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방법 논문

마우스 상처 모델 및 단일 세포 현탁액 준비

2.3K 조회수

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DOI:

10.3791/66499

⸱

2024년 9월 27일

 ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese People's Liberation Army, 2Department of Dermatology, Southwest Hospital, Army Medical University, 3Biomedical Treatment Center, the Seventh Medical Center, Chinese PLA General Hospital, 4The 83th Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University, 5Department of Dermatology, the Seventh Medical Center, Chinese PLA General Hospital

이 논문에서

요약

이 연구는 두 가지 중요한 실험 기법을 제시합니다: 상처 봉합을 평가하기 위한 쥐 상처 모델의 구축과 세포 생존력을 보존하기 위해 쥐 피부에서 단세포 현탁액을 준비하는 것입니다.

초록

급성 전층 피부 손상의 관리는 임상 실습에서 상당한 도전을 제시합니다. 다양한 세포 집단과 복잡한 상처 미세환경을 포함하는 상처 치유의 복잡성으로 인해 기존의 실험적 접근 방식을 사용하여 치료 효과와 상호 작용에 대한 평가가 복잡해집니다. 단세포 전사체 염기서열분석 기술은 상처 치유 중 세포 기능과 메커니즘에 대한 이해에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 마우스 상처 모델을 만드는 방법론의 가변성으로 인해 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 교란 요인이 발생합니다. 또한, 마우스 피부 조직을 해리하는 과정은 상당한 기술적 장애물을 제시하며, 정확한 전사체 염기서열분석을 위한 고품질 단일 세포 현탁액의 필요성을 강조합니다. 따라서 본 연구는 마우스 상처 모델의 구성을 최적화하여 상처 봉합의 변화를 정확하게 평가하는 동시에 후속 염기서열분석 결과에 영향을 미칠 수 있는 변수를 제거하는 것을 목표로 합니다. 또한, 비용과 효과를 최적화하기 위해 효소 준비 프로토콜과 테스트 키트 프로토콜을 모두 사용하여 단일 세포 현탁액의 준비를 수행했습니다.

서론

쥐는 인간과 매우 상동적인 유전자 서열, 빠른 번식, 비용 효율성 및 관리 가능한 크기로 인해 연구에서 널리 인정받는 동물 모델입니다1. 그러나 생쥐와 인간의 피부 구조에는 차이가 있습니다. 생쥐는 피부 수축에 기여하는 뚜렷한 피부막층을 가지고 있어 이 종의 상처 치유에 중요한 역할을 합니다. 대조적으로, 인간의 상처 치유는 주로 재상피화 및 육아 조직 형성을 포함합니다1.

피부 구조의 이러한 종간 차이에도 불구하고 마우스 모델은 상처 복구 연구에서 선호되는 선택으로 남아 있으며 다른 동물 모델에 비해 상당한 중요성을 유지하고 있습니다2,3. 인간의 상처 치유 과정을 모방하기 위해 마우스 피부를 사용할 때는 다양한 영향 요인을 신중하게 고려하는 것이 필수적입니다. 이러한 요인에는 수술 절차에 적합한 부위 선택, 마우스 모낭 주기 설명, 피부 막 수축의 영향 이해4,5가 포함됩니다. 해당 조치를 구현하는 것은 실험 조건을 최적화하고 관찰 결과의 정확도를 향상시키는 데 필수적입니다.

