방법 논문

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

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DOI:

10.3791/66479

⸱

2024년 5월 24일

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

이 논문에서

요약

지혈 혈전 형성을 위한 천자 상처 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 형성된 혈전은 크며 직경이 수백 미크론입니다. 따라서 볼륨 이미징 접근 방식이 적합합니다. 우리는 많은 사람들이 사용할 수 있는 고해상도 접근 방식으로 몽타주 광역 투과 전자 현미경을 제안하고 분취 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

초록

혈관 손상의 정상적인 생리적 조절 과정인 지혈은 인간 생활의 기본입니다. 우리 모두는 때때로 경미한 상처와 찔린 상처를 겪습니다. 지혈에서 자기 제한 혈소판 응집은 외부에서 구멍을 막음으로써 출혈 중단이 발생하는 구조적 혈전의 형성으로 이어집니다. 이 구조의 상세한 특성화는 지혈과 혈전증을 구별할 수 있으며, 혈전증은 과도한 혈소판 응집으로 이어지는 폐색성 응고의 경우입니다. 천자 상처 혈전 구조에 대한 이미징 기반 접근 방식이 여기에 제시되어 있으며, 이는 지혈 혈전의 내부를 시각화하는 얇은 단면 전자 현미경의 기능을 활용합니다. 이미징 기반 실험 프로토콜에서 가장 기본적인 단계는 우수한 시료 전처리입니다. 이 프로토콜은 후속 전자 현미경 검사를 위해 마우스의 천자 상처 및 혈소판이 풍부한 혈전을 준비하기 위한 자세한 절차를 제공합니다. 성형 천자 상처 혈전의 현장 고정 및 전자 현미경을 위한 염색 및 매립을 위한 후속 처리에 대한 자세한 절차가 제공됩니다. 전자 현미경은 순차적 절편과 결합될 때 혈전 내부의 세부 사항을 고해상도로 시각화할 수 있는 능력 때문에 말단 이미징 기술로 제시됩니다. 이미징 방법으로서 전자 현미경은 편향되지 않은 샘플링과 2차원 또는 3차원에서 나노미터에서 밀리미터까지 확장되는 실험 결과를 제공합니다. 수백 개의 프레임을 혼합하여 전체 천공 상처 혈전 단면의 나노미터 단위 이미징을 제공할 수 있는 광역 전자 현미경을 지원하는 적절한 프리웨어 전자 현미경 소프트웨어가 인용됩니다. 따라서 이미지 파일의 모든 하위 영역을 전체 횡단면의 컨텍스트에 쉽게 배치할 수 있습니다.

서론

출혈 중단으로 이어지는 천자성 상처 혈전의 형성은 인생에서 가장 중요한 사건 중 하나입니다1. 그러나 이러한 본질성에도 불구하고 정맥, 동맥, 죽상동맥경화성 사건 또는 폐색혈전 등 혈전 형성 중에 구조적으로 발생하는 것에 대한 지식은 해상도와 이미징 깊이에 의해 제한되어 왔습니다. 기존의 광학 현미경은 완전히 형성된 천공 상처 혈전과 비교할 때 깊이가 제한적이며, Z1에서 200 - 300 μm이며, 혈소판 소기관의 크기 및 그 간격과 비교할 때 해상도 수준이 30 nm 미만인 경우가 많습니다2. 이광자 광학 현미경은 필요한 이미징 깊이를 얻을 수 있지만 해상도를 크게 향상시키지는 않습니다. 예를 들어 초고해상도 기술과 같은 광학 현미경의 가장 최근 발전은 여전히 해상도가 제한되어 있으며, 실제로는 XY에서 ~20nm, Z에서 그 두 배이며 깊이가 제한되어 있어 기존 광학 현미경보다 크지 않습니다. 또한, 초고해상도 광학 현미경은 대부분의 연구용 광학 현미경과 마찬가지로 형광 현미경을 기반으로 하며, 형광 현미경 검사는 본질적으로 우수한 항체가 존재하거나 양호한 태그가 지정된 구조를 가진 작은 후보 단백질 세트에 편향된 기술입니다3. 결론적으로, 기존의 주사 전자 현미경은 기껏해야 혈소판이 풍부한 혈전을 형성하는 표면을 시각화할 수 있습니다.

혈전 구조를 특성화하는 데 있어 이러한 기술적 한계를 극복하기 위해 우리는 세 가지 목표를 가지고 있었습니다. 첫째, 생쥐의 정맥 또는 동맥에 정의된 천공 상처를 재현성 있게 생성한 다음 화학적 고정에 의해 현장에서 쉽게 안정화될 수 있습니다. 둘째, 막 보존을 강조하는 분취 절차를 적용하는데, 이는 형성 혈전 내 개별 혈소판의 위치를 정의하는 목표와 일치하는 목표입니다. 셋째, 단일 이미지에서 나노미터에서 거의 밀리미터 스케일 사이로 확장할 수 있는 편향되지 않은 시각화 기술을 사용합니다.

Montaged, 광역 전자 현미경은 한 가지 중요한 이유 때문에 주요 끝 시각화 기술로 선택되었습니다: 전자 현미경 이미징에서 세포 소기관과 소기관 내의 특징을 설명하는 세포 내의 광범위한 특징 배열을 볼 수 있습니다. 리보솜과 같은 작은 물체를 인식할 수 있습니다. 이러한 특징의 범위는 전자 현미경 검사에 사용되어 대비를 생성하는 전자 밀도가 높은 중금속 염색, 우라닐, 납 및 오스뮴이 광범위한 분자에 결합하기 때문에 볼 수 있습니다. 전자 현미경 이미지에서는 존재하는 것의 대부분을 볼 수 있는 반면, 면역형광 및 단백질 태깅 접근법에서는 불이 켜지는 것만 볼 수 있습니다. 예를 들어, 이는 주어진 개별 단백질 종에 존재하는 항원 부위를 의미합니다. 태그가 지정된 분자의 경우, 종종 단백질, 그것은 그 단백질이 있는 위치입니다. 다른 모든 분자는 어둡고 밝지 않습니다. 그러나 이러한 전자 현미경 선택이 실용적입니까? 천공 상처 혈전의 크기는 300 x 500μm이고 픽셀 크기가 3nm인 경우 100,000 x 167,000 픽셀의 이미지입니다. 고품질 전자 현미경 카메라에는 4000 x 4000 픽셀이 있습니다. 즉, 단일 이미지를 제공하기 위해 약 1000개의 프레임을 스티칭/블렌딩해야 합니다. 이는 지난 15년 동안 제조된 대부분의 전자 현미경에 존재해 온 가능성입니다. 현미경 스테이지는 컴퓨터화되어 있으며 이미지는 컴퓨터로 함께 스티칭할 수 있습니다. 이것이 제시된 프로토콜의 공식화의 기초가 되는 선택으로 이어진 이론적 근거입니다.

