방법 논문

호산구성 식도염의 상피 장벽을 조사하기 위한 3차원 세포 배양 모델

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DOI:

10.3791/66503

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2024년 5월 10일

 , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, University Digestive Healthcare Center, Clarunis

이 논문에서

요약

여기에서는 인간 식도 오가노이드 배양 및 공기-액체 계면 배양을 위한 프로토콜을 제공합니다. 식도 오가노이드의 공기-액체 계면 배양은 식도 상피 장벽에 대한 사이토카인의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

식도의 편평 상피는 환경에 직접 노출되어 식품 항원 및 미생물을 포함한 외부 항원과 지속적으로 마주합니다. 상피 장벽의 무결성을 유지하는 것은 감염을 예방하고 무해한 식품 유래 항원으로 인한 염증을 피하는 데 매우 중요합니다. 이 기사에서는 조직 항상성 및 질병의 맥락에서 식도의 상피 구획을 연구하기 위해 환자 생검에서 인간 식도 오가노이드 및 공기-액체 계면 배양을 생성하기 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 지난 10년 동안 중요한 과학적 이정표였으며, 환자 유래 일차 세포, 오가노이드 및 공기-액체 계면 배양에서 3차원 장기와 같은 구조를 설명했습니다. 그들은 3차원 프레임워크 내에서 식도 상피의 특정 사이토카인, 성장 인자 및 신호 경로의 기능을 조사하면서 기증자의 표현형 및 유전적 특성을 유지할 수 있는 가능성을 제공합니다. 오가노이드는 사이토카인 자극 후 전사체와 단백질체를 평가하여 조직 미세구조에 대한 정보를 제공합니다. 대조적으로, 공기-액체 계면 배양은 경상피 저항성(TEER) 또는 거대분자 플럭스 측정을 통해 상피 장벽 무결성을 평가할 수 있습니다. 이러한 오가노이드와 공기-액체 계면 배양을 결합하는 것은 손상된 식도 상피 장벽 상태에 대한 연구를 발전시키는 강력한 도구입니다.

서론

식도 염증은 Th2 지배 만성 식도 염증성 질환인 호산구성 식도염(EoE)에서 관찰되는 바와 같이 상피 장벽 무결성 1,2,3,4,5를 손상시킨다 6. EoE는 1990년대에 처음 기술되었으며7,8 주로 식품 항원 9,10,11,12,13에 의해 유도됩니다. 성인 인구에서 가장 빈번하게 발생하는 EoE 증상은 삼킴곤란과 음식물 매립이다14. 소아의 경우, EoE는 전형적으로 성장 부진, 음식 거부, 구토, 복통 등으로 나타난다15. 게놈 전체 연관 연구(Genome-wide association studies, GWAS)는 상피 장벽 무결성에 관여하는 EoE 위험 유전자를 식별하여 상피를 EoE 연구의 초점으로 이동시켰습니다 16,17,18. EoE 전사체학은 또한 손상된 분화 과정과 반응성 기저 영역 증식이 식도 상피 3,5,19,20,21,22의 손상된 장벽 기능을 유발한다는 것을 밝혔습니다. EoE가 Th2매개 질환이라는 초기의 이해6는 상피 무결성 3,4,21,23을 방해함으로써 IL-13을 구동 매개체로 발견하게 되었습니다. 유전적 소인을 통한 내인적 장벽 손상에서 상피 무결성에 대한 사이토카인 매개 효과를 해부할 수 있는 실험 시스템은 EoE에서 면역 세포와 상피 사이의 복잡한 상호 작용을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다. 인간 식도 오가노이드 및 공기-액체 계면(ALI) 배양은 사이토카인 자극이 상피 무결성에 미치는 영향을 분석하기 위한 유용한 도구로 제안되었습니다5.

