자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화

수지상 가시는 종종 glutamatergic synapses ^1,2의 시냅스 후 부위를 구성하는 수상돌기의 돌출부입니다. 수지상 가시는 시냅스 가소성 분야에서 특히 관심이 있습니다. 척추는 시냅스 강도가 변할 때 종종 변형되어 장기적인 시냅스 강화에서 커지고 강해지거나 장기적인 시냅스 함몰에서 더 작고 약해진다 3,4,5,6,7. 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 넘어서, 수상돌기 가시의 프로필은 일생에 걸쳐 변화합니다. 초기 발달에는 수지상 척추 형성 및 성장의 기간이 있으며, 그 후 정상 상태에 도달 할 때까지 수지상 척추 가지 치기가 뒤따릅니다 ^8,9,10. 노화된 뇌에서 척추 손실은 뇌 수축과 인지 기능 저하를 동반한다¹¹. 또한 많은 신경학적, 신경퇴행성 및 정신 질환은 비정상적인 수지상 가시가 특징입니다. 정신분열증을 앓고 있는 개인의 여러 뇌 영역은 수상돌기 가시가 더 적은데, 이는 시냅스 가지치기의 변화로 인한 것으로 보인다¹². 자폐 스펙트럼 장애는 수상돌기 척추 병리(dendritic spine pathology)에 의해서도 특징지어진다¹³. 수지상 척추 손실은 알츠하이머병과 파킨슨병의 특징입니다^14,15. 수지상 척추 특성에 대한 연구를 포괄하는 광범위한 연구 주제를 감안할 때 정확한 척추 정량화를 위한 기술이 가장 중요합니다.

염색, 즉 골지법(Golgi method) 또는 염료 충전을 통한 뉴런 라벨링 또는 형광 단백질 발현은 수지상 척추 시각화를 위한 일반적인 방법이다 16,17,18. 시각화가 완료되면 다양한 무료 및 상용 소프트웨어 클라이언트를 사용하여 스파인을 분석할 수 있습니다. 원하는 분석 결과는 어떤 소프트웨어가 가장 많이 사용될지 결정하는 데 중요한 요소입니다. Fiji는 수지상 척추 밀도에 중점을 둔 질문에 대한 실행 가능한 소프트웨어 옵션입니다. 그러나 이 기술은 편향 가능성을 도입할 수 있는 시간 소모적인 수동 계산에 크게 의존합니다. SpineJ와 같은 새로운 플러그인은 자동 정량화를 허용하며 또한 보다 정확한 척추경부 분석을 허용합니다¹⁹. 이러한 접근 방식의 단점은 SpineJ가 2차원 이미지 스택으로 제한되기 때문에 척추 부피를 결정하기 위한 3차원 분석이 손실된다는 것입니다. 또한 이러한 프로세스를 통해 척추 하위 유형 정보를 얻는 것이 어려워집니다. 4가지 주요 척추 아형인 thin, mushroom, stubby, filopodia는 모두 개별 기능을 내포하며 크게 형태학(morphology)²⁰을 통해 분류된다. 얇은 가시는 길쭉한 목과 뚜렷한 머리가 특징이다²¹. 버섯 가시는 훨씬 크고 뚜렷한 가시 머리를 가지고^{있다 22}. 뭉툭한 가시는 짧고 머리와 목 사이에 거의 차이가 없다²³. Filopodia는 길고 얇은 목과 명확하게 관찰 할 수있는 머리가 없는 미성숙한 가시입니다²⁴. 분류는 가치 있는 정보를 제공하지만, 척추는 차원의 연속체에 존재합니다. 범주로의 분류는 형태학적 측정 범위(^25,26)를 기반으로 한다. 분류를 위해 척추를 수동으로 측정하는 것은 이 접근 방식을 사용하는 연구원의 물류 부담을 가중시킵니다.

특히 3차원 수지상 척추 분석에 초점을 맞춘 다른 소프트웨어 옵션은 척추 부피 및 하위 유형 특성(27,28,29,30,31)에 대한 조사에 더 적합합니다. 낮은 z-plane 해상도 및 번짐과 같은 3차원 분석의 어려움에도 불구하고 이러한 소프트웨어 옵션을 사용하면 사용자 안내 반자동 방식으로 수상돌기 및 수상돌기 가시를 안정적으로 3차원으로 재구성할 수 있습니다. 식별된 척추를 하위 유형으로 자동 분류하는 것도 이러한 척추 분석 소프트웨어 패키지 중 일부에 있는 기능입니다. 이는 잠재적인 작업량과 실험적 편향에 대한 우려를 개선할 수 있습니다. Neurolucida 360은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 3차원 수지상 척추 식별 및 분류를 가능하게 하는 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 중 하나이다³². 여기에서는 이 소프트웨어를 사용하여 고정 조직을 효과적으로 준비하고, 이미지를 획득하고, 궁극적으로 수지상 가시를 정량화하고 분류할 수 있는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

모든 동물 시술은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 지침, 교내 연구에서 동물을 사용하는 지침을 따랐으며 미국 국립정신건강연구소(National Institute of Mental Health) 동물 관리 및 사용 위원회(National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 고정 된 해마 절편의 준비

1. 케타민/자일라진(케타민: 100mg/kg; 자일라진: 8mg/kg). tail pinch를 통해 마취를 확인하고 마우스를 관류판에 부착합니다.
