방법 논문

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader(플레이트 리더를 사용한 칼슘 동원 분석으로 프로테아제 활성화 수용체의 조절인자 특성 분석)

DOI:

10.3791/66507

⸱

2024년 5월 24일

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로테아제 활성화 수용체(PAR)의 리간드를 식별하는 데 사용되는 내피 세포를 사용한 칼슘 동원 분석을 위한 개선된 프로토콜이 개발되었습니다. 새로운 프로토콜은 총 분석 시간을 90-120분 단축하고 재현 가능한 농도-반응 곡선을 생성합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 내 칼슘 농도의 변화는 세포 내, 형광, 칼슘 결합 염료 및 최대 1,536웰의 형광 방출을 동시에 측정할 수 있는 이미징 기기를 사용하여 고처리량 방식으로 빠르게 모니터링됩니다. 그러나 이러한 기기는 훨씬 더 비싸고 웰을 개별적으로 스캔하는 널리 사용되는 플레이트 리더기에 비해 유지 관리가 어려울 수 있습니다. 여기에는 칼슘 결합 염료 Fluo-4를 사용하여 Gαq 신호의 프로테아제 활성화 수용체(PAR) 주도 활성화 및 후속 칼슘 동원을 측정하기 위한 내피 세포주(EA.hy926)와 함께 사용하기 위한 최적화된 플레이트 리더 분석법이 설명되어 있습니다. 이 분석은 Dockendorff 실험실에서 확인된 알로스테릭 PAR1 표적 항염증성 "파모듈린" 리간드를 포함하여 다양한 PAR 리간드를 특성화하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 자동화된 액체 핸들러의 필요성을 없애고 96웰 플레이트에서 PAR 리간드의 중간 처리량 스크리닝을 허용하며 칼슘 동원을 시작하는 다른 수용체의 연구에 적용할 수 있어야 합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로테아제 활성화 수용체(PAR)1,2,3은 혈소판 및 내피 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 발현되는 클래스 A G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 아과입니다 4,5,6,7. 대부분의 GPCR과 달리 PAR은 고유한 분자 내 활성화 모드를 가지고 있습니다. 대부분의 GPCR은 뚜렷한 결합 포켓과 상호 작용하는 용해성 리간드에 의해 활성화되지만, PAR은 N-말단의 단백질 분해 절단에 의해 활성화되며, 그 결과 세포 표면의 세포외 루프 2 도메인과 상호 작용할 수 있는 새로운 테더 리간드가 생성됩니다 6,8,9. 이 상호 작용은 수용체를 활성화하고 여러 신호 전달 경로를 시작하여 염증 및 혈소판 활성화와 같은 효과를 촉진할 수 있습니다 4,10,11,12. 상이한 프로테아제는 N-말단의 독특한 부위에서 절단을 통해 PAR을 활성화할 수 있으며, 이는 상이한 신호 전달 경로 9,13,14,15를 시작하는 수용체 형태를 안정화하는 상이한 테더 리간드(TL)를 드러낼 수 있습니다. 예를 들어, 가장 잘 연구된 아과(subfamily)인 PAR1에서 트롬빈에 의한 절단은 혈소판 활성화 및 내피에 대한 백혈구 모집을 포함한 수많은 생물학적 과정을 지원하는 데 사용되지만, 수용체가 과발현되거나 과활성화될 때 해로운 영향을 초래할 수 있습니다 4,16,17,18,19,20,21 . 반대로, 활성 단백질 C(aPC)에 의한 절단은 항염증 효과와 내피 장벽(15,22,23,24,25,26,27,28,29)의 유지를 촉진할 수 있습니다. PARs는 또한 분자간 방식으로 TLs의 펩타이드 유사체에 의해 활성화될 수 있습니다 13,30,31. 이러한 펩타이드는 PAR 표적 프로테아제 대신 PAR 억제(조절)를 측정하는 데 일상적으로 사용되며 이 프로토콜에 사용됩니다.

패혈증22,32, 심혈관 질환 33,34,35,36,37,38, 신장 질환 39,40,41,42, 겸상 적혈구 질환43, 섬유증44, 골다공증 및 골관절염45 등 수많은 질환이 병리학적 PAR1 신호전달과 관련되어 있다,46, 신경퇴행 47,48,49,50,51, 암 52,53,54,55,56,57,58,59. PAR1의 길항제는 1990년대부터 심혈관 질환에 대한 항혈소판제로 연구되어 왔으며, 수용체와 관련된 질병 목록이 증가함에 따라 생물학적 프로브(도구 화합물) 또는 잠재적인 치료제로 사용하기 위한 새로운 리간드의 식별이 필요하게 되었습니다. 현재 FDA가 승인한 PAR1 길항제인 vorapaxar는 고위험 환자의 관상동맥 질환 치료에 사용되는 단 하나의 약물입니다 34,36,37,60. 대체 PAR1 길항제인 펩두신 PZ-128은 심장 카테터 삽입 환자의 혈전증을 예방하기 위한 성공적인 2상 연구를 완료했습니다38. Dockendorff 그룹은 parmodulins61,62로 알려진 별도의 저분자 부류인 PAR1 리간드의 의약 화학 및 약리학에 중점을 두었습니다. 보라팍사르(vorapaxar)와 같은 보고된 PAR1 길항제와 달리, 파모듈린은 PAR1의 알로스테릭(allosteric) 편향된 조절제로서, Gαq 경로를 선택적으로 차단하면서 aPC와 유사한 세포 보호 효과를 촉진합니다. 보라팍사르(vorapaxar)와 같은 강력한 오르토스테릭 PAR1 길항제와 달리, 발표된 파모듈린(parmodulins)도 가역적이다 63,64,65.

초기에, 파모듈린은 혈소판에서 P-셀렉틴 발현 또는 과립 분비를 억제하는 능력에 대해 Flaumenhaft와 동료들에 의해 확인되었다61,66. 그러나 내피 세포에 대한 파모듈린의 효과를 연구하기 위해 대체 방법이 필요했습니다. GPCR 관련 신호전달을 모니터링하는 한 가지 일반적인 방법은 적절한 세포내 칼슘 결합 염료67,68을 사용하여 측정할 수 있는 중요한 2차 전달체인 세포내 Ca2+ 동원을 측정하는 것입니다. PAR1에 의해 유도된 칼슘 동원이 Gαq69,70의 활성화를 통해 이루어진다는 것을 보여주는 상당한 증거가 제공되었습니다. 테더링된 리간드(또는 적절한 외인성 리간드)에 의해 활성화되면 PAR1은 Gαq 서브유닛에 결합된 구아노신 이인산(GDP)이 구아노신 삼인산(GTP)68로 대체되는 구조적 변화를 겪습니다. 그런 다음 Gαq 소단위는 포스파티딜이노시톨 4,5 비스포스페이트(PIP2)의 가수분해를 촉매하는 포스포리파제 Cβ(PLC-β)를 활성화하여 1,4,5-이노시톨 삼인산(IP3) 및 디아실글리세롤(DAG)을 형성합니다. 마지막으로, IP3 는 소포체의 막에서 IP3 민감성 Ca2 + 채널에 결합하여, Ca2 +가 세포질 내로 방출 될 수 있도록하고, 여기서 Fluo-4와 같은 Ca2 + 의존성 형광 염료에 결합 할 수 있으며, 이는 세포71 에 첨가됩니다. 이 과정은 몇 초 내에 발생하며 Ca2+ 100 배의 농도를 증가시켜 칼슘 결합 염료의 양에 급격한 변화와 강력한 형광 신호를 초래할 수 있습니다.