성체 조직 특이적 줄기세포(ASC) 유래 식도 오가노이드를 생성하기 위한 첫 번째 프로토콜은 2009년 소장의 상피 구획을 재현하는 장 Lgr5+ ASC를 사용하여 장 오가노이드에 대한 첫 번째 발표된 보고서 이후 5년 후에 확립되었습니다24. DeWard et al.은 쥐 식도 상피 세포에서 오가노이드를 생성하는 데 앞장섰습니다25. 2018년, Kasagi et al.은 불멸화된 인간 식도 편평 상피 세포주 EPC2-hTERT 및 1차 환자 유래 세포26에서 인간 식도 오가노이드를 생성했습니다. 같은 해에 Zhang 등은 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 식도 오가노이드를 성공적으로 생성했습니다. 그들은 식도 전구 세포(EPC) 발달에 대한 TGFβ 및 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 억제의 중요성과 층화 편평 상피26,27의 분화에서 Notch 신호의 중요한 역할을 설명했습니다. 트리스노(Trisno)와 동료들은 Sox2를 식도 분화(esophageal differentiation)로 발달 운명을 이끄는 Wnt 억제제(inhibitor)로 확인함으로써 이러한 발견을 보완했다28. 프로토콜, 배지 조성 및 배양 조건의 후속 개선으로 오가노이드 형성 속도가 증가하고 동결 보존 후 오가노이드를 하위 배양 및 회수할 수 있게 되었습니다 26,29,30,31,32. 이러한 오가노이드는 사이토카인으로 자극한 후 조직 구조와 잠재적 표적 유전자의 발현을 연구하기 위한 강력한 도구이지만, 식도 오가노이드는 장벽 무결성에 대한 직접적인 측정으로 경상피 저항성(TEER) 또는 거대분자 플럭스를 측정할 수 있는 가능성을 제공하지 않습니다. Sherrill과 동료들에 의해 이전에 기술된바와 같이22, 상피 분화(epithelial differentiation)4를 모델링하는 ALI 배양은 상피 무결성(epithelial integrity)에 대한 직접적인 평가를 가능하게 한다. 환자 유래 오가노이드와 ALI 배양을 결합하는 것은 EoE에서 조직 구조와 상피 장벽 무결성을 조사하기 위한 강력한 도구입니다.

다음은 식도 생검에서 생존 가능한 세포를 분리하고 사이토카인이 장벽 무결성에 미치는 영향을 추가로 연구하는 데 사용할 수 있는 식도 오가노이드 및 ALI 배양을 확립하기 위한 지침이 포함된 절차입니다.

프로토콜

이 절차는 북서부 및 중부 스위스 윤리 위원회(EKNZ; 프로젝트 ID 2019-00273). 모든 환자는 내시경 검사 전에 생검의 실험적 사용에 대한 서면 동의서를 제공했습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 환자 유래 식도 오가노이드를 위한 세포 분리

참고: 인간 식도 오가노이드를 배양하기 위한 배지 성분 목록은 표 1에 나와 있습니다.

  1. 생검을 받습니다.
    참고: 본 연구에서는 작동 채널이 2.8mm인 위내시경을 사용하여 생검 겸자를 사용한 식도 위십이지장 내시경 검사 중에 한 식도 분절에서 두 번의 생검을 얻습니다.
  2. 생검을 시판되는 각질세포 무혈청 배지(KSFM; Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    알림: 생검은 사용할 때까지 몇 시간 동안 얼음에 보관할 수 있습니다.
  3. KSFM 배지를 1mL의 Dispase I(10U/mL)로 교체하고 실온에서 10분 동안 생검을 배양합니다.
  4. 300 x g 의 실온에서 2분 동안 생검을 원심분리합니다.
  5. 생검과 세포 파편 펠릿을 건드리지 않고 1000μL 피펫을 사용하여 Dipase를 흡입합니다.
  6. 1mL Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 생검을 헹굽니다.
  7. 300 x g 의 실온에서 2분 동안 생검을 원심분리합니다.
  8. 1000μL 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다.
  9. 800rpm에서 흔들면서 37°C에서 10분 동안 500μL의 Trypsin-EDTA(0.05%)로 생검을 배양합니다.
  10. single-cell suspension이 얻어질 때까지 반복적인 up-down 피펫팅을 통해 기계적 파괴를 수행합니다.
  11. 투베르쿨린 주사기의 고무 플런저 헤드를 사용하여 70μm 세포 여과기를 통해 세포를 여과합니다.
  12. 2-4mL의 대두 트립신 억제제(250μg/mL)로 여과기를 세척합니다.
  13. 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브의 스냅온 캡이 있는 35μm 세포 여과기를 통해 세포를 여과합니다.
  14. 단일 셀 용액을 15mL 코니컬 튜브에 옮깁니다.
  15. 300 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  16. 1000μL 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다.
  17. 100 μL의 KSFM 배지에 셀을 재현탁시킵니다.
  18. 트리판 블루 10μL와 세포 현탁액 10μL를 혼합합니다.
  19. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세십시오.