결론적으로, 우리는 생쥐의 정맥 또는 동맥에 재현 가능한 상처를 제공하는 일련의 단계를 제시한 다음 현장 고정 단계 및 이후 임베딩 단계에 따라 nm 규모의 montaged 광역 투과 전자 현미경으로 시각화 할 수 있으며 실제 in situ 규모 인 가까운 mm 스케일로 시각화 된 스티칭 이미지로 시각화 할 수 있습니다 고정식 혈전. 이러한 종류의 확장성은 혈전 형성을 혈액학/건강의 문제이자 혈소판이 주요 세포 유형인 발달 생물학 시스템으로 이해하는 데 필요합니다. 이러한 발전은 전자 현미경의 주요 미덕, 즉 불이 켜지는 것뿐만 아니라 거기에 있는 것을 볼 수 있다는 점을 제공합니다. SBF-SEM(serial block face scanning electron microscopy)을 위한 샘플 준비에 대한 자세한 프로토콜은 Joshi et al.4의 최근 논문을 참조하십시오.

프로토콜

실험은 아칸소 대학교 의과대학(University of Arkansas for Medical Sciences)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토 및 승인했습니다. 여기서, 8 - 12주령의 야생형 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 이 쥐는 지방이 거의 축적되지 않은 젊은 성인입니다. 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor) 또는 혈소판 당단백질 VI(GPVI)5,6와 같은 지혈에 중요한 다양한 단백질에 대한 마우스 돌연변이에도 동일한 절차를 적용할 수 있습니다. 사용된 모든 장비, 수술 기구, 시약 및 기타 재료는 그림 1과 같으며 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 경정맥/대퇴 동맥 천자 상처 1,7

