방법 논문

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

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DOI:

10.3791/66461

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2024년 2월 9일

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1ITMO University, 2University of Central Florida

이 논문에서

요약

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

초록

DNA 및 RNA 염기서열(분석물) 검출을 위한 DNAzyme 기반 나노머신(DNM)은 올리고뉴클레오티드로 만들어진 다기능 구조입니다. 이들의 기능에는 긴밀한 분석물 결합, 고도로 선택적인 분석물 인식, 형광 리포터 기판의 다중 촉매 절단에 의한 형광 신호 증폭, 센서 응답 증가를 위한 형광 기판 인력이 포함됩니다. 기능 단위는 협력 작용을 위해 공통 DNA 지지체에 부착됩니다. RNA 절단 10-23 DNM은 비촉매 혼성화 프로브에 비해 감도가 향상되었습니다. DNM의 안정성과 기질 인식의 증가된 기회는 이중 가닥 DNA 단편인 타일에 의해 제공됩니다. DNM은 접힌 RNA와 이중 가닥 DNA에서 단일 뉴클레오티드 차이로 두 개의 분석물을 구별할 수 있으며 다른 단백질이 없는 혼성화 프로브보다 ~1000배 낮은 농도의 분석물을 검출할 수 있습니다. 이 기사에서는 DNA-nanomachine 활성의 진단 잠재력에 대한 개념을 제시하고 핵산 검출 분석에서 DNM 설계, 조립 및 응용 분야에 대해 간략하게 설명합니다.

서론

핵산 검출을 위한 가장 초기의 방법 중 하나는 분석된 RNA 또는 DNA 염기서열에 대한 선택적 올리고뉴클레오티드의 상보적 결합입니다. 이 방법은 표적 DNA 또는 RNA 분석물1과 Watson-Crick 염기쌍을 형성할 수 있는 핵산 단편(프로브)을 사용합니다. 그런 다음 복합체는 다양한 기법으로 분석물 및 결합되지 않은 프로브와 구별됩니다. Northern blotting, in situ hybridization 또는 qPCR과 같은 특정 방법은 complementary binding2 현상을 기반으로 합니다. 가장 일반적인 hybridization probe에는 두 가지 중요한 단점이 있습니다: 낮은 감도(마이크로몰에서 나노몰 수준에 도달할 수 있음)와 점 돌연변이를 포함한 단일 뉴클레오티드 변이(SNV)에 대한 낮은 선택성. 이 문제는 이러한 단점에 대한 해결책이 서로 충돌하기 때문에 정교한 접근 방식이 필요합니다3. 최상의 선택성을 제공하기 위해, 검출 올리고뉴클레오티드는 일치하지 않는 분석물질과 불안정한 하이브리드를 형성할 수 있을 만큼 충분히 짧게 유지되어야 합니다. 이러한 짧은 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산을 단단히 결합하고 이들의 2차 구조를 풀어줄 수 없기 때문에 종종 검출 가능한 신호를 제공하지 못합니다. 생물학적 RNA 또는 이중 가닥 DNA(dsDNA)에서 CG가 풍부한 단편을 검출하는 것은 특히 어렵습니다. 반면에 긴 프로브는 SNV3에 둔감합니다. 교착 상태를 깨기 위해 바이너리 프로브의 개념이 개발되었습니다4.

바이너리 센서는 단일 검출 프로브를 두 조각으로 분할하고 그 조각을 전문화하여 그 중 하나가 헤어핀을 풀거나 dsDNA에 침입할 수 있도록 길게 유지합니다. 두 번째 바이너리 프로브 단편은 미스매치 염기에 민감하도록 짧게 유지되므로 SNV를 검출하기 위한 수단을 제공합니다. 두 개의 이진 센서 부품이 함께 결합되면 신호가 생성됩니다4. 전체 복합체는 FRET5, 분자 비콘 프로브 6,7 또는 과산화효소 유사 활성이 8,9,10인 G-quadruplexes 또는 RNA 절단 11,12,13 DNAzyme을 통해 시각화할 수 있습니다. 10-23 DNAzyme 코어가 있는 바이너리 센서에 대해 충분히 설명되었습니다. 이들은 합성적으로 생성된 단일-가닥 핵산 단편(11) 또는 단일-가닥 증폭 산물(14,15)을 검출하도록 조정되었다. 예를 들어, 세포 배양에서 추출된 16S rRNA의 경우, 이 분자가 세포(12,16)에 풍부하기 때문에 증폭 없는 검출도 가능합니다. 10-23 DNAzyme 코어가 있는 Binary 센서는 납 이온17과 같은 비핵산 검출에도 적용할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 낮은 감도는 여전히 바이너리 10-23 DNAzyme 센서의 주요 단점 중 하나로 간주되고 있으며, 이 문제를 해결하기 위해 캐스케이드(cascades)18 또는 대체 신호 향상 방법(alternative signal-enhancing methods)19을 포함한 다양한 접근법이 개발되었다. 불행히도 위의 기술은 센서 구성 요소의 비용과 불안정성을 크게 증가시켜 실용화되지 않았습니다.