2018년 Dockendorff 그룹은 PAR172의 Gαq 경로의 길항제를 식별하는 데 사용할 수 있는 중간 처리량 Ca2+ 동원 분석을 공개했습니다. 이 분석은 PAR1 발현의 눈에 띄는 변화 없이 여러 통로에 사용할 수 있는 하이브리드 인간 내피 세포주인 EA.hy92673을 사용했으며, 세포 보호 효과의 시험관 내 측정을 위해 확립되었습니다.

원래 프로토콜은 96웰 플레이트에 EA.hy926 셀을 사용하고 488nm의 강렬한 형광과 높은 셀 투과성 때문에 선택된 Fluo-4/AM 염료를 사용했습니다. 염료가 셀에 로드되면 자동화된 8채널 액체 핸들러를 사용하여 긴 세척 단계를 수행했습니다(96채널 세척기와 같은 더 빠른 액체 처리 방법은 접근할 수 없었습니다). 이 분석의 재현성은 신중하고 자동화된 로봇 매체 변경 없이 수행된 분석보다 우수했습니다. 그런 다음 길항제를 세포와 함께 배양하고, 선택적 작용제(한 번에 16웰)를 순차적으로 추가하여 PAR1을 활성화하고, 칼슘 동원 및 염료 결합으로 인한 형광의 변화를 측정하여 활성을 측정했습니다.

이 프로토콜을 사용하면 PAR1 매개 칼슘 동원을 측정할 수 있지만 각 96웰 플레이트를 분석하는 데 필요한 시간이 제한됩니다. 긴 실험 시간은 매일 스크리닝할 수 있는 화합물의 수가 제한되어 있을 뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 염료 유출이 발생하여 기저 형광을 증가시켜 분석 범위를 좁히기 때문에 문제가 됩니다. 긴 실험 시간의 원인 중 하나는 플레이트 세척을 위해 8채널 액체 핸들러를 사용하는 것인데, 이는 각 실험에 30분 이상을 추가합니다. 필요한 팁도 공급망 문제로 인해 얻기가 어려워졌습니다. 여기에서는 액체 핸들러가 필요하지 않아 더 높은 처리량으로 실행할 수 있는 PAR 매개 칼슘 동원 분석을 위한 업데이트된 프로토콜이 보고됩니다. 이 프로토콜은 세포 내 칼슘 동원으로 이어지는 다른 GPCR과의 신호 전달을 측정하는 데에도 적합해야 합니다. 이 업데이트된 플레이트 리더 프로토콜은 고가의 세포 이미징 기기를 위한 리소스는 없지만 수많은 화합물을 신속하게 스크리닝해야 하는 학술 및 소규모 산업 실험실에 이상적입니다. 플레이트 이미저를 사용한 칼슘 동원 분석의 예는 Caers et al.74를 참조하십시오.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다음 프로토콜의 1단계와 2단계에서 이루어진 모든 매체 교환/추가는 멸균 후드에서 수행됩니다. 달리 명시되지 않는 한, 멸균 후드에 사용되는 모든 플라스틱 용기는 멸균 및 밀봉하거나 오토클레이브를 통해 적절하게 멸균해야 합니다.

1. EA.hy926 세포주 개발

  1. EA.hy926 세포를 획득합니다.
  2. 세포의 바이알을 액체 질소 탱크의 증기 상태에 보관하십시오.
  3. 먼저 DMEM, FBS 및 펜/연쇄상구균(자세한 내용은 재료 표 참조)을 37°C 수조에서 15-30분 동안 데우어 DMEM 전체 배지를 준비합니다. 500mL의 DMEM에 FBS 50mL와 펜/연쇄상구균 1mL를 추가합니다. 용액을 반전으로 부드럽게 섞습니다.
    알림: 너무 세게 섞으면 과도한 양의 거품이 발생합니다.
  4. 액체 질소에서 세포 한 바이알을 제거하고 37°C 수조에서 5분 동안 데웁니다.
  5. 세포의 바이알과 DMEM complete medium의 병에 알코올을 분사하여 살균한 다음 멸균 후드로 이동합니다.
  6. 1,000 μL 피펫을 사용하여 세포를 15 mL 멸균 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 바이알에 DMEM 1mL를 넣어 헹구고 원심분리 튜브에 넣습니다.
  7. 원심 분리기 (150 × g, 5 분, 22 ° C)를 사용하여 세포 펠릿을 만듭니다. 흡인에 의해 원심 분리기 튜브에서 매체를 제거하십시오. 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
  8. 원심분리기 튜브에 3mL의 DMEM complete medium을 추가하고 1,000μL 피펫을 사용하여 셀 현탁액을 혼합하여 펠릿을 부드럽게 분해합니다.
    알림: 너무 세게 혼합하여 기포를 일으키는 것은 세포를 활성화하거나 손상시킬 수 있으므로 피해야 합니다.
  9. 20 μL 또는 200 μL 팁이 있는 피펫을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에서 셀 현탁액 10μL와 트리판 블루 10μL를 혼합합니다. 10μL의 세포 현탁액/트리판 블루 혼합물을 혈구측정기에 넣고 세포 수를 세습니다.
    참고: 0.1-10 μL 피펫 팁을 사용하면 세포를 절단할 수 있습니다. 이 크기의 팁은 셀 현탁액을 취급하는 동안 사용해서는 안 됩니다.
  10. 10 또는 25 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 66,000 cells/mL의 밀도를 만들기 위해 세포 현탁액에 DMEM complete medium을 추가합니다. 세포 현탁액 15mL를 T-75 배양 플라스크에 피펫팅합니다. 플라스크를 북쪽에서 남쪽으로, 동쪽에서 서쪽으로 이동하여 셀 현탁액이 균일하게 분산되도록 합니다.
  11. 현미경으로 검사하여 추정한 대로 밀도가 높아질 때까지(일반적으로 4-6일 후) 세포를 배양합니다. 이 시점에서 실험에서 세포를 사용하거나(섹션 2부터 시작) 팽창을 위해 새 플라스크에 파종하여 냉동 스톡을 준비합니다(T-75 플라스크당 15mL의 완전한 배지에 1,000,000개의 세포의 권장 파종 밀도에서).
    참고: 세포는 배양 플라스크에서 최대 3주 동안 모양, 건강 상태 또는 분석에서 눈에 띄는 차이 없이 성장할 수 있습니다. 완전한 매체는 3-4일마다 교체해야 합니다.