  1. 마우스의 마취
    1. 마우스를 유도 챔버에 놓고 이소플루란 기화기를 높은 유속 설정(500mL/분, 3% 이소플루란)으로 돌립니다. 이소플루란은 혈관 직경에 거의 영향을 미치지 않기 때문에 선택됩니다.
      주의: 이소플루란에 장기간 노출되면 건강에 악영향을 미칠 수 있습니다. 저유량 기화기, 마취 가스 포집 캐니스터 및 우수한 실내 환기를 사용하면 노출을 크게 줄일 수 있습니다.
    2. 쥐가 잠든 것처럼 보이면 쥐의 발가락 중 하나를 꼬집어 쥐가 반응하는지 확인합니다. 그렇다면 마우스를 인덕션 챔버에 몇 분 동안 다시 넣은 다음 핀치 테스트를 다시 시도하십시오. 마우스가 반응하지 않으면 가열판(이전에는 알루미늄 호일로 덮여 있음)의 누운 위치에 놓습니다.
    3. 기화기를 낮은 유속(100mL/분, 1.75% 이소플루란)으로 낮춥니다. 마우스의 코를 노즈 콘에 놓습니다. 각 팔다리를 확장하고 작은 접착 테이프 조각으로 테이프를 붙입니다.
    4. 직장 온도 프로브를 삽입하고 온도 조절기의 온도를 37°C로 설정합니다. 프로브가 실수로 뽑히는 것을 방지하기 위해 온도 프로브 코드를 테이프로 감습니다.
  2. 마우스 절개
    1. 이발기를 사용하여 쥐의 목과 가슴(경정맥의 경우) 또는 오른쪽 다리 안쪽(대퇴 동맥의 경우)을 면도합니다. 알코올 패드로 털 깎기를 닦아냅니다. 필요한 경우 가위로 해당 부위를 다시 살펴보고 남아 있는 털을 제거합니다.
    2. 새 알코올 패드로 해당 부위를 다시 닦아 모든 예지물을 제거합니다. 해당 지역이 가능한 한 깨끗하게 유지되는 것이 매우 중요합니다. 발가락 꼬집을 통해 마취의 수술 평면을 확인합니다.
    3. 가위와 뭉툭한 집게를 사용하여 오른쪽 경정맥 위의 피부를 들어 올려 자릅니다. 경정맥과 주변 조직의 일부를 노출시킬 수 있을 만큼 큰 피부의 둥근 창을 자릅니다.
  3. 경정맥 청소(대퇴 동맥에도 동일한 원칙이 적용됨)
    1. 무딘 해개 기법을 사용하여 지방절과 림프절, 결합 조직을 부드럽게 밀어냅니다.
      알림: 이 단계에서 용기 주변의 일부 일반적인 청소가 이루어집니다. 그러나 경정맥을 파라포름알데히드에 24시간 동안 고정한 후 현미경으로 신중하고 철저한 청소가 이루어집니다.
    2. 20mL 주사기에 37°C로 예열한 생리식염수를 채웁니다. 주사기를 주사기 주입 펌프에 넣습니다. 27G 버터플라이 바늘 및 관련 튜브를 주사기에 부착합니다.
    3. 시린지 펌프를 0.5mL/분의 유속으로 설정합니다. 식염수의 부드러운 흐름은 구멍이 뚫린 정맥/동맥에서 혈액을 씻어냅니다. 식염수 흐름을 천자 부위 바로 위가 아닌 측면으로 몇 mm 배치합니다.
  4. 경정맥/대퇴 동맥에 구멍을 뚫는 경우
    1. 타이머를 시작합니다. 경정맥용 30G 피하 주사 바늘(공칭 직경 300μm)과 대퇴 동맥용 33G 피하 주사 바늘(직경 200μm)을 얻습니다. 더 작은 바늘을 사용하면 고압 동맥 상황에서 출혈 시간이 약간 더 길어집니다.
    2. 베벨을 위로 향하게 합니다. 바늘을 경정맥/대퇴 동맥 위로 25° 각도로 놓습니다. 시간을 기록해 둡니다.
    3. 용기에 빠르게 구멍을 뚫고 용기 상단만 뚫어야 합니다. 용기 바닥에도 구멍이 뚫리지 않도록 주의하십시오. 출혈이 완전히 멈출 때를 주목하십시오.
    4. 관류 고정을 시작하기 전에 혈전 형성을 얻을 수 있는 적절한 시간(그림 2A) 동안 기다립니다(즉, 혈전 발달의 다른 단계를 얻기 위해 1, 5, 10 또는 20분). 동물을 절제하여 안락사시키거나 안락사에 대한 현지 기관 지침을 따르십시오.
  5. 경심 관류 고정 수행
    1. 수술이 시작되기 전에 연동 펌프를 설치하십시오. 두 개의 50mL 코니컬 튜브를 시험관 랙에 넣습니다. 경정맥 천자 연구를 위해 카코딜산나트륨 완충 용액(0.2M 카코딜산나트륨, pH 7.4에서 0.15M 염화나트륨)으로 제조된 4% 파라포름알데히드 정착액을 채우고 다른 튜브에 카코딜산나트륨 완충 용액을 채웁니다.
      알림: 여기에 설명된 조건은 경정맥의 저압 사례에 충분하며 동맥의 고압 경우에 맞게 수정됩니다. 동맥, 즉 대퇴 동맥을 사용한 고압 시스템 연구의 경우 파라포름알데히드 고정제에 0.1% 글루타르알데히드를 보충하고 외부 점적 고정과 관류 고정을 결합합니다.
    2. 펌프 튜브의 흡수 끝을 완충 용액이 들어있는 튜브에 넣습니다. 관련 튜브가 있는 27G 버터플라이 바늘을 펌프 튜브의 출력 끝에 부착하고 바늘을 깨끗한 비커에 넣습니다.
    3. 연동 펌프를 10mL/분의 유속으로 설정합니다. 관류 펌프를 켭니다.
    4. 완충 용액이 바늘에서 비커로 흐르기 시작하면 펌프를 끕니다. 튜브와 바늘은 이제 심 경 관류를 위해 준비되었습니다.
    5. 해부 가위와 뭉툭한 집게를 사용하여 흉골 상단에서 흉골 하단을 지나 몇 mm까지 피부를 정중선으로 절단하여 흉강을 노출시킵니다. 흉곽의 기저부를 따라 정중선에서 시작하여 양쪽의 내측에서 외측으로 절단하는 가로 절개를 합니다.
    6. 경심 관류를 시작하기 직전에 흉곽을 빠르게 잘라내고 양쪽을 반사하여 심장을 노출시킵니다.
    7. 연동 펌프를 켭니다. 27G 나비 바늘의 끝을 좌심실 바닥에 놓습니다.
    8. 바늘을 좌심실에 단단히 고정한 상태에서 날카로운 절개 가위를 사용하여 오른쪽 귓바퀴의 구멍을 잘라 혈액과 관류액이 흘러나갈 수 있도록 합니다. 타이머의 시간을 기록해 둡니다.
    9. 순환계에서 혈액을 씻어내기 위해 완충 용액을 3분 동안 관류합니다. 바늘을 좌심실에 단단히 고정한 상태에서 연동 펌프를 끄고 연동 펌프 튜브의 흡수 끝을 정착액이 들어 있는 50mL 튜브로 이동합니다.
    10. 타이머의 시간을 기록해 둡니다. 연동 펌프를 다시 켜고 정착액을 7분 동안 관류합니다. 연동 펌프를 끕니다.
    11. 좌심실에서 바늘을 꺼내 쓰레기 비커에 넣으십시오. 펌프 튜브의 흡입 끝을 증류수가 담긴 비커에 넣습니다.
    12. 연동 펌프를 켜고 약 20mL의 물이 튜브를 통해 흐르게 하고 27G 바늘을 폐기물 비커로 빼내어 튜브를 청소합니다. 펌프를 끄기 전에 튜브와 바늘에서 모든 물이 빠져나가도록 하십시오.