2. 환자 유래 오가노이드 배양

  1. 계수 후 세포 현탁액에 1-2mL의 KSFM을 추가합니다.
  2. 300 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  3. 세포 펠릿을 방해하지 않고 1000μL 피펫으로 상층액을 흡입합니다.
  4. 기저막 추출물(BME) 하이드로겔 매트릭스(20,000개 세포당 40μL의 BME)에서 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
    알림: BME를 추가한 후에는 BME의 조기 응고를 방지하기 위해 셀을 얼음 위에 두십시오.
  5. 200μL 피펫 팁을 절단하여 점성이 있는 BME-세포 현탁액 혼합물을 흡입합니다.
  6. 예열된(37°C) 현탁 세포 배양 플레이트에서 40μL 방울을 형성합니다.
  7. BME 방울의 응고를 보장하기 위해 37°C에서 20-30분 동안 배지 없이 플레이트를 배양합니다.
  8. 배양 첫 2일 동안 10μM의 Y27632(ROCK-inhibitor)가 보충된 사전 예열된 KSFM-C 배지를 추가합니다.
  9. 이틀에 한 번씩 새로운 KSFM-C 배지(Y27632 및 관심 +/- 사이토카인 제외)로 교체합니다.
  10. 배지를 흡입하고 피펫 팁으로 액적을 긁어내면서 1mL의 Dispase II(1.5U/mL)를 웰에 지속적으로 추가합니다.
  11. BME-dispase 혼합물을 15mL 원심분리 튜브에 옮기고 진탕수 수조에서 37°C에서 20분 동안 배양하여 BME를 분해합니다.
  12. 250 x g 에서 4 °C에서 3 분 동안 원심 분리하고 Dispase II를 흡입합니다.
  13. 관심 판독의 프로토콜에 따라 진행합니다(예: RNA 분리, 단백질 분리 또는 조직학을 위한 4% PFA로 고정).

3. 환자 유래 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양을 위한 세포 분리

  1. 생검을 받습니다. 2.8mm의 작동 채널이 있는 위내시경을 사용하는 식도 십이지장 내시경 검사에서는 생검 겸자를 사용하여 한 식도 분절에서 두 번의 생검을 수행합니다.
  2. 생검을 시판되는 무혈청 세포(KSFM; Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 사용할 때까지 몇 시간 동안 얼음에 보관하십시오.
  3. KSFM을 Dispase 1mL(10U/mL)와 교환합니다. 그 후, 실온에서 10분 동안 생검을 배양합니다.
  4. 300 x g의 실온에서 2분 동안 생검을 원심분리합니다.
  5. 생검 및 세포 파편 펠릿을 건드리지 않고 1000μL 피펫을 사용하여 Distase를 제거합니다.
  6. 1mL의 DPBS로 생검을 세척합니다.
  7. 실온에서 300 x g 에서 2분 동안 생검을 회전시킵니다.
  8. 1000μL 피펫으로 상층액을 흡입합니다.
  9. 생검을 37°C에서 500μL의 Trypsin-EDTA(0.05%)에 10분 동안 배양하고 배양 중에 800rpm에서 계속 혼합합니다.
  10. single-cell suspension이 얻어질 때까지 반복적인 up-and down pipetting으로 생검을 기계적으로 중단시킵니다.
  11. 해리된 세포를 투베르쿨린 주사기의 고무 플런저 헤드가 있는 70μm 세포 여과기에 통과시키고 50mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다.
  12. 스트레이너를 2-4mL의 대두 트립신 억제제(250μg/mL)로 세척하여 스트레이너에서 남은 세포를 제거합니다.
  13. 35μm 세포 스트레이너 스냅 캡으로 세포를 5mL의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 여과합니다.
  14. 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
  15. 4 °C에서 300 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다.
  16. 1,000μL 피펫으로 상층액을 제거합니다.
  17. 10 μM Y27632를 포함하여 4 mL의 KSFM 배지(Ca2+ 0.09 mM)에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
  18. 세포를 T25 세포 배양 플라스크에 옮깁니다.
  19. 원발성 각질세포를 확장하려면 약 1주일 동안 60%-80% 밀도가 될 때까지 세포를 배양합니다.
    참고: 통로 (P)0은 섬과 같은 세포 복합체를 형성하며 단층이 아닙니다. 일차 각질세포는 P1부터 단층을 형성합니다.
  20. 60%-80% 밀도로 통과하고 2-3 T25 또는 1-2 T75 세포 배양 플라스크에서 P1을 재파종합니다.
  21. 각질 형성 세포가 60%-80%의 밀도를 가진 단층을 형성할 때 다시 P1 통로.

