여기에서는 광열 오프-레조넌스 태핑(PORT)을 통한 생체 분자 상호 작용을 관찰하기 위한 이미징 프로토콜을 보여주며, 이미징 매개변수를 최적화하고, 시스템 한계를 식별하고, 이미징 3점-별 DNA 모티프 어셈블리의 잠재적 개선 사항을 조사했습니다.
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방법 논문
High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping(광열 오프-레조넌스 태핑을 이용한 DNA 3점-별 모티프 자기 조립)
이 논문에서
요약
초록
고속 원자력 현미경(HS-AFM)은 액체 환경의 생리학적 조건에서 이미징할 수 있는 기능으로 인해 단일 분자 생물학적 프로세스를 실시간으로 시각화하는 데 널리 사용되는 분자 이미징 기술입니다. 광열 오프 레조넌스 태핑(PORT) 모드는 구동 레이저를 사용하여 제어된 방식으로 캔틸레버를 진동시킵니다. 이 직접 캔틸레버 작동은 MHz 범위에서 효과적입니다. 공진 진폭이 아닌 시간 도메인 힘 곡선에서 피드백 루프를 작동하는 것과 결합된 PORT는 팁 샘플 힘을 직접 제어하여 초당 최대 10프레임의 고속 이미징을 가능하게 합니다. PORT는 섬세한 조립 역학의 이미징과 생체 분자에 의해 형성된 패턴의 정밀한 모니터링을 가능하게 하는 것으로 나타났습니다. 지금까지 이 기술은 이 작업에서 보여준 DNA 3점-별 모티프 조립 패턴을 포함하여 다양한 동적 체외 연구에 사용되었습니다. 일련의 실험을 통해 이 프로토콜은 HS-PORT AFM 이미징 시스템의 최적 이미징 매개변수 설정과 궁극적인 한계, 그리고 이것이 생체 분자 조립 프로세스에 미치는 영향을 체계적으로 식별합니다. 또한, 구동 레이저가 샘플과 주변 액체에 미치는 잠재적인 원치 않는 열 효과를 조사하며, 특히 스캔이 작은 영역으로 제한되는 경우 더욱 그렇습니다. 이러한 결과는 복잡한 생물학적 시스템을 연구하는 데 PORT 모드 적용의 발전을 주도할 귀중한 통찰력을 제공합니다.
서론
고속 원자력 현미경 (HS-AFM)은 빠르게 성장하는 이미징 기술입니다 1,2,3,4. 연구자가 생체 분자 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있는 속도로 작동합니다 5,6,7,8,9. 광열 오프 공진 태핑 (PORT)은 피크 포스 태핑 10,11, 펄스 포스 모드 12,13 또는 점프 모드14와 유사한 오프 공진 이미징 모드입니다. 그러나 PORT는 스캐너를 수직으로....
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프로토콜
1. 샘플 및 버퍼
참고 :이 연구에 사용 된 DNA 타일은 퍼듀 대학교 (Purdue University)의 마오 (Mao) 실험실에서 개발 된 3 점 별 모티프입니다19,25. 이 연구에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 Integrated DNA Technologies, Inc.에서 구입했습니다. 필요한 재료와 시약을 수집합니다.
- 어닐링 버퍼(5mM TRIS, 1mM EDTA 및 10mM MgAc2)에서 1:3:3 몰비(S1 0.6 μM, S2의 경우 1.8 μM, S3의 경우 1.8 μM)로 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 혼합합니다. DNA 모티프의 최종 농도는 0.6 μM (49 ng / μL, 3PS의 분자량은 82020.3 g / mol)이어야합니다.
- DNA 용액을 내열 용기에 넣고 80°C로 가열합니다. DNA 용액을 4시간 동안 80°C에서 20°C까지 천천히 냉각합니다. 이 어닐링 과정은 ssDNA 올리고뉴클레오티드가 원하는 이중 가닥 DNA 모티프를 형성하는 데 도움이 ....
