본 프로토콜은 난소 조직 동결보존을 통한 가임력 보존이 필요한 25세 미만 환자의 난소 예비력을 평가하는 방법을 설명합니다. 이 방법에는 (1) 대뇌 피질 샘플의 난소 예비력에 대한 조직학적 평가, (2) 참조 데이터 세트와의 비교, (3) Z-점수 계산이 포함됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
여성은 난소 예비력이라고 하는 재생 불가능한 난소 난포 풀을 가지고 태어납니다. 이 예비력은 난소의 원시 난포로 구성되며 유전 및 내분비 장애, 의학적 개입 및 내분비 교란 인자와 같은 많은 요인의 영향을 받을 수 있습니다. 생식선 독성 치료가 필요한 경우 생식력 보존이 권장됩니다. 여성이 선호하는 옵션은 난모세포와 배아 동결 보존입니다. 그러나 매우 어리고 성적으로 미성숙한 환자에서는 난소 조직 동결 보존이 유일한 옵션입니다. 동결 보존된 조직 샘플의 여포 밀도를 아는 것은 젊은 환자를 위한 불임 상담에 필수적입니다. 이 프로토콜은 가임력 보존을 받고 있는 25세 이하의 소녀 및 젊은 여성의 난소 조직 품질을 평가하기 위한 도구로 대뇌 피질 난포 밀도에 대한 Z-점수를 사용하는 것을 보여줍니다. 환자 샘플의 난포 밀도는 표준에서 가능한 편차를 추정하기 위해 Hassan et al.이 개발한 연령 정규화 참조 표준과 비교됩니다. 난포 밀도는 조직학적 정량화를 통해 측정됩니다. 이를 위해 난소 피질 조직의 작은 조각(~2mm x 2mm x 2mm)을 Bouin's 또는 포름알데히드 용액에 고정하고 파라핀에 삽입하고 4μm 두께로 절단하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 슬라이드 스캐너를 사용하여 디지털화합니다. 피질에 존재하는 난포 단계는 원시 난포에서 원시 난포까지 다양합니다. 대뇌 피질 영역은 조직학적 섹션의 표면 상피에서 1mm였습니다. 난포 밀도는 Schmidt et al.이 제시한 수정된 공식을 사용하여 계산되며 Z-점수는 기준 평균과 표준 편차를 사용하여 결정됩니다. Z-점수는 측정된 값이 기준 평균에서 얼마나 벗어나는지를 나타내며 감소된(<-1.7 Z-점수) 난소 예비력을 결정합니다. 이 방법을 사용하면 난포 밀도는 가임력 보존이 필요한 젊은 환자를 위한 난소 예비력의 귀중한 척도로 사용할 수 있습니다.
서론
난소는 역동적이고 내분비학적으로 활동적인 기관으로, 외부 피질과 내부 수질로 구성됩니다. 난소 내에는 이질적으로 분포하는 난포가 있으며, 난포는 기질 과립 세포로 둘러싸인 생식선 난모세포를 포함하고 있습니다1. 모든 난포는 태아 발달 과정에서 이미 형성되어 재태 연령 20주경에 최고조에 달한 후 기하급수적으로 감소합니다. 출생 시 1-200만 개의 원시 난포가 피질 내에 남아 있으며, 사춘기까지 수십만 개의 난포만이 생존한다2. 난소 예비력이라고도 하는 성장하지 않는 난포 풀은 다른 요인 중에서도 여성의 생식력에 영향을 미칩니다. 난소 예비력은 피질 내에 있으며 난포가 성장하고 성숙함에 따라 수질로 이동합니다. 일부 연구자들은 난소 예비력이 원시 난포로만 구성되어 있다고 인정하는 반면, 다른 연구자들은 모든 단층 난포(즉, 원시, 중간 및 일차)를 포함하는 것으로 인식합니다3,4,5,6. 여성의 일생 동안 300-400개의 난포만이 성숙하고 살아남아 결국 배란을 겪습니다. 폐경은 난포 수가 약 1,000개로 줄어들 때 시작되며, 일반적으로 약 50세에발생합니다 2,7. 현재 이종 이식 후 난모세포를 형성할 수 있는 성인 인간 난소에 난모줄기세포(OSC)가 존재하는지에 대한 논쟁이 진행 중입니다. 일부 연구에서는 원시 생식 세포의 유전자 프로필을 발현하고 난모세포 8,9로 분화하는 세포를 분리할 것을 제안하는 반면, 다른 연구에서는 주장된 OSC가 혈관 주위 세포(10,11,12)라고 지적합니다.