2. 전자 현미경을 위한 샘플 수집

  1. 대퇴 동맥 천자 상처의 경우 초기 2분 외부 고정제로 보충된 관류 고정 후 천자 부위와 혈전이 포함된 경정맥/대퇴 동맥 부분을 조심스럽게 절개합니다(그림 2A). 날카로운 가위를 사용하여 혈관 세그먼트의 말단 끝을 대각선으로 자르고 혈관 세그먼트의 근위 끝을 가로질러 직선으로 자릅니다.
    알림: 이러한 방식으로 절단하면 나중에 혈관의 방향을 잡고 혈관의 혈류 방향을 식별하는 데 도움이 됩니다.
  2. 용기 세그먼트를 카코딜산나트륨 완충 용액(pH 0.2에서 0.2M 카코딜레이트 나트륨, 0.15M 염화나트륨 7.4)에 담그고 실온에서 1시간 동안 둡니다.
  3. 고정 조직을 4°C로 24시간 동안 옮깁니다. 다음 날, ~ 5mm 두께의 실리콘 매트가 들어있는 35mm 배양 접시를 가져 가십시오 (제조업체의 지침에 따라 미리 준비). 고정 정맥 세그먼트가 잠길 수 있도록 충분한 카코딜레이트 나트륨 완충 용액을 접시에 붓습니다.
  4. 광학 현미경(~15배 확대)으로 보는 동안 조직을 완충 용액이 들어 있는 35mm 접시에 조심스럽게 옮기고 스테인리스 스틸 세밀한 핀과 미세한 집게를 사용하여 용기의 각 끝을 실리콘 매트에 핀으로 고정합니다.
  5. 경정맥/대퇴 동맥 분절을 마이크로 가위와 매우 미세한 집게를 사용하여 조심스럽게 청소합니다.
    1. 경정맥의 경우: 핀 중 하나를 제거하고 마이크로 가위를 사용하여 천자/혈전 부위 반대쪽의 혈관 벽을 세로로 자릅니다. 용기를 부드럽게 열고 4-5개의 핀(각각 와이어 커터로 반으로 자릅니다)을 사용하여 발광 면이 위를 향하도록 하여 실리콘 매트에 고정합니다.
  6. 완충 용액을 흡인하고 카코딜산나트륨 완충 용액에 1% 파라포름알데히드 용액으로 빠르게 교체하고 접시 위에 뚜껑을 놓습니다. 어떤 경우에도 티슈가 마르지 않도록 하십시오. 항상 액체에 담그십시오.
  7. 전자 현미경 검사를 위해 처리할 때까지 조직을 4°C에서 보관합니다(그림 2B). SBF-SEM4에 의한 이미징을 위해 경정맥/대퇴 동맥 천자 상처 샘플의 일부를 처리하고 WA-TEM 8,9에 의한 이미징을 위해 다른 샘플을 처리합니다. WA-TEM 단계는 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
    주의: 화학 흄 후드에서 포름알데히드, 프로필렌 옥사이드, OsO4 및 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol(DMP-30)과 관련된 모든 작업을 수행하십시오. 이들은 유해 화학 물질입니다. OsO4 에 노출되면 실명 및 사망을(를) 유발할 수 있음.
    참고: 모든 헹굼 및 염색 부피는 샘플 부피의 최소 2배입니다. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)는 0.1M 카코딜산나트륨 완충액을 대체할 수 있습니다. 고정 절차 중에는 샘플이 건조되지 않도록 하는 것이 매우 중요한데, 이는 초미세 구조에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 폴리프로필렌 튜브를 사용하십시오.

3. 몽타주 광역 투과 전자 현미경(WA-TEM)을 위한 샘플 준비

참고: 이 단계는 조사자가 WA-TEM을 준비하기 위해 노력하는 결정 지점을 나타냅니다. 이 분취 절차는 SBF-SEM을 지원하지 않습니다. SBF-SEM 볼륨 EM의 경우 플라스틱에 삽입하기 전에 모든 염색을 수행해야 합니다. SBF-SEM 준비 프로토콜에 대해서는4 를 참조하십시오.

  1. 35mm 접시의 조직 샘플을 Hank의 균형 소금 용액(HBSS) 또는 PBS로 실온(RT)에서 2번 세척합니다. 이러한 분취 단계를 통해 샘플의 방향을 추적할 수 있도록 샘플을 핀으로 고정하십시오.
  2. 0.8 % 말라카이트 그린 / 2.5 % 글루 타르 알데히드 / 0.1 M 카코딜 산 나트륨 (pH 6.7 - 7.0) 0.8 mL를 얼음에 20 분 동안 고정합니다.
  3. 정착액을 제거하고 0.1M 카코딜산나트륨으로 각각 5분 동안 샘플을 4번 세척합니다. 0.1M 카코딜산나트륨을 제거합니다.
  4. 0.1M 카코딜산나트륨에 0.8% K3Fe(CN)6 또는 K4Fe(CN)6 / 1.0% OsO4 K3Fe(CN)6 0.8mL를 첨가합니다. 빛을 차단하기 위해 접시 위에 덮개를 씌웁니다(OsO4 는 빛에 민감함). RT에서 20분에서 1시간 동안 염색합니다.
  5. OsO4 를 제거하고 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액으로 각각 5분 동안 4번 헹굽니다. 소듐 카코딜레이트 완충액을 제거하고 얼음에 1% 탄닌산으로 20분 동안 염색합니다.
  6. 탄닌산을 제거하고 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액 1x로 5분 동안 세척하고 분자 등급 증류수(DI)로 각각 2분 동안 5분 동안 세척합니다.
  7. 0.5% 우라닐 아세테이트(UA)로 1시간 RT 또는 어두운 곳에서 4°C에서 밤새 염색합니다.
  8. 우라닐 아세테이트를 제거하고 분자 등급 증류수로 각각 5분 동안 5번 헹굽니다. 마지막 세척 전과 샘플이 DI 물에 아직 잠겨 있는 동안 면도날로 핀이 고정된 샘플 주변의 실리콘 매트를 자릅니다. 이 작은 실리콘 매트 조각을 플레이트에서 들어 올려 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다.
    알림: 샘플이 튜브에 있는 동안 실리콘 조각에 고정되어 있는 것이 중요합니다. 이 단계에서 폴리프로필렌 튜브로 전환해야 하는데, 후속 단계에서 사용된 프로필렌 옥사이드가 35mm 플레이트의 폴리스티렌을 저하시키기 때문입니다.
  9. 마지막 완충액을 제거한 후 25% 에탄올로 1번 간단히 헹굽니다. 25% 에탄올을 버리고 25% 에탄올로 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다.
  10. 25% 에탄올을 제거합니다. 50% 에탄올로 1번 간단히 헹굽니다. 50% 에탄올을 버리고 50% 에탄올로 얼음 위에서 3분 동안 배양합니다.
  11. 50% 에탄올을 제거하고 75% 에탄올로 1배 잠시 헹굽니다. 75% 에탄올을 버리고 75% 에탄올로 얼음에 3분 동안 배양합니다.
  12. 75% 에탄올을 제거하고 1% 에탄올로 95배 잠시 헹굽니다. 95% 에탄올을 버리고 95% 에탄올로 얼음에서 3분 동안 배양합니다.
  13. 95% 에탄올을 제거하고 100% 에탄올(200프루프)로 매번 최소 10분 동안 3번 세척합니다. 100% 에탄올을 제거하고 프로필렌 옥사이드(PO)를 추가합니다. PO로 각각 최소 10분씩 3번 헹굽니다.
  14. 아래 설명된 대로 수지 혼합물을 준비합니다.
    1. 수지 성분을 60°C에서 예열하여 완전히 액화시킵니다. 60°C에서 50mL 튜브에 Embed-218 12.5mL, Araldite 502 7.5mL, DDSA 27.5mL를 철저히 섞습니다. 이 혼합물은 4 °C에서 6 개월 동안 보관할 수 있습니다. 사용하기 전에 60 °C로 데우십시오. 사용하기 전에 필요한 양을 배분하십시오.
  15. 아래 설명된 대로 샘플을 포함합니다.
    1. 레진 혼합물의 부분 표본을 튜브에 넣고 DMP-30 활성제 20μL/mL를 추가합니다. 60 °C에서 회전하여 철저히 혼합하십시오. 색상이 어두워져야 합니다.
    2. 이 활성 수지의 부분 표본을 PO에서 50% 희석하고 수지와 PO가 완전히 혼합되도록 합니다.
    3. 샘플 함유 튜브에서 마지막 PO 헹굼을 제거하고 50% 수지/PO 혼합물로 교체하여 튜브를 거의 완전히 채웁니다. 샘플을 실온에서 밤새 회전시킵니다.
    4. 다음 날, 새로운 수지 부분 표본(샘플당 1mL)을 DMP-30 20μL/mL와 혼합합니다.
  16. 해부 현미경(~6배 확대) 아래 샘플 튜브에서 50% 수지/PO가 소량 혼합된 폴리프로필렌 접시에 샘플을 놓고 조직에서 핀을 조심스럽게 제거합니다. DMP-30 활성제를 사용하여 소량의 100% 수지가 포함된 다른 폴리프로필렌 접시에 조직만 옮깁니다.
  17. DMP-30 활성제로 실리콘 임베딩 금형에 100% 수지를 채우고 샘플을 금형에 조심스럽게 넣습니다. 곰팡이를 오븐에 넣고 60 ° C에서 최소 48 시간 동안 굽습니다. 제조된 샘플은 그림 2B에 나와 있습니다.
  18. 10,11에 설명된 대로 몽타주 WA-TEM(Wide-Area Transmission Electron Microscopy) 이미징을 수행합니다. 그림 3을 참조하면 초기 천자에서 3차원으로 렌더링된 1분 혈전으로 이동하는 과정을 볼 수 있습니다. 몽타주 WA-TEM 전자 현미경 이미징에 대한 자세한 프로토콜의 포함은 여기에 포함되지 않으며 샘플 준비에 대한 현재 프로토콜의 범위를 벗어납니다.
    참고: WA-TEM은 컴퓨터 스테이지가 있는 대부분의 최신 투과 전자 현미경에서 과소평가된 기능입니다. 이러한 기능을 지원하는 쉐어웨어 소프트웨어10,11은 Dr. David Mastronarde, University of Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.) 그룹에서 사용할 수 있습니다.

