 즉 물 침수를 사용하는 Morris 물 미로 및 8-arm 방사형 물 미로와 같은 물 미로와 달리 긍정적인 강화를 위해 음식 미끼를 사용하여 쥐의 공간 학습 및 기억을 평가하기 위해 ^{설계되었습니다.} Olton과 Samuelson(²⁰)은 쥐가 RAM을 통과할 때 장소에 대한 기억력이 뛰어나다는 것을 발견했습니다. 그들은 해마가 공간 정보 처리에 관여한다는 것을 보여주었습니다. 따라서 그들은 설치류에게 작업 메모리와 참조 메모리로 구성된 이중 메모리 시스템의 개념을 도입했습니다. 이 이중 기억 시스템은 이전에 비둘기 실험을 기반으로 Honig³⁶에 의해 제안되었습니다. Olton et al. 해마 기능이 작업 기억에 필수적이라는 것을 발견했습니다. 이것은 해마 형성 26,33,34,35의 주요 외성 섬유 연결 각각을 방해하기 위해 후공 영역, 섬유-원추의 몸체, 해마, 중격 또는 교련 후 원추의 몸체에 병변을 만들어 달성되었습니다. Fornix-fembria 병변은 참조 기억에 영향을 미치지 않았습니다²⁶.

현대 프로토콜에서 동물은 연속 3일 동안 하루 10-15분 동안 미로를 자유롭게 탐색할 수 있도록 한 후 모든 팔 끝에 선호하는 음식으로 1-3주 동안 미로 훈련을 하거나 선택한 팔을 고정하여 동일한 실험에서 작업 기억 또는 작업 기억 및 참조 기억을 테스트합니다. 각각 ^9,29,37.

종종 이러한 프로토콜은 완전히 설명되지 않으며 쥐와 마우스 간의 행동 차이는 잘 고려되지 않습니다. 여기에서 우리는 우리의 프로토콜과 경험, 특히 쥐와 생쥐 간의 공포 관리 차이를 기반으로 두려운 경험을 장소 및 타이밍과 연관시키는 것을 피하는 방법을 자세히 제시합니다. 이 프로토콜은 공간 작업 기억을 연구하고 마우스를 사용하여 전기생리학, 실시간 이미징 및 조직학에 적용하려는 연구자를 위한 것입니다.

프로토콜

모든 마우스 실험은 UCL 윤리 위원회의 사전 승인을 받았으며 1986년 동물(과학적 절차)법 및 영국 정부의 후속 법률에 따라 승인되었습니다.

1. 소프트웨어 응용 프로그램의 자동 미로 제어를 위한 프로그램 준비

참고: 그림 1A-C와 같은 자동화된 방사형 암 미 로와 그림 1D의 방 레이아웃이 사용되었습니다.

1. 그림 2에 설명된 대로 도어 폐쇄를 위한 실험 워크플로를 준비합니다.
2. 소프트웨어 응용 프로그램에서 습관화 단계 1(그림 2A)의 시작을 설정합니다. 이렇게 하려면 아래 단계를 따르십시오.
   1. 평가판 및 비디오 녹화의 시작을 설정하고 소프트웨어의 모든 암을 닫습니다. 소프트웨어가 미로의 중앙 허브에 있는 마우스를 인식한 후 5초 후 추적을 시작하고 모든 문을 엽니다.
   2. 마우스가 팔 안으로 들어가 중앙 허브 도어의 가장 가까운 도어에서 4cm 떨어져 있으면 모든 도어를 닫습니다. 그런 다음 모든 문을 닫은 직후 마우스가 선택한 암의 문을 엽니다.
   3. 마우스가 중앙 허브로 돌아가면 문을 닫고 5초 동안 중앙 허브에 가두십시오. 이것을 30분 동안 반복합니다.
   4. 30분이 경과하면 비디오 녹화 및 추적을 중지하고 마우스가 중앙 허브로 돌아갑니다.
      알림: 마우스가 마음대로 미로를 자유롭게 탐색하도록 하십시오.
3. 습관화 단계 2(그림 2B)
   1. 관련 소프트웨어에서 평가판 및 비디오 녹화 시작을 설정하고 모든 도어를 닫습니다.
   2. 소프트웨어가 미로의 중앙 허브에 있는 마우스를 인식한 후 5초 후 추적을 시작하고 모든 문을 엽니다.
   3. 마우스가 각 팔에 최소 두 번 또는 30분 후에 들어간 다음 중앙 허브로 돌아가면 시험을 종료합니다. 마우스가 마음대로 미로를 자유롭게 탐험하게 하세요.
4. 습관화 단계 3(그림 2C)
   참고: 이 단계는 1단계와 2단계의 조합입니다.
   1. 평가판 및 비디오 녹화를 시작하고 모든 문을 닫도록 소프트웨어를 설정합니다.
   2. 소프트웨어가 중앙 허브에서 마우스를 인식한 후 5초 동안 미로 문을 제어하도록 소프트웨어를 설정합니다. 이 시점에서 추적의 시작을 설정하고 모든 문을 엽니다.
   3. 마우스가 암 안으로 들어가고 중앙 허브 도어의 가장 가까운 도어에서 4cm 떨어져 있을 때 모든 도어를 닫습니다. 그런 다음 팔의 문을 엽니다.
   4. 마우스가 중앙 허브에 완전히 들어가면 문을 닫고 마우스를 중앙 허브에 3초 동안 가둡니다. 30분 동안 또는 마우스가 각 팔에 한 번 이상 들어갈 때까지 이 시퀀스를 반복합니다.
   5. 조건을 충족한 후 마우스가 중앙 허브에 완전히 들어갈 때 시험 종료를 설정합니다.
      알림: 마우스가 마음대로 미로를 자유롭게 탐색하도록 하십시오.
5. 작업 기억 작업(그림 2D, E)
   1. 평가판 및 녹음을 시작하도록 소프트웨어를 설정하고 모든 도어를 닫습니다.
   2. 소프트웨어가 중앙 허브에서 마우스를 인식한 후 5초 후 추적을 시작하도록 소프트웨어를 설정합니다.
   3. 강제 실행 단계를 시작합니다. 의사 무작위로 선택된 4개의 팔을 마우스에 하나씩 제시합니다.
   4. 마우스가 첫 번째 암에 들어가 중앙 허브에서 3cm 떨어져 있으면 도어가 닫히고 15초 동안 암에 가두는지 확인합니다.
   5. 문을 열고 마우스를 중앙 허브로 다시 돌립니다.
   6. 문을 닫은 다음 두 번째 암을 엽니다.
   7. 네 번째 팔까지 이것을 반복합니다.
   8. 강제 실행 단계의 네 번째 암 이후 마우스가 중앙 허브로 돌아오면 5초 동안 중앙 허브에 가두십시오.
   9. 모든 문을 열고 자유 실행 단계를 시작하십시오.
   10. 모든 보상을 수집하거나 모든 팔을 한 번 이상 입력한 후 마우스가 중앙 허브로 돌아오면 시험을 종료합니다.

2. 개인 주택을 위한 홈 케이지 준비

1. 새 실험을 위해 표준 중첩 재료를 사용하여 새 케이지를 설정합니다.
   1. 실험을 위해 각 마우스를 위해 새 침구, 톱밥, 종이 이글루, 종이 터널, 종이 둥지 줄무늬 및 나무 바이트 블록을 새 케이지에 넣습니다.
   2. 푸드 호퍼를 놓고 뚜껑을 닫습니다.
      알림: 마우스는 푸드 호퍼가 없는 경우 환기를 위해 부품을 손상시킬 수 있습니다.