2. 96웰 플레이트에 EA.hy926 셀 추가

참고: 하나의 합류 T-75 배양 플라스크의 세포를 사용하여 2개 또는 3개의 분석 플레이트를 준비하거나 선택적으로 최대 15개의 새로운 T-75 플라스크로 확장할 수 있습니다. 정상적인 근무일에 섹션 4 및 5의 프로토콜을 사용하여 최소 5개의 분석 플레이트를 스크리닝할 수 있습니다. 다음 지침은 하나의 분석 플레이트를 준비하고 테스트하는 방법을 설명하지만 2.2, 2.7, 2.12 및 3.2 단계를 반복하여 원하는 수의 분석 플레이트를 준비하여 추가 플레이트를 준비할 수 있습니다. 가장 일반적으로 최대 16개의 화합물로 농도 반응을 측정하기 위해 하루에 4개의 분석 플레이트를 준비하며, 이를 위해서는 융합 세포가 있는 2개의 T-75 플라스크가 필요합니다.

  1. 37°C 수조에서 15-30분 동안 DMEM 완전 배지를 데웁니다. DMEM complete medium 병에 알코올을 분사하여 멸균한 다음 멸균 후드로 옮깁니다.
  2. 멸균된 0.4% 젤라틴 용액 100μL를 뚜껑이 있는 검은색 벽, 96웰, 투명한 바닥 플레이트의 모든 웰에 추가합니다. 인큐베이터(37 °C, 5% CO2)에서 젤라틴 용액과 함께 플레이트를 30분 동안 배양합니다.
  3. 도립 현미경을 사용하여 T-75 배양 플라스크의 세포가 80-100% 합류하는지 확인합니다. 흡입을 통해 T-75 플라스크에서 DMEM complete medium을 제거합니다.
  4. 플라스크의 세포를 10mL PBS로 세척하고 플라스크를 북쪽에서 남쪽으로, 동쪽에서 서쪽으로 부드럽게 움직입니다. 흡입을 통해 플라스크에서 PBS를 제거합니다.
  5. 플라스크에 5mL의 세포 해리 용액을 넣고 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 ~12분 동안 플라스크를 배양합니다. 6분 후에 플라스크를 두드리면 해리를 촉진하는 데 도움이 됩니다.
    참고: 참조된 세포 해리제로 15분 이상 세포를 배양하면 세포가 뭉치기 시작하여 정확한 세포 수를 얻기가 더 어려워지고 분석을 방해할 수 있습니다.
  6. 5mL의 사전 예열된 DMEM complete medium을 플라스크에 넣고 세포 해리 용액/세포 현탁액에 부드럽게 섞습니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 멸균 50mL 원심분리 튜브에 추가합니다. 원심 분리기 (150 × g, 5 분, 22 ° C)를 사용하여 세포 펠릿을 만듭니다.
  7. 펠릿이 형성되는 동안 진공에 연결된 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡인을 통해 96웰 플레이트에서 젤라틴 용액을 제거합니다. 젤라틴을 제거할 때부터 용액을 도금할 준비가 될 때까지 플레이트 뚜껑을 제거합니다.
    알림: 진공에 연결된 멀티채널 피펫 또는 멸균 매니폴드를 선택적으로 사용할 수 있습니다.
  8. 진공 또는 혈청학적 피펫에 연결된 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡인하여 원심분리 튜브에서 매체를 제거합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
  9. 5 또는 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 새로운 DMEM complete medium을 원심분리 튜브에 추가합니다. DMEM complete medium을 1,000 μL 피펫 또는 5 mL 혈청학적 피펫과 혼합하여 세포 펠릿을 부드럽게 분해합니다.
    참고: 일반적으로 8밀리리터의 DMEM이 사용되지만 세포 계수를 더 쉽게 하기 위해 더 많은 양을 추가할 수 있습니다.
  10. 20 μL 또는 200 μL 팁이 있는 피펫을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에서 셀 현탁액 10μL와 트리판 블루 10μL를 혼합합니다. 10μL의 세포 현탁액/트리판 블루 혼합물을 혈구측정기에 넣고 세포 수를 세습니다.
  11. 10 또는 25 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 600,000 cells/mL의 밀도를 만들기 위해 세포 현탁액에 DMEM complete media를 추가합니다. 이렇게 하면 60,000웰 플레이트에서 96개 셀/웰의 최종 밀도를 얻을 수 있습니다(실험에 의해 최적의 밀도로 결정됨).
    참고: 일반적으로 성공적인 세포 배양은 12,000,000에서 15,000,000 사이의 세포를 산출하며, 이는 2-3개의 96웰 플레이트를 파종할 수 있습니다.
  12. 원심분리기 튜브를 부드럽게 뒤집어 세포 현탁액을 혼합하고 50mL 다중 채널 피펫 reservoir에 추가합니다. 저장소를 좌우로 부드럽게 흔들어 30초마다 저장소의 현탁액을 혼합하고 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100μL의 셀 현탁액을 추가합니다. 투명 플레이트 커버를 교체하고 멸균 후드 표면을 북쪽에서 남쪽으로, 동쪽에서 서쪽으로 밀어 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포가 고르게 분포되도록 합니다. 인큐베이터(37 °C, 5% CO2)에서 16-24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
    알림: 추가 세포 현탁액을 사용하여 추가 플레이트를 준비하거나 1.10-1.11단계를 반복하여 세포주를 계속할 수 있습니다.

