방법 논문

인간 골육종 조직을 이용한 환자 유래 이종이식 마우스 모델 구축

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DOI:

10.3791/66491

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2024년 3월 22일

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 인간 골육종 조직을 이용하여 환자 유래 이종이식(PDX) 마우스 모델을 확립하는 방법을 설명한다.

초록

골육종은 소아와 청소년에서 가장 흔한 원발성 악성 골종양입니다. 최근 몇 년 동안 새로운 치료 계획이 개발되었음에도 불구하고 골육종 환자의 예후는 크게 개선되지 않았습니다. 따라서 충실도가 높은 강력한 전임상 모델을 구축하는 것이 중요합니다. PDX(Patient-derived xenograft) 모델은 각 환자에 대한 인간 악성 종양의 유전적, 후성유전적, 이질적 특성을 충실하게 보존합니다. 결과적으로, PDX 모델은 형질전환 연구에서 다양한 암을 연구하기 위한 진정한 in vivo 모델로 간주됩니다. 이 기사에서는 인간 골육종의 형태학적 특징을 정확하게 반영하는 PDX 마우스 모델을 만들고 유지하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 여기에는 갓 절제된 인간 골육종 조직을 면역력이 저하된 마우스에 즉시 이식한 후 연속적인 패스에이징이 포함됩니다. 설명된 모델은 골육종의 성장, 약물 내성, 재발 및 전이를 연구하기 위한 플랫폼 역할을 합니다. 또한 표적 치료제를 스크리닝하고 맞춤형 치료 계획을 수립하는 데 도움이 됩니다.

서론

골육종은 골간엽 세포에서 유래한 원발성 뼈 악성 종양으로 소아뿐만 아니라 청소년에게 가장 흔합니다. 장성질환의 골단(epiphysis)에서 자주 발생하며, 악성종양이 높고, 전이가 빠르며, 예후가 좋지 않은 것이 특징이다 1,2. 폐 전이는 골육종 환자의 주요 사망 원인입니다. 비전이성 골육종 환자의 5년 생존율은 65%-70%3입니다. 그러나 지난 40년간 전이성 골육종 환자의 5년 생존율은 20%에 불과하며, 골육종 환자의 25%는 진단 시점에 전이가 있는 것으로 나타났다4. 현재 골육종 치료를 위한 1차 약물은 합의에 도달했지만, 항암화학요법 요법과 치료 시간에는 여전히 상당한 차이가 있다5. 보다 효과적인 화학요법 요법을 얻기 위해 적절한 동물 모델을 기반으로 전임상 실험을 수행하는 것이 중요합니다.

현재 골육종 전임상 실험에 일반적으로 사용되는 모델에는 세포주 기반 in vitro 세포 배양 및 in vivo 세포 유래 이종이식(CDX) 및 환자 유래 이종이식(PDX)이 포함됩니다6,7.

세포주는 배양 및 체외 연구에 사용하거나, 면역 결핍 마우스에 이식하여 CDX 모델을 확립하는 데 편리하다8. 그러나 in vitro에서 배양된 세포주는 반복적인 passage 동안 in vitro 배양 환경에 적응하기 위해 발생할 수 있는 잠재적인 돌연변이로 인해 악성 종양의 이질성과 환자의 개별 특성을 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다. 또한 생체 내에서 종양 성장 및 발달에 필요한 미세환경과 면역 체계가 부족합니다. CDX 모델은 in vitro 세포 배양에 비해 몇 가지 이점을 제공하지만, CDX 모델에서 얻은 종양 조직은 in vitro 9에서 배양된 세포주에 비해 종양 내 이질성과 면역 체계 표현이 제한적이지만 여전히 골육종 환자의 개별 특성을 완전히 반영하지 못할 수 있습니다. 따라서 충실도가 높은 전임상 모델을 구축하는 것이 중요합니다.

PDX 모델은 갓 절제된 인간 암 조직을 면역 결핍 마우스에 즉시 이식하는 것을 포함합니다. 이 방법을 사용하면 각 환자에 대해 인간 악성 종양의 유전적, 후성유전적, 이질적인 특성을 충실하게 보존할 수 있으며, 심지어 마우스에서 연속적인 통로를 거친 후에도 가능합니다. 또한, PDX 모델은 이후의 임상 결과를 정확하게 예측하는 것으로 알려져 있어10 개별화된 치료법을 개발하고 정밀 의학 연구를 발전시키는 데 유용한 도구가 되고 있다11.