4. 환자 유래 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양

  1. ALI 배양을 위해 P2 1차 각질세포를 트랜스웰 삽입체에 파종합니다.
    참고: 500 μL의 KSFM(Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE)에 12개의 웰 인서트(0.6cm2당 200,000개의 각질세포)에 400,000개의 세포를 파종합니다.
    1. 100 μL의 KSFM (Ca2 + 0.09 mM, 1 ng / mL EGF, 50 μg / mL BPE)에 24 개의 웰 삽입 (0.5cm2 당 155,000 개의 각질 형성 세포)에 150,000 개의 세포를 파종합니다.
    2. 또는 -80°C의 KSFM 배지(Ca2+ 0.09 mM + 10% DMSO)에서 24시간 동안 동결한 후 동결된 세포를 액체 질소로 옮겨 나중에 사용할 수 있습니다.
      참고: 냉동 바이알을 사용하는 경우 해동 후 ALI 배양에 세포를 사용하기 전에 한 번 더 통과시키십시오.
  2. 트랜스웰 배양 플레이트의 삽입물 아래에 있는 하단 웰에 배지를 추가합니다.
    참고: 12웰 플레이트: KSFM 1.5mL(Ca2+ 0.09mM, 1ng/mL EGF, 50μg/mL BPE). 24웰 플레이트: KSFM 600 μL(Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
  3. 중칼슘에서 고칼슘 KSFM(Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE)을 2일 후에 교체합니다.
  4. 고칼슘 KSFM 배지를 7일까지 이틀에 한 번씩 교체하십시오.
  5. 상부 챔버에서 배지를 흡인하고 하부 챔버의 배지를 10ng/mL KGF(=FGF7), 75μg/mL 아스코르브산(AA)을 함유하는 고칼슘 KSFM(Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE)으로 교체하여 7일차에 공수를 수행합니다.
    1. 선택 사항: 원하는 농도의 관심 사이토카인을 배지에 추가합니다.
  6. 14일째까지 이틀에 한 번씩 매체를 교체하십시오.

5. 경상피 전기 저항(TEER) 측정

  1. TEER 미터의 전극을 24% 차아염소산나트륨이 있는 5웰 플레이트의 웰에 10-15분 동안 담가 멸균합니다.
  2. 멸균 ddH5O가 있는 4개의 하위 웰에 전극을 담그고 전극을 공기 중에서 건조시켜 2% 차아염소산나트륨을 씻어냅니다.
  3. 웰에 하나의 전극을 배치하고 두 번째 전극을 트랜스웰 인서트에 배치하고 PBS로 채우고 TEER를 측정하여 블랭크를 설정합니다.
    참고: TEER 측정을 위한 권장 용량: 12웰 플레이트(웰에서 1900 μL, 인서트에서 900 μL). 24웰 플레이트용(웰에서 750-1000 μL, 인서트에서 250 μL).
  4. ALI 배양액의 배지를 실온 멸균 PBS로 교체합니다.
    알림: 하단 웰에서 매체를 제거하고 두 번째 단계에서 트랜스웰 인서트에서 제거합니다. 마찬가지로, PBS를 먼저 인서트에 추가한 다음 하단 웰에 추가하여 트랜스웰 멤브레인에서 ALI 배양액이 분리되는 것을 방지합니다.
  5. ALI 배양이 있는 실험용 웰에 TEER 미터 전극을 배치하고 TEER 측정1을 수행합니다.
    알림: 매체를 교체하기 전에 이틀에 한 번씩 TEER 측정을 수행하십시오.