2. 큰 수술용 가위를 사용하여 가슴에서 피부와 털을 제거하여 밑에 있는 흉곽을 더 쉽게 시각화할 수 있습니다.
3. 간과 횡격막을 피하여 흉곽 너비 아래로 수평으로 절단합니다. 가는 집게를 사용하여 xiphoid 돌기를 위로 당기고 흉곽의 각 측면을 자릅니다. 흉곽을 목 부분까지 뒤집고 지혈 겸자를 사용하여 제자리에 고정합니다.
4. 21G의 나비 바늘을 심장의 좌심실에 삽입하고 약 5mL/분에서 실온 1x PBS로 관류를 시작합니다. 작은 수술 용 가위로 오른쪽 심방을 작게하십시오. 아트리움을 떠나는 용액이 맑아질 때까지 PBS로 관류합니다.
5. 관류 펌프를 꺼서 튜브에 기포가 들어가지 않도록 합니다. PBS의 튜브를 PBS의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA)에 넣습니다. 동물이 완전히 굳어질 때까지 약 25mL의 속도로 PFA를 관류합니다.
   알림: 최적의 고정을 위해 PFA가 신선한지 확인하십시오(재고가 1°C에서 보관된 경우 4주일 이내).
6. 작은 수술용 가위로 두개골 표면의 피부를 제거합니다. 두개골의 중앙 균열을 따라 작은 수술용 가위로 중간 시상을 자릅니다. 후각구와 소뇌 위로 측면 절개를 합니다.
7. 미세한 집게로 두개골을 열어 뇌를 노출시킵니다. 주걱을 사용하여 후각구에서 뇌를 부드럽게 퍼내고 밤새 PBS에 4% PFA를 넣습니다.
   참고: 설치류 관류에 대한 보다 포괄적인 프로토콜은 Gage et ^al.33을 참조하십시오.
8. PBS에서 1일 동안 4% PFA를 15% 자당으로 대체하여 고정 뇌를 냉동 보호합니다. 그 후, 뇌가 용액에 가라 앉을 때까지 1 일 동안 PBS 용액의 15 % 자당을 30 % 자당으로 교체하십시오.
9. 자당 용액에서 뇌를 제거하고 PBS가 있는 페트리 접시에 넣습니다. 메스 칼날을 사용하여 소뇌와 후각구를 잘라냅니다.
10. 직경 1-2cm의 소량의 최적 절삭 온도 화합물(OCT)을 시편 홀더 표면에 놓습니다. OCT의 꼬리 절단면이 있는 표본 홀더에 뇌를 관상적으로 장착합니다. 표본 홀더를 분쇄된 드라이아이스에 넣어 뇌를 눈에 띄게 얼릴 때까지 약 5-7분 동안 빠르게 얼립니다.
11. 저온 유지 장치의 블레이드 각도가 0°에서 5° 사이로 설정되어 균일한 단면을 생성하는지 확인하십시오. 최적의 슬라이스 평탄화를 위해 롤 플레이트 각도를 조정합니다. 구체적인 지침은 장비 설명서를 참조하십시오.
12. 검체 홀더를 블레이드에 가장 가까운 뇌의 복부 표면이 있는 냉동 장치에 놓습니다. 뇌를 30μm 등쪽 해마 절편으로 자르고 해마 앞쪽에 있는 모든 조각을 버립니다.
    참고: 프로토콜의 이 부분은 원하는 뇌 영역에 맞게 조정할 수 있습니다. 1.9-1.12단계는 관심 지역에 따라 변경됩니다.
13. 등쪽 해마 절편을 PBS로 옮깁니다. 붓을 사용하여 해마 부분을 현미경 슬라이드에 부드럽게 장착합니다. 면봉이나 섬세한 작업용 물티슈로 과도한 용액을 제거하십시오.
14. 100 μL의 하드 세트 장착 매체를 모든 뇌 절편을 덮고 있는 현미경 슬라이드에 적용합니다. 기포를 방지하려면 집게를 사용하여 장착 매체에 커버슬립을 천천히 내립니다. 거품이 생기면 집게로 커버슬립을 가볍게 두드려 거품이 빠져나갈 수 있도록 합니다. 이미징하기 전에 슬라이드를 하룻밤 동안 굳히십시오.