결과

천자 상처 출혈 시간에 대한 약물 효과의 정량화
천공 상처 출혈 시간은 마우스에서 쉽게 수행할 수 있는 약물 위험의 생리학적 모델을 제공합니다. 찔린 상처 실험에서 나온 결과는 예측적입니다. 여기에서, 우리는 dabigatran 용량-반응 출혈 곡선을 보여줍니다. 트롬빈 억제제인 다비가트란(Dabigatran)은 경구용 직접 작용 항응고제로 사용되며, 이를 DOAC12라고 합니다. 경정맥 천자 상처 모델은 마우스에서 지연된 혈전 형성을 통한 잠재적인 장기 출혈을 통해 다양한 용량의 다비가트란에 내재된 위험을 평가하는 데 사용되었습니다. 15, 50 또는 150 μg/kg의 다양한 용량의 다비가트란을 경정맥 천자 20분 전에 정맥 주사(i.v.)로 투여하였다. 우리는 dabigatran의 다양한 농도에서 출혈 시간 평균을 보여줍니다 (그림 4). 용량 수준에서, 출혈 시간의 유의한 연장이 관찰된다, p <0.051. 이것은 인간에 있는 약의 사용에 있는 중요한 위험 요인을 나타냅니다. 실험적으로, 이러한 용량의 약물은 혈전 형성의 미세 구조에 상당한 영향을 미칩니다.

형성 천자 상처 혈전에서 혈소판 활성화 상태 평가
WA-TEM 접근법은 낮은 배율에서 볼 때 단일 평면에서 상처 부위의 개요와 높은 배율에서 많은 세부 정보를 제공합니다(그림 5). 얻은 세부 정보는 개요의 컨텍스트 내에 직접 배치할 수 있습니다. 우리는 이 접근법을 사용하여 원반형 혈소판이 천자 상처 혈전을 형성하는 것을 평가했습니다. 순환 혈소판은 원반형이므로 이름이 붙여졌으며 전체 분비 과립 세트를 포함하고 있습니다. 핵심 질문은 순환하는 혈소판이 어떻게 남아 있는 혈소판의 자유로운 흐름 특성을 방해하지 않고 성장하는 혈전에 동원될 수 있는가 하는 것이었습니다. 우리의 연구는 순환 혈소판이 테더링 과정을 통해 전체 세포 소기관 세트를 포함하는 원반형 혈소판으로 하나씩 혈전으로 모집되는 Tether and Activate 가설을 지적합니다2. 이에 대한 증거는 천자 후 1분 후 경정맥 혈전의 WA-TEM에서 비롯됩니다. 아직 출혈이 진행 중인 상처 중앙에서 완전한 혈전 절편을 얻기 위한 절편 후, SerialEM 소프트웨어10을 사용하여 자동화된 스테이지와 투과 전자 현미경을 사용하여 혈전의 전체 치수를 가로질러 직사각형 XY 래스터 그리드에서 500-800 프레임, 4,000 x 4,000 픽셀, 3.185 nm 픽셀 크기를 이미지화했습니다. 그런 다음 IMOD 프로그램 suite11의 일부인 eTomo 소프트웨어를 사용하여 프레임을 함께 연결했습니다. 그 결과 다양한 크기의 단일 이미지(예: 120,000 x 90,000 픽셀)가 IMOD 프로그램 제품군의 일부인 3DMOD 소프트웨어를 사용하여 낮은 줌(0.02)에서 전체 화면 또는 높은 줌(0.25-1.0)에서 세부 이미지가 생성됩니다(그림 5). 넷에서, 소프트웨어 기반 분석은 천자 구멍 내의 말초에 결합된 혈전 관련 원반형 혈소판이 끈의 구슬처럼 간격을 두고 있다는 것을 발견했습니다. 혈전 내에서 짧은 거리에서, 원반형 모양은 덜 뚜렷했고, 혈소판은 서로 더 밀접하게 연관되어 있었다. 혈전 내부 더 깊은 곳에서는 혈소판이 둥글고 단단히 포장되어 부분적으로 과립이 제거되었습니다. 일련의 형태학은 긴 테더 분자(아마도 폰 빌레브란트 인자)를 통해 혈소판이 혈전에 초기에 결합하는 것을 시사했으며, 추가적인 혈소판 활성화 단계는 혈전 형성의 내부로 제한되었습니다. 따라서 혈전으로의 혈소판 모집은 경정맥 내의 혈액 순환을 방해하지 않고 발생할 수 있습니다.