이 연구는 인간 골육종 조직을 이식하여 면역결핍 마우스에서 PDX 모델을 확립하는 절차를 설명합니다. 이러한 모델은 골육종에 대한 전임상 실험을 수행하기 위한 플랫폼 역할을 합니다.

프로토콜

인체 조직과 관련된 모든 연구는 중국 상하이 전통 의학 대학(중국 상하이)과 연계된 Longhua Hospital의 기관 윤리 검토 위원회(2013LC52)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언에 따라 환자로부터 서면 동의를 받았습니다. 이 동물 연구에 대한 IACUC 번호는 PZSHUTCM221017013입니다. 4주령 수컷 CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl 마우스에게 이중 사자 방사선 조사 설치류 식단 GB 14924.3 및 멸균수를 제공하고, 12시간 라이트/다크 사이클의 SPF 조건 하에서 케이지당 5마리의 마우스가 있는 IVC 마우스 케이지에 수용했습니다. 재료 표 에는 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 기기에 대한 자세한 정보가 포함되어 있습니다.

1. 인간 골육종 조직의 제조

참고: 이 연구에서 인간 골육종 조직은 화학 요법 전에 15세 골육종 환자의 대퇴골 병변에서12 를 절제했습니다.

  1. 멸균 생리식염수로 헹군 후 골육종 세포 활성화의 보존을 극대화하기 위해 갓 절제된 골육종 조직을 조직 보호 용액에 즉시 보관하십시오.
    참고: 갓 절제된 골육종 조직은 가능한 한 빨리 마우스에 이식해야 합니다. 이식 전 최대 24시간 동안 조직 보호 용액에 보관할 수 있습니다. 모델링에 사용되는 골육종 조직은 화학 요법을 받지 않은 환자의 것이어야 합니다. 화학요법을 받은 환자의 종양 세포의 활성이 불량하여 모델 구축에 실패하고 높은 충실도를 잃게 됩니다.
  2. 조직 보호 용액에 저장된 갓 절제된 골육종 조직을 가능한 한 빨리 실험실로 옮깁니다.
  3. PDX 모델을 확립하기 위한 실험 도구 및 재료를 준비합니다: 메스(그림 1A); 안과용 핀셋(그림 1B,C); 안과 가위(그림 1D); 봉합사 바늘 (그림 1E); 봉합선(그림 1F); 직선 바늘 홀더 (그림 1G); 마킹 펜(그림 1H).
    알림: 모든 수술 기구가 사용하기 전에 고압멸균으로 멸균되었는지 확인하십시오.
  4. 멸균 후드에서 사전 냉각된 멸균 생리식염수로 골육종 조직을 두 번 헹굽니다.
  5. 출혈과 괴사가 있는 골육종 조직 부위를 제거합니다.
  6. 세척한 골육종 조직을 미리 냉각된 멸균 생리식염수가 들어있는 배양 접시에 메스로 3mm3 조각으로 자르고 얼음 위에 보관합니다.

2. 마우스 옆구리 부위에 골육종 조직 이식을 통한 PDX 모델 구축

  1. 생쥐에 멜록시캄(5mg/kg/24시간)의 수술 전 진통제를 투여하고 누드 생쥐를 멸균 수술용 커튼에 놓습니다. 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 제공합니다.
  2. 쥐를 3% 이소플루란과 97% 산소에 노출시켜 마취를 유도합니다. 마우스를 완전히 마취한 후 콧방울로 옮기고 1.5% 이소플루란과 98.5% 산소로 마취를 유지합니다.
  3. 발가락을 꼬집어 쥐가 완전히 마취되었는지 확인하고 여전히 경련이나 경련 반응이 있으면 더 오래 기다립니다.
    알림: 모든 절차는 멸균 후드의 멸균 장비를 사용하여 수행해야 합니다. 마취 중 쥐의 눈에 안과 연고를 바르는 것이 건조하지 않도록 하십시오.
  4. 마우스를 측면 욕창 위치에 고정합니다(그림 2A). 골육종 조직 이식을 위해 마우스 옆구리 부위의 한쪽을 포비돈 요오드와 70% 에탄올 소독제 면봉을 번갈아 가며 3번 소독합니다.
    알림: 외과적 소독은 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 나선형으로 원형 패턴으로 수행됩니다.
  5. 수술 절개 부위를 마커 펜으로 피부에 표시하십시오.
  6. 메스로 피부에서 피하 조직까지 5mm를 절개합니다(그림 2B).
  7. 왼손으로 안과용 핀셋으로 절개 가장자리의 위쪽 피부를 들어 올리고 오른손을 사용하여 직선 바늘 홀더로 마우스의 진피 아래 위쪽으로 둔기 절개를 수행합니다(그림 2C).
  8. 왼손으로 안과용 핀셋으로 절개 부위의 위쪽 피부를 잡고 오른손으로 안과용 핀셋으로 절개 가장자리에서 약 5mm 위에 골육종 조직을 피부 아래에 놓습니다(그림 2C).
    알림: 골육종 조직이 피부 진피 바로 아래에 이식되었는지 확인하십시오. 둔기 절개는 생쥐 피부의 진피층을 찾는 동안 생쥐 흉강을 관통하지 않도록 직선 바늘 홀더와 같은 직선 및 무딘 절개 겸자를 사용하여 수행됩니다.
  9. 5mm 절개를 위해 2-3바늘의 흡수성 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다(그림 2D).
  10. 쥐를 깨끗한 케이지로 돌려보내고 마취에서 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다.
    참고: 인간 골육종 조직을 이식하여 확립된 PDX는 통로 0(P0)으로 지정되고, PDX 조직을 P0에 이식하여 확립된 PDX는 통로 1(P1)로 지정되며, 그 다음으로 P2 및 P3로 지정됩니다.