조기 난소 기능 부전(premature ovarian biliciency, POI)은 40세 이전에 난포성 자극호르몬(FSH) 수치가 상승하면서 생리 주기가 중단되는 것을 말한다13. POI의 원인은 여러 요인에 의해 발생하며 특발성으로 발생할 수 있습니다. 그러나 의학적 상태의 결과로 발생하는 경우가 많다14. 예를 들어, 터너 증후군(Turner's syndrome)15과 같이 출생 시 이미 감소된 난소 예비력으로 인해 POI와 관련된 특정 선천성 유전 질환이 있습니다. POI는 또한 성선 독성 치료의 부작용으로 발생할 수 있으며, 이는 정상적인 사춘기를 겪지 못하고 난소 예비력을 급격히 손상시킬 수 있기 때문에 매우 어린 환자에게 특히 문제가 됩니다. POI의 위험과 환자의 연령에 따라 성숙한 난모세포의 동결 보존, 체외 수정 후 배아의 동결 보존, 난소 조직 동결 보존(OTC)과 같은 여러 가임력 보존 옵션을 사용할 수 있습니다. 사춘기 이전 환자의 경우, OTC는 성적 미성숙으로 인해 유일하게 실현 가능한 옵션이다16,17. 미국에서는 OTC를 통한 생식력 보존이 최근 수용 가능한 임상 루틴으로 간주되고 있다18. 그러나 OTC는 여전히 많은 유럽 국가에서 실험적인 것으로 간주되며, 특히 자가 이식에 대해서는 윤리적 승인이 필요합니다19,20. 따라서 OTC 프로토콜에 대한 포함 기준을 신중하게 고려해야 하며 각 환자에 대해 위험-편익 분석을 수행해야 합니다. 성선 독성 요법을 받는 모든 어린이가 가임력 보존을 받을 수 있는 것은 아닙니다. 스웨덴에서는 Nordic Society of Paediatric Haematology and Oncology21의 가임력 보존에 관한 지침에 따라 고위험군 또는 매우 고위험군 환자만 가임력 보존을 받을 것을 권장합니다. 이 그룹에는 (1) 줄기세포 이식이 필요하거나 난소와 함께 방사선 치료를 받는 사춘기 이전 및 사춘기 이후의 어린이와 (2) 알킬화 화학 요법의 누적 선량이 높은 사춘기 이후 어린이가 포함됩니다. 초경 이전 여아의 경우, 불임 위험이 매우 높을 수 있는 기준에는 난소에 방사선 선량>10 Gy, 동종 또는 자가 조혈모세포 요법(HSCT)으로 치료받은 경우가 포함됩니다. 제외 기준에는 수술 전에 다른 항응고제 제제를 위해 추가 혈액 제제가 필요하거나 호중구 수치가 <1인 사람이 포함됩니다. 초경 후 소녀/여성의 경우, 불임 위험이 높거나 매우 높음에 대한 포함 기준에는 난소에 대한 방사선량 >10 Gy, 동종 조혈모세포, 사이클로포스파마이드>9 g/m², 이포스파미드 >60 g/m², 프로카르바진 또는 니트로소우레아 화합물(BCNU/CCNU) >360 mg/m². 제외 기준에는 담당 의사가 평가한 출혈 위험 증가, 감염 위험 증가, 수술 합병증 위험 증가 또는 통증 문제 위험 증가가 포함됩니다.