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그림 1: 경정맥/대퇴 동맥 천자 상처 혈전 실험을 수행하기 위한 수술 설정. 수술 장비(A)와 기구(B)는 실험 중 타이밍이 중요하기 때문에 움직임의 효율성을 위해 신중하게 배치됩니다. (C) 관류 고정 후, 천자 상처 혈전이 포함된 혈관 부분을 광학 현미경으로 보면서 35mm 배양 접시의 실리콘 매트에 고정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 혈관에서 WA-TEM 또는 SBF-SEM을 위해 절단될 플라스틱 내장 샘플로 이동. (A) 천자 상처가 있고 축적된 혈관외 혈전(원과 화살표)이 있는 대퇴 동맥이 표시됩니다. (B) 혈전(원 및 화살표)은 후속 2D 이미징을 위한 마이크로톰과 함께 WA-TEM을 위한 절단을 위해 플라스틱에 내장되어 있습니다. (C) 혈전(원과 화살표)이 플라스틱에 내장되어 있으며, SBF-SEM 이미징 챔버 내의 핀에 부착하기 위해 1mm 미만의 짧은 막대기를 제공하도록 다듬어져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 천자에 의한 혈전 형성에 대한 천자: 천자 상처(A)에서 천자 후 1분 경정맥 혈전(B)의 이미지 절편까지의 분취 흐름 개략도. 혈관 벽은 이미지 조각에서 파란색으로 표시되고, 혈관 벽 근처의 작은 검은색 점은 적혈구이며, 혈전 혈소판 응집체는 짙은 회색 영역으로 나타납니다. 이 수치는1에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 경정맥 천자 상처 실험에서 생성된 그래픽 형식의 데이터 예. 다비가트란 용량-반응 출혈 곡선이 보인다. 이 수치는1에서 수정되었습니다. 다양한 농도의 dabigatran에서 블리딩 시간 평균은 플러스 또는 마이너스 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 표시됩니다. 학생의 t-검정을 사용한 통계 분석은 p-값이 <0.05로 나타났습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 몽타주를 형성하기 위해 함께 스티칭된 슬라이스의 WA-TEM 이미지. (A) 개별 고해상도 프레임을 수집한 다음 더 큰 컨텍스트에 기능을 배치하기 위해 함께 연결합니다. (B) 확대하면 중요한 세부 사항을 상황에 맞게 나타낼 수 있습니다(폴리: 다형핵 백혈구, 엔도: 내피, 콜: 콜라겐 섬유). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

경정맥 및 대퇴 동맥에서 지혈 혈전을 생성하기 위한 자세한 천자 상처 절차, 현장 관류 고정 및 몽타주 광역 투과 전자 현미경을 위한 샘플 처리를 제시합니다. 전체 절차는 초구조 분석을 위한 지혈 혈전을 생성하고 실험용 마우스(예: 다양한 유형 및 용량의 약물로 치료된 마우스)에서 출혈 시간을 비교하는 데 유용합니다. 또한 대조군 야생형 마우스의 출혈 시간과 knockout 마우스의 출혈 시간(즉, 접착 리간드와 상호 작용하는 혈소판의 다양한 당단백질에 대한 knockout) 및 후속 고해상도 전자 현미경을 비교하는 데에도 유용합니다. 이 프로토콜은 1차 판독으로 면역형광 분석에 쉽게 적용할 수 있으며, 전자 현미경을 강력하게 선택하는 특징이 손실됩니다. 반면에 면역형광은 구조 내에서 단백질을 찾기 위한 주요 도구입니다. 다른 기술 프로토콜과 마찬가지로 다른 단계보다 더 중요한 단계가 있으며 프로토콜 내에는 후속 분석에 중요한 선택 지점으로 취급할 수 있는 단계가 있습니다.

중요한 단계, 후속 분석을 위한 선택 지점 및 제한 사항은 다음과 같이 설명됩니다. 실제 바늘 천자 단계: 천자 상처는 정맥 또는 동맥에 대해 25° 각도로 고정된 주사기 바늘로 만들어집니다. 이렇게 하면 정맥이나 동맥의 양쪽에 구멍이 뚫릴 가능성을 최소화할 수 있습니다. 반면에 90° 각도는 혈관 내 내피층을 긁거나 혈관 외부의 혈관 외 콜라겐 매트릭스를 손상시키지 않을 가능성을 극대화하지만 정맥이나 동맥의 양쪽에 구멍을 뚫을 위험이 더 큽니다. 선택은 경험, 손, 자신감 중 하나입니다.