3. 칼슘 동원 분석 준비

  1. 분석 시약을 준비합니다.
    1. 미세 원심분리 튜브에 프로베네시드 36mg을 첨가하고 0.6M NaOH(500μL)에 용해시켜 프로베네시드 용액(250mM, 수용액)을 제조합니다. Vortex 솔루션.
      참고 : Probenecid는 유기 이온 수송체75,76,77을 억제하여 세포 내 염료의 유지를 향상시킵니다.
    2. HBSS-HEPES 분석 완충액을 만들려면 Ca/Mg/페놀 적색 무함유 HBSS 500mL 병에 HEPES(1.19g)를 추가합니다(HEPES 10mM 용액 제조). 완충액에 MgCl2 (1 M 수용액, 500 μL) 및 CaCl2 (1 M 수용액, 500 μL)를 보충합니다. 용액을 섞어 사용하지 않을 때는 5°C의 냉장고에 보관하십시오.
      1. 각 96웰 플레이트에 대해 50mL의 HBSS-HEPES 분석 완충액 을 50mL 원심분리 튜브에 추가하고 500μL의 프로브네시드 용액을 보충하고 잘 혼합합니다. 사용하기 전에 버퍼를 실온으로 데우십시오.
    3. Pluronic F-127(20mg)을 마이크로 원심분리기 튜브 또는 HPLC 바이알에 첨가하고 200μL의 DMSO로 용해시켜 DMSO에서 10% Pluronic F-127 용액을 만듭니다.
      알림: 이 용액은 실온에서 보관할 수 있으며 약 30개의 플레이트에 충분합니다. Pluronic F-127은 실온에서 매우 천천히 용해되며 용해를 용이하게 하기 위해 부드럽게 가열해야 합니다.
    4. 먼저 Fluo-4/AM(50μg) 바이알에 24μL의 DMSO를 첨가하여 염료를 용해시켜 염료 로딩 버퍼 를 준비합니다. 호일로 감싼 15mL 원심분리 튜브에 6mL의 HBSS-HEPES 분석 완충액 을 넣고 6μL의 10% Pluronic F-127 및 6μL의 Fluo-4/AM 용액을 보충합니다. 용액을 잠시 소용돌이치고 빛이 없는 실온에서 10분 동안 그대로 두십시오.
      참고: Fluo-4의 광표백을 방지하려면 염료 용액이 들어 있는 원심분리기 튜브와 분석 플레이트의 뚜껑 주위에 알루미늄 호일을 감아 염료를 빛으로부터 보호하십시오.
  2. 분석 플레이트를 준비합니다.
    1. 인큐베이터에서 분석 플레이트를 제거하고 도립 현미경을 사용하여 밀도를 확인합니다. DMEM complete media를 싱크대에 튕겨 넣고 종이 타월로 플레이트 상단을 닦아 수동으로 제거합니다.
      알림: 플레이트를 수평으로 잡고 튕긴 후 플레이트를 180° 회전시키고 반복하면 매체가 충분히 제거됩니다.
    2. HBSS-HEPES 분석 완충액과 프로브네시드 용액을 50mL 멀티채널 피펫 용매 저장소에 추가합니다.
      알림: 이 용액은 이후 세탁 단계에 사용되며 필요할 때까지 따로 보관하고 알루미늄 호일로 덮어야 합니다.
    3. 다중 채널 피펫을 사용하여 100μL의 HBSS-HEPES 분석 완충액과 프로베네시드 용액 을 각 웰에 추가하고 세포가 프로베네시드가 있는 상태에서 5분 동안 그대로 두십시오. 3.2.1단계와 동일한 방식으로 싱크대에 밀어 넣어 HBSS-HEPES 분석 완충액을 제거합니다.
    4. 염료 로딩 버퍼를 별도의 50mL 멀티채널 피펫 용매 저장소에 추가합니다. 50 μL의 염료 로딩 버퍼를 멀티 채널 피펫을 사용하여 분석 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 45분(37°C, 5% CO2) 동안 배양합니다.
    5. 플레이트가 인큐베이터에 있는 동안 작용제/길항제 용액을 준비합니다.
      1. 길항제 용액은 DMSO에 31.6mM 용액으로 저장됩니다. PCR 튜브에서 원액 2μL를 0.1% BSA/물 38μL로 희석하여 1.58mM 용액을 얻습니다. 이 용액 2μL는 분석 플레이트에서 최종 농도 31.6μM를 제공합니다. 1.58mM 길항제 용액 4μL를 5% DMSO/물 36μL(BSA 첨가 없음)로 희석하고 연속 희석을 통해 나머지 농도를 준비합니다.
      2. HBSS-HEPES 분석 완충액에 TFLLRN-NH2의 108.3μM(16.7x) 용액을 준비하며, 이는 분석 플레이트의 각 웰에 6μL를 추가할 때 6.5μM의 최종 농도를 제공합니다. 예를 들어, TFLLRN-NH2의 부분 표본 2mg을 5.244mL의 HBSS-HEPES 분석 완충액과 용해시켜 0.5mM 원액을 얻을 수 있습니다. 이 용액 1.083mL와 HBSS-HEPES 분석 완충액 3.917mL를 혼합하여 108.3μM 용액을 만듭니다.
        참고: TFLLRN-NH2 용액은 사용하지 않을 때 -20°C 냉동고에 보관해야 합니다.
    6. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 적절한 설정에서 형광 현미경을 사용하여 염료가 흡수되도록 합니다(일반적으로 녹색 형광 단백질의 경우, Fluo-4가 세포에 성공적으로 로드된 예는 그림 1 참조). 3.2.1단계와 동일한 방식으로 플레이트를 튕겨 염료 로딩 버퍼를 제거합니다.
    7. 각 웰에서 50μL의 HBSS-HEPES 분석 완충액과 프로브네시드 용액 (3.2.3단계에서)으로 세포를 2회 세척합니다(배지를 싱크대에 튕겨 제거).
    8. 각 웰에 92μL의 HBSS-HEPES 분석 완충액을 추가하고 형광 현미경으로 세포를 다시 관찰하여 과도한 염료가 완전히 제거되었고 세포가 부착된 상태로 유지되는지 확인합니다.
    9. 다중 채널 피펫을 사용하여 2μL의 길항제 용액과 차량을 적절한 웰에 추가합니다(대표적인 플레이트 맵은 표 1 참조).

4. 칼슘 동원 분석 수행

  1. 플레이트 리더를 다음과 같이 설정하십시오: 온도: 37 °C; 여기 파장: 485 nm; 방출 파장 : 525 nm; 측정 높이: 7.8mm(최적화됨); 깜박임 횟수: 100; 반복 횟수 : 20.
  2. 37°C의 플레이트 리더에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다. 열 1과 2에서 배경 형광을 측정합니다(웰당 5회 스캔).
  3. 플레이트 리더에서 플레이트를 배출하고 다중 채널 피펫을 사용하여 8-튜브 PCR 스트립에서 열 1 및 2의 각 웰에 6μL의 작용제 용액을 빠르게 추가합니다.
    참고: 이 단계에서는 0.1-10 μL 피펫 팁이 있는 전동 8채널 피펫을 사용합니다.
  4. 세포에서 칼슘 동원이 발생할 때 형광의 변화를 측정합니다. 위의 설정에 따라 각 웰을 20회 스캔합니다.
    참고: 두 개의 열로 각각 20번씩 각 웰을 스캔하는 데 약 5분이 걸립니다(즉, 각 웰 스캔 사이에 ~15초).
  5. 3-12열에 대해 4.2-4.4단계를 두 열씩 반복합니다.