단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq)은 기존 RNA 염기서열분석보다 훨씬 더 정교한 수준에서 세포를 염기서열분석하며, 그룹 내 차이를 최소화하면서 시료 품질에 대한 요구 사항이 훨씬 더 높습니다. 안정적인 마우스 급성 전층 피부 결손 모델을 정제하기 위해 여러 실험을 수행했습니다. 이러한 실험은 상처 치유를 종합적으로 평가하기 위해 문헌에서 확립된 방법과 혁신적인 접근 방식의 조합을 활용했습니다2,5. 상처 치유 모델을 개발하기 위해 마우스 전층 피부 절제를 사용하여 상처 복구 및 재생의 생리학적 과정을 복제했습니다. 이 연구의 목적은 scRNA-seq를 사용한 다양한 치료로 인해 유발되는 잠재적 변화를 평가하는 것이었습니다. 마우스의 피부 조직 해리는 단일 세포 현탁액을 준비하는 동안 낮은 세포 생존율과 높은 응집률을 포함한 문제를 제기합니다6. 이러한 어려움으로 인해 기기 막힘 및 비정상적인 세포 캡처와 같은 문제가 발생할 수 있으며, 이는 데이터 품질을 손상시킬 수 있습니다. 단일 세포 염기서열분석의 상당한 비용을 감안할 때, 단일 세포 현탁액의 안정성과 신뢰성을 보장하기 위해서는 여러 예비 실험을 수행하는 것이 중요합니다. 본 연구에서는 조직 해리에 대한 최적의 접근법을 규명하기 위해 혼합 효소 해리와 조직 키트 해리 방법의 효능을 평가하였다6,7. 이 연구는 추가적인 심층 조사를 위한 강력한 기반을 구축합니다.

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프로토콜

모든 절차는 중국 인민해방군 종합병원 제7의료센터 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 6주령의 수컷 C57/BL6 마우스를 사용하였다.

1. 마우스 상처 치유 모델

  1. 동물 그룹화
    1. 마우스를 실험 그룹과 통제 그룹(각각 6명)에 무작위로 할당합니다. 온도가 23-25°C로 유지되고 습도가 50%-60%이며 12시간의 명암 주기가 있는 특정 병원체가 없는(SPF) 동물 시설에 있는 사육 마우스.
    2. 생쥐가 표준 사료와 오토클레이브 수돗물을 제한 없이 이용할 수 있도록 합니다.
  2. 수술 전 준비
    1. 고정 장치를 사용하거나 엎드린 자세로 마우스를 단단히 잡고 마우스를 부드럽게 제지합니다. 실온으로 복원된 1% 펜토바르비탈 나트륨을 주사기에 넣고 체중 0.1mL/20g의 용량으로 투여합니다.
      참고: 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액은 4°C의 어두운 환경에서 보관해야 합니다.
    2. 알코올 면봉으로 마우스의 복부를 청소합니다. 주사기를 복부에 약간의 각도로 삽입합니다. 방광이나 장으로의 부주의한 투여를 방지하기 위해 주사 전에 흡인하십시오. 10분 동안 기다립니다.
    3. 쥐가 경련을 멈추고 더 이상 자극에 반응하지 않으면 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 흰색 바셀린을 바르십시오. 면도기를 사용하여 긴 등털을 다듬습니다.
    4. 뒤쪽에 제모 크림을 바르고 2분 정도 기다렸다가 촉촉한 거즈로 부드럽게 닦아내면 마우스의 피부가 손상되지 않습니다. 제모 크림을 장기간 방치하지 마십시오.
    5. 베타딘과 70% 알코올을 번갈아 가며 3개의 면봉으로 주변 피부를 부드럽게 소독합니다.