3. PDX 종양 조직 수집

  1. 일주일에 한 번 종양 부피를 측정합니다. 종양 크기가 1500mm3에 도달하면CO2 흡입 후 자궁경부 탈구법을 사용하여 마우스를 안락사시킨다. 인도적 평가변수에는 종양 궤양 또는 앞다리 이동성 문제가 포함됩니다.
    참고: 캘리퍼스를 사용하여 종양의 긴 직경(a)과 짧은 직경(b)을 측정합니다. V = 1/2 × a × b2 공식을 사용하여 종양 부피(V)를 계산합니다.
  2. 마우스를 옆으로 위치시켜 종양이 노출되도록 하고 알코올을 적신 면봉으로 종양 부위의 피부를 소독합니다.
  3. 안과 가위를 사용하여 전체 종양을 분리하십시오. 전자 저울을 사용하여 종양 종괴의 무게를 잰다.

4. 1차 임상 및 PDX 종양 조직의 병리학적 검사

  1. 30mL의 10% 중성 완충 포르말린 용액이 들어 있는 50mL 튜브에 종양 조직13 을 24시간 동안 고정합니다. 흐르는 물로 종양 조직을 철저히 헹구어 정착제를 제거합니다.
  2. 종양 조직을 탈수하고 파라핀14에 매립합니다.
  3. 종양 조직을 절개하고 정기 조직학적 검사를 실시한다15.

결과

이 프로토콜은 PDX 마우스 모델을 구축하기 위한 자세한 절차를 설명하며, 갓 절제된 인간 골육종 조직을 즉시 이식하고 마우스에서 연속적인 통로를 삽입한 후 인간 골육종의 형태학적 특징을 보존합니다. 여기에서 인간 골육종 조직을 사용하여 PDX 마우스 모델을 성공적으로 확립했습니다.

그림 3A 는 15세 환자로부터 대퇴 골육종 조직을 이식한 지 2개월 후인 P0에서 PDX의 대표적인 마우스를 보여줍니다. 그림 3B 는 PDX 조직을 P0에서 이식한 지 1개월 후인 P1에서 PDX의 대표적인 마우스를 나타낸 것이다. 그림 3C 는 PDX 조직을 P1에 이식한 지 1개월 후인 P2에서 PDX의 대표적인 마우스를 보여줍니다. 그림 3D 는 P2에서 PDX 조직을 이식한 후 1개월 후인 P3에서 PDX의 대표적인 마우스를 보여줍니다.

종양 크기가 1,500mm3에 도달했을 때CO2 흡입 후 자궁경부 탈구법을 사용하여 마우스를 희생하여 PDX 종양 조직을 수집하였다. 그런 다음 임상 환자와 마우스의 종양 조직을 파라핀에 묻히고 H&E 염색을 실시했습니다. 임상 환자 종양 조직의 대표적인 H&E 염색 이미지가 그림 4A에 나와 있습니다. P0, P1 및 P2에서 PDX 마우스 종양 조직의 대표적인 H&E 염색 이미지는 그림 4B,C,D에 나와 있습니다. 부모 임상 환자 종양 조직에서 둥글고 과색성 핵을 가진 작은 세포를 특징으로 하는 골육종 특징은 P0, P1 및 P2에서 확립된 PDX에서 유지되었습니다.