3. 동물 수용실에서의 취급, 체중 측정 및 식이 제한(-7일차부터 0일차까지)

1. 마우스를 홈 케이지에 제공된 종이 터널로 손으로 부드럽게 안내합니다.
2. 종이 터널 38,39,40을 사용하여 그룹화된 케이지에서 마우스를 손으로 들어 올리고 몇 초 동안 가슴 높이에 유지합니다. 또는 마우스가 자발적으로 손 위로 올라가도록 하십시오.
   참고: 최소한의 스트레스로 동물을 다루는 것은 행동 실험에 필수적입니다. 쥐에게 스트레스가 되는 꼬리를 잡지 마십시오. 쥐를 실험자에게 습관화하는 것도 중요합니다. 쥐는 잘 익숙해지고 긴장을 풀어야 하며, 그렇지 않으면 나중에 미로에서 잘 배우지 못할 것입니다.
3. 항상 동일한 처리 방법을 사용하여 마우스를 잡으십시오. 체중 모니터링을 위해 체중계에 마우스를 올려놓고 체중을 기록합니다.
   알림: 빠른 신체 움직임이나 큰 소리로 마우스에게 스트레스를 주지 마십시오. 조용한 환경에서 이 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 저울이나 실험자의 손에서 뛰어내릴 수 있습니다. 또한, 마우스가 스트레스를 받으면 눈을 가늘게 뜨고 삐걱거리며 실험자의 손을 물어뜯을 수 있습니다^41,42.
4. 무게를 측정한 후 이전에 준비한 새 케이지에 마우스를 넣으십시오.
5. 요골 팔 미로에 노출되기 전에 일주일 동안 제한된 양의 식단을 먹이십시오. 이것은 그들이 제공되는 음식 보상을 위해 미로를 찾도록 동기를 부여합니다. 실험 중 음식 보상은 희석된 가당 연유입니다.
6. 케이지에 표준 차우 2~3g을 넣고 실험 내내 체중을 시작 체중의 85~90% 사이로 유지합니다.
   참고: C57BL/6 마우스는 매일 3-4g의 표준 차우를 먹습니다⁴³.
7. 다음날 줄 음식의 양을 표준화하기 위한 지침으로 밤새 체중 감소를 관찰하십시오. 그때부터 실험 기간 동안 시작 체중의 85-90%를 유지하기 위해 충분한 양의 표준 음식을 매일 섭취하십시오.
   참고: 이 동물들은 천천히 체중을 감량해야 합니다. 스트레스를 피하기 위해 체중과 표정을 모니터링하십시오.
8. 가정용 케이지의 작은 플라스틱 컵에 희석된 연유 1mL(보상; 가당 연유 : 물 = 1:1)를 제공하여 습관화 단계 1이 끝날 때까지 마우스를 습관화시킵니다. 쥐가 보상을 먹도록 하십시오. 쥐 계통이 제시된 음식에 대해 신공포증을 보이는 경우 보상 음식을 변경하십시오.
   알림: 습관화 단계 2부터는 홈 케이지에서 보상을 제공하지 마십시오. 마우스의 체중이 시작 체중의 80% 미만으로 떨어지면 IACUC 및 국가별 지침에 따라 안락사시켜야 합니다. 마우스가 첫 번째 체중 검사에서 사용 중인 마우스 계통의 정상 체중 범위(8-12주에 20-30g)에 있지 않은 경우, 나중에 필요한 범위에서 체중을 유지하는 데 어려움을 겪지 않도록 코호트에서 고려해서는 안 됩니다.

4. 생쥐를 시험장으로 데려오기

1. 트롤리를 사용하여 쥐를 행동 테스트실로 천천히 데려옵니다.
2. 쥐를 트롤리에 5분 동안 방해받지 않고 둡니다.

5. 방 설정

1. 따뜻한 백색 전구로 중앙 허브를 간접적으로 비추는 실내 조명을 80lux로 설정하고 중앙 허브에서 측정한 70dB의 백색 소음을 재생합니다. 참고: 중간 강도의 백색 소음에 노출되면 쥐가 기하학적으로 복잡한 미로에서 더 나은 성능을 발휘하는 것으로 알려져 있습니다^44,45. 백색 소음은 단순히 환경에서 피할 수 없는 소음을 가리는 것 이상의 역할을 하는 것 같습니다. 70dB 백색 소음은 전두엽 피질, 시상하부 및 해마(선조체는 아님)를 포함한 쥐의 여러 뇌 영역에서 콜린 흡수를 증가시킵니다^.46 RAM 작업 기억 성능은 해마, 전두엽 피질 및 전뇌 사이의 콜린성 경로의 무결성에 의존하는 것으로 알려져 있습니다^32,47. 또한 동물은 주변 환경을 정확하게 탐색하기 위해 원위 및 근위 시각적 신호를 모두 사용하는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 마우스는 공간 학습 중에 탐색하기 위해 근위 단서보다 원위 시각적 단서에 더 의존합니다⁴⁸. 이 실험에서는 작은 종이에 인쇄된 근위 단서를 8군 RAM의 모든 암의 뒷벽에 도입했지만 데이지 체인 동작을 감소시키지는 않았습니다. 반면에 기하학적으로 비대칭적인 원위 시각적 단서(방의 천장과 벽)는 데이지 체인 연결을 줄이고 RAM의 공간 탐색에 필수적이었습니다.

6. 습관화 1단계 - 보상 없음(1일 - 2일차)

참고: 미로에는 보상이 없습니다. 이 단계는 쥐를 미로 문과 그 소리에 익숙하게 만드는 것입니다.

1. 소프트웨어에서 시작 버튼을 클릭하고 스트레스 없이 마우스를 미로로 가져와 마우스 추적 및 비디오 녹화를 시작합니다. 마우스가 실험자의 손에 있는 동안 천천히 움직이고 높이를 천천히 변경하여 이를 수행합니다. 중앙 허브에 마우스를 놓습니다.
   참고: 쥐가 실험자의 손을 흔들면 움직임을 늦추십시오. 그것은 두려움의 표시입니다. 생쥐는 강제 실행 단계를 시작하기 전에 중앙 허브에서 5초의 감금 기간 동안 움직입니다. 중앙 허브에 넣으면 어느 쪽이든 향할 수 있습니다.
2. 미로에서 멀리 떨어진 곳이나 미로 벽 아래에 배치된 PC 모니터에서 마우스의 동작을 계속 관찰하십시오. 쥐가 벽에 올라가 미로에서 탈출하려고 하면 의자에서 일어나 실험자의 존재를 보여주고 실험자의 성능을 모니터링하면서 미로를 향해 걸어가십시오. 최악의 경우 마우스를 미로 속으로 다시 밀어 넣으십시오.
   참고: 일반적으로 생쥐는 미로에 접근할 때 실험자의 옷의 마찰 소음을 듣고 미로로 돌아갑니다. 이것은 신속하게 수행되어야 합니다. 실험자가 이 작업을 계속하면 마우스는 습관화 단계 1에서 3 이후에도 미로에 머물게 됩니다. 쥐가 미로에서 계속 뛰어내리면 추가 실험 및 분석에서 제거하는 것이 좋습니다.
3. 시험이 끝난 후, 쥐가 실험자의 손에 자발적으로 올라가도록 하고 다른 손은 팔을 덮어 미로에서 뛰어내리지 않도록 함으로써 미로의 팔에서 쥐를 수집합니다.
4. 쥐의 배설물을 털어내고 마른 티슈로 미로를 닦아 보상의 흔적을 제거하세요. 그런 다음 물티슈로 닦고 마른 티슈로 미로를 말립니다(약 2분).
5. 이틀 동안 각 마우스에 대해 차례로 이 작업을 수행합니다.
   참고: 30분 후 생쥐는 미로의 8개 팔을 모두 방문하지 않았을 수 있습니다. 이것은 정상이며 문제가 되지 않습니다. 생쥐는 비체계적이고 비순차적인 패턴으로 팔을 방문하고 조심스럽게 움직이며 각 팔에서 고르지 않은 시간을 보내는 경향이 있습니다. 이 단계에서 쥐는 미로 벽에 오르거나 미로에서 뛰어내릴 수 있습니다. 이런 일이 발생하면(예: 마우스가 벽에 올라가려고 시도하는 경우) 실험자가 미로에 접근하여 옷이 바스락거리는 소리와 같은 소음을 내어 마우스가 자신의 존재를 인식하도록 하여 이를 방지하십시오. 따라서 RAM에서 마우스의 동작을 주의 깊게 관찰하고 빠른 조치가 필요할 수 있습니다. 이 절차를 몇 번 반복하면 생쥐는 미로에 머물게 됩니다. 모든 것에도 불구하고 익숙해지는 동안 마우스가 RAM에 머물지 않으면 분석에서 제거하십시오.