OTC의 경우, 복부 수술 시 개복술 또는 복강경 수술을 통해 편측 난소 절제술 또는 생검을 통해 난소 조직을 채취합니다. 수집된 난소 조직에서 수질을 제거하고, 남은 피질을 더 작은 조각으로 절단하여 제어속도 동결 또는 유리화(vitrification)를 통해 냉동 보존하고 나중에 생식력 복원에 사용할 수 있도록 한다22. 그런 다음 환자는 치료에서 회복되어 가정을 꾸리기를 원할 때까지 샘플을 액체 질소에 보관합니다. 암의 종류에 따라 난소 조직 이식에 대한 금기 사항이 없는 경우, 호르몬 및 난소 기능을 회복하기 위해 조직을 해동하고 자가 이식합니다. OTC는 50%의 임신율과 성인기에 수집된 냉동 보존된 난소 조직 이식 후 200건 이상의 출산이 보고되어 성공적인 것으로 입증되었습니다 23,24,25. 어린 시절에 수집된 난소 조직의 자가이식 후 보고된 출생은 거의 없으며, 의심할 여지 없이 사춘기 이전의 난소 조직의 자가이식 후 보고된 것은 없다 26,27,28,29,30. 조직의 질은 성공적인 생식력 회복을 위한 전제 조건이다31. 따라서 수집된 조직 샘플의 품질을 연구하는 것이 필수적입니다.
현재 난소 조직의 품질을 추정하는 방법은 조직학적 절편과 난포의 수동 계수를 통해 이루어집니다. 그러나 모낭 밀도의 정상성을 평가하는 것은 나이가 증가함에 따라 예비력이 자연적으로 감소하고 난포의 불균일한 분포로 인해 어렵습니다. 또한 참조 값과의 비교는 생검 크기 및 연령에 대해 표준화되지 않았기 때문에 까다롭습니다. AMH 혈청 수치 또는 소화된 조직을 칼세인 또는 중성 적색으로 염색하는 것과 같은 다른 평가 옵션은 잘 확립되어 있지 않거나 자체적인 한계가 있습니다. Wallace와 Kelsey는 이전에 알려진 난소 병리가 없는 환자의 전체 난소에서 난포 수에 대한 데이터를 수집하여 연령에 따른 정상적인 난소 예비력 모델을 발표했습니다2. 또한, 생검이 난소 전체를 대표하지 않기 때문에 Schmidt 등은 대뇌 피질 생검을 기반으로 총 난포 수를 추정하는 방법을 개발했습니다32. 이 방법의 수정된 버전과 정상 난소 예비력 모델을 사용하여 0-25세 여성의 난포 밀도에 대한 참조 데이터 세트를 설정했습니다33.
이 기사에서는 (1) 조직학을 사용하여 난포를 직접 정량화하고 (2) Z-scores를 통해 연령 정규화된 표준 참조와 결과를 비교하여 작은 난소 샘플을 기반으로 난포 밀도의 정상성을 평가하는 전략을 설명합니다. Z-점수의 사용은 난소 biopy의 난포 밀도와 연령 및 크기 표준화 참조 그룹 평균의 관계를 설명합니다. 이는 의사가 환자에게 자가 이식 및 가임력 보존 후 추가 치료를 상담하는 데 큰 도움이 될 것입니다.
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프로토콜
수행된 모든 절차는 스웨덴 윤리 검토 기관(Sveafertil 환자, Dnr: 2019-03802) 및 헬싱키 대학 병원 윤리 위원회(HCH 환자, Dnr 340/13/03/03/2015)의 승인을 받았습니다. 연구에 대한 서면 및 구두 정보는 연구 간호사에 의해 제공되었으며 헬싱키 선언에 따라 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 18세 미만 환자의 경우 법적 보호자로부터 사전 동의를 받았습니다. 모든 샘플은 유럽 일반 데이터 보호 규정(GDPR)에 따라 가명화되어 처리되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 난소 조직 채취 및 처리
참고: 현지 지침(예: 북유럽, 유럽 또는 국제 특정 지침)에 따라 불임 위험이 높거나 매우 높을 수 있는 징후가 있는 경우 가임력 보존에 적합한 모든 환자를 식별합니다. 유럽에서는 가임력 보존 연구 프로그램의 일환으로 미성년자 환자만 모집합니다. 불임 위험을 결정하려면 해당 국가의 가임력 보존 지침을 사용하십시오.