이 연구에서 설명 된 실험은 DNA-nanomachines (DNM) 20,21이라고하는 10-23 개의 DNA 효소 기반 DNA-nanosensor를 사용합니다. 이러한 구조에는 바이너리 센서와 (1) 바이너리 프로브 측면에 위치하여 구조화된 영역을 풀고 이중 가닥 DNA로 침입하는 DNA 촉진자, (2) 모든 DNM 부품을 근접하게 유지하고 신호 형성 가능성을 높이는 DNA 타일이 포함됩니다(그림 1). 전체적으로, 10-23개의 DNAzyme-based DNM은 검출 한계(LOD)를 피코몰 범위(21)까지 감소시킵니다. 이들은 세포 용해물22에서 16rRNA를 검출하거나 증폭 없이 바이러스 RNA의 존재를 보고하는 데 사용할 수 있습니다23,24. 동시에 DNM은 SNV에 민감하게 유지되며 이형접합 유기체의 유전자형 대립유전자형에도 사용할 수 있습니다25. DNM 분석법은 선택성이 높은 복잡한 혼합물에서 제품을 식별하거나 제품을 시각화하기 위한 모든 증폭 유형에 대한 보완 기법으로 사용할 수 있습니다. DNM은 기존의 TaqMan 및 비콘 프로브와 달리 시료를 가열할 필요가 없으므로 종점 검출 프로토콜에 사용할 수 있어 전체 검출을 비용 효율적으로 수행할 수 있습니다.

이 기사에서는 DNM의 인실리코(in silico ) 개발에 대해 설명하고 DNM의 조립 및 기능 특성화 절차를 보여줍니다. 이 작업은 바이러스 DNA(OR652423.1)의 위치 13972-14154에 해당하는 엡스타인-바 바이러스(EBV)의 합성 단편을 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조).