2. 고해상도 컨포칼 이미징

1. 저배율 접안렌즈를 사용하여 형광 세포를 식별합니다. 63x(NA = 1.4) 이상의 대물렌즈로 전환하여 대물렌즈에 적절한 이멀젼 매체를 적용합니다.
   참고: 최상의 결과를 얻으려면 63x 이상의 대물렌즈를 가진 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하십시오.
2. 이미지 획득을 위해 겹침이 제한된 잘 표지된 수지상 세그먼트를 식별합니다. 레이저 출력과 게인을 설정하여 형광 수상돌기가 포화되지 않도록 합니다. 또한 스캔 속도를 줄이면 더 나은 이미지 해상도를 제공할 수 있습니다.
3. 향후 분석을 위해 전체 수지상 세그먼트를 포괄하는 z-stack을 획득합니다. 10μm보다 큰 Z-스택은 z-평면에서 수지상 중첩이 발생할 가능성이 추가되기 때문에 바람직하지 않습니다.
   알림: 사용 가능한 가장 작은 z-step 크기(0.2-0.7μm)와 1개의 통풍이 잘되는 장치 핀홀 크기를 활용하십시오. 스텝 크기가 작을수록 z 스택에 더 많은 이미지가 생성되어 많은 현미경의 제한된 Z 해상도를 보상합니다.
4. 선택 사항: 사용 가능한 경우 현미경의 해당 디콘볼루션 소프트웨어 기능을 활용하여 이미지를 디콘볼루션합니다. 이렇게 하면 더 높은 해상도의 이미지를 얻을 수 있습니다.

3. 수지상 척추 정량화

1. Neurolucida 360(v2022.1.1 이상)을 엽니다. 척추 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 엽니다 (파일 > > 이미지 열기). 이미지 파일이 기본 창과 3D 환경에서 보이는지 확인합니다. 3D 환경 창이 나타나지 않으면 Trace 탭의 기본 창 상단 도구 모음에서 3D Environment를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다(보충 그림 1).
   참고: 프로토콜의 이 섹션은 마우스 조직의 수상돌기뿐만 아니라 모든 수지상 이미지에 적용할 수 있습니다.
2. 3D 환경 창의 [이미지 표시 변경] 탭에서 [이미지 표시 형식] 상자에 이미지가 3D 볼륨으로 표시되어 있는지 확인합니다. 이미지(Image) 탭의 이미지 스택 설정(Image Stack Settings) 상자에 있는 표면 표시 형식(Show Surface As) 드롭다운 메뉴에서 최대 투영(Max Projection)을 선택합니다. (보충 그림 2)
3. 추적에 적합한 수지상 세그먼트를 식별합니다.
   1. 3D 환경 창의 상단 도구 모음에서 피벗 포인트 이동 도구를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 원하는 덴드라이트를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 새 피벗점을 설정합니다. 이렇게 하면 효과적으로 확대할 수 있도록 방향이 변경됩니다.
   2. Reset Orientation 아이콘을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 원래 방향을 다시 설정합니다. 피벗 포인트를 설정한 후 Move Pivot Point 도구를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 수상돌기 추적을 시작합니다. (보충 그림 2).
      참고 : 이상적인 수상돌기는 좌표 평면의 다른 수상돌기와 겹치는 부분이 제한되어 있고 다른 수상돌기와 교차하지 않거나 아래의 다른 수상돌기에 표면적이지 않은 수상돌기입니다. XY 평면에서 다른 수상돌기에 대한 근접성이 낮은 수상돌기는 추적된 수상돌기에 인접한 척추를 부적절하게 할당하는 것을 방지하기 위해 바람직합니다. 또한 소마로부터의 두께, 순서 및 거리가 다른 수상돌기는 다른 수지상 척추 밀도를 갖는다는 점에 유의해야 한다(^34,35). 이는 실험 설계에서 고려되어야 합니다. 두께가 1.5μm< 2차 수상돌기는 추적에 이상적인 후보입니다(그림 1).
4. 3D 환경 창의 트리 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 추적 모드에 대해 User-Guiduration을 클릭하고 User-Guided Tracing Options의 방법으로 Directional Kernels를 클릭합니다.
5. 원형 커널이 나타날 때 수상돌기를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 추적을 시작합니다. 수지상 세그먼트를 따라 커서를 이동합니다. 이렇게 하면 커널이 자동으로 채워집니다. 커널이 자동으로 채워지지 않는 경우 3.51단계를 참조하십시오.
   1. 커널이 채워질 때까지 덴드라이트에서 커서를 앞뒤로 부드럽게 움직입니다. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 기존에 감지된 커널을 보존합니다. 커널이 더 이상 채워지지 않으면 커널이 수상돌기 아래로 더 채워질 때 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 수동으로 배치합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 추적을 종료합니다. 추적된 수상돌기의 길이가 최소 7μm인지 확인합니다(보충 그림 3).