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그림 1: 수술 기구. (A) 메스. (나,씨) 안과용 핀셋. (D) 안과 가위. (E) 봉합 바늘. (F) 봉합선. (G) 직선 바늘 홀더. (H) 마킹 펜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: PDX 모델의 확립. (A) 마우스 측면 영역의 골육종 조직 이식 부위는 마킹 펜으로 표시되어 있습니다. (B) 피부에서 피하 조직까지 5mm 길이의 절개 부위를 절개했습니다. (C) 둔기 박리 및 골육종 조직 이식. (D) 봉합 절개. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 15세 환자의 대퇴 골육종 조직으로 원래 이식된 PDX의 성장. (A) 인간 골육종 조직(P0)을 이식하여 확립된 PDX. (B) PDX 조직을 P0(P1)에 이식하여 확립된 PDX. (C) PDX 조직을 P1(P2)에 이식하여 확립된 PDX. (D) PDX 조직을 P2(P3)에 이식하여 확립된 PDX. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 1차 임상 및 PDX 조직의 조직 절편에 대한 Hematoxylin-Eosin(H&E) 염색. H&E 염색은 15세 환자로부터 (A) 대퇴골 골육종, (B) P0에서 PDX, (C) P1에서 PDX, (D) P2에서 PDX의 조직학적 특징을 검출했습니다. 눈금자: (A-D) 100 μm; (E-H) 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

PDX 모델은 인간 암의 특성을 시뮬레이션하고 유전 및 게놈 변경, 조직학, 이질성 및 유전자 발현 프로파일을 포함하여 원발성 종양과 더 많은 유사성을 유지할 수 있습니다 16,17,18,19. 따라서 암 환자의 분자 표현형과 유전자형을 보존하여 생물학을 연구하고 잠재적인 치료법을 평가하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다. 이러한 접근법에는 실제 임상 반응과 매우 유사한 반응을 보이는 새로운 항암제의 전임상 스크리닝, 약물 내성 바이오마커 검출, 맞춤형 임상 치료 요법 선택에서 민감한 약물 스크리닝, 환자 결과 예측 등이 포함된다20. 또한 PDX 모델의 구축 과정은 비교적 간단하며 특별한 장비가 필요하지 않습니다.

이 연구는 인간 골육종 조직을 사용하여 PDX 마우스 모델을 성공적으로 구축했습니다. 인간 골육종 조직으로 PDX 모델을 성공적으로 구축하기 위한 몇 가지 주요 측면이 밝혀졌습니다. 첫째, 생쥐에서 인간 골육종 조직의 이식 가능성이 실현 가능하여 쥐 시스템에서 인간 골육종 생물학을 연구할 수 있습니다. 높은 종양 형성률은 기능적 면역 체계가 결여된 면역 결핍 마우스를 사용하여 이식된 골육종 세포가 거부 반응 없이 증식할 수 있기 때문일 수 있습니다. 또한, 이 연구는 PDX 모델이 원래 인간 골육종 조직의 조직학을 유지한다는 것을 보여주었습니다. 종양 형태 및 조직병리학적 특징은 원발성 환자 종양과 PDX 종양 간에 유사했다. 이는 PDX 모델이 골육종을 정확하게 요약하여 골육종의 진행, 전이 및 치료에 대한 반응을 연구하는 데 유용한 도구임을 나타냅니다.

그러나 PDX 모델링 중에 몇 가지 핵심 사항을 해결해야 합니다. 첫째, 이식에 사용되는 인간 골육종 조직은 신선하게 절제해야 하며 가능한 한 빨리 조직 보호 용액에 보관해야 합니다. 절제 후 12시간 이내에 이식을 완료하는 것이 바람직하지만, 조직 보호 용액에 저장된 인간 골육종 조직에서 종양 세포의 활성은 최대 24시간16분 동안 유지될 수 있습니다. 둘째, 화학요법을 받지 않은 환자의 종양 조직을 사용하여 환자의 분자 표현형과 유전자형을 최대한 보존하는 것이 바람직하지만, 화학요법을 한 두 번 받은 환자의 인간 골육종 조직은 면역 결핍 마우스에 성공적으로 이식할 수 있습니다. 더욱이, 환자가 여러 번의 화학요법을 받으면 종양 세포 활성이 저하되어 이식 모델링 실패로 이어집니다. 그러나 재발한 환자의 골육종 조직은 처음에 진단된 환자의 골육종 조직보다 면역결핍 마우스에 이식한 후 종양 형성 성공률이 더 높을 수 있습니다. 셋째, 피부의 진피 바로 아래에 골육종 조직을 이식하면 면역결핍 마우스에서 종양 형성 속도가 향상될 것이다21.