6. 고분자 플럭스

  1. FITC-덱스트란(3-5kDa) 원액을 1mg/mL 농도로 희석합니다.
    알림: 항상 FITC-Dextran을 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오.
  2. 판독을 위한 표준으로 FITC 농도가 감소(1000 μg/mL - 0.25 μg/mL)하는 희석 행을 준비합니다.
  3. 500μL의 FITC-dextran 용액(1mg/mL)을 트랜스웰의 상부 챔버에 추가하고 1.5mL 배지(+/- 관심 사이토카인)를 하부 구획에 넣고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.
  4. 각 시점(예: 0분, 15분, 30분, 60분, 90분, 120분, 150분, 180분)에 하부 구획에서 120μL의 매체를 수집합니다.
  5. 피펫은 각 시점의 복제(50 μL/웰)를 검은색 96웰 투명한 평평한 바닥 플레이트에 넣습니다.
  6. 490nm에서 FITC-dextran을 여기시키고 플레이트 리더를 사용하여 520nm의 파장에서 방출을 판독합니다.
  7. 표준에 따라 고분자 플럭스의 양을 계산하십시오.

결과

식도 오가노이드는 도립 명시야 현미경으로 문서화된 대로 제공된 프로토콜의 지침에 따라 환자 생검에서 추출한 일차 세포에서 자랍니다(그림 1). 상피 ASC는 분리된 세포를 기저막 추출물에 파종한 후 배양 후 처음 2일 이내에 자기 조직화 방식으로 세포 클러스터를 형성하기 시작하여 골격 역할을 합니다. 도립 명시야 현미경으로 눈에 띄는 세포 클러스터의 크기와 수는 첫 주 내에 지속적으로 증가합니다(그림 2). 그러나 이 시점에서 세포 클러스터는 ASC 유래 식도 오가노이드의 다층 편평 상피의 특징인 양파와 같은 구조가 없습니다. 배양 9일째에는 양파와 같은 다층 구조와 오가노이드 중앙에서 성장하는 각질화된 코어가 분명해집니다(그림 2A). 오가노이드 배양은 최대 21일 동안 지속될 수있다 26. 그러나 오가노이드는 11일에서 14일 사이에 완전히 성숙하고 최대 크기에 도달하는 것으로 입증되었습니다. 11일째부터 배양 과정은 주로 각질화를 진행하고 대사 활성, 생존 가능한 세포 5,26을 감소시키는 것이 특징입니다. 따라서 실험을 위해 오가노이드를 검색하는 최적의 시간은 원하는 분화 단계에 따라 다르며 5일에서 11일 사이입니다.

오가노이드가 성장을 멈추기 전에 최대 3개의 통로가 가능한데, 이는 증가된 케라틴 코어가 생존 가능한 세포의 수를 줄이기 때문입니다. 오가노이드는 유전자/단백질 발현을 분석하거나 조직학 및 바이오뱅킹을 위해 원하는 날에 RNA 또는 단백질 분리를 위해 수확할 수 있습니다.

ALI 및 오가노이드 배양을 위한 초기 세포 분리 단계는 동일합니다. ALI 배양을 확립하기 전에 새로 분리된 일차 세포를 오가노이드 프로토콜과 대조적으로 확장해야 합니다. 두 번째 통과 후, 1차 각질세포는 트랜스웰 인서트에 파종되고 칼슘 농도가 낮은 배지에서 배양하여 단층 형성을 유도하고 분리된 1차 각질세포의 조기 분화를 방지합니다. 48시간 후 합류 단층이 형성되면 매체의 칼슘 농도가 1.8mM로 상승하여 상피층의 분화 및 층화를 유도합니다. 7일 후, 공수는 다층 상피의 정점 쪽을 공기에 노출시켜 각질화를 일으킵니다. ALI 배양은 일반적으로 최대 14일 동안 유지할 수 있습니다(그림 2B). TEER 측정 및 고분자 플럭스 실험은 상피의 기능을 모니터링합니다. 여기에서 TEER 측정은 원발성 식도 각질세포의 ALI 배양, 각 웰 바닥에 NIH/3T3 섬유아세포 공급층이 있는 일차 각질세포 ALI 배양, 각 삽입물에 NIH/3T3 섬유아세포 공급층이 있는 원발성 각질세포 ALI 배양에서 수행되었습니다(그림 2C).