6. 3D 환경 창을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 드래그하여 3D 환경, 피치, 요, 롤의 세 방향을 모두 사용하여 수상돌기 추적의 정확성을 확인합니다. 수상돌기 추적이 수상돌기의 적절한 위치 밖에 있는 점을 식별합니다. 위에서 아래로 정확하게 추적되는 것처럼 보이지만 z 차원에서는 점이 수상돌기에 있지 않은 경우가 있을 수 있습니다(그림 2).
7. 부적절하게 추적된 수지상 세그먼트를 수정하려면 Tree 메뉴에서 Edit 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 관심 있는 덴드라이트를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭한 다음 Points를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.
8. 잘못 배치된 점을 클릭하고 드래그하여 덴드라이트 세그먼트로 다시 이동합니다. 점을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 Delete 버튼을 클릭하여 관련 없는 점을 삭제합니다. 수상돌기가 적절하게 채워지지 않은 경우 점의 크기를 변경합니다. 점의 크기를 변경하려면 점을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 두께 슬라이더를 조정하여 크기를 변경합니다(보충 그림 4).
   참고: 부적절하게 채워진 수상돌기는 수지상 세그먼트의 구성 요소인 잘못된 척추를 식별하는 결과를 초래할 수 있습니다. 반대로, 수상돌기를 과도하게 채우면 실제 가시를 가릴 수 있습니다.
9. 3.10단계에서 척추 식별을 진행하기 전에 이미지의 여러 수상돌기에 대해 3.3-3.8단계를 반복합니다.
10. 3D 환경 창에서 Spine 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 외부 범위, 최소 높이 및 최소 복셀 수에 대한 감지 설정을 지정합니다. 준비에 따라 변경에 대한 명확하고 구체적인 근거가 있는 경우 사전 설정된 값을 변경해야 할 수도 있습니다. 사전 설정 조건은 외부 범위: 2.5μm, 최소 높이: 0.3μm, 최소 복셀 수: 10복셀입니다.
    참고: 세포 배양 대 급성 조직과 같은 다양한 제제와 다양한 발달 시점에는 기존 문헌에서 파생되어야 하는 다른 기준이 필요합니다. 감지 설정을 변경하면 결과가 크게 변경될 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 예를 들어, 최소 높이가 높을수록 짧은 스파인을 제외할 수 있습니다. 검출 설정은 실험의 전체 과정에서 일관되게 유지되어야 합니다.
11. Detector Sensitivity(감지기 감도)를 70%로 설정하고 Detect All(모두 감지)을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 이것은 모든 수상돌기에서 이 검출기 민감도로 식별된 척추를 채울 것입니다. 수상돌기 특정 방식으로 스파인을 선택하려는 경우 가장 가까운 분기에서 모두 감지하려면 이미지 클릭 상자를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 다른 검출기 감도를 가진 각 덴드라이트를 수동으로 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.
    참고: 이 단계에서는 모든 수지상 가시가 채워지지 않는 것이 정상입니다. 마찬가지로, 비가시가 부적절하게 채워질 수 있습니다. 초기 70% 감도도 유연합니다. 이것은 준비에 따라 변경 될 수 있습니다.
12. 이 검출기 민감도에 의해 선택된 척추를 세 방향 모두에서 수상돌기를 클릭하고 드래그하여 검사합니다. 감지된 스파인의 대부분이 완전히 채워지지 않은 경우 3.12.1단계로 진행합니다. 감지된 스파인이 과도하게 채워진 경우 3.12.2단계로 진행합니다. 감지된 스파인이 적절하게 채워진 것으로 나타나면 3.13단계로 진행합니다.
    1. 감지기 감도를 5%-10% 높이고 Detect All을 다시 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 이렇게 하면 이전에 감지된 모든 척추가 더 높은 감도의 새 척추로 교체됩니다. 감지된 가시가 적절하게 채워질 때까지 필요에 따라 반복합니다.
    2. 감지기 감도를 5%-10% 낮추고 모두 감지를 다시 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 이렇게 하면 이전에 감지된 모든 척추가 더 낮은 감도의 새 척추로 교체됩니다. 감지된 가시가 적절하게 채워질 때까지 필요에 따라 반복합니다.
13. 3D 환경의 Spine 탭에서 Keep Existing Spines를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 가장 가까운 분기에서 모두 감지하려면 이미지 클릭을 선택한 경우 선택을 취소합니다.
    참고: Keep Existing Spines(기존 스파인 유지 )를 선택하면 새로 식별된 수지상 스파인이 수동으로 이전에 식별된 스파인을 덮어쓰지 않도록 합니다. 이전 작업을 덮어쓰지 않도록 계속하기 전에 이 상자가 선택되어 있는지 확인하십시오.
14. Move Pivot Point 를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 피벗 포인트를 설정하기 위해 추가 척추 감지가 필요한 덴드라이트를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.