프로토콜

1. DNM 설계

  1. 관심 게놈 내에서 고유한 영역을 선택합니다.
    참고: 이 작업은 위치 13972-14154(OR652423.1)의 엡스타인-바 바이러스(EBV) 게놈 영역을 사용합니다.
  2. 예를 들어 Ugene26에 내장된 Primer3 도구를 통해 선택한 단편의 증폭을 위한 프라이머 세트를 생성합니다.
  3. UNAFold 웹 도구27 ( 재료 표 참조)을 열고 선택한 영역을 삽입합니다. 접힘 온도를 55°C로, 이온 조건을 250mM의 1가 이온, 200mM의 Mg2+로 변경합니다.
    1. 생성된 ssDNA 단편의 2차 구조를 열고 안정적인 헤어핀을 선택합니다. DNA-나노머신의 결합 부위를 구조화되지 않은 영역 또는 헤어핀 구조의 루프에 위치시켜 표적의 더 강력한 결합을 달성합니다.
  4. 표적 분석물 부위가 스템 루프 구조로 접혀 있는 경우 Arm 1과 2를 다음과 같이 배치합니다: Arm 2가 스템의 한쪽 면, 루프 및 두 번째 스템 면의 3-5nt와 결합하는지 확인합니다. 암 1은 두 번째 줄기 쪽의 조각을 결합합니다.
  5. DinaMelt 도구28 ( 재료 표 참조)을 열고 팔의 서열과 이의 역보수 서열을 분석합니다. DinaMelt 도구를 사용하여 Arms 2 및 3의 Tm이 65°C 이상, 즉 분석 온도(55°C)보다 10°C 이상 높은지 확인합니다.
    1. 높은 인식 선택성을 달성하려면 Arm 1의 Tm을 반응 온도(55°C)보다 최소 1-3°C 높게 유지하십시오29.
  6. Arms 1 및 2 염기서열을 DNAzyme 코어의 절반 및 F-sub 결합 단편13과 결합합니다.
  7. UNAFold27을 사용하여 설계된 DNA 가닥의 2차 구조를 분석합니다.
    참고: 55°C(분석 온도), 200mM Mg2+, 250mM 1가 이온(HEPES, Na+, K+).
    1. 폴딩 ΔG가 -4kcal/mol 미만인 경우에만 디자인을 사용하십시오. CG가 풍부한 긴 시퀀스는 피하십시오. 2차 구조가 너무 안정되면 Arm에 돌연변이를 도입하여 접힘 ΔG30을 증가시킵니다. 대안적으로, Arm 3을 Arm 2에서 2-3 nt 떨어진 곳에 배치하는 것은 안정적인 분자간 구조를 피하기 위해 Arm 3 서열을 변경하는 또 다른 전략입니다.
  8. Arm 3만큼 긴 DNA 타일 조각에 대한 무작위 염기서열을 생성합니다. (dT)4-6 또는 에틸렌 글리콜(예: 트리에틸렌 글리콜(TEG) 또는 헥사에틸렌 글리콜(HEG))을 통해 Arm 3 서열을 DNA 타일 서열과 결합합니다. 실험에 제시된 DNM 버전은 (dT)6을 사용합니다.
  9. 링커를 통해 단계 1.8에서 선택된 DNA 타일 단편에 상보적인 서열과 Arm 2를 연결합니다.
  10. UNAFold 웹 앱을 사용하여 설계된 DNA 가닥의 2차 구조를 분석합니다. 각 DNA 가닥의 접힘 에너지가 55°C에서 4kJ/mol 이상인지 확인하고 긴 CG 농축 염기서열을 피하십시오. 바람직하게는, DNA 타일 서열을 변경하십시오.
  11. 사용 가능한 벡터 그래픽 소프트웨어를 사용하여 구조를 그립니다. 이 글에서는 시각화를 위해 Biorender와 Pixelmator Pro를 사용합니다( 재료 표 참조). 각 가닥에 대해 5'->3' 방향으로 정확도를 확인합니다.
    참고: 신뢰할 수 있는 상용 공급업체에서 시퀀스를 구하십시오.