5. 데이터 분석

  1. 분석의 데이터를 각 2열 그룹에 대한 별도의 스프레드시트로 내보냅니다.
  2. AVG(first scan: last scan) 함수를 사용하여 기초 형광 판독값의 평균을 구합니다. 두 열의 모든 웰에 대해 이 작업을 수행합니다.
  3. 작용제 첨가 후 최대 형광을 MAX (first scan: last scan) 함수를 사용하여 구합니다.
  4. 최대 형광에서 기저 형광을 빼서 형광의 변화를 계산합니다.
  5. 동일한 열의 각 웰에서 음성 대조군(작용제 없이 차량 추가)에 대해 계산된 형광의 변화를 뺍니다.
  6. 각 웰의 형광 변화를 차량 내 형광 변화(0.1% DMSO/물) + 6.5 μM TFLLRN-NH2 웰로 나누어 형광의 상대적(정규화된) 변화를 찾습니다.
  7. 비제어 값을 백분율로 복사하여 통계 및 그래프 작성 소프트웨어 프로그램에 복사합니다. 참조된 소프트웨어를 사용하는 경우 숫자를 X축으로 선택한 XY 테이블 옵션을 선택하고 나란히 있는 하위 열의 값을 Y축으로 복제합니다.
  8. 이 프로그램을 사용하여 데이터에서 농도-반응 곡선(CRC)을 플롯합니다. 참조된 소프트웨어를 사용하는 경우 log(inhibitor) vs. response - Variable slope (four parameter) 옵션을 선택합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 분석의 목적은 일반적으로 3-4개의 새로운 파모듈린에 대한 농도-반응 곡선(CRC)을 생성하는 것입니다. 각 분석 플레이트에서 NRD-21과 같은 알려진 화합물에 대한 추가 CRC가 종종 생성되며, 이는 알려진 IC50으로 인해 실험에 대한 품질 검사 역할을 합니다. CRC를 생성하려면 표 1 에 표시된 것과 같은 플레이트 맵을 계획해야 합니다. 대신 단일 포인트 농도 반응이 필요한 경우 10μM 최종 농도(또는 기타 선호 농도)의 화합물을 최소 3개의 웰에 추가해야 합니다.

분석을 수행할 때 플레이트 리더에 의해 표시되는 형광이 빠르게 증가해야 합니다(증가는 처음 3-4회 스캔 내에서 시작되어야 함). 플레이트 리더가 형광의 증가를 정확하게 포착할 수 있도록 작용제를 빠르게(15초 이내) 추가해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 실제 실험에서 차량 웰의 형광 신호는 평평하게 유지되어야 하는 반면, 포지티브 컨트롤 웰(차량 + 6.5 μM TFLLRN-NH2)의 형광 신호는 3회 또는 4회 스캔 후에 증가하기 시작해야 합니다. 최대값에 도달하면(~10회 스캔 후) 형광 신호가 천천히 감소하기 시작해야 합니다. 매우 효과적인 길항제에 대한 실험에서 길항제 농도가 가장 높은 우물은 음성 대조군과 유사하게 상대적으로 평평하게 유지되는 신호를 가져야 합니다. 또한 양성 대조군의 신호와 길항제의 농도가 낮은 우물의 신호 사이에는 거의 차이가 없어야 합니다(그림 2C). 가장 낮은 농도의 길항제가 여전히 칼슘 동원을 억제하는 경우, 더 낮은 농도를 포함하도록 선별된 농도를 조정해야 합니다. 생성된 CRC에는 곡선의 시그모이드 특성을 완전히 보여주기 위해 하나 이상의 데이터 포인트~100%가 있어야 합니다.

실험이 효과가 없었다는 가장 흔한 징후는 포지티브 대조군(vehicle + 6.5 μM TFLLRN-NH2)에서 형광이 크게 증가하지 않는 경우입니다(그림 2B). 이는 다양한 이유로 발생할 수 있습니다: 세포 수가 적거나(밀도가 확인되지 않은 경우), 작용제 용액이 손상되었을 수 있거나, 세포가 부적절한 양의 염료를 흡수했을 수 있습니다. 특정 우물에 작용제를 실수로 추가하지 않을 수도 있습니다.

프로그래밍된 방법을 사용하면 데이터가 6개의 개별 스프레드시트로 출력되며, 각 스프레드시트에는 2개의 열에 대한 데이터가 포함됩니다. 기저 형광의 5개 스캔은 자체 행에 있으며, 바로 아래 행에 작용제를 추가한 후 20개의 스캔이 수행됩니다(대표 출력은 그림 3 참조). 계산 예의 경우 NRD-21을 사용한 실험의 열이 사용됩니다. 내보낸 파일(그림 3)에서 각 웰의 기저 형광은 C에서 G열로 출력되고 작용제 첨가(다음 20회 스캔) 후의 데이터는 후속 행의 C에서 V열로 출력됩니다. 파일의 14-17행에는 두 개의 개별 열에 대한 포지티브 제어가 포함되어 있습니다. 포지티브 컨트롤 웰 중 하나에 대한 기저 행의 평균은 1,039.8의 값을 제공하는 "=AVERAGE(C16:G16)" 명령을 사용하여 계산되었습니다. 이 명령은 각 웰의 추가 기초 측정에 대해 반복되었습니다. 실험적 스캔의 최대값은 2,629의 값을 제공하는 "=MAX(C16:V16)" 명령을 사용하여 계산되었습니다. 다시 말하지만, 그 명령은 모든 우물에 대해 반복되었습니다. 그런 다음 각 웰에 대한 기저 형광을 최대값에서 뺐습니다. 이 실험에서는 각 웰의 음성 대조군에서 형광 변화를 빼서 데이터를 정규화했습니다(예제 열에서는 142.6). 그런 다음 이 값을 포지티브 대조군의 유사하게 계산된 값으로 나눴습니다. 이 열에서 최대값은 2,629, 평균 기초 측정값은 1,039.8, 공백에서 뺀 값은 142.6입니다. 따라서 조정된 포지티브 컨트롤 값은 1,446.6(방정식에서 계산)입니다. 이 방정식은 열의 각 웰에 대해 반복되며 계산된 값을 1,446.6으로 나누어 형광의 상대적 변화를 제공합니다. 그런 다음 비율을 백분율로 변환하여 분석 소프트웨어에 복사했습니다. 이 프로세스는 다른 11개 열에 대해 반복되었습니다.