7. 습관화 2단계 - 보상(3일 - 4일차)

참고: 이 단계는 쥐가 음식 보상을 위해 미로를 자유롭게 탐험하도록 장려하기 위한 것입니다.

1. 각 팔의 각 식품 웰에 70μL의 식품 보상을 넣습니다.
2. 6.1에 설명된 대로 소프트웨어에서 시작 버튼을 클릭한 다음 마우스를 미로 중앙 허브에 놓아 마우스 추적 및 비디오 녹화를 시작합니다.
3. 멀리서 PC 모니터에서 마우스의 동작을 계속 관찰하고 필요한 경우 벽에 오르거나 미로에서 뛰어내리는 등 적어두세요. 마우스가 각 팔에 최소 두 번 또는 30분이 경과하면 시험을 종료합니다.
4. 시험이 끝난 후, 쥐가 자발적으로 실험자의 손에 올라가도록 하고 다른 손은 팔을 덮어 미로에서 뛰어내리지 않도록 미로에서 쥐를 팔에 모으십시오.
5. 6.4(습관화 단계 1, 약 2분)에 설명된 대로 미로를 청소합니다.
6. 이틀 동안 하루에 두 번 각 마우스에 대해 차례로 이 작업을 수행합니다.
   참고: 이 단계에서 마우스는 데이지 체인 방식으로 행동할 수 있지만 작업 기억 작업의 추가 4개 팔 항목이 이 움직임을 방해할 수 있으므로 걱정할 필요가 없습니다. 이 단계에서 생쥐는 보상을 소비하지 않고 팔에서 멈출 수 있습니다. 4일째에 쥐는 3일차보다 더 많이 훈련되어야 하지만 여전히 팔 중앙에서 멈출 수 있습니다.

8. 습관화 3단계 - 보상(5일 - 6일)

참고: 이 단계는 마우스가 1단계와 2단계의 조합 환경에 익숙해지도록 하는 것입니다.

1. 보상 70μL로 모든 음식 우물을 미끼로 만듭니다.
2. 소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하고 미로의 중앙 허브에 마우스를 놓아 마우스 추적 및 비디오 녹화를 시작합니다.
3. 마우스가 각 팔에 최소 한 번 또는 30분이 경과할 때까지 멀리서 PC 모니터에서 마우스의 동작을 계속 관찰합니다. 쥐가 미로에서 탈출하려고 하면 습관화 단계 1(6.2)에 명시된 대로 빠르게 행동하십시오.
4. 시험이 끝나면 쥐가 실험자의 손에 자발적으로 올라가도록 하고 다른 손은 팔을 가리고 미로에서 뛰어내리지 않도록 미로에서 쥐를 제거합니다.
5. 6.4(습관화 단계 1)(약 2분)에 설명된 대로 미로를 청소합니다.
6. 이틀 동안 하루에 두 번 각 마우스에 대해 이 작업을 수행합니다.
   참고: 이 단계에서는 분석에서 미로에서 탈출하려는 쥐를 제거하는 것이 가장 좋습니다.

9. 작업 기억 작업 - 보상(7일차 - 15일차)

1. 보상 40μL로 모든 팔을 미끼로 삼습니다. 각 음식에 보상을 중앙 허브 가까이에 배치하여 쥐가 중앙 허브에서 보기 어렵게 만듭니다.
2. 소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하여 마우스 추적 및 기록을 시작한 다음 스트레스 없이 미로 중앙 허브에 마우스를 놓습니다.
3. 중앙 허브에 갇혀 있는 5초 동안 미로에서 멀리 떨어진 곳에 앉으십시오. 마우스의 행동을 모니터링하고 마우스가 미로에서 방문하는 팔의 순서를 기록합니다( 보충 파일 1 참조).
4. 마우스가 작업 기억 작업의 끝인 8개의 음식 보상을 모두 수집하면 팔 방문 시퀀스 기록을 중지한 다음 4개의 추가 팔을 방문하도록 합니다.
   참고: 이렇게 하면 생쥐가 잡히기까지 더 많은 시간을 가질 수 있어 생쥐가 작업 기억 작업에 집중할 수 있습니다. 이 단계를 통해 쥐는 보상이 한 번 수집되면 보충되지 않는다는 사실을 강화할 수 있습니다.
5. 네 번의 추가 팔 방문 후, 마지막 팔 방문이 끝날 때 다른 손으로 팔을 가리고 손 위로 올라가도록 하여 미로에서 마우스를 제거합니다.
   참고: 중앙 허브에서 쥐를 잡지 않음으로써 쥐는 쥐가 다음에 어떤 팔로 갈지 결정하는 중앙 허브와 잡히는 것을 연관시키지 않습니다. 쥐가 추가 팔 방문을 포함하여 작업에 익숙해지면 마지막 먹이 우물 근처에서 자유롭게 이동하거나 중앙 허브에서 시간을 보낼 수 있습니다. 그러나 4번의 추가 팔 방문은 3분 이내에 완료해야 합니다. 5분 이내에 다 먹지 않으면 홈 케이지로 돌려보내십시오.
6. 다음 시도를 위해 케이지를 눌러 각성 수준을 조정하려면 다음 케이지를 선택합니다.
7. 6.4(습관화 단계 1)(약 2분)에 설명된 대로 미로를 청소합니다.
8. 다음 마우스로 이동하여 6일 동안 각 마우스에 대해 9회 반복합니다.
   참고: 4번의 추가 팔 방문의 평균 기간은 마우스가 더 이상 보상을 사용할 수 없거나 들어갈 새로운 방문되지 않은 팔이 없을 때 인식하는 법을 배우기 때문에 이후 시험에서 더 길어져야 합니다.