- 전신 마취하에 수술을 수행합니다. 마취 유도를 위해 프로포폴(2mg/kg), 수펜타닐(0.5마이크로그램/kg), 브로마이드로쿠로늄(0.6mg/kg) 정맥 투여합니다.
- 6-8mL/kg의 일회 호흡량과 6-8cm의 H2O의 호기양압으로 환자를 삽관하고 인공호흡합니다. 흡입 마취를 유지하기 위해 기관내관을 통해 세보플루란을 1%에서 2%까지 전달합니다.
- 수술 중 브로마이드(0.15mg/kg)로 신경근 차단을 유지하여 적절한 근육 이완을 제공하고 더 낮은 복강 내 주입 압력에서 복강경을 사용할 수 있도록 합니다.
- 이중 스펙트럼 지수를 사용하여 마취 깊이를 안내하여 감소된 마취량으로 빠른 깨어남을 촉진합니다. sugammadex (2-4 mg / kg)로 잔류 신경근 차단을 길항합니다.
- 3포트 기법을 사용하여 배꼽의 복막강에 10mm 투관침을 삽입하여 카메라가 부착된 광학 렌즈를 삽입하고, 수술 기구 및 조직 채취를 위해 직접 시야 하에 좌우 장골 영역(위쪽 2cm, 각 전방 상장골 척추 내측 2cm)에 2개의 5mm 투관침을 삽입합니다. 양쪽 난소를 포함한 골반 장기를 검사하여 정상 상태를 확인합니다.
- 가장 쉽게 접근할 수 있는 난소를 파악한 다음 파악합니다. 난소의 약 1/3 크기(또는 윤리적 허가서에 명시된 대로)를 자른 다음 필요한 경우 지혈을 확보하기 위해 투열 요법을 사용합니다.
참고: 수술 중 또는 수술 후 과도한 출혈에 대한 위험 요인 또는 감염 위험 증가와 같은 금기 사항이 없는 경우에만 생검을 수행하십시오. 명확하게 지정하고 해당 국가의 포함 및 제외 기준을 따릅니다. 불임의 위험이 매우 높거나 일부만 절단할 위험이 너무 높다고 간주되는 경우(예: 출혈로 인해) 난소 전체를 촬영할 수 있습니다. 조직을 손상시킬 수 있으므로 샘플을 채취하기 전에 투열 요법을 사용하지 마십시오.
- 가장 쉽게 접근할 수 있는 난소를 파악한 다음 파악합니다. 난소의 약 1/3 크기(또는 윤리적 허가서에 명시된 대로)를 자른 다음 필요한 경우 지혈을 확보하기 위해 투열 요법을 사용합니다.
- 수술실에서 CaCl2, MgCl2, 1g/L D-glucose, 36mg/L 피루브산이 포함된 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS) 5mL가 들어 있는 튜브에 조직을 넣고 샘플을 실험실에서 즉시 처리하는 경우(30분 이내) 4°C로 가열하거나 장시간 운송(최대 24시간) 시 4°C로 유지합니다.
참고: 수송 솔루션에는 PBS 및 MEM34와 같은 간단한 완충액뿐만 아니라 상업적으로 이용 가능한 일련의 장기 수송/관류 용액이 포함됩니다. - 난소 표면에서 난소 조직의 작은 조각(2mm x 2mm x 2mm)을 자릅니다. 이 조각은 난소 난포가 있는 난소의 바깥 부분인 피질을 포함하고 있습니다35.
주의: Biosafety Level 2 관행 및 절차를 사용하여 난소와 같은 인체 조직을 다루십시오.
참고: 전문 생식 의학 부서는 환자의 가임력 회복에 잠재적으로 향후 사용할 수 있도록 난소 조직의 나머지 부분을 임상적으로 냉동 보존합니다. - 실온에서 350μL Bouin의 용액에 2시간 동안 또는 4°C에서 350μL의 4% 포름알데히드에 밤새 넣어 조직이 완전히 잠기도록 합니다. 배양 후 70% 에탄올로 조직을 세 번 세척합니다.