figure-results-1
그림 1: 환자 유래 식도 오가노이드 배양 과정. 시료 채취 절차, 세포 분리, 오가노이드 배양 및 환자 유래 식도 오가노이드의 잠재적인 실험 응용 분야를 보여주는 다이어그램입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 환자 유래 식도 오가노이드의 형성 및 분화. (A) 환자 생검 유래 일차 세포에서 배양된 식도 오가노이드의 대표적인 명시야 이미지. (B) 14일째에 생검 유래 일차 세포에서 배양한 식도 ALI 배양의 대표적인 명시야 이미지. 눈금 막대: 50μM. (C) 원발성 식도 각질세포의 공기-액체 계면(ALI) 배양에서 표시된 일수의 경상피 전기 저항(TEER) 측정, 각 웰 바닥에 NIH/3T3 섬유아세포 공급층이 있는 원발성 각질세포에서 배양된 ALI 및 각질세포층 아래의 각 삽입부에서 NIH/3T3 섬유아세포 공급층이 있는 일차 각질세포에서 배양된 ALI. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보통(주)케이에스에프엠KSFM-C (주)케이에스엠씨
베이스 매체각질세포-SFM각질세포-SFM
보충제페니실린/스트렙토마이신1%1%
소 뇌하수체 추출물 (BPE)50μg/mL50μg/mL
표피 성장 인자(EGF)1ng/mL1ng/mL
염화칼슘(CaCl2)0.09 밀리미터0.6 mM의
Y-27632 (ROCK-inhibitor)-10 마이크로미터

표 1: 일차 세포 유래 식도 오가노이드 배지. 인간 식도 오가노이드를 배양하기 위한 배지 구성 성분 목록. SFM: 무혈청 배지.

토론

제공된 절차를 통해 성공 가능성이 높은 환자 유래 오가노이드 및 ALI 배양을 할 수 있습니다. 오가노이드 프로토콜은 인간 식도 오가노이드26의 생성을 보고하는 첫 번째 발표된 프로토콜과 최근에 발표된 프로토콜32에서 채택되었습니다. Sherill과 동료들은 ALI 모델22를 설명했습니다. 오가노이드 및 ALI 배양 모델은 EoE 5,26과 같은 식도 질환의 맥락에서 사이토카인 및 기타 매개체가 식도 상피 장벽에 미치는 영향을 연구하는 데 서로 도움이 됩니다.

오가노이드 프로토콜의 한 가지 장점은 배양 과정과 세포 배양 배지의 구성이 간단하다는 것입니다. 대부분 여러 고가의 보충제 및 성장 인자 24,25,27,28,33을 추가해야 하는 다른 ASC 및 PSC 기반 프로토콜과 달리 KSFM 배지는 상대적으로 저렴합니다. 인간 재조합 상피 성장 인자(hEGF)와 소 뇌하수체 추출물(BPE)만 추가하면 됩니다. KSFM은 각질세포 배양에 최적화된 기본 배지이며 섬유아세포 공급층(34)의 필요성을 제거합니다. 오가노이드 배양에 사용되는 KSFM-C 배지를 얻기 위해서는CaCl2를 사용하여 KSFM의 Ca2+ 농도를 0.09 mM에서 0.6 mM로 적정해야 합니다. ALI 배양은 오가노이드 모델보다 1.8mM의 더 높은 Ca2+ 농도가 필요합니다. 높은 Ca2+ 농도는 각질세포 분화를 시작하는 데 필수적이며, 이후 식도 오가노이드26,34,35 내에 존재하는 다층 편평 상피의 전형적인 양파 모양 구성의 형성을 촉진하고 ALI 배양22에서 상피 층화를 촉진합니다.

조기 각질세포 분화, 오가노이드 및 ALI 배양 생성을 방지하려면 세포 분리 중 높은 Ca2+ 농도를 피해야 합니다. 조기 분화는 콜로니 형성을 감소시키고 오가노이드의 자기 조직화 형성과 ALI 배양의 기초가 되는 미분화 각질세포의 합류 단층 형성을 방해합니다. 세포 분리 중 트립신의 효소 활성을 중지하기 위해 혈청 함유 배지를 사용하는 것은 세포 분리 중 Ca2+ 농축 배지를 사용하는 것과 유사하게 조기 분화를 유발하여 성공적인 오가노이드 생성을 저해합니다36. 대신, 대두 트립신 억제제 또는 기타 무혈청 트립신 억제제를 사용하여 트립신으로 생검 소화 후 효소 반응을 중지하는 것이 좋습니다. 배양 배지는 배양 첫 2일 동안 Rho-kinase(ROCK) 억제제 Y27632를 보충하여 콜로니 형성 속도를 향상시킵니다. ROCK의 억제는 항 세포 사멸 효과가 있고 각질 형성 세포의 노화를 방지하여 오가노이드 형성 속도를 향상시킵니다37,38.