    1. 피벗 포인트 이동을 선택 취소합니다. 채워지지 않은 수지상 척추를 식별합니다. 감지기 감도를 이전 감지보다 10%-20% 높이고 척추를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 감지된 스파인이 부족하거나 과도하게 채워진 경우 3.14.3 또는 3.14.4단계로 진행합니다. 스파인이 채워지지 않으면 Unable to detect a spine at the selected location(선택한 위치에서 스파인을 감지할 수 없음) 메시지가 나타납니다. 이 경우 3.14.2단계로 진행합니다.
    2. 척추가 감지되고 적절하게 채워질 때까지 감지기 감도 를 100% 이상으로 점진적으로 높입니다. 스파인이 감지되었지만 부적절하게 채워진 경우 3.14.3단계로 진행합니다. 스파인이 과도하게 채워진 경우 3.14.4단계로 진행합니다(그림 3).
    3. Edit(편집) 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 언더filled spine을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 마우스 왼쪽 버튼 클릭 제거. 편집 탭을 선택 취소합니다. 감도를 5%-10% 높이고 척추를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 척추가 여전히 충분히 채워지지 않은 경우 이 단계를 반복합니다.
    4. Edit(편집) 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 과도하게 채워진 척추를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 마우스 왼쪽 버튼 클릭 제거. 편집 탭을 선택 취소합니다. 감도를 5%-10% 낮추고 척추를 클릭합니다. 척추가 여전히 과도하게 채워진 경우 이 단계를 반복합니다.
15. 시각적 식별로 식별된 모든 척추가 감지될 때까지 3.14-3.14.4단계를 반복합니다. 인접 수상돌기에 속하는 척추, 참 신호가 없는 거짓 척추 또는 척추로 잘못 레이블이 지정된 수상돌기의 잠재적 세그먼트가 있는지 수상돌기를 다시 확인하십시오. Remove 함수를 사용하여 이러한 잘못된 척추를 삭제하십시오.
16. 수상돌기에서 식별된 가시를 검사합니다. 경우에 따라 여러 개의 척추가 하나의 대기업 척추로 나타날 수 있습니다. 스파인이 두 개를 둘러싸고 있는 것처럼 보이면 Edit 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 척추를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 Hide Selection을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 대기업 스파인을 확인한 후 Edit(편집 ) 탭에서 Show Selection(선택 항목 표시 )을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 Split(분할)을 선택합니다. 한 대기업에 두 개 이상의 척추가 있는 경우 이 단계를 반복해야 할 수 있습니다(그림 4).
    참고: 3.16단계 후에도 역모 척추가 분리되지 않으면 척추를 제거합니다. 그런 다음 더 낮은 감도에서 대기업의 더 강렬한 척추를 선택하십시오. 더 강렬한 척추가 채워지면 민감도를 높여 채워지지 않은 다른 척추를 선택합니다. 또는 역모 척추를 삭제한 다음 민감도를 높이면 적절한 분할이 가능할 수 있습니다.
17. 시각적으로 식별할 수 있는 모든 가시가 감지되고 적절하게 채워지면 Spine 탭에서 Classify All 을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 척추를 thin, mushroom, stubby 및 filopodia의 네 가지 하위 유형으로 분류합니다(그림 5).
    참고: Spine 분류 매개변수는 Spine 탭의 Classification(분류) 상자에 있는 Settings(설정) 창에서 변경할 수 있습니다. 감지기 설정과 마찬가지로 기존 매개변수를 변경하기 위한 명확한 근거가 강력히 권장됩니다. 사전 설정 값은 머리와 목의 비율: 1.1, 길이와 머리 비율: 2.5, 버섯 머리 크기: 0.35μm, 필로포디움 길이: 3μm입니다.
18. 3D 환경 창의 상단 도구 모음에서 Neurolucida Explorer에서 저장 및 보기를 선택합니다. Neurolucida Explorer는 추적에서 데이터를 수집하는 곳입니다. 작업은 모든 추적 및 스파인을 포함하는 .dat 파일로 저장됩니다.
19. 탐색기 창의 View 탭에서 Select All 을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 모든 수상돌기와 척추를 강조 표시합니다.
20. 위쪽 도구 모음에서 Analyze 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. Structure(구조 ) 드롭다운 메뉴를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. Branched Structure Analysis를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.
21. 관심 있는 변수에 따라 모든 분석을 선택할 수 있습니다. 척추 밀도와 평균 척추 부피를 중심으로 한 질문에 가장 유용한 두 가지는 각 나무> 각 수상돌기와 척추 세부 정보를 > 척추입니다. 확인을 선택하면 데이터가 두 개의 별도 창에 나타납니다.
22. 추가 편집 및 분석을 위해 데이터를 스프레드시트에 복사합니다.
