방법 논문

인간 Vagina-on-a-Chip에서 건강하고 dysbiotic 질 미세환경 모델링

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⸱

DOI:

10.3791/66486

⸱

2024년 2월 16일

 ,  ,  , 
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Vascular Biology Program and Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School, 3Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences

이 논문에서

요약

이 기사에서는 미세공기성 조건에서 살아있는 질 마이크로바이옴과 인간 숙주의 상호 작용을 연구할 수 있는 미세유체 질 온 칩(Vagina Chip) 배양 장치를 만들기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 칩은 질 질환을 조사하고 잠재적인 치료 대책을 개발 및 테스트하는 도구로 사용할 수 있습니다.

초록

여성의 건강, 특히 여성 생식관 질환(FRT)은 건강하지 않은 생식기관이 생명을 위협하는 질병, 불임 또는 임신 중 부정적인 결과를 초래할 수 있음에도 불구하고 마땅히 받아야 할 관심을 받지 못했습니다. 이 분야의 한 가지 장벽은 FRT의 생리학 및 병태생리학을 충실하게 모방하는 전임상 실험 모델이 부족하다는 것입니다. 현재의 체외 및 동물 모델은 호르몬 변화, 미세 호기성 조건 및 질 마이크로바이옴과의 상호 작용을 완전히 요약하지 못합니다. 조직-조직 계면, 혈관 관류, 간질액 흐름 및 인간 장기의 주요 하위 단위의 물리적 미세환경을 모방할 수 있는 Organ-on-a-Chip(Organ Chip) 미세유체 배양 기술의 출현은 잠재적으로 이 문제에 대한 해결책이 될 수 있습니다. 최근에는 인간 질 기질과 연결되어 역동적인 유체 흐름을 경험하는 원발성 인간 질 상피와 인간 질 미생물 컨소시엄의 공동 배양을 지원하는 human Vagina Chip이 개발되었습니다. 이 칩은 건강하고 불균형한 미생물 군집에 대한 인간 질의 생리적 반응을 복제합니다. 인간 질 칩을 만들기위한 자세한 프로토콜이이 기사에 설명되어 있습니다.

서론

산성 미세환경을 유지하는 데 도움이 되는 Lactobacillus spp.가 지배하는 질 마이크로바이옴은 여성의 생식 건강을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다1. 그러나 때때로 마이크로바이옴을 구성하는 미생물 군집의 구성에 변화가 있을 수 있으며, 이로 인해 질 박테리아의 다양성이 증가할 수 있습니다. 이러한 불균형적 변화는 종종 락토바실러스가 지배하는 상태에서 보다 다양한 혐기성 박테리아 종(예: Gardnerella vaginalis)이 지배하는 상태로 전환되는 결과를 낳으며, 세균성 질염, 위축성 질염, 요로 감염, 외음부 칸디다증, 요도염 및 융모막염과 같은 생식계의 다양한 질병과 관련이 있습니다 2,3,4,5 . 이러한 질병은 여성이 성병과 골반 염증성 질환에 걸릴 가능성을 높입니다 6,7,8,9. 또한 임산부의 조산 및 유산 위험이 더 높으며10,11,12 불임과도 관련이 있다 13,14,15,16.

정적인 2차원(2D) 배양 시스템에서 배양된 질 상피 세포를 사용하여 질 미생물 불균형을 모델링하려는 노력이 이루어졌지만17,18, 질 미세환경의 생리학적 및 복잡성을 효과적으로 모방하지는 못한다19. 동물 모델은 또한 질 미생물 불균형을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나 이들의 월경 단계와 숙주-마이크로바이옴 상호작용은 인간과 크게 다르기 때문에 이러한 연구 결과의 생리학적 관련성은 불분명합니다 19,20,21. 이러한 문제에 대응하기 위해 인간 질 조직의 오가노이드 및 Transwell 삽입 모델도 FRT 19,22,23,24에서 숙주-병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나 이들은 정적 배양이기 때문에 짧은 기간(<16-24시간) 동안만 살아있는 미생물과 인간 세포의 공동 배양을 지원할 수 있으며, 점액 생성 및 유체 흐름과 같은 인간 질 미세환경의 다른 잠재적으로 중요한 다른 많은 물리적 특징이 부족합니다22.

장기 칩(Organ Chip)은 동적 유체 흐름 하에서 배양된 살아있는 세포가 늘어선 하나 이상의 평행한 중공 미세채널을 포함하는 3차원(3D) 미세유체 배양 시스템입니다. 2채널 칩은 두 개의 평행 채널을 분리하는 다공성 멤브레인의 반대쪽에서 서로 다른 세포 유형(예: 상피 및 기질 섬유아세포 또는 상피와 혈관 내피)을 배양하여 장기 수준의 조직-조직 인터페이스를 재현할 수 있습니다(그림 1). 두 조직 모두 유체 흐름에 독립적으로 노출될 수 있으며, 복잡한 마이크로바이옴 25,26,27,28과 공동 배양을 가능하게 하는 미세 호기성 조건을 경험할 수도 있습니다. 이 접근법은 최근 호르몬에 민감한 원발성 질 상피와 기저 기질 섬유아세포로 둘러싸인 인간 질 칩을 개발하는 데 활용되었으며, 이는 상피 내강에서 낮은 생리적 산소 농도를 유지하고 시험관 내에서 최소 3일 동안 건강한 디스바이오틱 마이크로바이옴과 공동 배양을 가능하게 합니다 29. 질 칩은 최적(건강한) L. crispatus 컨소시엄에 의한 집락화를 연구하고 최적이 아닌(건강하지 않은) G. vaginalis 함유 컨소시엄으로 인한 염증 및 부상을 감지하는 데 사용할 수 있음을 입증했습니다. 여기에서는 인간 질 칩을 만들고 건강하고 불균형적인 박테리아 커뮤니티를 온칩에 구축하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다.