- Bouin의 용액의 경우 노란색이 사라질 때까지 씻으십시오. 조직을 파라핀 왁스36에 삽입합니다. 4μm 두께의 연속 조직 절편을 최소 30개 절단하여 유리 슬라이드에 놓습니다.
주의 : Bouin의 용액과 포름알데히드를 화학 후드 내부와 적절한 보호 장비로 처리하십시오.
알림: 포름알데히드는 조직에 수축 관련 아티팩트를 유발할 수 있습니다. 따라서 Bouin의 솔루션은 조직학을 보존하기 위해 선호되는 선택입니다. 그러나 Bouin의 솔루션에는 추가적인 위험이 있어 여러 기관에서 포름알데히드37의 사용을 선호하게 됩니다.
- Bouin의 용액의 경우 노란색이 사라질 때까지 씻으십시오. 조직을 파라핀 왁스36에 삽입합니다. 4μm 두께의 연속 조직 절편을 최소 30개 절단하여 유리 슬라이드에 놓습니다.
2. Hematoxylin 및 Eosin (H &E) 염색
- 100mL 오토클레이브 유리병에 에오신 Y 분말 5g을 칭량합니다. 800mL의 95% 에탄올과 200mL의 탈이온수를 추가하여 0.5% 에오신 원액을 만듭니다. 0.25% 에탄올 200mL의 0.5% 에오신 원액을 160mL의 100% 에탄올, 1mL의 아세트산 및 40mL의 탈이온수로 희석하여 40% 에오신 작업 용액을 준비합니다.
알림: 분말은 완전히 녹지 않을 수 있습니다. 침전물을 줄이기 위해 사용하기 전에 용액을 여과하십시오. - 슬라이드를 랙에 놓습니다. 슬라이드가 있는 랙을 크실렌에 15분, 100% 에탄올에 5분, 70% 에탄올에 10회 담그기, 50% 에탄올에 10회 담근 다음 탈이온수에 10회 담그십시오.
- 슬라이드가 있는 랙을 헤마톡실린 용액에 3분 동안 담근 다음 슬라이드가 있는 랙을 증류수가 담긴 용기에 30초 동안 옮겨 과도한 헤마톡실린 얼룩을 씻어냅니다.
- 슬라이드가 있는 랙을 분화 용액(70% 에탄올 100mL에 37% HCl 1mL를 추가)이 있는 용기에 1분 동안 넣은 다음 슬라이드가 있는 랙을 증류수 수돗물이 있는 용기로 30초 동안 옮깁니다.
알림: 조직 부분이 액체에 잠겨 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 용기에 더 많은 시약을 추가합니다. 많은 양을 염색할 때는 5회 사용 후 크실렌을 교체하십시오. 70% 에탄올을 희석하여 50% 에탄올을 제조합니다(예: 70% 에탄올 35mL를 DPBS 15mL에 추가하여 50% 에탄올 50mL를 만끽).
주의 : 후드 내부의 크실렌을 적절한 보호 장비로 다루십시오.
- 슬라이드가 있는 랙을 Scott의 수돗물(블루잉 용액이라고도 함)에 30-60초 동안 넣은 다음 슬라이드가 있는 랙을 증류수 수돗물이 담긴 용기에 30초 동안 옮깁니다. 슬라이드가 있는 랙을 eosin 작업 용액에 1분 동안 담그십시오.
- 슬라이드를 100% 에탄올로 30초 동안, 100% 에탄올이 든 두 번째 용기에 30초 동안 넣고 크실렌에 두 번 담궈 슬라이드를 탈수합니다. 크실렌 용액에서 랙을 제거한 후 후드 내부에 크실렌이 떨어지는 것을 방지하기 위해 유리 용기에서 건조시키십시오.
- 장착 용액 2방울로 슬라이드를 장착합니다. 기포가 생기지 않도록 커버 슬라이드를 조심스럽게 놓고 장착 용액을 건조시키십시오.
주의 : 후드 내부의 크실렌을 적절한 보호 장비로 다루십시오.