    알림: 개별 나무는 수상돌기로 분리되지만 척추 부피는 그렇지 않습니다. 스프레드시트의 정렬 기능을 사용하여 척추 세부 정보를 피처별로 필터링할 수 있습니다.

이 분석 방법을 효과적으로 활용하는 것은 추적을 위한 수지상 세그먼트를 선택하는 것으로 시작됩니다. 그림 1에서 설명한 바와 같이, 추적을 위한 이상적인 수상돌기는 다른 수상돌기에 근접하지 않습니다. 병렬로 실행되는 수상돌기는 인접한 수상돌기에서 척추를 부적절하게 식별하는 결과를 초래할 수 있습니다. 다른 z 평면에서 직접 교차하거나 수직으로 달리는 수상돌기는 정확한 수지상 추적에도 상당한 어려움을 더합니다. 수상돌기 두께의 차이에 유의하는 것도 중요합니다. 이전에 보고된 바와 같이, 다양한 두께의 수상돌기(dendrites)와 척추 밀도(spine dendides)에는 주요 차이점이 있다(36). 또한 분기점(37)으로부터의 거리가 증가된 동일한 수상돌기 내에서도 차이가 있을 수 있다. 이상적으로는 유사한 분지 점 기원을 가진 동일한 순서와 두께의 수상돌기를 추적하면 수지상 척추 밀도의 기존 이질성을 제어할 수 있습니다. 일부 제제에서 분기점을 식별하는 것은 불가능할 수 있지만 수상돌기의 두께는 수상돌기 추적에서 항상 제어 가능한 요소여야 합니다. 수지상 세그먼트의 정확한 추적은 이 분석에서 정확한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 추적된 수상돌기의 모든 지점이 실제로 수상돌기 내에 있는지 확인해야 합니다. 다른 방향에서 3차원 수상돌기를 보는 것이 이 과정에 도움이 될 수 있습니다. 그림 2A,B에서 볼 수 있듯이 하향식 보기는 적절하게 추적된 수상돌기로 보이는 것을 보여줍니다. 측면에서; 그러나 많은 점이 수상돌기 자체에 위치하지 않습니다. 이러한 문제는 그림 2C의 측면 보기에는 나타나지 않습니다. 또한 추적 중에 수상돌기가 제대로 채워졌는지 확인하는 것이 중요합니다. 수상돌기가 충분히 채워지면 수상돌기 조각이 가시로 부적절하게 식별될 수 있습니다. 과도하게 채워진 덴드라이트는 최소 높이 임계값으로 인해 실제 척추가 식별되지 않을 수 있습니다. 사용자 안내 추적에 대한 이러한 수동 평가는 정확한 수지상 척추 분석을 허용하는 데 매우 중요합니다.

수상돌기 가시를 식별하려면 사용자 안내 접근 방식도 필요합니다. "Detect All" 기능을 사용하여 균일한 검출기 감도 임계값을 설정하는 것은 여러 가지 이유로 부적절합니다. "모두 감지" 기능을 사용하면 가장 노골적으로 명백한 스파인을 식별하는 데 유용하지만 이러한 스파인의 채우기를 확인하려면 확인해야 합니다. 초기 "Detect All(모두 감지)"이 있는 식별된 스파인은 충분히 채워지지 않을 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 식별된 스파인을 개별적으로 삭제한 다음 더 높은 검출기 감도에서 수동으로 다시 식별해야 합니다(그림 3A-C). 이렇게 하면 척추가 적절하게 채워집니다. 스파인에 필요한 검출기 감도에는 상당한 이질성이 있으며, 이는 수동으로 고려해야 합니다. 검출기 감도를 높여 모든 검출을 감지하면 스파인이 과도하게 채워질 수 있으며, 이 경우 수동 수정도 필요합니다(그림 3D). 부적절한 검출기 감도의 또 다른 문제는 여러 척추를 둘러싸고 있는 하나의 채워진 수지상 척추인 역암 척추의 부적절한 생성입니다. 서로 근접한 두 개의 척추가 하나의 역암 척추로 부적절하게 병합될 수 있습니다(그림 4A, B). 스파인 감지 소프트웨어에는 "분할" 기능이 있어 과충전으로 인해 병합된 스파인을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. "Split" 기능을 사용하면 복합 스파인에서 개별 스파인을 쉽게 생성할 수 있습니다(그림 4C). 정확한 수상돌기 추적 및 수상돌기 척추 충전을 통해 척추 아형으로 정확하게 분류할 수 있습니다. 척추 분류는 채워진 가시로부터의 형태와 수상돌기로부터의 거리에 의존하므로 프로세스의 모든 단계가 형태학적 분류에서 중요한 역할을 합니다(그림 5).

