지혈 혈전 형성을 위한 천자 상처 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 형성된 혈전은 크며 직경이 수백 미크론입니다. 따라서 볼륨 이미징 접근 방식이 적합합니다. 우리는 많은 사람들이 사용할 수 있는 고해상도 접근 방식으로 몽타주 광역 투과 전자 현미경을 제안하고 분취 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.
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방법 논문
Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis
이 논문에서
요약
초록
혈관 손상의 정상적인 생리적 조절 과정인 지혈은 인간 생활의 기본입니다. 우리 모두는 때때로 경미한 상처와 찔린 상처를 겪습니다. 지혈에서 자기 제한 혈소판 응집은 외부에서 구멍을 막음으로써 출혈 중단이 발생하는 구조적 혈전의 형성으로 이어집니다. 이 구조의 상세한 특성화는 지혈과 혈전증을 구별할 수 있으며, 혈전증은 과도한 혈소판 응집으로 이어지는 폐색성 응고의 경우입니다. 천자 상처 혈전 구조에 대한 이미징 기반 접근 방식이 여기에 제시되어 있으며, 이는 지혈 혈전의 내부를 시각화하는 얇은 단면 전자 현미경의 기능을 활용합니다. 이미징 기반 실험 프로토콜에서 가장 기본적인 단계는 우수한 시료 전처리입니다. 이 프로토콜은 후속 전자 현미경 검사를 위해 마우스의 천자 상처 및 혈소판이 풍부한 혈전을 준비하기 위한 자세한 절차를 제공합니다. 성형 천자 상처 혈전의 현장 고정 및 전자 현미경을 위한 염색 및 매립을 위한 후속 처리에 대한 자세한 절차가 제공됩니다. 전자 현미경은 순차적 절편과 결합될 때 혈전 내부의 세부 사항을 고해상도로 시각화할 수 있는 능력 때문에 말단 이미징 기술로 제시됩니다. 이미징 방법으로서 전자 현미경은 편향되지 않은 샘플링과 2차원 또는 3차원에서 나노미터에서 밀리미터까지 확장되는 실험 결과를 제공합니다. 수백 개의 프레임을 혼합하여 전체 천공 상처 혈전 단면의 나노미터 단위 이미징을 제공할 수 있는 광역 전자 현미경을 지원하는 적절한 프리웨어 전자 현미경 소프트웨어가 인용됩니다. 따라서 이미지 파일의 모든 하위 영역을 전체 횡단면의 컨텍스트에 쉽게 배치할 수 있습니다.
서론
출혈 중단으로 이어지는 천자성 상처 혈전의 형성은 인생에서 가장 중요한 사건 중 하나입니다1. 그러나 이러한 본질성에도 불구하고 정맥, 동맥, 죽상동맥경화성 사건 또는 폐색혈전 등 혈전 형성 중에 구조적으로 발생하는 것에 대한 지식은 해상도와 이미징 깊이에 의해 제한되어 왔습니다. 기존의 광학 현미경은 완전히 형성된 천공 상처 혈전과 비교할 때 깊이가 제한적이며, Z1에서 200 - 300 μm이며, 혈소판 소기관의 크기 및 그 간격과 비교할 때 해상도 수준이 30 nm 미만인 경우가 많습니다2. 이광자 광학 현미경은 필요한 이미징 깊이를 얻을 수 있지만 해상도를 크게 향상시키지는 않습니다. 예를 들어 초고해상도 기술과 같은 광학 현미경의 가장 최근 발전은 여전히 해상도가 제한되어 있으며, 실제로는 XY에서 ~20nm, Z에서 그 두 배이며 깊이가 제한되어 있어 기존 광학 현미경보다 크지 않습니다. 또한, 초고해상도 광학 현미경은 대부분의 연구용 광학 현미경과 마찬가지로 형광 현미경을 기반으로 하며, 형광 현미경 검사는 본질적으로 우수한 항체가 존재하거나 양호한 태그가 지정된 구조를 가진 작은 후보 단백질....