2. DNM의 기능 테스트

  1. 완충액 및 시약의 준비
    1. 50mM HEPES(pH 7.5-7.8), 50mM NaCl, 150mM KCl 및 200mMMgCl2로 구성된 반응 완충액을 준비합니다. 최대 50mL의 탈이온수를 채웁니다.
    2. Dzb-Tile 및 Tile-Arm3 올리고뉴클레오티드의 10μM 부분 표본을 준비합니다. Dza의 1 μM 용액, 100 μM F-sub 및 1 nM, 10 nM, 100 nM 분석물을 RNase/유리수 또는 멸균 탈이온수에 준비합니다. 올리고뉴클레오티드 서열의 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.
  2. DNM 어셈블리
    1. 사용하기 전에 올리고뉴클레오티드 용액을 완전히 해동하십시오. 두드려서 부드럽게 섞습니다(과도하게 소용돌이치지 않음). 마이크로 원심분리기를 사용하여 용액을 (몇 초 동안) 스핀 다운합니다.
    2. 0.5mL 미세 원심분리기 튜브의 반응 완충액 200μL에 Dzb-Tile과 Tile-Arm3 각각 1μM를 혼합합니다.
    3. 튜브를 부드럽게 섞고 용액을 회전시킵니다.
    4. 닫힌 튜브의 뚜껑을 파라핀 필름으로 감쌉니다. 또는 스크류 캡 튜브를 사용하십시오.
    5. 끓는 물과 함께 500mL 비커에 튜브를 2분 동안 배양한 다음 히터를 끄고 밤새 온도를 수동적으로 식힙니다.
    6. 12% 네이티브 PAGE 준비: 10х TBE 완충액 1mL, 40% AA:BA 3mL, 최대 10mL의 탈이온수, APS 50μL 및 TEMED 5μL를 혼합합니다( 재료 표 참조). 혼합물을 겔 카세트로 옮기고 중합시킵니다.
    7. 각 샘플 1μL, 즉 조립된 DNM, Dzb-Tile 및 Tile-arm3를 1μL의 4x 로딩 염료와 혼합하고 겔에 로드합니다.
    8. 카세트를 챔버에 넣고 1x TBE 버퍼로 채우고 겔을 80V에서 90분 동안 작동시킵니다.
    9. 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고 겔 문서화 시스템을 사용하여 시각화합니다( 재료 표 참조).
  3. LOD 어세이
    1. 반응 완충액에서 160μL의 200nM F-sub를 준비합니다. 이는 기판 안정성의 기본 배경을 평가하기 위해 수행됩니다.
    2. 반응 완충액에서 20nM의 DNM 및 Dza와 200nM의 F-sub 농도로 사전 조립된 DNM, F-sub 및 Dza 160μL의 7개 부분 표본을 준비합니다. 7개의 튜브 중 튜브 #1을 빈 배경으로 유지하여 DNAzyme 코어의 자발적 조립을 평가합니다.
    3. 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM 및 1000 pM의 최종 농도로 분석물을 튜브 #2-7에 추가합니다.
    4. 튜브를 부드럽게 혼합하고 회전시킨 다음 용액을 50μL 부분 3개로 분류하여 검은색 96웰 플레이트에 넣습니다. 광학적으로 투명한 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
    5. 플레이트를 55°C의 수조에서 1시간 동안 배양합니다. 접시를 아래로 돌립니다.
    6. 525nm(λex = 495nm)에서 형광을 측정합니다. 각 점의 평균과 표준 편차를 계산합니다.
    7. F-sub 및 DNM이 포함된 튜브의 신호를 F-sub만 포함된 튜브의 신호로 나누어 블랭크 대 기본 비율을 계산합니다. 비율이 1.1-1.5 범위 내에 있는지 확인합니다.
    8. F-sub, DNM 및 분석물을 포함하는 튜브의 신호를 F-sub 및 DNM만 포함하는 튜브의 신호로 나누어 신호 대 블랭크 비율을 계산합니다. 신호가 배경 평균에 3 표준편차를 더한 값보다 높으면 참양성으로 간주합니다.
    9. 실험을 두 번 반복하고 분석 반복 간의 표준 편차가 0.5 미만인지 확인합니다.

결과

첫 번째 실험의 목적은 분석물의 합성 단편보다 먼저 DNM의 조립을 보여주는 것이었습니다. 모든 구성 DNM 가닥을 반응 완충액에 첨가하고 비커에 조립했습니다. 조립된 DNM 복합체는 네이티브 PAGE에 의해 정확한 크기와 균질성을 평가받았습니다. Native PAGE는 레인 1에 분석물질이 있는 조립된 DNM과 레인 2 및 4에 있는 두 개의 DNM 가닥을 보여줍니다. DNA nanomachine가 조립되지 않는 경우에, 단 하나 낮 기동성 악대 대신에 2개 또는 3개의 따로 있는 악대를 볼 수 있을 것입니다 ( 그림 2A에 있는 lane 2).

프로토콜의 두 번째 부분은 DNM 성능 및 표적 핵산 검출의 기능적 특성을 의미합니다. 이 연구에서는 EBV 13972-14154의 합성 단편을 사용했습니다. 이를 위해 사전 조립된 DNM의 단편을 Dza와 함께 55°C에서 1시간 동안 다양한 농도의 분석물로 배양했습니다. 두 개의 제어 형광 신호 값을 측정하여 분석물이 없는 사전 조립된 DNM의 단편 및 Dzb(blank)와 F-sub의 배경(basic)을 측정했습니다. 세 가지 기술적 측정이 이루어졌습니다. 통계에 관해서는, 3건의 독립적인 임상시험도 수행되었다. 이 연구에서 마그네슘 농도가 문헌30에서 찾을 수 있는 것보다 높다는 점은 주목할 만합니다. 높은 수준의 마그네슘 이온은 자발적인 F-sub 절단(31)을 촉진하기 때문에 모든 시험관에서 신호를 증가시킨다. 우리는 기술 개발의 예비 단계에서 반응 완충액 조성을 최적화했으며 수행된 모든 연구에서 이 프로세스를 반복하지 않았습니다.