    6. 오토클레이브 피부 생검 펀치, 가위, 겸자 및 살균을 위한 기타 도구. 살균된 작업 공간을 유지하십시오. 새 수술용 천에 후속 수술을 수행합니다.
  3. 전체 두께 피부 절제
    참고: 상처 부목 모델은 상처 치유를 위한 치료의 효과를 평가하는 데 사용되었습니다.
    1. 영구 마커를 사용하여 마우스의 등쪽 영역의 위쪽 중앙 영역을 직경 8mm의 원 하나로 표시합니다.
    2. 깨끗한 집게를 사용하여 등쪽 피부를 들어 올리고 미세한 수술 용 가위를 사용하여 첫 번째 절단을합니다. 첫 번째 절단 후 집게를 사용하여 부분적으로 제거된 피부 부위를 잡고 표시된 원을 조심스럽게 잘라냅니다.
    3. 맞춤형으로 설계된 스테인리스 스틸 링(내경 15mm, 외경 18mm)을 사용하십시오. 절개 부위 주변의 금속 링을 5-0 비흡수성 봉합사로 봉합하여 절개 부위 피부의 수축을 방지합니다(그림 1A). 녹 및 변형을 방지하기 위해 스테인리스 스틸을 링 재질로 사용하십시오.
    4. 수술 후 통증을 치료하기 위해 상처 근처에 10% 부프레노르핀 염산염 희석액을 0.1mL 피하 주사합니다.
    5. 마우스를 다시 도입하여 개별 케이지를 청소합니다. 마우스를 엎드린 위치에 놓습니다. 마우스가 의식을 되찾기 전에 마우스를 방치하지 마십시오.
    6. 2일마다 마우스의 상처를 관찰하고 사진을 찍어 1.2단계에서 설명한 대로 마취 후 상처 크기를 측정합니다.
  4. 생검 조직을 얻기 위한 상처 스탬프 마킹
    1. 1.1단계와 1.2단계에 설명된 대로 실험을 준비합니다.
    2. 원 지름이 8mm이고 한 변의 길이가 정사각형인 맞춤형 마우스 상처 마킹 스탬프를 만듭니다(그림 1B).
    3. 마우스를 엎드린 자세로 놓고 알코올 면봉으로 등 피부를 소독합니다. 스탬프를 잉크에 담그십시오. 마우스 뒷면의 중간 상단 부분에 스탬프를 표시합니다.
    4. 수술용 가위를 사용하여 등의 피부층 전체를 원형 표시를 따라 조심스럽게 절제하여 근육층을 완전히 노출시킵니다. 상처의 상태를 방해하지 않도록 옷을 입지 않고 상처를 열어 두십시오. 마우스를 깨끗하고 소독된 환경에 놓고 상처가 자연적으로 딱지를 형성하도록 하여 상처의 무균 상태를 유지합니다.
    5. 수술 후 통증을 치료하기 위해 상처 근처에 10% 부프레노르핀 염산염 희석액을 0.1mL 피하 주사합니다.
    6. 마우스를 다시 도입하여 개별 케이지를 청소합니다. 마우스를 엎드린 위치에 놓습니다. 마우스가 의식을 되찾기 전에 마우스를 방치하지 마십시오.
    7. 1.2단계에서 설명한 대로 마취 후 상처 크기를 측정하기 위해 2일마다 마우스의 상처를 관찰하고 사진을 찍습니다.
    8. 1.4에 설명된 대로 치료 투여를 수행합니다.
  5. 치료 관리
    1. 마우스가 의식을 되찾은 후 4시간이 지나면 1.2.2-1.2.3 단계에 설명된 대로 마취를 수행합니다.
    2. 원하는 치료제를 피하주사하며, 치료군은 절개 부위 주위 PBS 200 μL에 용해된 인간 탯줄 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀(hucMSC-Exo) 100 μg을 투여한다.
    3. 대조군을 위해 절개 부위 주위에 PBS 200μL를 피
      4. 하주사합니다.
    4. 최대 14일 동안 2일마다 1.5.2 및 1.5.3 단계를 반복합니다. 주사 부위에 부기, 발적 또는 감염 징후가 있는지 검사합니다.