번성하는 오가노이드 배양을 보장하기 위해 40 μL의 BME 방울에 약 20,000개의 세포를 파종하는 것이 권장되며, ALI 배양을 위해 150,000 - 400,000개의 세포를 파종하는 것이 좋습니다. 적절한 세포 파종 수는 후속 transcriptomics, proteomics 및 조직학을 위한 충분한 물질을 보장합니다. 인간 식도 상피 세포주 EPC2-hTERT와 같은 세포주를 활용할 때, 이 세포주(26)에 의해 나타나는 증가된 오가노이드 형성 속도로 인해 파종 세포 수를 줄일 수 있습니다. 이러한 현상은 생검 유래 일차 세포에 비해 세포주에 의해 입증된 균질성과 우수한 세포주기 동시성에 기인하는 것으로 보입니다. 또한 불멸화된 EPC2-hTERT 세포주는 증식 능력을 보존하여 오가노이드의 무한 passaging을 가능하게 합니다.

반대로, 식도 생검에서 유래한 인간 오가노이드는 장기 배양을 위해 유지할 수 없습니다26,28. 완전히 발달된 식도 오가노이드 내에서 분열하고 생존 가능한 세포의 감소와 각 통로(26)에서 오가노이드 형성 속도의 감소는 일차 세포 유래 오가노이드에서 증식 능력의 손실이 전구 세포의 말단 분화 및 각질화에 기인한다는 것을 나타냅니다. 배양 배지에 Noggin, Wnt3a 또는 A83-01을 보충하여 증식 능력을 유지하려는 이전의 시도는 성공하지 못했습니다 26,28,32. 따라서 환자 유래 식도 오가노이드의 장기 바이오뱅킹은 향후 연구에서 해결해야 할 과제로 남아 있습니다.

오가노이드 배양의 출현은 EoE 5,39,40,41,42의 상피 변화를 일으키는 주요 염증 매개체 및 환경 요인을 발견할 수 있는 새로운 실험 가능성을 가져왔습니다. 그럼에도 불구하고 ASC 및 PSC 유래 식도 오가노이드는 식도의 모든 세포 구획을 완벽하게 재현하지 못하기 때문에 한계가 있다는 점에 유의해야 합니다. ASC 유래 오가노이드는 상피 구획(24,26,27,33)을 재배치하는 반면, PSC 유래 오가노이드는 상피, 내피 및 중간엽 구획(28,43,44)을 재현합니다. 그러나 현재의 모든 오가노이드 모델에는 면역학적 미세환경이 없습니다. 최근 연구에서 인간 식도 오가노이드와 ALI 배양은 IL-20 사이토카인 계열의 사이토카인으로 자극되어 EoE5의 상피 장벽 기능 장애의 새로운 측면을 해독했습니다. 두 3차원 배양 모델의 조합은 상피 장벽 무결성의 간접 및 직접 측정을 평가했습니다. 더 많은 간행물에서 식도 오가노이드를 ALI 배양과 함께 사용하여 상피에 대한 정의된 사이토카인의 효과를 규명할 것입니다. 이 접근법은 면역 체계와 상피 사이의 혼선의 복잡성을 줄여 상피에 대한 특정 매개체의 기능을 밝혀내지만, 잠재적으로 관련된 다른 많은 요인을 무시합니다. 오가노이드와 장기 칩(organ-on-a-chip) 기술을 결합하면 이러한 한계에 대한 솔루션을 제공할 수 있습니다. 미세유체역학 기반 장기 칩(organ-on-a-chip) 기술은 관형 장기의 내강 및 기저측 미세환경을 복제하여 면역 세포 및 기타 순환 및 발광 구성 요소의 유입 및 유출을 가능하게 할 수 있습니다. 이를 통해 항상성 및 질병에서 상피와 면역 세포 간의 상호 작용을 조사 할 수 있습니다45,46. 온전한 상피 장벽과 기능적 경상피 이온 수송을 나타내는 생리학적으로 분극화된 신장 세뇨관 오가노이드의 성공적인 배양은 장기 온 칩 플랫폼(47)에서 환자 유래 오가노이드 온 칩 기술의 확장된 사용을 지원합니다. 또한, 오가노이드-온-어-칩(organoid-on-a-chip) 기술을 활용하는 또 다른 진전은 튜브형 오가노이드의 정점 쪽에 있는 미세유체 채널을 통해 루날 흐름을 구현하여 상피 세포의 탈락을 제거함으로써 일차 세포에서 유래한 오가노이드의 확장된 배양을 통해 입증되었습니다(46). 이러한 발전은 이 기술이 체외 환경에서 체외로 복제 할 수 있는 잠재력을 강조합니다.