참조된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하려면 나란히 있는 열에 세 번의 반복 측정을 포함할 수 있는 옵션과 함께 XY 테이블을 선택해야 합니다. 각 농도의 -log 값은 x-값에 입력되어야 하며 계산된 백분율은 y-값에 추가되어야 합니다. 데이터에 대해 비선형 회귀 분석을 수행해야 하며, 이로 인해 4개의 농도-반응 곡선이 생성됩니다. 이 프로그램은 또한 IC50 값, 정량화된 오류 통계량 및 적합도 통계량을 출력합니다.

figure-results-1
그림 1: EA.hy926 셀에 로드된 Fluo-4/AM. Fluo-4는 염료 배양 및 세척 단계 후 EA.hy926 세포에 선택적으로 로드됩니다. 모든 형광은 염료 누출 없이 세포 내에 있습니다. EVOS 세포 이미저의 GTP 설정과 20배 배율을 사용하여 얻은 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 분석의 잠재적 출력. (A) 작업 분석의 대표 플레이트 리더 출력. A행은 음극 대조군이며 형광에 변화가 없습니다. B행은 양성 대조군이며 형광의 급격한 증가를 보여줍니다. 행 C-H는 플레이트에서 더 낮은 파모듈린 농도가 높은 실험용 웰입니다. (B) 실패한 실험의 출력 예. 양성 대조군인 B행에서는 형광의 증가가 보이지 않습니다. (C) PAR1 작용제 TFLLRN-NH2에 의해 유도된 시간 경과에 따른 형광 변화. 제공된 설정을 사용하여 96웰 플레이트의 두 컬럼을 스캔하는 데 PerkinElmer EnSpire 플레이트 리더에서 ~5분이 걸립니다(즉, 각 웰 스캔 사이에 ~15초). 다른 NRD-21 용액은 표시된 바와 같이 "작용제"는 6.5 μM TFLLRN-NH2, n = 1입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 작업 분석에 대한 Excel 출력의 예. 기저 형광은 10행에서 시작하여 짝수 행으로 출력되며, 작용제 첨가 후 처음 10개 스캔의 결과는 후속 홀수 행에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 로봇 액체 핸들링과 "플릭". 분석 플레이트를 젤라틴으로 사전 코팅하고 플레이트를 튕기고 말리는 방식으로 배지 교환을 수동으로 수행하면 변동성이 낮은 농도-반응 곡선이 생성됩니다. (A) 파모듈린 ML161 및 NRD-21 및 5μM TFLLRN-NH2, n = 3(자동 액체 처리)의 농도-반응 곡선. (B) parmodulins ML161 및 NRD-21 및 5μM TFLLRN-NH2, n = 3(젤라틴 코팅, 플릭 플레이트)의 농도-반응 곡선. 데이터는 SEM± 수단입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 온도 연구. 37°C에서 분석을 수행하면 실온에서보다 더 많은 재현성 있는 데이터가 생성됩니다. (A) ML161 및 5μM TFLLRN-NH2, n = 3(실온)의 농도-반응 곡선. (B) ML161 및 5μM TFLLRN-NH2의 농도-반응 곡선, n = 3(37°C). 데이터는 SEM± 수단입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 세포 밀도 연구. 최적의 세포 밀도는 분석을 시작하기 16-24시간 전에 파종할 때 60,000 cells/well입니다. (A) 다른 세포 밀도에서 TFLLRN-NH2 의 농도-반응 곡선, n = 3. (B) 60,000 cells/well의 최적 세포 밀도에서 TFLLRN-NH2 의 농도-반응 곡선. 데이터는 SEM± 수단입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 분석 부피. 100 μL의 분석 부피를 사용하면 200 μL의 최종 부피를 사용하는 분석보다 더 재현 가능한 농도-반응 곡선이 생성됩니다. (A) ML161 및 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (200 μL 최종 부피)의 농도-반응 곡선. (B) ML161 및 5μM TFLLRN-NH2, n = 3(100μL 최종 부피)의 농도-반응 곡선. 데이터는 SEM± 수단입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-8
그림 8: 히트 화합물을 검출하는 분석의 능력을 결정하기 위한 Z' 인자 생성. 6.5μM TFLLRN-NH2 (B열)와 선택적 PAR1 길항제인 10μM NRD-21(C열) 또는 0.316μM vorapaxar(D열)를 사용한 칼슘 동원 반응. (A) 세포 파종 후 16시간 후에 분석이 완료되었습니다. (B) 세포 파종 후 24시간 후에 분석이 완료되었습니다. (C) 다음 방정식을 사용하여 계산된 Z'-계수 표: figure-results-9여기서 σp 는 양성 대조군의 표준 편차이σn 은 음성 대조군 또는 샘플의 표준 편차이μp 는 양성 대조군의 평균이고 μn 은 음성 대조군 또는 샘플의 평균입니다. 각 값은 vehicle + 6.5 μM TFLLRN-NH2 를 양성 대조군으로 지정하고 표시된 조건과 음성 대조군(차량) 또는 샘플(NRD-21 및 vorapaxar)로 비교하여 계산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-10
그림 9: PAR2 작용제의 칼슘 동원. 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4에 의해 유도된 시간 경과에 따른 형광 변화. 데이터는 SEM± 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 화합물 스크리닝을 위한 96웰 플레이트 맵의 예. 각 농도는 삼중으로 측정됩니다. 행 A에는 음성 대조군(길항제 없음, 작용제 없음)이 포함되고 행 B에는 양성 대조군(길항제 없음, 작용제 없음)이 포함됩니다. 1열에서 3열에는 품질 관리에 선택적으로 사용할 수 있는 파모듈린 NRD-21의 6개의 하프 로그 농도가 포함되어 있습니다. PM-A, PM-B, PM-C는 명명되지 않은 파모듈린입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 이전에 발표된 프로토콜과 새롭고 최적화된 프로토콜 비교. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이전에 보고된 프로토콜72는 일반적으로 신뢰할 수 있었고 새로운 리드 파모듈린을 식별할 수 있었지만 NRD-21,62는 보다 효율적인 프로토콜이 필요했습니다. 이 분석은 COVID-19 전염병으로 인한 공급 부족 기간 동안 더욱 손상되었습니다. 자동 액체 핸들러에 대한 팁을 확보하는 것이 어려워졌고 팁을 세척, 멸균 및 재사용하려고 시도하면 상당한 변동이 있는 CRC가 생성되었습니다. 이를 통해 개선된 PAR 기반 칼슘 동원 분석을 간소화하기 위해 고안된 일련의 긴급 실험을 용이하게 했습니다.

세척 단계를 위한 자동 액체 처리기 사용에 대한 유효한 대안을 식별하는 것이 이 연구의 주요 우선 순위였습니다. 이전 분석 개발 중에는 로봇 액체 핸들러를 사용하여 수동 매체 교환으로 인한 오류를 줄였습니다. 그러나 8채널 액체 핸들러와의 매체 교환으로 각 분석 플레이트의 총 시간이 30-45분 증가했기 때문에 분석에 상당한 시간이 추가되었습니다. 매체 교환의 "튕기는" 방법이 이전에 시도되었지만, 이러한 실험은 세포 파종 전에 분석 플레이트를 젤라틴으로 코팅하지 않고 수행되었습니다. 플레이트를 젤라틴으로 전처리함으로써 세포가 배지를 수동으로 제거하는 데 사용되는 힘에 관계없이 제자리에 유지되도록 보장했습니다. 젤라틴 코팅된 플릭 플레이트를 사용한 분석에서 생성된 CRC는 자동화된 액체 핸들러가 사용된 곡선보다 여러 데이터 포인트에서 더 나은 적합도 점수와 더 작은 오차 막대를 가졌습니다(그림 4). 자동 액체 핸들러를 사용한 플레이트의 RMSE(제곱 평균 오차) 값은 ML161 곡선의 경우 9.687, NRD-21 곡선의 경우 10.690인 반면, 젤라틴과 수동 매체 교환을 사용한 플레이트의 RMSE 값은 ML161 곡선의 경우 7.658, NRD-21 곡선의 경우 6.408이었습니다. RMSE 값이 낮을수록 지정된 데이터에 더 잘 맞는 곡선을 나타냅니다. 이 변경은 또한 총 분석 시간을 크게 줄입니다. 또는 다중 채널 자동 플레이트 세척기를 사용할 수 있습니다.