2. 단세포 RNA 염기서열분석 준비

  1. 조직 채취 및 준비
    1. 1.2.2-1.2.3 단계에 설명된 대로 마취를 수행합니다.
    2. 깨끗한 집게를 사용하여 등쪽 피부를 들어 올리고 딱지를 제거합니다. 상처 부위의 피부를 약 2cm2 정도 잘라내고, 지방 조직과 큰 혈관을 잘라낸다.
    3. 멸균 집게를 사용한 피부 생검을 미리 냉각된 4mL의 PBS로 채워진 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.
    4. 눈에 보이는 혈액이 없을 때까지 4mL의 PBS로 채워진 새 웰(6웰 플레이트)에 생검을 순차적으로 옮겨 PBS로 세척합니다.
    5. 메스로 피부를 약 2mm 크기로 자르고 0.04% BSA가 함유된 DPBS로 더 씻고 이물질을 제거합니다.
  2. 효소 해리(그림 2)
    1. 1mL의 콜라겐분해효소 I(10mg/mL), 1mL의 콜라겐분해효소 IV(5mg/mL), 1mL의 콜라겐분해효소 D + 디스페이아제 II(15mg/mL), 1mL의 DNase I(5mg/mL) 및 6mL의 DPBS를 멸균 원뿔형 튜브에 결합하여 분해액을 준비합니다. 균질성을 보장하기 위해 구성 요소를 철저히 혼합하십시오.
    2. 원뿔형 튜브를 37°C로 설정된 수조에 10분 동안 넣어 소화 용액을 예열합니다.
    3. 조직에 2.5mL의 소화액을 넣고 37°C에서 70분 동안 분해하고 10분마다 시험관을 뒤집어 철저히 혼합합니다.
    4. 70μm 스트레이너를 세척 버퍼(PBS의 경우 0.2% BSA)로 미리 적십니다. 해리된 세포 및 잔류 조직 단편을 포함한 반응 혼합물을 스트레이너에 1 mL 광구경 피펫 팁을 사용하여 옮깁니다.
    5. 사전 습윤된 70μm 세포 여과기를 통해 이 혼합물을 15mL 원심분리 튜브로 여과합니다.
    6. 반응 혼합물을 300 x g, 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 다음 해리 단계를 위해 펠릿(세포)을 보관합니다.
  3. 적혈구 용해
    1. 적혈구 용해 용액(10x)을 이중 증류수로 1:10 비율로 희석합니다. 원뿔형 튜브에서 1x 적혈구 용해 용액으로 세포를 1:10 비율로 희석합니다.
    2. 혼합물을 5초 동안 와류로 가열하고 실온에서 2분 동안 배양한 다음 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 흡입하고 동일한 부피의 DPBS로 세포를 재현탁시킨 다음 얼음에 보관합니다.
  4. 여과
    1. 세포 현탁액을 회수하고 40μm 스트레이너를 통해 새 원뿔형 튜브로 여과합니다.
    2. 튜브를 4.5mL의 RPMI(10% FCS)로 2번 헹구어 남아 있는 세포가 모두 수집되도록 합니다.
    3. 세포 현탁액을 300 x g의 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.
    4. 상층액을 버리고 펠릿을 부드럽게 튕긴 다음 50μL의 0.04% BSA PBS에서 넓은 구멍의 팁으로 세포를 재현탁합니다. 이 과정 내내 얼음 위의 세포를 유지하십시오.
  5. 죽은 세포 제거
    1. dead cell removal kit 20x stock buffer를 nuclease-free water와 1:20 비율로 혼합하여 1x binding buffer를 얻습니다.
    2. 300 x g에서 시료를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 60mg의 피부 시료에 대해 10μL의 사체 제거 마이크로비드를 추가합니다.
    3. 실온에서 15분 동안 배양합니다. 500μL에 도달할 때까지 스톡 버퍼를 추가합니다. 키트의 준비된 컬럼에 샘플을 로드하고 디스해리터에 부착합니다.
    4. dissociator 프로그램을 실행하여 살아있는 셀을 분리합니다. 프로그램이 종료된 후 30μm 필터를 통해 현탁액을 여과하고 동일한 부피의 D-PBS.
      로 희석합니다. 참고: 점적 속도가 눈에 띄게 느려지면 불순물이 공극을 막고 세포 회복에 영향을 미치지 않도록 즉시 컬럼을 교체하십시오.
    5. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 Acridine Orange/Propidium Iodide(AO/PI) 염색 및 세포 계수를 수행합니다. 세포 생존율 ≥ 85%, 세포 응집률 < 20%, 눈에 보이는 적혈구 또는 세포 단편이 없는 허용 기준을 사용합니다.
  6. multi-tissue dissociation kit의 해리 절차(대안)
    1. RPMI 1640 2.5mL, 효소 D 100μL, 효소 R 50μL 및 효소 A1 12.5μL를 부드러운 MACS C 튜브(Multi Tissue Dissociation Kit의 구성 요소)에 혼합합니다.
    2. 효소 혼합물이 들어 있는 부드러운 MACS C 튜브로 조직을 옮기고 단단히 닫습니다.
    3. 튜브를 37°C의 수조에 90분 동안 놓고 10분마다 부드럽게 반전하여 해리 용액에 조직이 적절하게 노출되도록 합니다.
    4. 해리 용액을 버리고 DPBS로 조직을 씻습니다.
    5. 70 μm 및 40 μm 셀 스트레이너에 단일 셀 현탁액을 순차적으로 통과시키고 4°C의 300 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
    6. 2.3단계와 동일한 절차에 따라 적혈구 용해 시약을 사용하여 적혈구를 용해합니다.
    7. 2.58단계와 동일한 절차에 따라 죽은 세포 제거 키트를 사용하여 죽은 세포를 제거합니다.
    8. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 AO/PI 염색 및 세포 계수를 수행합니다. 세포 생존율 ≥ 85%, 세포 응집률 < 20%, 눈에 보이는 적혈구 또는 세포 단편이 없는 허용 기준을 사용합니다.