10. 채점

1. "일일 성공률 점수"(%) = 4(골) / (총 팔 항목 수[4+오류]) x 100을 계산합니다.
   참고: 강제 달리기 후에는 네 개의 팔만 보상, 즉 목표로 채워집니다. 강제 실행에서 마우스가 방문한 팔에 들어가면 이를 하나의 오류로 계산하고 자유 실행에서 반복된 팔로 계산합니다.
2. 6회 시행에서 "완전 시행 비율 점수"(%) 계산 = [(완전 시행 횟수) / 6 ] x 100
   참고: 만점은 작업 기억 오류가 없음을 의미합니다.
3. 분석을 위해 소프트웨어에서 마우스의 속도, 거리 및 가속도를 선택하고 매일 평균을 계산합니다. 이러한 분석에서 4개의 추가 팔 방문을 제외해야 합니다. 또한 실험 후 마우스 추적 비디오를 검토하여 4번의 추가 팔 방문 기간을 측정합니다.
   알림: 쥐는 팔에 들어간 직후 빠르게 회전할 수 있습니다. 작업 기억이 유효하다는 것을 의미하는 빠른 실수 수정이므로 이것을 항목으로 계산하고 점수를 매기지 마십시오⁴⁹. 그러나 마우스가 팔의 중간점을 가로지르거나 3초 이상 팔에 머무르면 항목을 세고 점수를 매깁니다. 일일 성공률 점수는 마우스의 학습 곡선을 나타내고 완벽한 시도 비율 점수는 작업 기억 유지 효율성을 나타냅니다.

11. 통계

1. 이전 간행물⁵⁰에서 수행된 바와 같이 대조군과 녹아웃 마우스 계통 사이의 차이를 연구하는 경우, 아래에 설명된 대로 통계를 수행한다.
   1. 사후 분석(예: Bonferroni 테스트)[9개의 서로 다른 시점에서 각 피험자 측정]과 함께 반복 측정 양방향 ANOVA를 사용하여 대조군과 실험군의 결과 데이터를 비교합니다.
   2. 그룹을 비교하는 경우, 각 그룹에서 최소 10마리, 바람직하게는 ~20마리의 마우스를 테스트합니다. 유전자 조작, 병변 만들기 또는 약물 치료의 효과가 명백한 경우 표본 크기가 더 작아서 결론을 내릴 수 있습니다.

결과

이 프로토콜은 MyRF cKO 마우스와 대조군⁵⁰을 사용하여 공간 작업 기억 작업 수행에 새로운 희소돌기아교세포와 수초가 필요한지 여부를 질문한 이전 간행물에서 사용되었습니다. 우리는 작업 기억 작업 성능이 대조군 마우스에서 향상되었지만 MyRF cKO 마우스에서는 개선되지 않았다는 것을 발견했습니다. 작업 기억 작업은 야생형 마우스의 작업 기억 처리와 관련된 뇌 영역에서 희소돌기아교세포 전구체 세포(OPC) 증식 및 분화, 희소돌기아교세포(OL) 수초화를 자극하고 촉진했습니다. 우리는 또한 공간 작업 기억을 평가하기 위해 T-maze 보상 교대 작업을 수행했습니다. 이 작업은 MyRF cKO 마우스에서 작업 기억 결핍을 감지하기 위해 수행되었습니다. 그러나 T-미로 보상 교대 작업을 수행한 마우스 그룹과 홈 케이지 대조군 간의 조직학적 분석에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다. 따라서 여기에 제시된 프로토콜이 작업 기억 연구를 위한 T-미로 보상 교대 작업보다 더 효과적이라는 결론을 내렸습니다.

각 마우스는 하루에 총 1시간 동안 작업 기억 작업을 6번 시도했습니다. 따라서 이 프로토콜은 코호트에서 최대 8마리의 마우스를 허용했습니다. 익숙화 초기에 쥐는 미로 팔에서 고르지 않은 시간을 보냈고 움직임이 느렸습니다. 그들은 오랫동안 팔 끝에 머물렀습니다. 미로에서 습관화의 5일차가 끝날 때까지 그들은 미로 팔에서 다양한 시간을 보냈고 보상을 건드리지 않고 중앙 허브로 돌아갈 수 있었습니다(그림 3A). 그러나 여섯째 날에 동물은 8-15분 이내에 각 팔에 적어도 한 번 들어갔고, 각 팔에서 비슷한 기간을 보냈는데, 이는 동물이 미로에 익숙해지고 작업을 수행할 준비가 되었음을 나타냅니다(그림 3A, 6일차 아래 행 및 그림 3B).

습관화 단계에는 뒷다리로 서서 팔이나 중앙 허브에서 위를 올려다보는 경우가 많았습니다. 작업 기억 작업 중에 유사한 행동이 관찰되었지만 반드시 같은 방향으로 돌아다니는 것은 아닙니다(예: 2 -> 3-> 5 -> 8 [시계 방향] 또는 8 -> 5 -> 3 ->2 [시계 반대 방향]). 방향을 바꿀 수 있습니다(예: 5 -> 4 -> 6 -> 1). 개별 마우스는 팔 서열을 선택하는 명백한 공동체 경향이 없었습니다. 생쥐는 자유 달리기에서 첫 번째 보상 팔보다 마지막 보상 팔을 선택하는 데 조금 더 많은 시간을 소비하는 경향이 있습니다. 이는 아마도 프리 런의 첫 번째 선택에서 선택할 수 있는 옵션이 4개 있었고 마지막 보상에 대한 옵션이 하나뿐이었기 때문일 것입니다. 강제 실행 단계의 첫 번째 팔은 자유 실행 시작 최소 50초(15+15+15+5)초 전에 마우스에게 제공되었습니다. 따라서 이 작업 기억 작업은 작업 기억 오류 없이는 수행하기가 쉽지 않았습니다. 보충 비디오 1 은 작업 기억 작업 훈련의 8일째에 완벽한 시험을 받는 마우스를 보여줍니다.

두 채점 시스템 중 하나를 사용하여 9일간의 RAM 테스트 기간 중 처음 3일 동안은 성능이 거의 평평했지만 그 이후에는 눈에 띄게 향상되었음을 발견했습니다(그림 4A, B). 6일간의 습관화와 9일간의 미로 훈련 후, 수컷 C57BL/6 마우스는 8일째부터 정기적으로 80%의 일일 성공률 점수를 ≥달성했으며, 이는 4/(4+E)로 정의되며, 여기서 E는 오류 수입니다. 프리 런에서 이동한 평균 거리는 시간이 지남에 따라 짧아졌지만 평균 속도와 가속도는 매일 상당히 일정했습니다(그림 4C-F). 생쥐는 4번의 추가 팔 방문 중에 잡혔다는 공포 기억을 개발했을 수 있으며, 이는 생쥐가 실험이 끝날 무렵 더 많은 시간을 보낸 이유 중 하나일 수 있습니다(그림 4G).

이 프로토콜에서 습관화 단계는 6일 동안 지속되었으며, 이는 동물 시설에서 빛/암흑 주기가 역전되지 않더라도 실험을 위해 생체 시계를 조정할 수 있습니다.