작용제 첨가 방법은 연구 된 추가 요인이었습니다. 이것은 작용제를 모든 플레이트 웰에 동시에 추가할 수 있는지 확인한 후 전체 플레이트를 한 번에 스캔할 수 있는지 확인하기 위해 수행되었습니다. 이렇게 하면 연구원이 수많은 개별 작용제 추가에 대해 시간에 민감한 분석 기간 동안 플레이트 리더 근처에 머물 필요가 없어져 처리량이 크게 증가할 수 있습니다. 안타깝게도 모든 웰에 작용제를 추가하고 플레이트 전체를 스캔하는 것은 반응이 너무 빨라 모든 웰의 일시적인 최대 칼슘 농도를 안정적으로 측정할 수 없어 매우 가변적인 CRC를 제공하기 때문에 문제가 있었습니다. 스캔하는 컬럼 수를 12개에서 6개로 줄이면 결과가 약간 개선되었지만 한 번에 두 개의 컬럼(16웰)만 스캔할 때 최상의 결과가 생성되었습니다. 분석 온도를 37°C에서 실온으로 낮추면 칼슘 농도의 변화를 충분히 늦출 수 있어 신뢰할 수 있는 측정이 가능할 수 있다는 가설을 세울 수 있습니다. 다양한 염료 또는 세포주를 사용한 여러 칼슘 동원 프로토콜이 실온78,79에서 검증되었지만, 이 특정 분석에서는 37°C에서 개선된 결과가 관찰됩니다. 실온(~23°C)에서 측정된 길항제 농도-반응 곡선은 37°C에서만큼 균일하지 않았습니다(그림 5A 대 그림 5B). 이러한 결과로 인해 37°C에서 한 번에 두 개의 컬럼을 스캔하는 것이 최적이라는 것이 확인되었습니다.

분석 시간을 줄이기 위해 면밀히 조사한 또 다른 변수는 길항제 배양 시간이었습니다. 이전 프로토콜에서는 길항제를 작용제를 첨가하기 전에 40분 동안 배양했지만, 여기서는 15분이 파모듈린이 PAR1과 상호 작용하기에 충분한 시간이라고 결정되었습니다. 이것은 파모듈린 용액을 동시에 여러 컬럼에 첨가한 후 서로 다른 시점에 작용제를 첨가하여 테스트했습니다(작용제는 t = 15분, 30분 및 45분에 추가되었습니다). 파모듈린(parmodulins)의 활성은 유지되었지만, 길항제를 더 오래 배양함으로써 개선되지는 않았다. 이 발견의 결과로, 새로운 프로토콜에서는 길항제 용액을 한 번에 전체 플레이트에 첨가하고, 작용제 용액을 15분 배양 후 첫 번째 컬럼에 첨가합니다. 이 변경으로 총 실험 시간이 30분 더 단축됩니다. vorapaxar와 같은 느린 결합 역학을 가진 길항제는 더 긴 배양 시간80,81을 필요로 할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.

분석 시간을 단축하고 액체 핸들러에 대한 의존도를 없애는 것이 분석 프로토콜에 대한 업데이트가 필요한 주요 요인이었지만 대체 세포 배양 방법도 테스트되었습니다. 이전에는 냉동 재고에서 직접 세포로 플레이트를 파종하고 파종 후 40-48시간 동안 플레이트에서 자랄 수 있었습니다. 그러나 플레이트의 파종과 분석 수행 사이의 시간이 길어지면서 매주 수행할 수 있는 실험 횟수가 제한되었습니다. 배양 플라스크에서 성장한 세포를 사용하면 이 시간을 크게 줄일 수 있습니다. 세포를 조직 배양 처리된 T-75 플라스크에서 성장시키고, 비효소적 세포 해리제를 사용하여 플라스크 표면으로부터 제거하였다. 이는 트립신으로 인해 특정 세포 표면 수용체, 특히 PAR2가 손상되는 것을 방지하는 데 중요할 수 있습니다. 분석 플레이트에 추가되면 세포가 안정화되고 젤라틴에 달라붙는 데 충분한 시간이 필요합니다. 매체 제거의 튕김 방법도 세포를 변위시킬 수 있기 때문에 세포가 젤라틴에 포매될 수 있도록 충분한 시간이 필요합니다. 세포를 2시간 동안 가라앉히는 실험은 세포의 상당한 손실을 일으켜 사용할 수 없는 분석(데이터 표시되지 않음)을 초래했습니다. 2시간에서 12시간 사이의 안정화 시간은 하루에 분석할 수 있는 플레이트의 수를 제한하므로 더 긴 야간 배양이 선호됩니다. 16 시간에서 24 시간 사이의 어느 곳에서나 새로 배양 된 세포를 배양하면 세포가 젤라틴에 완전히 달라 붙을 수 있으며 재현 가능한 데이터를 얻을 수 있음이 밝혀졌습니다.

냉동 세포에서 배양 플라스크 성장 세포로 변경하면 최적의 세포 파종 밀도도 변경되었습니다. 예상대로 이전 프로토콜에서 표준이었던 25,000 cells/well 밀도의 seeding well은 세포가 더 짧은 배양 시간으로 밀도에 도달하는 것을 허용하지 않았습니다. 작용제 CRC는 최적의 조건을 결정하기 위해 8개의 개별 세포 밀도로 생성되었습니다(그림 6). 이전에는 TFLLRN-NH2를 5μM에서 PAR1 작용제로 사용했는데, 이는 용해도가 낮은 파모듈린으로 합리적인 길항작용을 허용했기 때문입니다. 45,000-65,000 cells/well로 seeding할 때 배경 또는 최대 신호에는 큰 차이가 없지만 60,000 cells/well을 추가할 때 5 μM TFLLRN-NH2에서 변동성이 감소합니다. 흥미롭게도, 세포 수가 많을수록 최대 형광이 크게 증가하지 않기 때문에 변동성이 감소하여 60,000 cells/well이 최적의 밀도로 선택되었습니다. 작용제 CRC는 또한 TFLLRN-NH2에 대해 6.5μM의 EC50을 생성했기 때문에 이것이 새로운 표준 작용제 농도로 선택되었습니다.