대부분의 세포 유형을 가진 상피 구획에서 거의 완전한 미니 장기에 이르기까지 모든 것을 유사한 3D 오가노이드를 배양할 수 있는 능력은 가능한 임상 응용 분야에 대한 필요성을 촉구합니다 5,26,46. 최근 몇 년 동안 상당한 진전이 이루어졌지만, 오가노이드를 임상 실습에 사용하기 위해서는 추가적인 장애물을 극복해야 합니다. 오가노이드의 임상적 구현에 있어 중요한 장애물은 배양 배지 및 스캐폴딩 ECM 제품에 동물 유래 단백질이 존재한다는 것입니다. 각질세포 배양을 위한 동물성 단백질이 없는 배지가 이미 사용 가능하고 BPE-free KSFM 변이체가 등장했지만, 기존 ECM 제품과 유사한 특성과 배양 결과를 가진 동물성 단백질이 없는 ECM 대체품을 생산하는 것은 더 어려워 보입니다. 최근에, 잠재적으로 유망한 완전히 화학적으로 합성된 대안이 보고되었다48. 그럼에도 불구하고 현재로서는 상업적으로 접근 가능한 동물 유래 성분이 없는 ECM 제품은 없습니다.

식도 오가노이드 및 ALI 배양은 EoE를 연구하는 데 필수적인 도구입니다. 여기에 제공된 프로토콜을 사용한 오가노이드 및 ALI 배양은 호산구성 식도염 5,26,39,41,42,49,50에서 상피 구획의 관여에 관한 새로운 밝혀의 기초가 되었습니다. 이러한 프로토콜의 간단한 구현과 3차원 세포 배양 기술의 지속적인 발전은 생체 내 환경에 대한 실험적 근사치를 용이하게 하여 발견의 번역 가능성을 높이고 동물 실험을 점진적으로 줄일 수 있습니다.

공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

SNSF가 J.H.N.에 부여한 보조금 310030_219210은 이 원고의 출판을 제한 없이 지원했다. 그림 1 은 BioRender.com 의 도움으로 만들어졌습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1250 &마이크로; L 그립팁 - 필터Integra4445
300 µ L 그립팁 - 필터Integra4435
70 µ M cell strainerSarstedt83.3945.070
Ascorbic AcidSigma-Aldrich (Merck)A4544
Bovine Pituitary extractGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
염화칼슘Sigma-Aldrich (Merck)21115
세포 배양 현탁 배양을 위한 멀티웰 플레이트 CELLSTARGreiner Bio-One7.657 185
Cultrex 기저막 추출물(BME), 유형 2, PathclearR& D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
II Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (디펜스)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE 자동 세포 계수기NanoEntekEVE-MC
EVE 세포 계수 슬라이드NanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL 원형 바닥 폴리스티렌 시험관, 세포 여과기 스냅 캡 포함Falcon352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextranSigma-Aldrich (Merck)FD4평균 mol wt 3000-5000
헤레우스 - 메가푸지  40R Thermo Fisher Scientific75004518
인간 재조합 표피 성장 인자Gibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinocyte-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
재조합 Human KGF/FGF-7 ProteinR& D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
스크류 캡 튜브, 15 mLSarstedt62.554.502
단일 채널 EVOLVE 100-1000 µ 엘 Integra3018
단일 채널 EVOLVE 20-200 &마이크로; 엘 Integra3016
Syringe 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Glycine max (대두)의 트립신 억제제Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 dihydrochlorideTocris (Bio-Techne)1254

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