프로토콜

이 연구는 인간 세포 사용에 대한 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 세포는 상업적으로 얻어졌다( 재료 표 참조). 모든 단계는 생물안전 작업대(BSC)에서 무균 상태로 수행해야 합니다. 이 프로토콜에는 필터(또는 배리어) 피펫 팁만 사용하십시오.

1. 인간 질 상피 세포 배양

  1. 50mL의 질 상피 배지(VEM, 재료 표 참조)를 37°C로 데웁니다.
  2. 9mL의 VEM을 15mL 튜브에 분취합니다. 그런 다음 인간 질 상피 세포(HVEC)의 바이알을 해동하고 VEM이 들어 있는 튜브에 추가합니다.
  3. 15mL 튜브를 실온(RT)에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 남겨두고 상층액을 흡입합니다.
  4. 펠릿을 VEM 2mL에 부드럽게 재현탁시키고 14mL의 VEM이 들어 있는 두 개의 T75 플라스크 각각에 1mL를 추가합니다.
  5. 플라스크를 37 ° C에서 5 % CO 2 로 배양합니다. HVEC가 약 70%(약 5일) 합류할 때까지 2일마다 VEM을 변경합니다.

2. 인간 자궁 섬유아세포 배양

  1. 이중 증류수(ddH2O)에 15μg/mL 폴리-L-라이신 용액(PLL) 10mL를 준비합니다. 두 개의 T75 플라스크 각각에 5mL의 PLL 용액을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  2. 섬유아세포 배지 50mL(FM, 재료 표 참조)를 37°C로 예열합니다.
  3. PLL 용액을 흡입하고 각 플라스크를 5mL의 ddH2O로 세척합니다.
  4. 9mL의 FM을 15mL 튜브에 분취하고 인간 자궁 섬유아세포(HUF) 바이알을 해동합니다.
  5. FM이 들어 있는 15mL 튜브에 HUF를 추가합니다.
  6. 15mL 튜브를 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 남겨두고 상층액을 흡입합니다.
  7. 펠릿을 2mL의 FM에 부드럽게 재현탁시키고 14mL의 FM이 들어 있는 두 개의 T75 플라스크 각각에 1mL를 추가합니다.
  8. 37 ° C에서 5 % CO2 로 플라스크를 배양하고 세포가 약 70 % 합류 할 때까지 2 일마다 배지를 교체합니다.

3. 칩 활성화 및 채널 코팅

  1. 진공 데시케이터에서 30분 동안 칩(상업적으로 획득, 재료 표 참조)을 탈가스합니다.
  2. 활성화 시약 1(AR-1) 및 활성화 시약 2(AR-2)( 재료 표 참조)가 포장을 제거하지 않고 15분 동안 RT와 평형을 이루도록 합니다.
  3. 15mL 원뿔형 튜브를 호일로 싸서 빛으로부터 보호합니다. AR-1 바이알의 벽에 AR-2 용액 1mL를 천천히 넣고 잘 섞습니다. 혼합물을 호일로 감싼 15mL 튜브로 옮깁니다.
  4. AR-1 분말이 바이알에서 완전히 세척될 때까지 AR-1 용액을 1mL 단위로 AR-1 바이알에 반복적으로 추가합니다.
  5. AR-2 용액으로 AR-1 재구성 용액을 10mL까지 보충합니다.
  6. 이 용액 200μL를 배출구에서 흡입하면서 각 칩의 정점 채널 입구에 추가합니다(그림 1A). 기저 채널에 대해 반복합니다. 피펫을 칩에 수직으로 유지하면서 용액을 추가하여 흐름이 방해받지 않도록 단단히 밀봉하십시오.
  7. 모든 칩에 대해 3.6단계를 반복합니다.
  8. 모든 칩에 거품이 있는지 확인하십시오. 영향을 받는 채널에 더 많은 용액을 추가하여 기포를 제거합니다.
  9. 채널 입구와 출구를 피하면서 칩 표면에서 과도한 AR-1 용액을 모두 흡입합니다.
  10. 150mm 페트리 접시에 칩을 넣고 이 덮개를 덮지 않은 접시를 UV 라이트 상자에 넣습니다.
  11. UV 라이트 박스를 BSC 뒤쪽으로 향하게 하고 칩을 30분 동안 일정한 UV 라이트 아래에 둡니다. 칩에 있는 용액의 색상이 짙은 분홍색에서 마호가니로 바뀝니다.
  12. 200μL의 AR-2 용액을 입구에 추가하면서 동시에 출구에서 흡입하여 각 채널을 세척합니다.
  13. 배출구에서 동시에 흡입하면서 200μL의 차가운 DPBS(-/-)를 입구에 추가하여 각 채널을 두 번 세척합니다.
  14. 정점 채널 코팅(DMEM에서 200μg/mL 콜라겐 I 및 30μg/mL 콜라겐 IV 혼합물)을 준비합니다( 재료 표 참조). 얼음 위에 두십시오.
  15. 기저 채널 코팅(DMEM에서 15μg/mL PLL 및 200μg/mL 콜라겐 I 혼합물)을 준비합니다. 얼음 위에 두십시오.
  16. 200 μL의 기저 채널 코팅을 기저 채널 입구에 추가합니다. 코팅 용액이 배출구에 나타나면 P200 팁으로 배출구를 막으십시오. 입구와 출구 팁 부피가 같아질 때까지 용액을 분주한 다음 피펫에서 피펫 팁을 분리하고 팁을 입구에 남겨 둡니다.
  17. 마찬가지로, 200 μL의 정점 채널 코팅을 정점 채널에 추가합니다.
  18. 칩 표면에서 과도한 용액을 흡입합니다.
  19. 모든 칩에 거품이 있는지 확인하십시오. 영향을 받는 채널에 더 많은 채널 코팅을 추가하여 기포를 제거합니다.
  20. 칩을 37 % CO2 와 함께 37 ° C에서 150 mm 페트리 접시에서 밤새 배양합니다.