1시간 배양 후, 분광형광계(spectrofluorometer)를 사용하여 시료 형광을 측정하였다( 재료 표 참조). DNM에 의한 분석된 DNA의 검출을 확인하기 위해 분석된 DNA와 조립된 센서의 형광 신호와 분석물이 첨가되지 않은 음성 대조군의 형광 신호를 비교했습니다. 신호-블랭크 비율(분석물을 포함하는 웰과 분석물이 없는 웰의 평균 상대 형광 단위 사이의 비율)은 성공적인 검출을 확인하기 위해 1.5 이상이어야 한다(32). 블랭크 대 염기성 비율(분석물이 없을 때 센서 응답의 형광을 F-sub 전용 대조군의 형광으로 나눈 값)은 1.1-1.5 범위여야 합니다. 이 비율은 DNM 및 Dzb 농도를 변경하여 조정할 수 있습니다(각각의 일반적인 농도 범위는 5-20nM임). 우리의 관행에서 LOD는 추세선의 교차점과 평균 블랭크 위의 3 표준 편차로 정량화됩니다(그림 2B). DNM은 LOD가 <100pM33인 경우에 효과적이다. LOD가 100pM보다 높은 경우 DNM을 다시 설계해야 합니다.

figure-results-1
그림 1: 이 연구에 사용된 3개 암 DNM. Dza, Dzb-Tile 및 Tile-Arm3의 세 가지 올리고뉴클레오티드는 각각 녹색, 파란색 및 자주색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: DNM 특성화. (A) 50 bp+ DNA ladder를 사용하여 12% 폴리아크릴아미드 겔, 80V, 1시간에서 천연 전기영동을 통해 DNM 조립. (B) 55°C에서 60분 배양 후 합성 DNA의 검출 한계. 수평선은 임계값을 나타내고 수직선은 LOD를 나타냅니다. 3개의 독립적인 측정의 평균값은 1개의 표준 편차로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

DNA 기계의 설계는 간단하지만 혼성화 프로브 또는 기능적 DNA 나노 구조를 설계하는 데 약간의 경험이 필요합니다. 분석물 단편을 가능한 한 짧게 유지하여 가능한 2차 구조의 수를 줄이고 2차 구조에 대한 DNM 침습을 단순화하는 것이 적절합니다. CG 함량은 안정적인 분자 내 구조를 피하기 위해 60% 미만인 것이 바람직합니다. DNM의 성공적인 조립은 느린 냉각 속도에서 달성됩니다. 경우에 따라 DNM을 튜브에 자발적으로 조립할 수 있으며 어닐링 단계를 제거할 수 있습니다. DNM 조립은 0.1-0.3 °C/min의 열 순환기 또는 대량의 냉각수에서 수행할 수 있습니다. 부적절한 DNM 조립의 경우 어닐링 단계에서 온도 변화를 늦추는 것이 좋습니다.

LOD를 측정하려면 선형 의존성을 관찰하기 위해 0 pM 분석물 농도(F-sub + DNM)와 1nM에서 1pM 범위의 6가지 다른 분석물 농도 등 최소 7개의 분석물 농도 포인트가 필요합니다(그림 2B). 정확도를 높이기 위해 7개 이상의 집중점이 사용되는 경우가 많았습니다. 각 농도 포인트에 대해 3번의 기술 시험(각각 50μL)을 수행해야 합니다. 따라서 각 농도에 대한 총 부피는 160μL(피펫 오류를 고려한 10μL 초과)였습니다.

DNM 기법은 다른 하이브리드화 기반 시스템보다 SNV에 대해 더 높은 감도를 제공합니다. SNV에 대한 높은 선택성은 박테리아 유전형 분석(22 )과 관련된 점 돌연변이의 식별 또는 식물(25)에서 이형접합체의 선택과 같은 특정 목표에 관련될 수 있습니다. 비특이적 분석물질은 동일한 실험 절차가 필요합니다. 낮은 농도의 분석물에 대한 SNV의 오해를 피하기 위해, 실험적 미지의 분석물의 신호를 동일한 농도의 알려진 완전히 상보적인 분석물의 신호와 비교하는 것이 좋습니다.