여기서 주요 고정은 단일 반응성 알데히드 그룹을 포함하는 작은 분자인 관류 파라포름알데히드로 수행됩니다. 파라포름알데히드는 단일 화학적으로 반응성 그룹을 포함하기 때문에 세포 구성 요소를 가교하는 경향이 거의 없고 항원성을 파괴하는 경향이 거의 없으므로 요약하면 전자 현미경의 일반적인 고정제인 글루타르알데히드에 비해 상대적으로 약한 고정제로 간주되며, 이는 두 개의 반응성 알데히드를 함유하고 있으므로 훨씬 더 많은 분자 가교를 생성합니다13. 이것은 구조를 보존하기 위해 고안된 현장 단계입니다. 관류 단계는 제제에서 혈전에 갇히지 않은 적혈구를 제거합니다. 이는 대부분의 적혈구가 없는 제제를 제공하고 혈소판 특성에 쉽게 집중할 수 있도록 합니다. 우리는 혈관 외로 적용된 글루타르알데히드/파라포름알데히드 혼합물과 함께 현장 고정을 사용하는 방법을 탐구했습니다. 이 절차는 특히 높은 유량/압력 상황에서 효과적입니다. 그러나 순환하는 적혈구를 제자리에 고정시킵니다. 이는 천자 상처 혈전을 형성하는 혈소판 응집체의 모양과 조성에 대한 전자 현미경 사진의 후속 세분화 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 글루타르알데히드의 사용은 정착제에 의해 생성되는 높은 수준의 자가형광 때문에 대체 면역형광 절차를 매우 복잡하게 만듭니다.

실리콘 패드에 고정된 혈관을 고정/펼치는 것은 삽입을 위해 혈전을 찾는 데 중요합니다. 이 단계에서는 혈류에 대한 샘플의 방향을 추적하고 후속 단계를 위해 알 수 있습니다. 천공 구멍과 형성된 혈전은 열린 혈관에서 쉽게 찾을 수 있습니다. 반면, 혈전은 절제된 온전한 혈관에서는 발견하기 어렵습니다. 그것은 고정된 순환 적혈구가 풍부한 샘플에서 특히 그러할 것입니다. 건초 더미의 바늘이 어디에 있는지 추적할 수 있는 것은 매우 중요합니다.

혈관을 활짝 펴고 형성된 혈전, 천공이 위치한 위치를 촬영하는 것이 선택 포인트입니다. 전체 프로토콜에서 제시된 후속 단계는 WA-TEM용 샘플을 준비하는 것과 관련이 있습니다. 이 단계에서 다른 프로토콜을 선택할 수 있습니다. 한편으로는, 샘플은 전자 현미경이 아닌 면역 형광 현미경 검사로 처리 될 수 있습니다. 반면에 샘플은 WA-TEM 대신 직렬 블록 면 주사 전자 현미경(SBF-SEM 또는 다른 부피 전자 현미경 접근 방식)으로 처리할 수 있습니다. SBF-SEM의 처리 단계는 이 절차를 준비하기 위해 전자 현미경을 위한 모든 중금속 염색 단계를 사전 임베딩으로 수행해야 하기 때문에 확실히 다릅니다4.

이 프로토콜의 중금속 염색 단계는 핵산이 풍부한 생물학적 복합체인 리보솜 및 염색체에 비해 막을 강조하도록 설계되었습니다. 다른 중금속 염색 프로토콜이 사용될 수 있습니다(예: Storrie 및 Attardi14 및 Liu et al.15).

정맥과 동맥의 차이에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 정맥 대 동맥의 더 높은 압력은 오프셋되어야 합니다16,17. 예를 들어, 경정맥 상처에 비해 대퇴 동맥 상처를 만들기 위해 더 작은 직경의 바늘이 사용됩니다. 이것은 더 높은 압력을 보상하여 거의 동일한 출혈 중단 시간을 제공합니다. 경정맥 천자 상처 절차에서는 파라포름알데히드가 작은 단일 알데히드 함유 고정제로서 빠르게 작용하지만 항원성을 그대로 유지하는 경향이 있는 약한 고정제이기 때문에 고긴장 조건에서 파라포름알데히드를 고정제로 사용하는 것이 선호됩니다. 즉, 여기에 설명된 프로토콜은 광학 또는 전자 현미경 수준18,19에서 항체 매개 국소화 연구로 보완될 수 있습니다. 대퇴 동맥 천자 상처의 경우, 동맥 혈전을 안정화하고 고정하기 위해 0.1M 카코다얄산 나트륨 완충액(pH 7.4)에서 더 강력한 가교 고정제인 글루타르알데히드를 파라포름알데히드와 함께 사용합니다. 이 수정은 정맥에 비해 동맥의 더 높은 혈압을 상쇄하기 위해 필요합니다. 동맥의 경우, 카코딜산나트륨 농도는 경정맥 혈전에 대한 정착액에 사용되는 농도의 절반입니다.

여기에 제시된 전자 현미경을 위한 시료 처리 절차는 WA-TEM에 맞게 조정되었으며 제한된 부피의 전자 현미경 정보를 제공합니다. WA-TEM은 3.185nm 픽셀 크기 이하의 제한된 고해상도 이미지 시리즈를 흐름1에 평행 또는 수직인 전체 트롬비 단면에 걸쳐 생성합니다. 유리와 다이아몬드 나이프의 조합을 사용하여 혈전으로 약 10%, 25%, 50%, 75% 및 90%에서 일련의 단면을 수동으로 생성합니다. 완전한 혈전 단면을 달성하려면 4,000 x 4,000 픽셀 전자 현미경 품질의 카메라로 수백 개의 프레임을 이미징해야 합니다. 그런 다음 프레임을 함께 스티칭합니다. 거의 400 - 800개의 프레임이 전체 단면 이미지를 얻기 위해 필요합니다. WA-TEM은 SBF-SEM으로 보완할 수 있습니다. SBF-SEM은 SEM 이미징 챔버1의 진공 내에 둘러싸인 다이아몬드 나이프를 사용하여 작은 단계로 점진적으로 절단될 때 블록 면의 일련의 순차적 이미지를 생성합니다. 이러한 이미지를 결합하여 혈전을 형성하는 완전한 3차원 렌더링을 제공할 수 있습니다. 마이크로톰은 SEM 이미징 챔버 내부에 있기 때문에 SBF-SEM에 대한 모든 염색 단계는 사전 임베딩을 수행해야 합니다. 이 두 가지 전자 현미경 접근 방식을 결합하면 제한된 수의 단면(WA-TEM) 또는 거의 밀리미터 크기의 천공 상처 혈전(SBF-SEM)의 전체 깊이에 걸쳐 ~3nm 이상의 해상도로 이미징할 수 있습니다. 3DMOD 소프트웨어(10 )에서 스티칭된 WA-TEM 이미지를 보는 것은 다양한 줌 레벨 간의 신속한 조작을 가능하게 하여 고해상도 뷰조차도 전체 혈전 폭 단면 내에서 컨텍스트에 배치될 수 있습니다.