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프로토콜
실험은 아칸소 대학교 의과대학(University of Arkansas for Medical Sciences)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토 및 승인했습니다. 여기서, 8 - 12주령의 야생형 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 이 쥐는 지방이 거의 축적되지 않은 젊은 성인입니다. 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor) 또는 혈소판 당단백질 VI(GPVI)5,6와 같은 지혈에 중요한 다양한 단백질에 대한 마우스 돌연변이에도 동일한 절차를 적용할 수 있습니다. 사용된 모든 장비, 수술 기구, 시약 및 기타 재료는 그림 1과 같으며 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 경정맥/대퇴 동맥 천자 상처 1,7
- 마우스의 마....
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결과
천자 상처 출혈 시간에 대한 약물 효과의 정량화
천공 상처 출혈 시간은 마우스에서 쉽게 수행할 수 있는 약물 위험의 생리학적 모델을 제공합니다. 찔린 상처 실험에서 나온 결과는 예측적입니다. 여기에서, 우리는 dabigatran 용량-반응 출혈 곡선을 보여줍니다. 트롬빈 억제제인 다비가트란(Dabigatran)은 경구용 직접 작용 항응고제로 사용되며, 이를 DOAC12라고 합니다. 경정맥 천자 상처 모델은 마우스에서 지연된 혈전 형성을 통한 잠재적인 장기 출혈을 통해 다양한 용량의 다비가트란에 내재된 위험을 평가하는 데 사용되었습니다. 15, 50 또는 150 μg/kg의 다양한 용량의 다비가트란을 경정맥 천자 20분 전에 정맥 주사(i.v.)로 투여하였다. 우리는 dabigatran의 다양한 농도에서 출혈 시간 평균을 보여줍니다 (그림 4). 용량 수준에서, 출혈 시간의 유의한 연장이 관찰된다, .......
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토론
경정맥 및 대퇴 동맥에서 지혈 혈전을 생성하기 위한 자세한 천자 상처 절차, 현장 관류 고정 및 몽타주 광역 투과 전자 현미경을 위한 샘플 처리를 제시합니다. 전체 절차는 초구조 분석을 위한 지혈 혈전을 생성하고 실험용 마우스(예: 다양한 유형 및 용량의 약물로 치료된 마우스)에서 출혈 시간을 비교하는 데 유용합니다. 또한 대조군 야생형 마우스의 출혈 시간과 knockout 마우스의 출혈 시간(즉, 접착 리간드와 상호 작용하는 혈소판의 다양한 당단백질에 대한 knockout) 및 후속 고해상도 전자 현미경을 비교하는 데에도 유용합니다. 이 프로토콜은 1차 판독으로 면역형광 분석에 쉽게 적용할 수 있으며, 전자 현미경을 강력하게 선택하는 특징이 손실됩니다. 반면에 면역형광은 구조 내에서 단백질을 찾기 위한 주요 도구입니다. 다른 기술 프로토콜과 마찬가지로 다른 단계보다 더 중요한 단계가 있으며 프로토콜 내에는 후속 분석에 중요한 선택 지점으로 취급할 수 .......
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공개 사항
저자는 이 연구와 관련된 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 아칸소 의과대학(University of Arkansas for Medical Sciences, Jerry Ware, Sung W. Rhee), 펜실베이니아 대학교(University of Pennsylvania, Tim Stalker, Lawrence Brass), 켄터키 대학교(University of Kentucky, Sidney W. Whiteheart, Smita Joshi), 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 산하 국립생물영상생물공학연구소(National Institute of Bioimaging and Bioengineering, Richard D. Leapman, Maria A. Aronova)의 동료들에게 감사를 표한다. 저자들은 미국심장협회(American Heart Association)와 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립심장폐혈액연구소(National Heart Lung and Blood Institute, R01 HL119393, R56 HL119393, R01 BS 155519, NIH 보조금 R01 HL146373 및 R35 HL150818)의 재정 지원에 감사를 표합니다.
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재료
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| 33G x 1/2 EXELint 특수 피하 주사 바늘 | Medline | NDA26393 | |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | Fisher Scientific | 06-443-20 | |
| 알코올 준비 패드 (70 % 이소 프로필 알코올) | Medline | MDS090670Z | |
| 알루미늄 호일 | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| 동물 가열판 | Physitemp 기기 | HP-1M | |
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| Axiocam 305 컬러 R2 현미경 카메라 | Carl Zeiss 현미경 | 426560-9031-000 | |
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참고문헌
- Rhee, S. W., et al. Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates. Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).
- Pokrovskaya, I. D., et al.
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