4. HUFs를 가진 씨를 뿌리는 칩 기초 수로를

  1. 매일 현미경으로 플라스크의 HUF가 자라는 것을 볼 수 있습니다.
  2. HUF 배양액이 70%-90% 합류하면(도금 후 ~3일) FM 25mL, Ca2+/Mg2+ 유리 DPBS(DPBS(-/-) 5mL, 트립신/EDTA 10mL, 트립신 중화 용액(TNS, 재료 표 참조) 15mL를 37°C로 데웁니다.
  3. 플라스크에서 매체를 흡입합니다. 5mL의 DPBS(-/-)로 세척한 다음 다시 흡입합니다.
  4. 각 플라스크에 4mL의 트립신-EDTA를 넣고 세포가 분리될 때까지 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
  5. 각 플라스크에 6mL의 TNS를 추가하고 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
  6. 현탁액을 피펫과 잘 섞고 세포 계수를 위해 10μL 부분 표본을 취합니다. 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 트리판 블루를 혼합하고 혈구계를 사용하여 계산합니다.
  7. RT에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리기 셀 현탁액. 상층액을 흡입하고 펠릿을 따뜻한 FM에서 최종 농도인 7.5 x 105 cells/mL로 재현탁시킵니다.
  8. 200 μL의 FM으로 기저 채널을 세척하십시오.
  9. VEM 15mL를 37°C로 데웁니다. 200μL의 VEM으로 정점 채널을 세척합니다.
  10. 200 μL의 전체 VEM을 정점 채널 입구에 추가하면서 피펫 팁으로 출구를 막습니다. 입구와 출구 팁 부피가 같아질 때까지 매체를 분주한 다음 피펫에서 피펫 팁을 분리하고 팁을 입구에 남겨 둡니다. 입구와 출구 모두에서 상단 채널을 채우고 막은 상태로 유지하십시오.
  11. 50 μL의 HUF 셀 현탁액을 배출구에서 흡인하면서 동시에 기저 채널 입구로 천천히 피펫팅합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 피펫 플런저를 누르거나 놓지 않고 셀 현탁액의 ~2μL가 피펫 팁에 남아 있을 때 주입구에서 피펫 팁을 제거합니다. 피펫 팁으로 입구와 출구를 막습니다.
  12. 현미경으로 기포가 있는지 확인하십시오. 존재하는 경우 FM으로 기초 채널을 세척하고 4.11단계를 반복합니다.
  13. 15mL 튜브 랙에서 플러그된 칩을 거꾸로 뒤집고 37°C에서 5% CO2 로 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 칩을 관찰하고 세포 부착을 확인합니다.
  14. 피펫 팁으로 기저 채널의 출구를 막습니다. 피펫 플런저를 아래로 누르지 않고 200 μL의 FM을 기저 채널 주입구에 추가합니다. 피펫에서 팁을 분리하고 매체가 중력 흐름에 의해 채널을 통해 출구 피펫 팁으로 자유롭게 흐르도록 합니다.
  15. HUF 씨를 뿌린 칩을 37 ° C에서 5 % CO 2로 밤새 배양합니다.

5. 질 상피 세포를 가진 칩 정점 수로를 파종하기

  1. VEM 50mL를 37°C로 데웁니다.
  2. 정점 채널 코팅(DMEM에서 200μg/mL 콜라겐 I)을 준비합니다. 얼음 위에 두십시오.
  3. 피펫 팁으로 정점 채널 출구를 꽂습니다.
  4. 200 μL의 정점 채널 코팅을 정점 채널 입구에 추가합니다. 입구와 출구 팁 부피가 같아질 때까지 정점 코팅 용액을 분주한 다음 피펫에서 피펫 팁을 분리하여 팁을 입구에 남겨 둡니다.
  5. 칩 표면에서 과도한 용액을 흡입합니다.
  6. 37 ° C에서 5 % CO2 로 1 시간 동안 칩을 배양합니다.
  7. 1시간 후 출구에서 흡입하면서 정점 채널 입구에 200μL의 VEM을 추가하여 정점 채널 코팅을 세척합니다.
  8. ~70%-90% 밀도에 대해 현미경으로 HVEC 성장을 확인하십시오.
  9. 세포가 70%-90% 합류하는 경우 플라스크당 6mL의 완전한 질 상피 세포 배지와 4mL의 트립신/EDTA를 37°C로 데웁니다.
  10. HVEC 플라스크에서 배지를 흡입하고 5mL의 DPBS(-/-)로 세척한 다음 흡입합니다.
  11. 각 플라스크에 4mL의 트립신을 추가하고 세포가 분리될 때까지 3-5분 동안 5% CO2 로 37°C에서 배양합니다.
  12. 플라스크에 VEM 6mL를 추가하여 트립신을 비활성화하고 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
  13. 현탁액을 피펫과 잘 섞고 세포 계수를 위해 10μL 부분 표본을 취합니다. 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 트리판 블루를 혼합하고 혈구계를 사용하여 계산합니다.
  14. RT에서 5분 동안 300 x g 에서 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 VEM의 펠릿을 최종 농도인 35-400만 cells/mL로 재현탁시킵니다.
  15. 25mL의 FM을 37°C로 데웁니다.
  16. 피펫 팁으로 정점 채널 출구를 꽂습니다. 최소 40μL의 HVEC 셀 현탁액을 정점 채널 입구로 천천히 피펫팅합니다. Inlet 및 Outlet 팁 부피가 같아질 때까지 셀 현탁액을 분주한 다음 피펫에서 피펫 팁을 분리하고 팁을 Inlet에 남겨 둡니다. 기초 채널을 FM으로 채우고 입구와 출구 모두에 플러그를 꽂아 두십시오.
  17. 칩 표면에 과도한 매체를 조심스럽게 흡입하고 현미경으로 기포가 있는지 확인합니다. 있는 경우 5.16단계를 반복합니다.
  18. 큰 페트리 접시에 칩을 넣고 37 ° C에서 5 % CO2 로 밤새 배양합니다.
  19. 다음 날에는 세포 부착을 위해 현미경으로 칩을 관찰합니다.
  20. 정점 및 기저 채널의 입구와 출구에서 피펫 팁을 제거합니다.
  21. 피펫 팁으로 기저 채널 출구를 연결하고 피펫 플런저를 아래로 누르지 않고 기저 채널 입구에 200μL의 FM을 추가합니다. 피펫에서 피펫 팁을 분리하고 매체가 중력 흐름에 의해 채널을 통해 출구 피펫 팁으로 자유롭게 흐르도록 합니다.
  22. VEM을 사용하여 정점 채널에 대해 5.21단계를 반복합니다.
  23. 이중 파종된 칩을 37°C에서 5% CO2 로 24시간 동안 배양합니다.