수동 선택 및 임계값 설정이 필요하기 때문에 모든 분석에 대해 일관된 표준을 따르는 것이 중요합니다. 이는 여러 사용자가 데이터 분석에 기여하는 경우에 특히 적합합니다. 분석을 수행하는 모든 조사자가 동일한 표준을 따르도록 하기 위해 조사자는 동일한 추적된 수상돌기의 데이터를 비교해야 합니다. 이렇게 하면 각 연구자가 블라인드 방식으로 공유된 균일한 기준에 따라 척추를 식별하도록 함으로써 실험자 편향의 가능성을 줄일 수 있습니다. 또한 피로로 인해 한 명의 연구자가 며칠 사이 또는 같은 날에 편향될 가능성도 있습니다. 이는 데이터 분석 프로세스 전반에 걸쳐 모니터링되어야 합니다. 분석의 타당성을 더욱 보장하기 위해 초기 결과를 문헌에 발표된 결과와 비교하면 프로토콜이 효과적으로 준수되고 있는지 확인할 수 있습니다. 이 비교는 준비 및 매개 변수가 공유되는 경우에만 효과적이라는 점에 유의해야 합니다. 염색, 형광 신호의 획득, 수상돌기의 순서와 두께, 또는 뇌 영역의 차이는 다른 결과에 기여할 수 있습니다 8,36. 발표된 결과가 누락된 경우, 여러 연구자를 통해 척추 식별을 검증하면 분석의 신뢰성과 재현성에 대한 신뢰도를 높일 수 있습니다. 이 원고에는 보충 분석 폴더가 포함되어 있습니다. 이 폴더에는 수지상 분절, 추적된 수상돌기, 식별 및 분류된 척추가 있는 추적된 수상돌기, 데이터 출력(보충 표 1, 보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3 및 보충 파일 4)의 샘플 이미지 파일이 포함되어 있습니다. 새 사용자는 이 데이터 세트에 대해 학습하여 이 문서에 설명된 절차를 연습할 수 있습니다. 제공된 샘플 데이터 세트의 10% 이내의 사용자 생성 결과는 분석 표준을 재현하는 데 허용되는 것으로 간주됩니다. 완전히 채워진 척추의 주관적인 기준과 자동으로 감지된 척추에 대한 수동 검사의 필요성으로 인해 연구자 간 및 연구자 내 분산은 분석의 정상적인 부분입니다. 생성된 결과가 해당 임계값을 초과하는 경우; 그러나 서로 다른 스파인 볼륨의 인스턴스와 부적절하게 포함되거나 제외된 스파인의 인스턴스를 결정하기 위해 나란히 비교를 수행해야 합니다. 그런 다음 허용 가능한 임계값에 도달할 때까지 샘플 데이터 세트를 다시 분석할 수 있습니다.

그림 1: 수상돌기 척추 분석을 위한 수상돌기 선택. (A) THY1-YFP 형질전환 마우스 라인의 CA1 근위 수상돌기에서 가져온 z-stack 컨포칼 이미지의 3D 볼륨 디스플레이. 파란색 타원형의 두꺼운 1차 수상돌기와 분홍색 타원형의 더 얇은 2차 및 3차 수상돌기를 가진 수상돌기 순서의 이질성에 주목하십시오. (B) 수상돌기 추적을 위한 이상적인 후보는 녹색 타원으로 표시됩니다. 두께와 제한된 교차점, 겹침 및 다른 수상돌기에 대한 근접성에 유의하십시오. 빨간색 타원은 높은 교차점, 겹침 및 다른 수상돌기에 대한 근접성으로 인해 수지상 추적을 위해 피해야 하는 수지상 세그먼트를 나타냅니다. 더 두꺼운 1차 수상돌기도 추적에 적합한 후보가 아닙니다. 눈금 막대 = 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 수상돌기 분절의 정확한 추적. (A) THY1-YFP 형질전환 마우스 라인의 CA1 근위 수상돌기에서 채취한 z-stack 컨포칼 이미지의 3D 볼륨 디스플레이는 사용자 안내 방향성 커널 방법을 통해 추적됩니다. 스케일 바 = 10 μm. (B) 수상 돌기 추적 불량의 예. 수상돌기는 하향식 보기에서 제대로 추적된 것으로 보입니다. 측면도는 수상돌기가 수상돌기에서 벗어난 점으로 부적절하게 채워져 있음을 보여줍니다. (C) 적절한 수상돌기 추적의 예. 하향식 뷰는 B와 비슷하게 보이지만 측면 뷰는 크게 다릅니다. C의 수상돌기는 수상돌기에서 편차 없이 완전히 채워짐으로써 표시된 대로 적절하게 추적됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 수동 선택을 사용하여 수상돌기 가시를 정확하게 채우기. (A) 수동 검출을 기다리는 척추의 THY1-YFP 형질전환 마우스 라인에 있는 CA1 근위 수상돌기에서 촬영한 z-stack 컨포칼 이미지의 3D 볼륨 디스플레이. 척도 막대 = 0.5 μm. (B) 부족 충전된 수지상 척추의 예. 불완전한 충전으로 인해 여전히 상당한 형광 신호가 보입니다. (C) 적절하게 채워진 수지상 척추의 예. 충전재 외부 주변에서 거의 보이지 않는 신호의 "코로나"의 존재는 수지상 가시를 정확하게 채우기 위한 표준입니다. (D) 과도하게 채워진 수지상 척추의 예. 감지기 감도가 너무 높아 척추가 과도하게 채워집니다. 