결론적으로, 우리는 마우스에서 천자 상처 혈전을 생성하고, 제자리에서 고정하고, 혈전이 정맥 또는 동맥 내에 쉽게 위치할 수 있고 혈류에 대한 방향을 추적할 수 있는 방식으로 전자 현미경을 위해 처리하기 위한 입증된 프로토콜을 제시합니다. 사용자가 샘플 분석 방법을 선택할 수 있도록 다양한 결정 사항이 제공됩니다. 우리는 세포의 다른 구성 요소와 비교하여 멤브레인을 강조하는 전자 현미경 준비에 중점을 둡니다. 결국, 다른 연구에서 가장 일반적인 프로토콜 부분은 광역 투과 전자 현미경 (WA-TEM)이 세포, 즉 밀리미터 크기의 큰 구조 내의 혈소판에 대한 나노 단위 지식을 지원하는 몽타주 접근 방식이라는 저자의 인식입니다. 전체 컨텍스트 내에서 세부 사항을 배치할 수 있는 능력은 다양한 단계를 전체 절차로 결합하는 핵심 강점입니다.

공개 사항

저자는 이 연구와 관련된 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자들은 아칸소 의과대학(University of Arkansas for Medical Sciences, Jerry Ware, Sung W. Rhee), 펜실베이니아 대학교(University of Pennsylvania, Tim Stalker, Lawrence Brass), 켄터키 대학교(University of Kentucky, Sidney W. Whiteheart, Smita Joshi), 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 산하 국립생물영상생물공학연구소(National Institute of Bioimaging and Bioengineering, Richard D. Leapman, Maria A. Aronova)의 동료들에게 감사를 표한다. 저자들은 미국심장협회(American Heart Association)와 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립심장폐혈액연구소(National Heart Lung and Blood Institute, R01 HL119393, R56 HL119393, R01 BS 155519, NIH 보조금 R01 HL146373 및 R35 HL150818)의 재정 지원에 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 생리식염MedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint 두피 정맥 세트MedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint 피하 주사 바늘MedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint 특수 피하 주사 바늘MedlineNDA26393
50 mL 원뿔형 튜브Fisher Scientific06-443-20
알코올 준비 패드 (70 % 이소 프로필 알코올)MedlineMDS090670Z
알루미늄 호일Fisher Scientific01-213-100
동물 가열판Physitemp 기기HP-1M
Araldite GY 502전자 현미경 과학10900
Axiocam 305 컬러 R2 현미경 카메라Carl Zeiss 현미경426560-9031-000
BD Luer-Lok 주사기, 20 mLMedlineB-D303310Z
염화칼슘Fisher ScientificC79-500
세포 배양 접시 35mm x 10mmCorning Inc.
코튼 팁 애플리케이터MedlineMDS202055H
DMP-30 활성제전자 현미경 과학13600
도데세닐 숙신산 무수물/DDSA전자 현미경 과학13700
드레싱 집게, 5", 곡선, 톱니, 좁은 팁Integra Miltex6-100
드레싱 집게, 5", 표준, 톱니 모양의Integra Miltex6-6
EMBED 812 수지전자 현미경 과학14900
에틸 알코올, 무수 200 증거전자 현미경 과학15055
Fisherbrand 4-Way Tube RackFisher Scientific03-448-17
Fisherbrand 디지털 타이머Fisher Scientific14-649-17
Fisherbrand 단일 주사기 주입 펌프Fisher Scientific7801001
거즈 스폰지 2" x 2"- 4 PlyMedlineNON26224H
글루타르알데히드 (10% 용액)전자 현미경 과학16120
이소플루란 액체 흡입제 마취, 100 mLMedline66794-017-10
보석상 스타일 마이크로 파인 집게, 스타일 5FIntegra Miltex17-305필요합니다.
L/S 펌프 튜브, 실리콘, L/S 15; 25피트VWRMFLX96410-15
L-아스파르트산Fisher ScientificBP374-100
질산납Fisher ScientificL-62
말라카이트 그린 4전자 현미경 과학18100
Masterflex L/S Easy-Load II 펌프 헤드VWRMFLX77200-62
Masterflex L/S 가변 속도 디지털 드라이브VWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" 와이어 커터Fisher Scientific50-191-9855
오스뮴 테트록사이드 4% 수용액전자 현미경 과학19150
파라포름알데히드(16% 용액)전자 현미경 과학15710
Physitemp 온도 컨트롤러Physitemp InstrumentsTCAT-2LV
칼륨 페로시안화물시그마-알드리치P-8131
프로필렌 옥사이드, ACS 시약전자 현미경 과학20401
파이렉스 유리 비커Fisher Scientific02-555-25B
생쥐용 직장 온도 프로브Physitemp InstrumentsRET-3
스카치 매직 인비저블 테이프, 3/4" x 1000"3M Company305289
Cacodylate Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4전자 현미경 과학11623
SomnoFlo 저유량 전자 기화기Kent ScientificSF-01
SomnoFlo 스타터 키트마우스 Kent ScientificSF-MSEKIT
스테인리스 스틸 Minutien PinsFine Science 도구26002-10
실체 현미경 steREO Discovery.V12Carl Zeiss 현미경495015-9880-010
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머세계 정밀 기기SYLG184실리콘 매트
Tannic AcidElectron Microscopy Sciences21700
Thiocarbohydrazide (TCH)Sigma-Aldrich88535
Uranyl Acetate전자 현미경 과학22400
Vannas Spring Micro ScissorsFine Science Tools15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", 곡선, 톱니 모양의Integra Miltex18-8182쌍이 필요합니다.
Wagner 가위파인 사이언스 도구14068-12
Wahl MiniFigura 동물 트리머Braintree ScientificCLP-9868
Zen Lite 소프트웨어Carl Zeiss 현미경410135-1001-000
수 430165 2쌍이

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Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis
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