6. 칩을 포드에 연결하고 질 상피 세포를 분화합니다.

  1. 50mL의 FM 및 VEM을 분취하여 50mL 코니컬 튜브를 분리하고 37°C로 예열합니다.
  2. FM 및 VEM 매체를 멸균 진공 상태에서 5분 동안 37°C로 예열하여 가스를 제거합니다.
  3. Dynamic Flow Module(DFM, 재료 표 참조)의 트레이를 소독하고 청소합니다. 포장에서 꼬투리를 제거하고 트레이에 넣습니다.
  4. 탈기된 VEM 2mL를 정점 입구 저장소(오른쪽 상단 저장소; 그림 1B). 기포 형성을 방지하기 위해 저수지 벽을 따라 매체를 추가하십시오.
  5. 탈기된 FM 3mL를 기저 입구 저장소(왼쪽 상단 저장소, 그림 1B)에 추가합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 저수지 벽을 따라 매체를 추가하십시오.
  6. 500μL의 탈기된 VEM을 정점 출구 저장소(오른쪽 하단 저장소, 그림 1B)에 추가합니다. 매체가 저장소의 전체 바닥 표면을 덮도록 포드를 기울입니다.
  7. 500μL의 탈기된 FM을 기저 배출구 저장소에 추가합니다(왼쪽 하단 저장소, 그림 1B). 매체가 저장소의 전체 바닥 표면을 덮도록 포드를 기울입니다.
  8. 포드가 포함된 트레이를 DFM에 밀어 넣고 프라임 사이클을 두 번 실행합니다. 각 포드의 아래쪽에 있는 포트에서 물방울이 나오는지 확인합니다.
  9. 4번의 "Prime" 주기 후에도 액적이 형성되지 않으면 포드의 출구 저장소(그림 1B) 및 해당 매체의 피펫 200μL 내부의 포트와 직접 접촉하여 매체가 저장소와 채널 사이를 흐를 수 있도록 합니다. 이를 "핸드 프라이밍"이라고 합니다.
  10. 칩에서 피펫 팁을 제거하고 각 칩의 모든 포트에 해당 매체의 방울을 놓습니다.
  11. 칩을 포드에 밀어 넣고 포드를 트레이에 놓습니다.
  12. 칩 표면의 모든 매체를 흡입하고 각 트레이를 DFM에 밀어 넣습니다.
  13. DFM에서 다음 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 상단 및 하단 - 액체; 정점(상단 채널) 유량 - 15μL/h; 기초(하단 채널) 유량 - 30 μL/h; 스트레치 = 0%; 주파수 = 0Hz.
  14. DFM에서 조절 주기를 실행하고 밤새 흐름을 허용합니다.
  15. 24시간 후 정점 채널에 대한 유량 설정을 0μL/h로 변경하고 기저 채널을 24시간 동안 30μL/h 유량으로 유지합니다.
  16. 4mM L-글루타민, 20mM 하이드로코르티손, 1x ITES, 20nM 트리요오드티로닌, 100μM O-포스포릴 에탄올아민, 180μM 아데닌, 3.2mM 염화칼슘, 2% 열불활성화 FBS, 1% 펜-스트렙 및 120mL의 Ham's F-12 배지를 저포도당 DMEM( 재료 표 참조)에 첨가하여 500mL의 분화 배지(DM)를 준비하고 필터 멸균합니다.
  17. 50mL의 DM을 37°C로 데웁니다.
  18. 20μL의 10μM 에스트라디올( 재료 표 참조)을 DM 50mL에 넣고 잘 섞은 다음 멸균 진공 상태에서 5분 동안 가스를 제거합니다.
  19. VEM 50mL를 수조에서 37°C로 데우고 멸균 진공 상태에서 5분 동안 가스를 제거합니다.
  20. DFM에서 트레이를 제거하고 BSC에 배치한 다음 저장소의 포트를 피하여 포드에서 미디어를 흡입합니다(그림 1A). 그런 다음 정점 채널 입구 reservoir에 VEM 2mL를 추가하고 기저 채널 입구 reservoir에 3mL의 DM을 추가합니다.
  21. 트레이를 DFM으로 되돌리고 정점 채널 유량을 15μL/h로, 기초 채널 유량을 30μL/h로 설정합니다.
  22. DFM이 4-7시간 동안 흐르도록 합니다. 그런 다음 정점 채널 흐름을 0μL/h로 설정하여 중지합니다. 기저 채널 흐름이 30μL/h로 계속되도록 합니다.
  23. 6.16시간마다 6.19-48단계에 따라 미디어를 교체합니다.
  24. 단계 6.20-6.21에 따라 추가로 5일 동안 매일 4-7시간 동안 정점 채널에서 간헐적으로 매체를 흘립니다.
  25. 1.26 mM 염화칼슘, 0.49 mM 염화마그네슘 육수화물, 0.406 mM 황산마그네슘, 5.33 mM 염화칼륨, 137.93 mM 염화나트륨, 0.441 mM 인산칼륨 일염기성 및 5.55 mM D-포도당을 ddH2O로 첨가하여 포도당(HBSS(LB/+G)) 매체로 완충 용량이 낮은 Hanks의 균형 염 용액을 준비합니다( 재료 표 참조). 산도 4.8.
  26. 저혈당 DMEM에 4mM L-글루타민, 20mM 하이드로코르티손, 1x ITES, 20nM 트리요오드티로닌, 100μM O-포스포릴 에탄올아민, 180μM 아데닌, 3.2mM 염화칼슘, 2% 열불활성화 FBS, 120mL의 Ham's F-12 배지를 첨가하여 500mL의 Pen-Strep-free DM을 준비하고 여과 멸균합니다.
  27. 6일째에 6.16-6.19단계에 따라 정점 채널 매체를 (HBSS(LB/+G))로 교체하고 기저 채널 매체를 Pen-Strep-free DM으로 교체합니다.
  28. 세균 접종을 진행하기 전에 DFM의 유량을 정점 채널의 경우 15μL/h, 기저 채널의 경우 30μL/h로 24시간 동안 설정합니다.