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결과

해당 절차의 여러 변형 방법을 탐색하였습니다. 스탬프 프로토콜은 상처 치유 과정에 대한 간섭이 최소화되고, 긁힘이나 봉합사와 같은 외부 영향으로부터 상처의 무결성을 유지할 수 있어 선호되었습니다. 이는 후속 시퀀싱을 위해 단일 세포 수준에서 노이즈가 발생하는 것을 방지하기 위함입니다. 마우스의 양쪽에 상처를 내는 경우, 마우스 피부 고유의 탄성으로 인해 상처 면적에 뚜렷한 차이가 발생하는 결과가 나타났습니다.그림 3A,B). 양측 천자는 상처를 가장자리에 더 가깝게 배치하였으며, 이 영역은 마우스의 자가 긁기 행동에 취약합니다. 7주령 이상의 마우스 중 일부에서 등 쪽 피부 주변의 불규칙한 착색이 나타났기 때문에, 이들은 본 연구에 부적합한 것으로 간주되었습니다.th 수술 후 일수, 모발 재성장 시작을 나타냄 (그림 4A). 이로 인해 원치 않는 추가 변수가 도입되었습니다....

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토론

프로토콜의 성공을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필수적이었습니다. 이러한 단계에는 철저한 면도 및 세척을 통한 상처 부위의 정확한 준비, 특정 크기와 깊이의 표준화된 상처 생성, 감염을 모니터링하고 적절한 치료를 시행하기 위한 부지런한 상처 후 관리가 포함되었습니다. 이러한 절차의 표준화는 실험 조건 전반에 걸쳐 일관성을 보장하여 결과의 신뢰성과 재현성을 향상시켰습니다10.

다른 방법은 마우스 상처 긁힘 및 봉합사 파열과 같은 추가 변수를 도입하기 때문에 시퀀싱을 위해 상처 스탬프 표시를 사용했습니다 2,5. 스탬프 모델은 생쥐의 상처 초기 일관성을 개선하고 상처 치유를 평가하기 위한 표준화된 벤치마크를 제공하여 쥐 모델에서 상처 치유율을 추정할 때 잠재적인 부정확성을 줄입니다. 또한 스탬프 마크는 ImageJ와 같은 소프트웨어를 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 ( # 82373494).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
75 % AlcolcholLiuheJIUJING500ML
C57 / BL6J 마우스Charles River Laboratories
Collagenase D + Dispase IIRoche11088858001
Collagenase IRoche5349907103
Collagenase IVRoche5267439001
면봉HaishiMIANQIAN
사체 제거 키트Miltenyi Biotec130-090-10
DNase IRoche10104159001
gentleMACDissociator Miltenyi Biotec130-093-235
의료용 나일론 스레드JinlongHM507
Multi Tissue Dissociation Kit 1Miltenyi Biotec130-110-201
펀치 생검 바늘Integra Miltex
적혈구 용해 용액Miltenyi Biotec130-094-183
외과 가위JingluJIANDAO
백색 바셀린ShangyuanBAIFANSHILIN

참고문헌

  1. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  2. Wu, J., Landén, N. X. Investigation of skin wound healing using a mouse model. Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).
  3. Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).
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  5. Ganguli-Indra, G. Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model. Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
  7. Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells. Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).
  8. Dead cell removal kit. , Available from: https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline (2015).
  9. Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
  10. Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy. STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).
  11. Gao, C., Zhang, M., Chen, L. The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium. Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).
  12. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).
  13. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).

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