그림 1: RAM 사양 및 기능. (A) 천장에 장착된 CCD와 측면에서 미로를 본 모습과 치수. (B) 먹이우물을 미로 바닥 아래 1.5cm에 가라앉혀 쥐가 >10cm 떨어진 곳에서 내용물을 볼 수 없도록 하였다. (C) 미로 경기장 설정. 중앙 허브와 암 1-8이 표시됩니다. (D) 실험실 개략도 및 방 사진이 포함된 외부 시각적 단서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 미로 제어 프로그램의 흐름도. (A) 습관화 단계 1(1일 및 2일). (B) 습관화 단계 2(3일 및 4일). (C) 습관화 단계 3(5일 및 6일). (D) 작업 기억 작업(7-15일). (E) 작업 기억 작업 패러다임의 스키마. 쥐는 의사 무작위로 선택된 4개의 강제 실행 암을 통과하고 5초 동안 중앙 허브에 갇힌 다음 나머지 보상을 수집하기 위해 자유 실행을 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 6일간의 습관화 동안의 히트 맵과 새 둥지 맵. (A) 3마리의 마우스에 대한 습관화 1-6일 동안의 마우스 궤적의 히트 맵. 습관화 3-6일 동안 마우스는 하루에 두 번의 시도를 거쳤습니다. 위쪽 히트맵은 첫 번째 시도를 보여주고 아래쪽은 두 번째 시도를 보여줍니다. (B) 습관화 6일째를 위한 새 둥지 지도. 위쪽 3개는 첫 번째 시도를 나타내고 아래쪽 3개는 마우스 1, 2 및 3의 두 번째 시도를 보여줍니다. 아래 표에는 동일한 세 마리의 마우스에 대한 시험 기간이 나열되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: RAM 작업 메모리 작업. (A) [4/(자유 달리기 중 팔 진입 수) x 100]으로 계산된 평균 일일 성공률 점수(%). 6건의 시도 점수가 그날의 평균을 받았습니다. (B) 작업 9일 동안 완벽한 시험 점수. (C) 개별 이동 거리 및 평균. (D) 작업에서 마우스의 개별 실행 속도 및 평균. (E) 마우스의 개별 가속도와 평균. (F) 마우스의 개별 감속과 평균. (G) 추가 4회 팔 방문의 개별 및 평균 기간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 1: 마우스는 작업 기억 작업 훈련의 8일째에 완벽한 시험을 거칩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 예제 녹음 시트. 마우스의 행동을 관찰하면서 팔 방문 순서를 기록합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

RAM에서 작업 메모리 훈련 및 테스트
작업 기억은 정신적 작업의 계획 및 실행에 조작되고 사용되는 동안 짧은 시간 동안 제한된 양의 정보를 보유할 수 있는 인지 과정입니다. 예를 들어 원격 위치에 있는 문의 진입 코드를 기억하거나 특정 목적지까지의 경로를 기억하는 것이 있습니다. 이중 N-백 작업과 공간 범위 작업은 일반적으로 인간 피험자에게 자극의 위치, 정체성 및 시간적 순서를 암기하도록 요청하는 시공간 작업 기억 작업입니다. Takeuchi et al. 이중 N-back 작업을 포함하는 인간의 성공적인 작업 기억 작업에 대한 훈련의 양은 MRI를 사용한 연구에서 뇌량 신체 앞부분의 증가된 분수 이방성과 상관관계가 있음을 발견했습니다⁵¹. 이전 연구⁵⁰에서 이 논문에 설명된 프로토콜을 사용하여 우리는 주의력에 관여하는 것으로 여겨지는 전대상피질을 포함하여 작업 기억 처리에 관여하는 것으로 생각되는 전뇌량 및 기타 뇌 영역에서 수초성 희소돌기아교세포가 증가한다는 것을 발견했습니다. 희소돌기아교세포 증가는 작업 기억 작업 수행과 밀접한 상관관계가 있으며, 이는 Takeuchi et^{al 50,51,52}의 인간 연구와 일치합니다. 그러나 인간과 생쥐 사이의 심리적 과정(예: 전기생리학)에 유사성이 있는지 연구할 필요가 있습니다. 작업 기억은 주의력과 밀접한 관련이 있습니다. 이는 인간의 '유동 지능' 측정과 관련이 있으며 학습에 중요하므로 연구하는 것이 중요합니다. Olton과 Samuelson은 쥐의 공간 기억을 훈련하고 평가하기 위한 8팔 방사형 미로(RAM) 작업을 설명했습니다²⁰. 자유 선택 실험에서 그들은 모든 미로 팔에 0.1g의 쥐차우를 제공했는데, 이는 테스트 중에 보충되지 않았습니다. 그래서 한 번의 테스트에서 8개의 보상만 획득했습니다. 모든 팔이 열려 있었고 쥐는 실험 중에 모든 팔에 즉시 접근할 수 있었습니다. 음식 보상이 보충되지 않았기 때문에 쥐는 작업이 끝나기 전에 가능한 한 많은 보상을 회복하기 위해 이전에 방문한 팔을 다시 방문하지 않기 위해 작업 기억을 사용해야 했습니다. 각 쥐는 처음에 중앙 허브에 배치되어 16개의 팔을 선택하거나 10분이 경과할 때까지 음식 보상을 회복하기 위해 마음대로 팔에 들어갈 수 있었습니다. Olton et al. 처음 8개의 선택 내에서 쥐가 방문한 별개의 팔의 수를 계산한 결과 모든 쥐가 10^{일 이내에} 평균 7개 이상의 별개의 팔을 선택했음을 발견했습니다. 우리는 쥐를 대상으로 유사한 프로토콜을 시도했고 쥐와 달리 쥐가 며칠 동안 데이지 체인 관계를 보였고 그 이후에는 전략을 변경하지 않아 작업 기억을 평가하는 목적을 우회한다는 것을 발견했습니다. 따라서 쥐는 팔 방문 사이에 중앙 허브에 갇혀 중앙 허브에 갇히면 데이지 체인 행동이 방지되기를 바랐습니다.

Olton et al. 선택의 순서를 방해하기 위해 1분 또는 15초 동안 쥐를 중앙 허브에 가두었습니다. 이로 인해 그들은 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 미로 주위를 지속적으로 진행하는 일반적인 경향을 채택할 수 없었습니다^20,53. 어떤 팔의 선택이 무작위이고, 동등하게 확률적이며, 이전 선택과 완전히 독립적이라면, 실험은 고전적인 '점유 문제'²⁰의 예이므로, 처음 8번의 연속 팔 방문 내에서 n개의 별개의 팔을 선택하는 확률 p(n,8)는 다음과 같습니다: p(1,8)=4.8x10-7, p(2,8)=4.2x10-4, p(3,8)=0.019, p(4,8)=0.17, p(5,8)=0.42, p(6,8)=0.32, p(7,8)=0.067, p(8,8)=0.0024. 이러한 확률에서 별개의 팔을 선택할 평균 확률은 8개 중 5.3(기대값 = = 5.25; 5.3/8= 66%)이라고 계산할 수 있습니다. Olton et al. 10일의 훈련 기간 동안 쥐는 1-5일 동안 평균 5.7/8개의 뚜렷한 팔(71%; 범위: 4.2-6.6)에 들어갔고, 6-10일 동안 7.6/8개의 뚜렷한 팔(95%; 범위: 7.2-8.0)으로 증가^{했으며, 이는} 우연보다 훨씬 높습니다. 이것은 쥐가 음식이 고갈된 팔을 피하기 위해 작업 기억을 사용했음을 나타냅니다. 우리는 쥐에게 유사한 접근 방식을 시도하여 팔 방문 사이에 5초 동안 중앙 허브에 가두었습니다. 마우스는 1-5일 동안 8-군 시험당 평균 5.7/8개의 다른 군(71%; 범위: 5.2-5.8; 11개의 C57BL/6 마우스) 및 6-10일 동안 5.9/8개의 다른 군(74%; 범위: 5.7-6.5; 11개의 C57BL/6 마우스). 따라서 생쥐는 실험 10일 동안 우연한 수준보다 훨씬 높은 보상 찾기 성능을 향상시키는 학습을 할 수 없거나 매우 느리게 학습했습니다. 따라서 위의 프로토콜은 생쥐에게 부적합한 것으로 간주되어 대신 Sasaki et ^al.27이 쥐에 대해 설명한 것과 유사한 '강제 실행/자유 실행' 패러다임을 선택했습니다