- 가능한 경우 슬라이드 스캐너를 사용하여 슬라이드를 스캔하여 디지털화합니다. 이 옵션을 사용할 수 없는 경우 20-40x 배율의 일반 도립 현미경을 사용하여 난포를 직접 계산합니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 면적 측정을 용이하게 하기 위해 전체 생검의 이미지를 촬영해야 합니다.
3. 여포 세기
- 슬라이드가 디지털화된 경우 적절한 소프트웨어(예: 오픈 소스 소프트웨어 QuPath38)를 사용하여 파일을 엽니다. 디지털화되지 않은 경우 도립 현미경과 해당 소프트웨어를 사용하여 직접 분석을 수행합니다.
- 파일을 QuPath의 기본 창으로 드래그합니다. 이미지 유형을 Brightfield H&E 로 설정합니다( 그림 1A 참조). 스케일 바를 사용하여 표면 상피(표면을 둘러싸고 있는 직육면체 세포의 단일 층)에서 1mm를 정의합니다. 타원 도구를 클릭하고 모낭에 주석을 답니다( 그림 1B 참조).
- 이 1mm 영역 내에 있는 원시 단계부터 1차 단계까지 난포의 수를 세십시오. 각 난포의 단계(원시 - 난모세포를 둘러싼 편평한 과립구 세포의 층, 중간 단계 - 편평한 과립세포와 직육면체 과립구 세포의 혼합물, 1차 - 난모세포를 둘러싼 직육면체 과립세포 세포의 전체 층 1개)를 확인합니다.
- 샘플 ID, 연령, 각 슬라이드에 대한 모낭 수, 단면 두께 및 계산된 n번째 단면을 Follicle Z-score 계산기 Excel 파일의 Follicle (mm3)이라는 시트에 입력합니다(보충 파일 1 및 그림 2A 참조).
참고: 모낭의 직경(가장 작은 모낭>35μm)으로 인해 동일한 모낭이 연속된 섹션에 나타날 수 있습니다. 단면 사이의 거리가 모낭 직경보다 작은 단면을 계산할 때 각별한 주의를 기울이십시오. 바람직하게는, 매 10번째 섹션(예를 들어, 섹션 #10, #20, #30)에서 모낭을 세는 것이다. 표면 상피는 조직 처리 중에 분리될 수 있으며 슬라이드에 부분적으로만 존재할 수 있습니다. 눈에 보이는 세포질이 있는 난포만 계산합니다. 품질 관리를 위해 두 사람이 독립적으로 모낭을 세고 그들의 수가 얼마나 잘 일치하는지 결정하도록 합니다. 동일한 샘플에 대한 각 관찰자의 여포 수 간의 간단한 상관 함수를 사용하여 관찰자 간 일치를 계산합니다.
- 눈으로 측정하여 계수된 각 섹션에서 가장 큰 10%의 난포를 식별합니다. 선 도구를 클릭하고 난모세포막을 통해 두 개의 수직선을 그린 다음 Measure(측정)를 선택한 다음 Show annotation measurements(주석 측정값 표시 )를 선택하여 이러한 난모세포의 평균 직경을 측정합니다( 그림 1C 참조).
- 길이 μm 컬럼 아래에 측정값을 기록합니다(그림 1D 참조). Follicle Z-score calculator Excel 파일의 각 슬라이드에 대한 평균 난모세포 직경(μm) 필드에 모든 난모세포의 평균 직경을 입력합니다(mm3의 여포, 보충 파일 1 및 그림 2A 참조).
- QuPath의 화면 중앙에 이미지를 배치한 다음 ImageJ 아이콘을 클릭합니다. 스냅샷을 ImageJ로 보내기 를 선택합니다( 그림 3A 참조). ImageJ에서 브러시 도구를 사용하여 테두리에서 1mm 간격을 둡니다. Image(이미지), Type( 유형)을 차례로 클릭하고 8비트 를 선택합니다( 그림 3B 참조).