7. 분화된 칩의 세균 접종

알림: 미생물 취급 규정을 준수하는 실험실 및 BSC에서 다음 단계를 수행하십시오.

  1. 접종물에 포함될 각 박테리아 균주의 CFU/mL를 계산합니다. 각 박테리아 균주의 필요한 양을 최대 ~ 5 x 106 CFU / mL까지 혼합합니다.
  2. 혼합물을 7,000 x g 에서 4 ° C에서 7 분 동안 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 (HBSS (LB/+G))에 재현탁시킵니다. 이것이 세균 접종물이 될 것입니다.
  3. 포드에서 칩을 분리합니다. 피펫 팁으로 기저 채널의 출구를 막고 피펫 플런저를 아래로 누르지 않고 200μL의 Pen-Strep-free DM을 기저 채널 입구에 추가합니다. 피펫에서 피펫 팁을 분리하고 매체가 중력 흐름에 의해 채널을 통해 출구로 자유롭게 흐르도록 합니다.
  4. 37μL의 박테리아 접종물을 출구에서 흡입하면서 정점 채널 입구에 추가합니다. 피펫 팁에 약 2μL가 남아 있으면 팁을 당겨 빼내고 정점 채널 입구와 출구를 피펫 팁으로 막습니다.
  5. 대조군(접종되지 않은) 칩의 경우 37μL(HBSS(LB/+G))로 7.4단계를 반복합니다.
  6. 칩 표면에 있는 모든 매체를 흡입합니다. 칩을 150mm 페트리 접시에 넣고 37°C에서 5% CO2 로 24시간 동안 배양합니다.
  7. 포드(칩 없음)를 트레이에 놓고 37°C에서 5% CO24 시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.
  8. 50mL(HBSS (LB/+G)) 및 50mL의 Pen-Strep-free DM을 37°C로 데웁니다.
  9. 20μL의 10μM 에스트라디올을 50mL의 Pen-Strep-free DM에 넣고 잘 섞은 다음 멸균 진공 상태에서 5분 동안 가스를 제거합니다. 진공 상태에서 5분 동안 (HBSS(LB/+G))의 가스를 제거합니다.
  10. 저장소 입구와 출구 포트를 피하면서 포드의 미디어를 조심스럽게 흡입합니다.
  11. apical inlet pod reservoir에 탈기된(HBSS(LB/+G)) 3mL를 추가하고 apical outlet pod reservoir에 탈기된(HBSS(LB/+G)) 500μL를 추가합니다.
  12. 기저 입구 포드 reservoir에 가스가 제거된 Pen-Strep-free DM 3mL를 추가하고 기저 출구 포드 reservoir에 가스가 제거된 무항생제 DM 500μL를 추가합니다.
  13. 포드(칩 제외)가 있는 트레이를 DFM에 밀어 넣고 프라임 사이클을 두 번 실행합니다. 포드 아래쪽의 각 포트에서 물방울이 나오는지 확인합니다.
    참고: 4번의 "Prime" 주기 후에도 액적이 형성되지 않으면 포드의 출구 저장소(그림 1B) 내부의 포트와 해당 매체의 피펫 200μL에 직접 접촉하여 매체가 저장소와 채널 사이를 흐를 수 있도록 합니다.
  14. 칩에서 피펫 팁을 제거하고 모든 채널 입구와 출구에 해당 매체의 한 방울을 놓습니다.
  15. 칩을 포드에 밀어 넣고 포드를 트레이에 넣습니다.
  16. 정점 및 기저 출구 포드 저장소의 흡입 매체와 칩 표면의 모든 매체. 그런 다음 트레이를 DFM에 밀어 넣습니다.
  17. DFM에서 다음 매개 변수를 설정하십시오 : 상단 및 하단 - 액체; 정점(상단) 유량 - 40 μL/h; 기초 (바닥) 유량 - 40 μL / h; 스트레치 - 0%; 주파수 - 0Hz. 조절 주기를 실행합니다.
  18. 4시간 후에 흐름을 멈추고 유출물, 즉 정점 및 기저 출구 저장소의 매체를 수집합니다.
  19. 유출량을 측정하고 기록합니다.
  20. 칩을 DFM에 다시 배치하고 정점 유량을 0μL/h로, 기초 유량을 30μL/h로 설정합니다. 밤새 실행되도록 흐름을 시작합니다.
  21. 다양한 계획된 분석을 위해 수집된 폐수를 분취하고 적절한 온도에서 보관합니다.
    알림: CFU 측정의 경우 글리세롤을 최종 농도 16%까지 첨가하고 즉시 -80°C에서 보관하십시오.
  22. 기저 배출구 저장소에서만 배지를 흡입하고 DFM에서 정점 및 기저 유속을 40μL/h로 설정합니다. 4시간 동안 흐름을 시작하고 7.18-7.21단계를 반복합니다. 이것은 48시간 동안 폐수 수집이 될 것입니다.
  23. 72시간 동안 또는 실험이 끝날 때까지 7.22단계를 반복합니다.
  24. 실험의 끝에서 7.18-7.19 단계에 따라 폐수를 수집합니다.
  25. TrypLE express에 1mg/mL 콜라겐분해효소 IV를 첨가하여 분해 용액을 준비합니다. 분해 용액 10mL를 37°C로 데웁니다.
  26. 기저 채널의 출구 포트를 피펫 팁으로 꽂습니다. 100 μL의 분해 용액을 기저 채널에 추가합니다. 잘 섞고 피펫을 사용하여 '튜브 B'라고 표시된 튜브의 채널에서 모든 용액을 수집합니다.
  27. 정점 채널의 출구 포트를 피펫 팁으로 꽂습니다. 100 μL의 분해 용액을 정점 채널에 추가합니다. 잘 섞고 피펫을 사용하여 '튜브 A'라고 표시된 튜브의 채널에서 모든 용액을 수집합니다.
  28. 또 다른 100 μL의 분해 용액을 정점 및 기저 채널 입구에 추가하고 피펫 팁으로 출구를 막습니다. 칩과 튜브 A와 B를 37°C에서 1-1.5시간 동안 배양합니다.
  29. 입구와 출구에 이미 배치된 막힌 팁을 사용하여 채널 내부에서 분해 내용물을 잘 혼합합니다. 정점 채널과 기저 채널의 내용물을 각각 튜브 A와 B로 수집합니다. 이들은 칩, 정점 및 기저 소화물입니다.
  30. 혈구계를 사용하여 튜브 A의 세포 수를 셉니다. 또한 7.21단계에 따라 CFU 측정을 위해 칩 다이제스트에서 부분 표본을 제거합니다.