Sasaki et ^al.27의 프로토콜에서 실험 시작 시 모든 팔에 미끼가 붙었고 보상이 보충되지 않았으며 각 쥐는 처음에 개방형 상승 8군 RAM의 중앙 허브에 국한되었습니다. 그런 다음 그들은 팔 방문 사이에 팔과 중앙 허브에 국한시키지 않고 한 번에 한 팔씩 미리 선택된 4개의 팔 각각에 풀려났습니다('강제 실행'). 4^번째 팔 방문 후 쥐는 중앙 허브로 돌아가고 쥐가 마음대로 모든 팔을 방문할 수 있도록 모든 문이 즉시 열렸습니다('자유 달리기'). 자유 달리기 동안 가장 효율적인 방법으로 남은 모든 음식 보상을 수집하기 위해 동물은 강제 또는 자유 달리기에서 이미 방문한 팔을 기억하고 피해야 합니다. 우리는 생쥐와 매우 유사한 접근 방식(그림 2E)을 사용했습니다. Sasaki et ^al.27에서 매일 RAM 훈련이 시작될 때 10분의 습관화 기간은 훈련 전 단일 6일 습관화 기간으로 대체되었습니다. 또 다른 수정 사항은 모든 보상이 회수된 후 각 시험이 끝날 때 쥐가 팔을 4번 추가로 방문할 수 있도록 허용하는 것입니다. 이는 이전에 방문한 무기에서 보상이 보충되지 않는다는 사실을 강화하기 위한 것입니다. 또한, 마우스는 "후회를 피하는 법"을 배우기 때문에^54,55, 후속 시험을 시작하기 직전에 4번의 추가 팔 방문 동안 그러한 행동이 보상되지 않기 때문에 다음 시험에서 데이지 체인 행동을 억제할 수 있습니다. 추가로 4번의 팔 방문에 대한 또 다른 이유는 쥐가 모든 보상의 성공적인 회복을 작업이 끝날 때 실험자에게 잡힐 수 있는 두려운 경험과 연관시키는 것을 방지하기 위함이었습니다. 쥐는 네 번의 추가 팔 방문 중에 잡혔을 때 공포 기억을 발달시켰을 수 있으며, 이는 실험이 끝날 무렵 더 많은 시간을 보낸 이유 중 하나일 수 있습니다(그림 4G). 실제로, 쥐는 시험에서 추가로 4번의 팔 방문 동안 데이지 체인 행동을 깨뜨렸습니다. 또한, 생쥐는 강제 달리는 동안 각 팔에 15초 동안 갇힌 다음 자유 달리기를 시작하기 위해 모든 문을 열기 전에 5초 동안 중앙 허브에 갇혔습니다. 마우스를 중앙 허브에 가두지 않고 마우스는 위에서 설명한 것처럼 데이지 체인 방식으로 이동하는 경향이 있었습니다.

강제 실행의 경우 3개 이하의 인접한 팔을 포함하는 5개의 4군 의사 랜덤 시퀀스 세트에서 선택했습니다. 이들은 (1,3,5,7), (2,4,5,8), (1,4,5,7), (2,3,4,7), (1,2,5,6) 및 다양한 팔 순서 및 회전의 변형으로 팔을 1-8로 번호를 매기고 상단에서 시계 방향으로 번호를 매깁니다(그림 1C). 코호트의 각 마우스는 RAM 테스트의 습관화 후 9일 동안 하루에 6번의 시도(1회 시도 = 강제 실행 + 중앙 허브에서 5초 감금 + 자유 실행)를 거쳤습니다. 자유 실행 중에 마우스가 강제 실행 후 남은 4개의 보상을 모두 복구하기 위해 4번의 팔만 방문하면 이를 "완벽한 시험"이라고 합니다. 9일간의 훈련 동안의 성과는 4/(4+E)로 계산된 "일일 성공률 점수"로 정량화되었으며, 여기서 E는 자유 실행 중 오류 수 또는 "완벽한 시도"인 시도의 비율입니다(즉, E=0). 예를 들어, 마우스가 자유 실행 중에 나머지 4개의 보상을 검색하기 위해 7번의 팔 방문이 필요한 경우 "일일 성공률 점수"는 4/7 = 0.57 또는 57%가 되고 완벽한 시도는 이 척도에서 100%의 점수를 받습니다. 마우스가 당일 5번의 완전 시도를 수행한 경우 완전 시도 비율 점수는 5/6 = 83.3%가 됩니다.

데이지 체인에 의해 달성된 일일 성공률 점수는 마우스가 RAM의 8개 팔 중 하나에서 무작위로 자유 달리기를 시작한다고 가정하고 사용된 4팔 강제 실행 패턴 각각에 대해 수동으로 계산되었습니다(이전 단락). 데이지 체인 방식으로 달성할 수 있는 많은 시도의 평균 점수는 개별 강제 달리기 팔 패턴의 경우 53%에서 56% 사이 또는 전체 팔 패턴의 ~55%입니다. 데이지 체인 방식으로 만점을 얻을 확률(100%)은 0이며, 무작위 팔 방문에 의한 확률은 <1%(4/8 x 3/7 x 2/7 x 1/7 = 0.87%)입니다. 따라서 9일간의 테스트 기간의 마지막 2일 동안 마우스가 도달한 평균 일일 성공률 점수(>80%)와 완벽한 시험 점수의 백분율(>60%)(그림 4A,B)은 작업 기억 기반 전략을 통해서만 일관되게 달성될 수 있습니다.

작업에 익숙한 쥐는 모든 보상을 소비한 후 마지막 먹이 우물이나 중앙 허브에서 배회하는 경향이 있었고, 또한 작업이 끝날 때 추가 4개의 팔 방문에 더 많은 시간을 보내는 경향이 있습니다(그림 4G), 각 팔에는 단 하나의 보상이 포함되어 있다는 "규칙"을 배웠음을 시사합니다. 또한 그들은 사용 가능한 모든 무기를 방문했다는 사실을 추적할 수 있었습니다. 여기에 사용된 것과 다른 유전적 배경을 가진 마우스(C57BL/6)의 경우, 행동 실험에서 유전적 배경이 중요하기 때문에 결과가 달라질 수 있습니다 56,57,58. 그러나 우리의 이전 연구⁵⁰에서 혼합된 C57BL/6, CBA, 129P2 배경을 갖지만 C57BL/6J 마우스와 역교배한 마우스를 사용하여 작업 기억 작업 성능이 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 크게 향상되었으며, 자유 실행 동안 데이지 체인 관계에 의존하는 마우스가 더 적다는 것이 밝혀졌습니다. Koike et ^al.59는 129개의 마우스 근친 교배 아계통 모두가 DISC-1 단백질의 프레임 시프 및 절단을 유발하여 기능에 영향을 미치는 Disc-1의 엑손 6에서 25bp 결실로 구성된 Disc-1 결실 다형성을 가지고 있다고 보고했습니다^60,61. 이 돌연변이는 식욕을 돋우는 또 다른 윈-시프트 미로 작업인 T-미로 지연 교대 작업⁵⁹로 연구했을 때 작업 기억 장애를 일으켰으며, 이는 이전 연구⁵⁰에서 사용된 대조군 마우스가 근친 교배 C57BL/6 마우스보다 작업 기억 점수가 약간 낮은 이유를 설명할 수 있습니다. 우리는 체중을 85%에서 90% 사이로 유지하는 데 어려움을 겪지 않도록 항상 나이와 변형에 따라 정상 체중 범위에 속하는 마우스를 사용합니다. 새끼 크기는 NMRI⁶²라는 균주에서 어린 시절의 과잉 먹이기 때문에 공간 기억과 불안과 유사한 행동에 영향을 미칠 수 있습니다. 작은 새끼 크기는 NMRI 및 C57BL/6 마우스 계통 모두에서 과잉 수유 및 체중 증가를 유발합니다. 그러나 두 계통은 공간 학습 작업을 다르게 해결했습니다. C57BL/6 마우스는 작은 새끼 크기와 대조군 새끼 크기 사이에 차이를 나타내지 않았지만, NMRI 마우스는 Morris 물 미로(MWM) 테스트로 학습 단계에서 상당한 손상을 보였고 Y-미로 자발적 교대 작업에서는 유의하지 않았지만 약간의 손상을 보였습니다. 또한, 작은 새끼 크기는 NMRI 균주에서 MWM 및 Y-미로 테스트 후 해마 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)의 단백질 수치를 유의하게 감소시키고 해마 인터루킨-1b(IL-1b)의 단백질 함량을 증가시켰습니다. 그러나 이러한 변화는 C57BL/6 균주에서는 관찰되지 않았습니다. 생쥐의 NMRI 계통은 작은 새끼 크기로 키울 때 불안 유사 행동과 스트레스 유발 코르티코스테론 수치가 크게 증가했습니다. 대조적으로, C57BL/6 균주의 작은 새끼 크기는 불안 유사 행동과 코르티코스테론 수치를 모두 감소시켰습니다. 따라서 행동 실험을 설계할 때 마우스 계통의 새끼 크기를 고려하는 것이 중요합니다.