분석된 또 다른 요인은 분석에 사용된 부피였습니다. 이전 프로토콜에서는 각 웰에 2μL의 작용제를 첨가하여 200μL의 최종 분석 부피를 얻었습니다. 더 많은 양의 작용제 용액을 추가하되 최종 농도를 일정하게 유지하면 혼합에 도움이 되어 더 빠르고 신뢰할 수 있는 신호를 유발할 수 있다는 가설이 세워졌습니다. 이 가설을 테스트하기 위해 다양한 농도의 NRD-21을 포함하는 분석 플레이트에서 2μL, 6μL 및 10μL TFLLRN-NH2 를 100μL 또는 200μL의 HEPES-HBSS에 첨가하는 방법을 비교했습니다. 각 조건에서 NRD-21의 CRC를 생성하여 작용제 부피와 최종 분석 부피의 어떤 조합이 가장 일관된 데이터를 제공하는지 확인했습니다. 2 μL 및 6 μL 첨가 모두 변동성이 거의 없는 CRC를 생성했지만, 10 μL TFLLRN-NH2 첨가로 생성된 곡선에 대해서는 동일하게 말할 수 없었습니다(데이터 표시 안 됨). 형광의 증가는 이러한 웰에서 크기나 타이밍에 일관되지 않았으며, 이로 인해 동일해야 하지만 대신 크게 다른 CRC가 생성됩니다. 2 μL 및 6 μL 첨가도 유사한 결과를 얻었지만, 6 μL의 TFLLRN-NH2를 첨가하면 형광의 변화가 훨씬 더 빨리 발생하여 각 웰의 총 스캔 수를 40 스캔에서 20 스캔으로 절반으로 줄일 수 있었습니다. 또한 100μL의 최종 부피를 사용하면 200μL의 최종 부피로 생성된 CRC에 비해 더 균일한 CRC가 생성되는 것으로 확인되었습니다(그림 7).

새로운 프로토콜이 더 높은 처리량의 분석에 적합한지 확인하기 위해 분석에 대한 Z' 인자를 계산했습니다(그림 8). Z' 인자는 스크리닝 분석의 품질을 측정하는 통계적 방법이며, 분석이 활성 및 비활성 화합물을 신뢰성 있게 구별할 수 있는지를 결정한다(82). Z' 인자는 파종 플레이트 후 16시간 및 24시간 사이에 수행된 분석과 다른 세포 통로에서 수행된 분석에 대해 계산되었습니다. 모든 경우에서—작용제만 및 작용제와 길항제 모드 모두에서—계산된 Z' 인자는 0.5보다 컸으며, 이는 우수한 분석법82를 나타낸다. 또한 계산된 Z' 인자는 이전 분석에서 계산된 것과 유사했으며, 이는 더 빠른 분석을 생성하기 위해 프로토콜에 대한 변경 사항이 품질에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다.

PAR 기반 칼슘 동원을 위한 프로토콜은 CRC에서 IC50 값을 생성하는 실험을 통해 업데이트되었지만, 이 분석은 단일 농도에서 PAR1 길항제의 효능을 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 분석은 PAR2 리간드의 활성을 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, PAR2 작용제 SLIGKV-NH2 는 업데이트된 프로토콜에서 TFLLRN-NH2 를 대체할 수 있습니다(그림 9). 이전 프로토콜은 PAR2 작용제 및 길항제(83)와 함께 사용되었다. 여기에서 명시적으로 테스트되지는 않았지만 이 프로토콜은 이전 프로토콜과 함께 사용된 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells) 및 잠재적으로 다른 부착 세포주에도 적용할 수 있어야 합니다. 이와 같은 프로토콜과 함께 스캐닝 플레이트 리더를 사용하는 경우의 제한 사항은 빠른(초 미만) 응답을 연구하는 데 적합하지 않다는 것이며, 적어도 플레이트 이미저로 가능한 것처럼 병렬로 연구해서는 안 됩니다.

결론적으로, 여기에 보고된 것은 플레이트 리더를 사용하는 내피 PAR-driven 칼슘 동원 분석을 위한 더 빠르고 간단한 프로토콜입니다. 자동화된 액체 핸들러의 필요성을 없애고, 길항제 배양 시간을 줄이고, 각 웰에 대한 스캔 횟수를 줄임으로써 총 분석 시간이 최소 90-120분 단축되고 분석 비용이 절감되었습니다(이전에 보고된 프로토콜과 현재 프로토콜 간의 비교는 표 2 참조). 이를 통해 매일 더 많은 화합물을 스크리닝할 수 있을 뿐만 아니라 염료 유출로 인한 분석 창 감소의 위험을 제거할 수 있으며, 이는 신뢰할 수 없는 결과로 이어질 수 있습니다. 새롭게 최적화된 분석을 통해 플레이트 리더 사용이 제한된 실험실에서 PAR1 또는 PAR2 리간드 또는 세포 내 칼슘 동원을 활성화하는 잠재적으로 다른 GPCR 리간드의 내피 세포에서 더 빠른 스크리닝을 수행할 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.D.는 파모듈린과 관련된 특허의 발명자이며, 임상용 파모듈린을 개발하고 있는 Function Therapeutics, Inc.의 설립자이자 주주입니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로젝트에 공간을 제공하고 간접적인 지원을 해준 Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler(Versiti Blood Research Institute), Dr. Leggy Arnold(University of Wisconsin-Milwaukee)와 적절한 조언을 제공한 Dr. John McCorvy(Medical College of Wisconsin)에게 감사드립니다. 보조금을 지원해 주신 미국 국립심장폐혈액연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute, R15HL127636), 미국 국방부(U.S. Dept. of Defense, W81XWH22101), 국립과학재단(National Science Foundation, 2223225)에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
세포 배양 시약
Adherent EA.hy926 세포ATCCCRL-2922
CellStripper 세포 해리 시약Corning25-056-CITrypsin을 선택적으로 사용할 수 있지만 PAR2 분석에서는 반드시 피해야 합니다.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
돼지 껍질에서 추출한 젤라틴MilliporeSigmaG2500탈이온수로 0.4%(w/v) 수용액을 만드는 데 사용합니다. 살균하기 위해 사용하기 전에 오토클레이브.
펜/스트렙(100X)코닝30-002-CI
인산염 완충 식염수(PBS)코닝21-040-CV
트리판 블루(0.4% w/v)코닝25-900-CI
강한>칼슘 동원 시약
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
소 혈청 알부민 (BSA)Avantor97061-420
염화칼슘 이수화물Thermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
염화마그네슘 육수화물MilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
수산화나트륨VWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Versiti Blood에서 Trudy Holyst가 준비했습니다. Research Institute
Materials
96-well 배양 처리, 검은색 벽, 투명 바닥 분석 플레이트Corning3603with transparent lids
원심분리기 튜브, 15 mLAvantor89039-664
원심분리기 튜브, 50 mLAvantor89039-656
배양 플라스크, T-75Corning353136조직 배양 처리된
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참고문헌

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