8. 칩 폐수 및 분해물 분석

  1. 폐수 및 분해물에서 박테리아를 계수하기 위해 폐수 또는 분해물을 멸균 DPBS(-/-)에서 연속적으로 희석하고 적절한 배지 플레이트에 플레이트를 놓고 37°C에서 24-48시간 동안 배양하고 플레이트의 콜로니를 계산합니다.
  2. pH 측정을 위해 수집 직후 72시간 폐수 중 10μL를 취하고 pH 스트립을 사용하여 폐수의 pH를 측정합니다.
  3. 사이토카인 분석을 위해 유출물을 사용하여 Luminex 기반 분석, ELISA 또는 기타 적용 가능한 기술29,30을 사용하여 특정 사이토카인을 검출합니다.

결과

인간의 질은 섬유아세포가 풍부한 콜라겐 기질 위에 있는 성층상피(stratified epithelium)로 둘러싸여 있습니다. 이를 모델링하기 위해 2채널 미세유체 장기 칩 장치 내에서 공통 다공성 막의 반대쪽에 있는 원발성 인간 질 상피와 섬유아세포를 배양하여 조직 인터페이스를 만들었습니다. 질 상피의 형성은 명시야 현미경 이미징을 사용하여 모니터링되며, 이를 통해 점진적으로 여러 세포층을 형성하는 연속적인 세포 시트의 형성을 확인할 수 있습니다(그림 2A). 이전 보고서에서는 이 형태가 횡단면29에서 볼 때 완전히 층화된 상피의 발달과 관련이 있음을 확인했습니다. 그러나 상피층이 고르지 않고 불연속적으로 보이는 경우(그림 2B) 질 칩이 실험에 사용하기에 적합하지 않을 수 있습니다.

그림 3은 질 칩(Vagina Chip)의 생성에 대한 개략도를 보여줍니다. 질 칩의 기능을 검증하기 위해 칩에 L. crispatus 와 G. vaginalis 를 접종하여 각각 건강한 질 환경과 불균형적인 질 환경을 모델링했습니다. G. vaginalis 는 주로 세균성 질염에 관여하는 박테리아입니다. 질 칩에 건강하고 불균형적인 박테리아가 생착하는지 확인하기 위해, 채널 유출물과 소화된 세포층을 선택적 박테리아 성장 매체( L. crispatus 의 경우 De Man-Rogosa-Sharpe(MRS) 한천, G. 질의 경우 Brucella 혈액 한천(BBA))( 재료 표 참조)에 도금하고 원래 접종물을 사용하여 유사한 배양물과 비교하여 다양한 박테리아 집단으로 접종된 질 칩의 박테리아 부하를 정량화했습니다. L. crispatus 와 G. vaginalis 의 콜로니는 도금 후 48시간 이내에 검출되었으며(그림 2C), 건강한 박테리아와 불균형 박테리아가 모두 질 칩에 생착되었음을 확인했습니다. 그러나, 접종물이 들어있는 플레이트에서 박테리아 콜로니가 관찰되지만 필요한 배양 후 폐수 또는 소화물이 들어있는 플레이트에서 관찰되지 않는 경우, 박테리아가 생착하지 않았다는 결론을 내릴 수 있습니다.