이 분석법은 ssDNA, miRNA, 접힌 RNA 또는 dsDNA 앰플리콘에 성공적으로 적용할 수 있습니다. 긴 RNA 또는 dsDNA 단편, 특히 CG가 풍부한 단편에는 4-6개의 분석물 결합 암이 장착된 DNM이 필요할 수 있으며, 불안정한 2차 구조(ΔG 폴딩이 -10kcal/mol 이상)인 단일 가닥 분석물에는 2개의 분석물 결합 암이 충분합니다. 이 방법은 PCR, SDA 또는 LAMP 증폭기의 검출에 적용할 수 있습니다. DNM은 총 RNA 22,34,35를 분리하지 않고 박테리아 배양의 끓인 샘플에서 rRNA를 증폭 없이 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 펨토몰 수준만큼 낮은 농도와 측면 영역의 CG 함량이 65% 이상인 dsDNA 단편에서는 잘 작동하지 않을 수 있습니다. CG 함량은, 예를 들어, 생물학적 제제 CG 함량 계산기(36)를 이용하여 추정할 수 있다. 감도를 높이거나 CG 함량이 높은 경우 dsDNA를 ssDNA로 변환하기 위해 DNM 디자인에 후크 부품37을 추가하는 것이 좋습니다. 이 방법의 또 다른 한계는 DNM이 샘플의 품질에 민감하기 때문에 핵산을 신중하게 정제해야 한다는 것입니다. DNM의 올리고뉴클레오티드 서열의 품질에도 동일하게 적용됩니다. 따라서 모든 올리고뉴클레오티드 공급의 안정성과 순도를 검증하는 것이 제안됩니다. 기존의 증폭 기술과 비교했을 때, DNM의 설계에는 기술이 필요하며, 논문 발표 시점에는 거의 전적으로 수작업으로 이루어집니다. DNM은 실제 DNA 또는 RNA 샘플에 적용하기 전에 합성 단편에 대한 몇 가지 예비 테스트가 필요하므로 테스트 시스템 개발의 전체 기간이 늘어납니다.

이 방법은 다재다능하며 다양한 유형의 리포터 프로브를 채택할 수 있습니다. 이는 다중화(38)될 수 있으며, F-sub가 G-쿼드러플렉스 형성 기판(39)으로 대체되면 이 기술은 비색 버전으로 변형될 수 있다. 중합효소의 존재는 가닥 성장의 오류와 관련이 있습니다. 따라서, 이 방법은 종래의 Real-Time PCR 및 디지털 PCR뿐만 아니라 SHERLOCK 및 DETECTR과 같은 다른 뉴클레아제-의존성 기술에 비해 유리하며, 이는 부패하기 쉬운 단백질 효소의 부족 및 견고하고 간단한 검출 절차(40,41)로 인한 것이다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자들은 EBV의 gDNA를 친절하게 제공해 준 예카테리나 V. 니키티나(Ekaterina V. Nikitina)에게 감사를 표한다. 무한나드 아테이아(Muhannad Ateiah), 마리아 Y. 베레조프스카야(Maria Y. Berezovskaya), 마리아 S. 루벨(Maria S. Rubel)은 러시아 연방 교육과학부(Grant No FSER-2022-0009)와 Priority 2030 프로그램에 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 튜브BiofilCFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µ L 피펫KirgenKG-Pro1000
10-100 µ L 피펫KirgenKG-Pro100
1-10 µ L 피펫KirgenKG-Pro10
20-200 µ L 피펫KirgenKG-Pro200
2-20 µ L 피펫KirgenKG-Pro20
4x 젤 로딩 염료EvrogenPB020
아크릴아미드 4KAppliChemA1090,0500
과황산암모Carl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
비사크릴아미드몰레쿨라22797959
붕산TechSnabH-0202
ChemiDoc 이미징 시스템BioRad12003153
Costar 96-Well Black 폴리스티렌 플레이트CorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
에티듐 브로마이드BioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
염화 마그네슘AppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
피펫 10 µ L 팁KirgenKG1111-L
피펫 1000 &마이크로; L 팁KirgenKG1636
피펫 200 &마이크로; L 팁KirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator 팀https://www.pixelmator.com/pro/
염화칼Carl Roth1782751
PowerPac 기본 전원 공급 장치BioRad1645050
RNAse/DNAse 자유 물Invitrogen10977049
PCR 플레이트용 밀봉 필름SovtechP-502
염화나트륨VektonHCh (0,1)
Spark 다중 모드 마이크로플레이트 리더TecanSpark- 10M
T100 증폭기BioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNA폴드RNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
수조LOIPLB-140
Oligos 사용
Analyte:Evrogendirect order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogen직접 주문, 표준 탈염 정제
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogen직접 주문, 표준 탈염 정제
F-sub 올리고뉴클레오티드: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntez직접 주문, HPLC 정제
늄 륨

참고문헌

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
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