이 연구의 한계를 인정하는 것이 중요하다. 첫째, PDX 모델의 확립 주기는 길고 이식에서 종양 형성까지 4-12주가 소요된다22. 둘째, 완전히 발달된 암세포 골육종 조직이 이식되고 이식 과정에서 희귀한 subclone 또는 게놈 변형이 손실될 수 있기 때문에 종양 시작 및 병인과 관련된 정보가 없을 수 있습니다. PDX 종양의 전체 게놈 염기서열 분석 및 환자 샘플과의 비교는 모델23의 유전적 충실도를 평가하는 데 중요할 것입니다. 셋째, 마우스 숙주 세포는 종양에 침투하여 잠재적으로 종양 세포 활성에 영향을 미칠 수 있다9. 넷째, PDX 모델의 실패율은 약 50%24,25입니다. 마지막으로, 일부 경우에는 면역결핍 마우스에 이식한 후 종양 세포 전이가 없기 때문에 암 전이를 연구할 수 없다26.

결론적으로, 이 연구는 인간 골육종 조직을 이용한 PDX 마우스 모델의 성공적인 확립을 검증합니다. 이 모델은 원래 종양의 조직병리학적 특징을 충실하게 요약하여 골육종 생물학을 탐구하고 잠재적인 치료법을 테스트하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 이 PDX 모델을 사용한 추가 연구는 골육종에 대한 이해를 높이고 이러한 환자를 위한 보다 효과적인 전략을 개발하는 결과를 낳을 것입니다.

공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 (1) 국립 자연 과학 재단 (81973877 및 82174408)의 보조금으로 지원됩니다. (2) 상하이 최우선 연구 센터 건설 프로젝트(2022ZZ01009); (3) 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2020YFE0201600); (4) 병원 TCM 준비 및 (5) 상하이 중의학 대학 예산 내 연구 프로젝트(2021LK047).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% 포르말린 중성 용액Wuhan Saiweier Biotechnology Co., LtdG1101-500ml티슈
고칠일본 Hiryama CompanyHVE-50살균 수술 기구
CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd./동물
캘리퍼스Yantai Green Forest Tools Co., Ltd.034180A종양 부피 측정
접시 (60mm)Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd430166, 이식 중 코닝샘플 배치
소독제 면봉Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.20230627쥐의 피부를 소독
일회용 멸균 장갑Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd.YT21131무균 작업
더블 라이온 방사선 처리 설치류 다이어트Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.GB 14924.3동물 사료
전자 저울Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd1-2000종양의 무게를 잰
EosinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdE4009-25GHematoxylin eosin stain
HematoxylinShanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdH3136-25GHematoxylin eosin stain
IsofluraneShenzhen RWD Life Technology Co., LtdVETEASY마우스 마취 
IVC 쥐 케이지Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.HH-MMB-2동물성 장벽
표 펜얼룩말 무역 (심천) Co., 주식 회사.YYST5Mark 외과 절개
올림푸스 광학 현미경일본 올림푸스 회사BH20스캔 조직 절
편 안과 연고Shanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdSOICOEYEGRL마취 중 생쥐의 안구 건조를 피하십시오
안과 가위Shanghai NianYue Biotechnology Co., LtdY00030 JZ피부 절단
안과 핀셋Shanghai NianYue Biotechnology Co., LtdBS-ZER-S-100 Biosharp이식 중 골육종 조직
유지 파라핀Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd.80200-0015매장된 골육종 조직
파라핀 슬라이싱 기계Lyca Microsystem(Shanghai) Trading Co., Ltd.RM2235골육종 조직 단면도
생리적 식염수광저우 Jinsheng 생물공학 Co., Ltd.605-004057골육종 조직의 헹굼 및 임시 보관
메스수술 기구 공장 Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd.J11010-10# JZ골육종 조직의 분리 및 외과적 절개
무균 후드 ThermoFisher Technology (China) Co., Ltd.ECO0.9외과 수술 테이블
멸균 수술 커튼Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.20160090멸균 수술 부위
스트레이트 니들 홀더제공 Shanghai Gengyun Biotechnology Co., LtdJ31050 JZ상처
봉합 라인상하이 푸동 Jinhuan 의료 제품 유한 회사F3124상처
봉합 바늘상하이 푸동 Jinhuan 의료 제품 유한 공사F3124상처
조직 보호 용액 봉합Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTDBC-CFM-03조직 세포의 활성 유지
튜브(50mL)Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.BLD-BL2002500포르말린 정착 용액 설치
하십시오 다

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