건강한 질 환경은 산성이며, 미생물 불균형으로 인해 질 pH31이 증가합니다. 따라서 Vagina Chip의 정점 상피 채널의 유출물의 pH도 분석되었습니다. L. crispatus 를 접종한 Vagina Chips의 pH는 접종하지 않은 대조군 칩의 pH와 유사했으며, G. vaginalis 와 공동 배양했을 때 pH가 크게 증가했습니다(그림 2D). 감염되지 않은 질 칩의 pH가 높은 것으로 관찰되면 문제가 있음을 나타내며 이러한 칩을 실험에 사용해서는 안 됩니다.

질 조직의 염증 상태는 질 마이크로바이옴의 구성에도 민감하며, 이형성 미생물 마이크로바이옴이 염증을 자극합니다. L. crispatus 또는 G. vaginalis를 접종한 지 3일 후에 질 칩의 정점 채널에 있는 전염증성 사이토카인을 분석한 결과, 감염되지 않은 칩 및 L. crispatus를 접종한 칩에 비해 G. vaginalis에서 전염증 반응이 더 높은 것으로 유사하게 밝혀졌습니다(그림 2E). 종합하면, 이러한 결과는 질 칩이 건강한 상태와 불균형 상태 모두에서 인간의 질 미세 환경을 밀접하게 모방한다는 것을 보여줍니다.

figure-results-1
그림 1: 2채널 칩과 해당 포드. (A) 채널과 포트를 보여주는 2채널 PDMS 칩의 이미지. (B) 정점 및 기저 수로의 저장소와 항구를 묘사하는 포드 이미지. (C) 미생물에 감염된 질 칩의 단면도를 보여주는 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: Vagina Chip은 건강하고 불균형적인 인간 질 미세환경을 모방합니다. (A) 견고한 질 칩의 정점 채널에 있는 질 상피 세포. 스케일 바는 상단 이미지에서 칩의 1mm를 나타내고 하단 이미지에서 500μm를 나타냅니다. (B) 부적절한 질 칩의 정점 채널에 있는 질 상피 세포. 스케일 바는 상단 이미지에서 칩의 1mm를 나타내고 하단 이미지에서 500μm를 나타냅니다. (C) 질 칩에서 L. crispatus (LC) 및 G. vaginalis (GV)의 생착. (D) 감염되지 않은(대조군) 질 칩과 비교하여 L. crispatus(LC) 및 G. vaginalis(GV)로 72시간 배양 후 질 칩의 pH. (E) 감염되지 않은(대조군) 질 칩과 비교하여 72시간 배양 후 L. crispatus(LC) 및 G. vaginalis(GV)에 대한 질 칩의 전염증 반응. (C-E) 그래프는 4-6 칩에 대한 평균 ± SD를 나타냅니다. * p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001 대조 질 칩과 비교; 각 (●)는 1개 칩의 데이터를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: Vagina Chip의 생성을 위한 프로토콜의 개략도 . 세포를 파종하고 Vagina Chip의 생성과 관련된 단계를 개략적으로 표현합니다. HVEC - 인간 질 상피 세포; HUF - 인간 자궁 섬유아세포; VEM - 질 상피 매체; FM - 섬유아세포 매체; DM - 분화 매체; PS - 페니실린 스트렙토마이신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

과거의 인간 질의 체외 모델은 질 조직 구조, 유체 흐름 및 숙주-병원체 상호 작용을 충실하게 복제하지 못했다19,22. 동물 모델은 또한 미생물군집의 종간 변이와 발정기 또는 월경 주기의 차이에 의해 제한된다19,22. 이 원고는 건강하고 불균형한 미생물 군집에 대한 인간의 반응을 효과적으로 모방할 수 있는 인간 질의 장기 칩 모델을 만들기 위한 프로토콜을 설명합니다.

이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 2채널 장기 칩 장치에서 병렬 미세채널을 분리하는 공유 다공성 막의 반대쪽에 질 상피 세포와 섬유아세포 세포를 파종하는 것을 포함합니다( 재료 표 참조). 다공성 막은 성장 인자와 다른 형태의 세포 간 통신의 이동을 허용합니다. 그러나 콜라겐 코팅과 세포 단층의 존재는 채널 간 매체의 혼합을 방지합니다. 정점 채널에서 질 상피 세포 단층이 형성되면 분화 인자가 기저 채널에서 흐르는 배지에 도입되어 간질 공간을 통과하여 질 상피 세포의 분화를 촉진하여 층화된 상피를 형성합니다. 파종 시점의 질 상피 세포의 밀도는 분화 단계가 끝날 때 질 칩의 건강을 결정하는 중요한 요소입니다. 따라서, 질 상피 세포의 밀도는 분화를 시작하기 전에 평가되어야 하며, 이는 단층이 확립될 때까지 시작되어서는 안 됩니다. 분화 인자에 대한 노출은 질 상피 세포의 원하는 밀도가 얻어질 때까지 그리고 세균 접종 전에 계속될 수 있습니다. 또한, 성장 속도는 다른 기증자(또는 상업적 출처)의 주요 질 상피 세포에 대해 다를 수 있으며, 이는 생성된 질 칩의 품질에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 모든 미세유체 장기 칩 연구에서는 배지 흐름을 방해하고 결국 영양소 가용성을 감소시키고 세포 생존력을 잃게 할 수 있으므로 칩 배양 전반에 걸쳐 채널에 형성될 수 있는 기포를 제거하는 것이 가장 중요합니다.