- 선 도구를 클릭하고 화면 왼쪽 하단의 눈금 막대에 선을 그립니다(그림 3C 참조). Analyze(분석)를 클릭한 다음 Set Scale(스케일 설정)을 클릭하고 Known Distance(알려진 거리) 필드에 스케일 막대에 표시된 길이를 입력한 다음 OK(확인)를 클릭합니다(그림 3C 참조). Image(이미지)를 클릭한 다음 Adjust(조정), Brightness/Contrast(밝기/대비)를 클릭하고 Auto(자동)를 선택합니다(그림 3D 참조).
- Image(이미지)를 클릭한 다음 Adjust(조정), Threshold(임계값)를 클릭하고 Auto(자동)를 선택합니다(그림 3E 참조). 지팡이 도구를 클릭하고 영역을 선택한 다음 Ctrl + M을 누릅니다(그림 3F 참조). 면적 값을 Follicle Z-score calculator Excel 파일에 입력합니다(mm3의 여포, 보충 파일 1 및 그림 2A 참조).
4. 여포 조밀도, 대뇌 피질 부피 및 Z 점수 계산
- 제공된 Follicle Z-score 계산기 Excel 파일을 사용하여 아래에 설명된 계산을 자동으로 수행합니다. 결과는 섹션 3에 표시된 세부 정보가 "mm³의 모낭" 시트에 입력된 경우 Excel 계산기의 "Z-점수(mm³당 모낭)" 시트에 나타납니다( 보충 파일 1 참조).
- 이 섹션에서 모낭 밀도를 계산하려면 Schmidt et al.32가 제시한 수정된 공식을 사용하십시오. 먼저, 동일한 여포의 이중 계수를 설명하기 위해 보정 계수 α 적용합니다. 수정된 공식은 다음과 같습니다.
참고: 이 공식에서 t 는 단면 두께, d 는 난모세포의 직경, q 는 난포 직경을 단면 두께로 나눈 몫입니다. - 다음 공식33을 사용하여 섹션의 여포 수에서 피질의 총 여포 수(n 여포)를 외삽합니다.
참고: 이 수식은 계산되지 않은 모든 섹션도 고려합니다. 여기서, γ는 계산되지 않는 절편의 수를 나타내고(예를 들어, 매 10번째 절면이 계산되는 경우 γ = 10), α는 4.1에서 계산된 보정 계수이고, N은 계수된 단면의 수이고, ni는 계수된 단면의 총 여포 수이다.- 다음 공식33을 사용하여 계산된 영역에서 전체 피질 부피(V)를 외삽합니다.
참고: 여기서 AI(Ai)는 단면의 면적이고 TI는 조직 두께입니다. γ와 N에 대해서는 4.2단계를 확인하십시오. - 다음 공식33 을 사용하여 난포 밀도를 계산하십시오.
- 다음 공식33을 사용하여 계산된 영역에서 전체 피질 부피(V)를 외삽합니다.
- 공식33을 사용하여 Z-점수를 계산하여 감소한(<-1.7 Z-점수) 난소 예비력이 있는지 확인합니다.
참고: Z-점수는 섹션 3(모낭 계산)(그림 2B)에 제공된 정보를 기반으로 Excel 계산기(보충 파일 1 참조)의 "Z-점수(mm³당 여포)" 시트에서 자동으로 계산됩니다. 이 공식에서 Z는 Z-점수를 나타내고, x는 연구 샘플(단계 4.4)의 계산된 난포 밀도(follicles/cm3)이고, M은 각 연령 그룹의 평균 난포 밀도이고, SD는 각 연령 그룹의 표준 편차입니다. 0-25세 여성에 대한 기준값은 Hassan et al.33에 의해 확립되었습니다. 각 연령 그룹의 난포 밀도의 평균 및 표준 편차는 Follicle Z-score 계산기 Excel 파일(보충 파일 1)에서 찾을 수 있으며 Z-score 계산에 사용할 수 있습니다.