충전재는 형광의 경계를 넘어 거의 감지할 수 없는 코로나를 가지고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 쪼개지는 역암 수지상 가시 . (A) 두 개의 가시가 근접한 THY1-YFP 형질전환 마우스 라인의 CA1 근위 수상돌기에서 가져온 z-stack 컨포칼 이미지의 3D 볼륨 디스플레이. 척도 막대 = 0.15 μm. (B) 두 개의 독립적인 척추가 하나의 역암 수지상 척추로 부적절하게 채워진 예. (C) "분할" 기능을 사용한 후, 역암 척추는 적절하게 채워진 두 개의 뚜렷한 수지상 가시로 분할됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 수지상 척추 식별 및 아형으로의 분류. (A) 수지상 척추 정량화 및 분류를 위해 분리된 추적된 수지상 세그먼트의 THY1-YFP 형질전환 마우스 라인의 CA1 근위 수상돌기에서 채취한 z-stack 공초점 이미지의 3D 볼륨 디스플레이. 척도 막대 = 5 μm. (B) 적절한 충전 및 분할을 보장하기 위해 모든 수지상 가시를 식별하고 검사한 추적된 수지상 분절. 소프트웨어는 이 단계에서 식별된 스핀에 색상을 임의로 할당합니다. (C) 소프트웨어에서 정의된 매개변수를 사용하여 식별된 모든 수지상 가시를 하위 유형으로 분류합니다. 파란색 = 버섯, 노란색 = 얇음, 녹색 = 뭉툭함. Filopodia는 이 조직의 나이로 인해 존재하지 않습니다. (D) 버섯, 얇고 뭉툭한 가시가 채워지지 않은 경우(위)와 채워진 경우(아래)의 대표 이미지. 스케일 바 = 0.3 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 3D 환경 액세스. 소프트웨어 인터페이스에서 볼 수 있는 컨포칼 이미지의 Z 스택. 기본 뷰어의 추적 탭에서 3D 환경 탐색이 노란색으로 강조 표시되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 3D 환경에 대한 이미지 매개변수 및 방향 설정. 컨포칼 z-stack 이미지를 위한 3D 환경 뷰어. 노란색 화살표로 표시된 강조 표시된 이미지 표시 변경 탭의 매개변수는 이미지 표시 형식: 3D 볼륨 및 표면 표시 형식: 최대 투영으로 설정됩니다. Move Pivot Point 및 Reset Orientation 은 노란색 화살표로 식별됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 덴드라이트 세그먼트 추적. (A) 수상돌기 추적을 위한 z-stack 컨포칼 이미지의 3D 볼륨. 트리 탭, 사용자 안내 및 방향성 커널을 모두 선택한 상태에서 추적은 왼쪽 클릭으로 초기 커널을 덴드라이트에 배치하는 것으로 시작됩니다. (B) 커서 이동 후 덴드라이트 아래로 방향성 커널의 번식. (C) 수상돌기 아래쪽을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하면 방향성 커널이 채워집니다. (D) 수상돌기를 채우지 않는 방향성 커널의 예. 대신, 고독한 커널이 세그먼트 아래쪽에 있습니다. (E) 고독한 커널을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하면 두 점 사이의 수상돌기가 채워집니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하면 추적이 종료됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: 추적된 수상돌기의 점 조정. (A) 추적된 덴드라이트 세그먼트 보류 포인트 조정. 덴드라이트 편집을 위해서는 "나무" 탭과 "편집" 탭을 선택해야 합니다. 둘 다 노란색으로 강조 표시됩니다. 덴드라이트는 왼쪽 클릭으로 편집할 수 있도록 선택되었습니다. (B) 노란색으로 강조 표시된 포인트 탭을 선택하면 덴드라이트 세그먼트에서 개별 포인트를 선택할 수 있습니다. 녹색 점의 두께는 1.2μm입니다. (C) 덴드라이트를 보다 정확하게 채우기 위해 점을 조정했습니다. 녹색 점의 새 두께 값은 0.6μm입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 샘플 이미지 분석 결과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 수상돌기 및 spines.dat을 사용한 샘플 이미지 추적 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: dendrites.dat을 사용한 샘플 추적 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: 샘플 수상돌기 이미지 파일.czi 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: Sample dendrite image file.jpx 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.