이 프로토콜은 또한 질 칩을 사용하여 건강한 질 상태 또는 세균성 질염을 모방하는 박테리아 커뮤니티를 온칩으로 구축하는 방법을 설명합니다. 질 칩은 또한 다른 질 질병이나 장애를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 연구를 수행할 때 각 질병의 특성과 결과를 임상 결과와 연관시키는 가장 좋은 방법을 이해하는 데 주의를 기울여야 합니다. 요약하면, 인간 질 칩은 FRT와 관련된 과다한 질병 및 상태를 연구하는 새로운 길을 열고, 잠재적인 치료법을 조사하기 위한 귀중한 도구가 될 수 있습니다.

공개 사항

도널드 잉버(Donald Ingber)는 Emulate의 창립자, 이사회 멤버, 과학 자문 위원회 의장 및 지분 보유자입니다. 다른 저자들은 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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2채널 칩에뮬레이트BRK-S1-WER-242채널 칩 키트의 일부입니다
200 & mu; L 배리어 팁(또는 필터 팁)토마스 사이언티픽, SHARP1159M40칩 씨딩에 사용되는 팁
활성화 시약 1(또는 ER-1 분말) & nbsp;에뮬레이트칩 S1 기본 연구 키트-24PK2채널 칩 키트의 일부; 저장 온도 -20 & deg; 참고; 그리고 nbsp;
활성화 시약 2(또는 ER-2 용액) 에뮬레이트칩 S1 기본 연구 키트-24PK2채널 칩 키트의 일부; 저장 온도 4 & 도; C
아데닌시그마 올드리치 A2786분별 매체의 구성 요소
브루셀라 혈액 한천 플레이트VWR 인터내셔널 주식회사 89405-032헤민과 비타민 K와 함께; 가드네렐라 질의 개체 조사를 위해서입니다
Ca2+ 및 Mg2+ 자유 DPBS (DPBS (-/-)사이엔셀303세척 셀을 위해
염화칼슘시그마 올드리치 C5670분별 매체의 구성 요소
염화칼슘(무질)그리고 nbsp;시그마 올드리치 499609HBSS의 구성 요소 (LB/+G)
콜라겐 I 코닝354236HVEC용 코팅 솔루션에 대해
콜라겐 IV와 nbsp;시그마 올드리치 C7521HVEC용 코팅 솔루션에 대해
콜라겐제 IV깁코17104019질 칩에서 세포 분리를 위해
완전 섬유아세포 매체 사이엔셀2301HUF 문화를 위한 미디어
완전 질 상피 매체생명선LL-0068HVEC 문화를 위한 미디어
D-포도당(덱스트로스) 시그마 올드리치 158968HBSS의 구성 요소 (LB/+G)
DMEM(저혈당) 서모피셔12320-032분별 매체의 구성 요소
동적 흐름 모듈(또는 Zoë)에뮬레이트Zoë-CM1칩의 유량을 조절합니다
햄의 F12서모피셔11765-054분별 매체의 구성 요소
열로 불활성화 FBS Thermofisher와 nbsp;10438018분별 매체의 구성 요소
인간 자궁 섬유아세포사이엔셀7040후프
인간 질 상피 세포생명선FC-0083HVEC
하이드로코르티손시그마 올드리치 H0396분별 매체의 구성 요소
이테스론자17-839Z분별 매체의 구성 요소
L-글루타민서모피셔25030081분별 매체의 구성 요소
육수화마그네슘 클로라이드시그마 올드리치 M2393HBSS의 구성 요소 (LB/+G)
황산마그네슘 헵타하이드레이트시그마 올드리치 M1880HBSS의 구성 요소 (LB/+G)
MRS 한천 플레이트VWR 인터내셔널 주식회사 89407-214락토바실러스 열거
O-포스포릴레탄놀아민시그마 올드리치 P0503분별 매체의 구성 요소
펜/연쇄상구균Thermofisher와 nbsp;15070063분별 매체의 구성 요소
pH 스트립피셔-사이언티픽13-640-520pH와 nbsp 측정을 위해;
포드 (1/칩) 에뮬레이트BRK-S1-WER-242채널 칩 키트의 일부입니다
폴리-L-라이신사이엔셀403HUF용 코팅 용액을 위해
염화칼륨 시그마 올드리치 P3911HBSS의 구성 요소 (LB/+G)
인산칼륨 단염성시그마 올드리치 P0662HBSS의 구성 요소 (LB/+G)
멸균 80% 글리세롤 & nbsp;국회의원 생의학 및 nbsp;113055034박테리아 샘플 냉동
트리이오도티로닌시그마 올드리치 그리고 nbsp; T6397분별 매체의 구성 요소
트리판 블루 솔루션 (0.4%) 시그마 올드리치 T8154살아있는 세포/죽은 세포 수를 세는 데
트립LE 익스프레스Thermofisher와 nbsp;12605010질 칩에서 세포 분리를 위해
트립신 중화용액(TNS) 사이엔셀113트립신 중화를 위해
트립신/EDTA 솔루티옴 (0.25%)사이엔셀103세포 해리에 대해... nbsp;
β-에스트라디올 시그마 올드리치 E2257분화 매개체를 위한 호르몬

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