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결과
난소 난포는 슬라이드의 성공적인 절편, 염색 및 스캔 후 정량화됩니다. 난포의 다양한 단계와 건강을 구별하고 추가로 분석합니다. 그림 4A에는 성인의 Bouin 고정 난소의 HE 염색 단면이 피질 및 수질 조직의 예와 함께 표시됩니다. 그림 4B 는 표면 상피의 예와 함께 어린이의 난소의 대표적인 사진을 보여줍니다. 난소 예비력(즉, 성장하지 않는 난포 풀)과 작은 성장 난포는 피질에 있습니다. 가상 현미경을 사용하여 난포를 확대하고 분류하여 난소 예비량만 포함되도록 합니다. 그림 5 는 Bouin's-(그림 5A) 및 포름알데히드 고정(그림 5B) 난소 피질 조직에서 발견되고 계수된 난포의 단계를 나타냅니다: (1) 원시 난포(직경 약 40μm), (2) 중간, ...
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토론
여성은 보충할 수 없는 유한한 난모세포를 가지고 태어납니다. 난소 예비력은 여성의 생식 잠재력을 결정하는 핵심 요소입니다. 이 기사에서는 난포 밀도의 조직학적 정량화 방법과 젊은 환자와 최대 25세 여성의 난소 피질 난포 밀도의 Z-점수를 사용하여 참조 표준물질과 비교하는 방법을 간략하게 설명합니다.
이 프로토콜에서 난소 조직은 가임력 보존을 위해 OTC를 받는 불임 위험이 높거나 매우 높은 소녀 및 여성 또는 성전환 수술을 받는 환자로부터 얻습니다. 난소 조직의 작은 조각은 동결 보존된 물질을 평가하는 데 사용됩니다. 난소 예비력은 연령에 따라 달라지기 때문에 난포 밀도를 Z-점수로 변환하면 출생부터 성적 성숙까지 연령 정규화된 참조 값과 비교할 수 있습니다(Hassan et al.33). Z-score의 사용은 난소 예비 샘플의 정상성을 추정하기 위한 연령 표준화된 코호트 ...
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
참가자 모집 및 조직 채취에 도움을 주신 의료진과 난소 조직을 기증해 주신 모든 환자에게 감사드립니다. 우리는 또한 이 연구를 가능하게 한 소아암 기금(PR2020-0096)과 카롤린스카 연구소 박사 학위 기금 KID에 감사드립니다. 또한 조직학적 슬라이드를 준비해 준 형태학적 표현형 분석 시설에도 감사드립니다. 이 원고를 언어 편집한 Nicola Byers에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염 | Thermo Fisher | 14190144 | |
| 1x 인산염 완충 식염수 w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate | Thermo Fisher | 14287-080 | |
| 37% 염산 | Sigma-Aldrich | 1.09057.1000 | |
| 70% 에탄올 | Histolabs | 01370.01L | |
| 95% 에탄올 | Fisher scientific | 10572143 | |
| Absolute ethanol | Histolabs | 01399.01L | |
| Bouin의 솔루션 | Sigma-Aldrich | HT10132-1L | |
| Eosin Y Free acid | Sigma-Aldrich | E4009-5G | |
| 포름알데히드 | Thermo Fisher | 28908 | |
| 헤마톡실린 용액, Delafield | Sigma-Aldrich | 03971-250ML | |
| ImageJ | |||
| Microsoft Excel | |||
| 마이크로톰 | |||
| Pertex 마운팅 솔루션 | Histolabs | 00840-05 | |
| 프로포폴 | 박스터 홀딩 변환기 | 카탈로그 번호 QuPath | |
| 대신 | |||
| Rocuronium bromide | B. 브라운 멜숭겐 AG | 카탈로그 번호 대신 제공되는 M03AC09 ATC 코드 Scott | |
| 의 수돗물 대체 농축액 | Sigma-Aldrich | S5134-6x100ml | |
| Sevoflurane | Baxter Medical AB | 카탈로그 | 번호 Slide 스캐너 대신 제공되는 N01AB08 ATC 코드 |
| Sufentanil | Hameln Pharma gmbh | N01AH03 | ATC 코드 |
| 제공되는 V03AB35 | ATC 코드 | ||
| 히스톨랩& | nbsp; 06400 | ||
| SuperFrost Plus White 현미경 슬라이드 | Histolabs | 06400 | |
| 크실렌 | Saveen Werner | 131769.1611 |
참고문헌
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