쥐와 생쥐의 행동 차이
대부분의 인지 작업은 원래 쥐를 위해 설계되었습니다. 또한 공간 학습/기억은 쥐에서 광범위하게 연구되었습니다. 생쥐를 위한 오늘날의 형질전환 및 게놈 변형 기술의 장점으로 인해 연구자들은 종종 쥐를 위해 고안된 프로토콜을 생쥐에 적용합니다. 그러나 쥐와 생쥐 사이에는 일관된 행동 차이가 있습니다 3,4,5,6,7. 예를 들어, 그들은 선호도 차이(쥐의 사회적 선호도와 생쥐의 음식 ^선호도)3가 있으며 서로 다른 미로 작업(물 또는 육지 미로)을 협상하기 위해 서로 다른 전략을 사용합니다.⁴. 또한 마우스는 8군 RAM ^4,8,9에서 좋은 공간 학습 점수를 달성하는 데 더 오랜 시간이 걸리는 경향이 있으며, 이는 일반적으로 마우스가 공간 학습 작업에서 쥐보다 열등한 것으로 간주되는 이유 중 하나입니다.

쥐와 생쥐는 또한 스트레스 또는 공포 관리에 대한 반응을 포함하여 일반적인 행동/성격이 다릅니다 3,4,5,6,7,10. 예를 들어, 이전 연구에서는 청소년 쥐 11,12,13,14에서 두려움 소멸 학습이 좋지 않은 것으로 나타났지만 쥐 15,16,17,18에서는 그렇지 않았습니다. 또한, 쥐는 쥐에 비해 스트레스를 받기 쉽고, 다루어지는 것을 좋아하지 않는데, 쥐는 다루기에 익숙할 때 핸들러에게 간지럽히는 것을 즐기고 더 많은 간지럼을 위해 핸들러와 상호 작용하려고 시도하는 것으로 보입니다¹⁹. 따라서 공포 관리는 쥐의 행동을 연구할 때 고려해야 할 중요한 요소입니다. 또한, Borrow et ^al.63은 만성 가변 스트레스가 옥시토신 mRNA를 감소시키고 뇌실주위 핵에서 옥시토신 뉴런의 체세포 부피를 증가시킨다고 보고했습니다. 또한 최근 연구에 따르면 터널 핸들링은 행동 실험에서 스트레스를 줄이고 성능을 향상시킬 수 있습니다 38,39,40. 따라서 행동 실험 중 또는 그 전에 마우스에게 스트레스를 주지 않는 것이 중요합니다.

마우스는 예를 들어 개방된 필드 테스트 또는 고가 미로에서 야외에 노출되는 것을 좋아하지 않으며, 더 밀폐되고 어두운 장소를 선호합니다^64,65. RAM의 맥락에서 중앙 허브는 가장 열린 공간이며 쥐가 다음에 방문할 팔을 결정하는 곳은 거기에서 입니다. 중앙 허브에서 불안해하면 업무에 주의가 산만해져 수준 이하의 성과를 낼 수 있습니다. 이러한 이유로 우리는 쥐가 허브를 두려운 경험과 연관시키지 않도록 중앙 허브가 아닌 방사형 팔 중 하나(절차 부분 참조)에서 쥐를 잡기로 결정했습니다.

음식 보상을 위해 8팔 RAM을 탐색할 때 주어진 팔에서 나오는 쥐는 다음 팔 방문을 위해 직각으로 회전하는 경향이 있으며 중간에 있는 팔을 건너뛰고 팔을 순차적으로 방문하는 경우는 거의 없습니다(우리가 "데이지 체인"이라고 부르는 것). 즉, 쥐는 1,2,3,4 20,53,66이 아닌 1,3,5,7 순서로 방문하는 경향이 있습니다. 대조적으로, 쥐는 아마도 신체 크기와 유연성 때문에 데이지 체인 전략을 채택하는 경우가 많습니다. 데이지 체인 전략은 생쥐가 먹이 보상을 회수하는 데 상당히 비용 효율적인 방법이지만, 실험의 목적을 회피하기 때문에 공간 작업 기억을 테스트하려는 실험자에게는 상당한 단점이다⁶⁷. 그러나 스트레스 노출은 학습 능력에 영향을 미치고 학습 전략을 변화시킬 수 있습니다⁶⁸. 데이지 체인 접근 방식은 스트레스를 나타낼 수 있으므로 마우스가 스트레스를 받지 않도록 하는 것이 중요합니다. 우리는 마우스가 데이지 체인 전략을 사용하지 않기 때문에 작업 기억 작업 중에 마우스에게 스트레스가 없는 것으로 현재 프로토콜을 설명합니다.

마우스는 미로를 탐색할 때 근위 시각적 단서보다 원위 시각적 단서에 더 의존하는 것으로 알려져 있습니다 48,69,70. 우리는 종이에 인쇄되어 모든 팔의 뒷벽에 배치된 추가 근위 시각적 단서를 통합해도 이러한 행동이 감소하지 않는다는 것을 발견했으며, 이는 쥐에 대한 Olton et al.²⁰. 그러나 미로 내 단서로 목표 암에 비콘을 배치하면 한 실험에서 6-arm 방사형 미로 참조 기억 및 작업 기억 테스트의 작업을 해결하는 데 있어 생쥐가 미로 외 단서보다 더 많은 도움이 되었습니다⁷¹. 또한, 다른 마우스 계통은 서로 다른 시각 능력을 나타내지만⁷², Barnes 미로에서 테스트된 시공간 학습 능력과 기억력은 반드시 시각 능력을 반영하지 않았으며, 이는 BALB/c와 같이 시각 능력이 좋지 않은 마우스가 다른 뇌 과정에 의존할 수 있음을 시사합니다. 따라서 실험자는 실험에 가장 적합하기 위해 어떤 단서를 사용하고 싶은지 고려해야 합니다.