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결과
이 조사에서 DNA 3점-별 모티프가 안정된 섬으로 동적으로 조립되는 과정을 HS-PORT AFM의 기능을 활용하여 성공적으로 관찰되었습니다. 이 기술을 통해 이러한 구조물의 조립을 실시간으로 캡처할 수 있었습니다. 그림 2A,B에서는 100kHz PORT 속도(800nm x 800nm 스캔 크기)에 대해 각각 100Hz 및 200Hz 라인 속도로 선명한 이미지 스캔을 얻을 수 있습니다. 이는 각각 픽셀당 3.9 및 1.95 진동 주기에 해당합니다. 그러나 픽셀당 최소 1회의 진동 주기를 허용하는 PORT 속도의 동시 증가 없이 더 빠른 속도로 이미징하면 그림 2C(픽셀당 진동 주기의 0.78)에서 볼 수 있듯이 이미지 품질이 크게 저하됩니다. 이미징 속도는 캔틸레버가 적절한 팁-샘플 힘 제어로 표면을 프로브하는 속도에 의해 제한되는데, 이는 지형 변화 속도가 너무 빨라서 표면 샘플링 속도로 .......
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토론
섬세한 생물학적 샘플을 이미징할 때 AFM의 오프레조넌스 태핑 이미징 모드는 팁-샘플 상호 작용력(10)을 직접 제어할 수 있기 때문에 특히 유용합니다. 그 중 PORT 모드는 도달할 수 있는 더 높은 발진율로 인해 더 높은 스캔 속도를 가능하게 하기 때문에 두드러집니다. PORT는 레이저로만 캔틸레버를 직접 작동시키기 때문에 특히 공진 주파수가 높은 초단 캔틸레버를 사용할 때 기존의 오프 레진 태핑 모드보다 훨씬 높은 주파수에서 여기가 가능합니다5. 그러나 HS-AFM용 PORT를 사용할 때는 우수한 이미징 품질을 얻기 위해 이미징 매개변수에 주의해야 합니다.
그림 2에서 볼 수 있듯이 PORT 속도를 동시에 높이지 않고 스캔 속도를 높이면 이미징 품질이 저하됩니다. 첫째, 픽셀당.......
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공개 사항
저자는 공개할 내용이 없습니다
감사의 글
저자는 이미지 시리즈 처리를 위한 Python 스크립트를 프로그래밍하는 데 도움을 준 Raphael Zingg에게 감사를 표합니다. GEF는 H2020 - UE Framework Programme for Research & Innovation (2014-2020)의 자금 지원을 인정합니다. ERC-2017-CoG; 인셀; 프로젝트 번호 773091. VC는 이 프로젝트가 Marie Skłodowska-Curie 보조금 계약 No. 754354에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 지원받았음을 인정합니다. 이 연구는 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation)의 보조금 200021_182562의 지원을 받았다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AC10DS | Olympus | BL-AC10FS-A2 | 단종 |
| 바이옴트라 컴팩트 XS/S | 바이옴트라 GmbH | 846-025-199 | 전기영동 단위 |
| Biometra TRIO | Biometra GmbH | 207072X | 써모사이클러 어닐링용 바이오 |
| 맞춤형 AFM 설정 | 실험실, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fé DÉ 랄 로잔 | 바이오-나노 계측 실험실을 통해 얻을 수 | |
| EDTA | ITW 시약 | A5097 | 담금질 버퍼 |
| 레이저 파워 미터 | Thorlabs | PM100D | 디지털 핸드헬드 광학 전력 및 에너지 계량기 콘솔 |
| Lively 3AP 전원 공급 장치, MP-310 | 주요 과학 | MP-310 | 전기 영동 전원 공급 장치 |
| MgAc2 | ABCR GmbH | AB544692 | 어닐링 버퍼 |
| TBE | Thermo Scientific | 327330010 | 전기 영동을 위한 러닝 버퍼 |
| TRIS | Bio-Rad | 1610719 | 어닐링 버퍼 |
참고문헌
- Ando, T. High-speed atomic force microscopy and its future prospects. Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).
- Uchihashi, T., Scheuring, S. Applications of high-speed atomic force microscopy to real-ti....
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재인쇄 및 허가