쥐를 다루는 동안 불안 감소
스트레스 처리는 동물에게 생리학적, 행동적으로 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있습니다 73,74,75,76,77. 또한, Sandi 등은 마지막 학습 시험과 프로^{브 테스트 사이에} 암컷 고양이를 스트레스 요인으로 사용하여 해마 의존성 물 미로 작업에서 쥐를 테스트함으로써 급성 스트레스로 인한 공간 기억 장애가 해마 및 전두엽 피질에서 신경 세포 접착 분자(NCAM)의 발현 감소와 관련이 있음을 입증했습니다, 해마와 전두엽 피질이 높은 수준의 스트레스에 취약하다는 것을 시사합니다. 따라서 동물 연구 내에서 및 동물 연구 간에 설명할 수 없는 변동을 피하기 위해 실험 동물의 스트레스/불안을 줄이는 것이 중요합니다. 특히 작업 기억 작업은 작업 중에 동물이 집중해야 하므로 불필요한 산만함을 피해야 합니다. 쥐의 작업 기억 또는 작업 기억과 참조 기억을 함께 테스트하기 위해 발표된 프로토콜에는 실험자가 작업이 끝날 때 미로에서 동물을 제거하는 방법, 시기, 위치와 같은 중요한 세부 정보가 포함되지 않는 경우가 많습니다. 쥐는 핸들러와 함께 쥐보다 덜 사회적이고 스트레스를 받기 쉽기 때문에 이러한 세부 사항은 쥐를 대상으로 한 실험에서 더 중요합니다. 설치류는 시간, 위치 및 관련 감정에 대한 기억을 포함하는 명시적 장기 기억의 한 형태인 일화 기억을 개발할 수 있습니다 79,80,81. 따라서 우리는 쥐가 RAM에서 모든 음식 보상을 수집한 직후 미로에서 쥐를 제거하지 않고 대신 음식 보상을 얻지 못한 채 팔을 네 번 방문하도록 허용했습니다. 이는 마우스가 모든 보상의 성공적인 회복을 실험자에게 잡힐 수 있는 두려운 경험과 연관시키는 것을 방지하기 위해 수행되었으며, 이는 특히 RAM에서 학습의 초기 단계에서 중요합니다. 또한, 보상되지 않은 추가 4번의 팔 방문은 생쥐가 이전에 방문한 팔에서 음식 보상이 보충되지 않는다는 사실을 강화할 수 있습니다. 쥐를 다루는 것이 너무 스트레스가 되지 않으면 실험자와 더 자주 상호 작용합니다³⁸. 스트레스를 피하기 위해, 실험³⁸을 위해 그룹화된 케이지에서 분리되었을 때 제공된 홈 케이지에 있는 종이 튜브를 사용하여 RAM 실험 시작 시 홈 케이지에서 마우스를 들어 올리거나, 그렇지 않으면 실험 전에 홈 케이지에서 마우스를 다룰 때, 그리고 홈 케이지에서 미로로 데려올 때 마우스가 자발적으로 실험자의 손 위로 올라가도록 허용합니다. 실험이 끝날 때 미로에서 쥐를 회수할 때는 미로 안에서 쥐를 쫓지 말고 한 손으로 미로 팔 입구를 막고 쥐가 자발적으로 올라가도록 하고, 다른 손으로 미로 팔을 덮어 쥐가 미로 밖으로 튀어나오지 않도록 합니다. 이렇게 하면 미로에서 쫓기거나 꼬리에 잡히는 스트레스가 줄어듭니다. 남성 실험자는 때때로 쥐와 관련된 여성 실험자보다 더 스트레스를 유발합니다⁸². 그러나 여기에 설명된 스트레스 감소 단계에 주의를 기울임으로써 남성 실험자는 큰 문제 없이 RAM 테스트를 수행할 수 있다는 것이 밝혀졌습니다. 따라서 쥐를 다루는 방법이 더 중요합니다.

성별 차이
여기에 보고된 실험에서는 성별이 다양한 종(설치류 및 인간)에서 관찰되는 인지, 학습 및 기억에 미치는 다양한 영향과 스트레스 대처 반응이 수컷과 암컷 간에 다르기 때문에 수컷 마우스만 사용됩니다 63,83,84,85,86,87. 그러나 설치류에서 얻은 결과를 인간에게 미칠 수 있는 이점에 대해 해석할 때 남녀 모두를 연구하는 것이 중요합니다. NIH 및 기타 자금 지원 위원회의 지침에서도 수컷과 암컷 동물을 모두 사용할 것을 제안합니다.

프로토콜의 장점
우리의 반자동 8팔 방사형 미로는 불투명한 흰색 아크릴 벽이 있지만 뚜껑이 없는 밀폐된 미로입니다(치수는 그림 1A 참조). 미로를 탐색하는 동안 생쥐는 실험자를 볼 수 없어 투명한 벽이나 팔이 열려 있는 미로에서는 주의를 산만하게 할 수 있지만 미로 위의 원위 미로 외 시각적 신호는 볼 수 있습니다( 그림 1 참조). 또한, 이 프로토콜은 원칙적으로 미로 위에 배선이 없고 마우스가 작업을 효율적으로 학습할 수 있기 때문에 실시간 생체 내 이미징 및 전기생리학에 적용할 수 있습니다.

향후 방향
현재 프로토콜은 습관화부터 작업 기억 작업 종료까지 15일입니다. 우리는 주말에 쉬지 않고 프로토콜을 수행했습니다. 그러나 6일간의 습관화 후 주말 휴식을 취하는 것은 다음 9일간의 작업 기억 작업에 큰 영향을 미치지 않아야 합니다. 9일간의 작업 기억 작업 중 주말 휴식을 취하면 생쥐의 학습 속도가 느려질 수 있습니다. 따라서 쥐를 다루는 데 잘 훈련된 두 명의 실험자를 두면 쥐의 학습 속도를 늦추지 않으면서 실험자의 스트레스를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 그림 4A, B에 따르면, 마우스는 4일째 이후 평균적으로 한 번 이상의 완벽한 시도를 달성하기 때문에 처음 3일이 중요합니다. 따라서 처음 3일 동안은 휴식을 피하는 것이 좋습니다. 관심 있는 쥐에게 작업 기억 작업이 너무 쉬운 경우 강제 실행 후 제한 시간을 늘려야 할 수 있습니다. 개별 사례에 맞게 조정해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
동맥 겸자 또는 펜치	Any	N/A	표준 차우 절단용
C57BL/6J 마우스	슨 실험실	후 2~3개월 생	000664잭
유(카네이션)	네슬레	N/A	과제의 보상으로 사용
류수	Any	N/A	연유의 세척 및 희석제용
EthovisionXT13	Noldus	N/A	로 문 및 추적 마우스 제어
- 다중 신체 포인트 모듈	Noldus	N / A	다중 신체 포인트 추적 -
Trial & 하드웨어 제어 모듈	Noldus	N/A	평가판 및 하드웨어 제어
-- I/O 상자	Noldus	N/A	미로 문 제어
Extramaze 시각적 신호	Any	N/A	마우스로 미로 매핑 고
해상도 카메라	Tracksys	N/A	마우스 추적 및 촬영 페인트
브러시	N/	A	청소 종
이 터널	N	/A	마우스 취급
종이 이글루	모든	N/A	중첩용
이 중첩 줄무	늬 모든	N/A	중첩
용 Pipetteman P1000	길슨	F144059M	가정용 케이지에 희석된 연유를 제공하기 위해
피펫 팁 P1000	모든
피펫맨 P200	길슨	F144058M	미로
피펫 팁 P200	모든
방사형 암 미로	트랙시스	N/A	맞춤형
룸 램프	모든	N/A	수 미로의 조명
작은 플라스틱 컵	모든	N/A	가정 케이지에 희석된 연유 제공
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