여기에서는 신선한 흑색종 조직에서 분리된 세포 현탁액을 배양하여 흑색종 환자 유래 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 오가노이드는 in vitro 에서 환자 특이적 종양을 충실하게 재현하여 종양 면역억제 메커니즘, 약물 스크리닝, 약물 내성 메커니즘 및 암 감시 접근법을 탐구하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
면역 요법이 개발됨에 따라 자연 종양의 종양 미세환경을 재현할 수 있는 모델을 개발해야 할 필요성이 지속적으로 증가하고 있습니다. 기존의 2차원 및 3차원 모델은 암의 발병 및 진행에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 이러한 모델은 토착 종양의 충실한 모방을 방해하는 중요한 측면이 부족합니다. 많은 주목을 받고 있는 대안 모델은 환자 유래 오가노이드(Patient-derived organoid)입니다. 이러한 오가노이드의 개발은 종양의 복잡한 세포 간 통신, 종양 미세환경 및 조직 구조를 요약합니다. 이 논문은 흑색종 환자 유래 오가노이드(MPDO) 모델을 확립하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 모델을 검증하기 위해 T 세포 활성화 마커의 발현 수준을 포함한 면역 세포 구성을 평가하여 오가노이드의 세포 이질성을 확인했습니다. 또한 세포 치료에서 MPDO의 잠재적 유용성을 설명하기 위해 γδ T 세포로 오가노이드를 처리하는 세포독성 능력을 평가했습니다. 결론적으로, MPDO 모델은 종양의 복잡성을 이해하고, 치료 전략을 검증하며, 잠재적으로 개인화된 치료를 발전시킬 수 있는 유망한 방법을 제공합니다.
서론
기존의 2-D 세포 배양 모델은 암 진행 및 치료를 연구하기 위한 암 연구에서 필수적인 도구입니다1. 이러한 모델은 암 발병 및 진행의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기 위해 통제된 실험 조건을 허용할 뿐만 아니라 비용 효율적이고 상대적으로 빠른 실험 결과를 제공합니다. 그러나 종양 미세환경(TME)의 제한된 세포 다양성으로 인해 사용이 제한되며, 이는 단일 배양 모델2의 동일 평면적 특성으로 요약할 수 없습니다. 또한, 세포 배양 모델은 인체에 비해 지나치게 단순화된 환경을 제공한다3. 따라서 암의 진행을 더 잘 이해하고 효과적인 치료법을 개발하기 위해 연구자들은 자연에서 TME를 면밀히 재현하는 것을 목표로 하는 혁신적인 모델로 눈을 돌렸습니다. 결과적으로, 이러한 모델에서는 토착 종양에 대한 충실도를 유지하는 것이 가장 중요합니다. 암의 복잡한 특성을 감안할 때, 원래 종양에서 크게 벗어나면 종양 행동에 대한 의미 있는 결론을 혼란스럽게 할 수 있는 예상치 못한 변수가 발생할 수 있습니다.
환자 유래 이종이식(PDX)은 생체 내에....
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프로토콜
인간 흑색종 조직은 펜실베니아 대학의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)에서 승인한 조직 수집 프로토콜(UPCC08607)을 사용하여 펜실베니아 대학에서 치료를 받는 환자로부터 얻었습니다. 모든 환자는 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다. 인간 흑색종 조직을 절제한 후 종양 조직을 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 넣고 처리할 때까지(6시간 이내) 4°C에서 유지합니다. 흑색종 환자 유래 오가노이드(MPDO)는 그림 1과 같이 새로운 종양에서 파생되었습니다.
1. 인간 흑색종 조직에서 세포의 분리
- 수속 시작 전의 준비 사항
참고: 두 가지 배양 방법(Matrigel 및 콜라겐 겔)을 사용하여 해리된 흑색종 조직을 배양할 수 있습니다.- Matrigel 방법의 경우: GFR Basement Membrane Matrix를 오가노이드 배양 배지( 표 1 참조)로 1:2 비율로 희석하여 GFR(Growth Factor Reduction) Base....
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결과
MPDO의 모양과 크기는 성장 역학을 연구하기 위해 시간이 지남에 따라 모니터링되었습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 초기 성장 기간 동안 오가노이드 크기는 표시된 7일 동안 크게 증가했습니다. MPDO 성장 역학을 관찰한 후, 오가노이드가 원래 종양에 충실하게 재현되어 있는지 확인하기 위해 면역 세포 구성을 평가하는 데 관심이 쏠렸습니다. 주로 αβ T 세포 풍부도에 초점을 맞춘 이 평가는 오가노이드와 부모 종양 간의 유사성에 대한 통찰력을 제공했습니다. 그림 3 은 모종양과 Matrigel 또는 콜라겐에서 배양된 각 오가노이드 간에 αβ T 세포 비율에서 통계적으로 유의한 차이가 없음을 보여줍니다. 부모 종양과 오가노이드 간의 유사성을 보여준 후, 다음으로 유세포 분석을 사용하여 T 세포 활성을 평가했습니다. 게이팅 전략은 그림 4에서 확인할 수 있으며, 이는 단일 .......
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토론
PDO의 출현은 이전에 확립된 다른 암 연구 방법으로 인해 제기된 여러 가지 한계를 해결하는 동시에 이 분야에서 혁신적인 잠재적 응용 프로그램을 도입했습니다. 이 오가노이드 기술은 2009년 한스 클레버스(Hans Clevers)와 동료들에 의해 처음 제안되었으며, R-스폰신, EGF 및 Noggin 인자20을 포함하는 3D 매트릭스 겔에서 마우스의 장에서 유래한 Lgr5+ 줄기 세포를 배양하여 장내 오가노이드 배양 시스템을 성공적으로 구축할 수 있었습니다. 몇 년 후인 2020년, 쾰러의 연구팀은 인간 PSC만을 사용하여 최초로 체외 내 피부 생성을 가능하게 한 오가노이드 배양 모델을 보고했습니다21. 이러한 오가노이드 기술의 눈부신 발전에 비추어 종양 오가노이드 모델의 개발이 빠르게 부상하여 암 연구 및 약물 개발에 혁명을 일으킬 수 있는 잠재력.......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 R01(CA258113), SPORE(CA261608) 및 P01(CA114046)의 보조금으로 부분적으로 자금을 지원받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 년에 작성되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 레드 캡 내부 나사식 폴리프로필렌 극저온 바이알 | Corning | 431420 | |
| 50 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 | Corning | 352070 | |
| 100 mm TC 처리 세포 배양 접시 | Corning | 353003 | |
| 105 mm 폴리스티렌 펜치 멸균 | Caplugs 상록수 | 222-1121-B1I | |
| 150 cm2 세포 배양 플라스크 | Corning | CLS430825 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human Perforin 항체 | BioLegend | 308120 | |
| Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 항체 | BioLegend | 350522 | |
| Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) 항체 | BioLegend | 345028 | |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD45 항체 | BioLegend | 304050 | |
| 세포 배양 인서트 0.4 µ m, 30mm 직경 | Millipore Sigma | PIHP03050 | |
| 세포 염색 완충액 | BioLegend | 420201 | |
| Cell Strainer 40 µ M 나일론 | 코닝 | 352340 | |
| 세포 여과기 70 µ M 나일론 | 코닝 | 352350 | |
| 콜라겐분해효소, 타입 IV, 분말 | Gibco | 17104019 | |
| Cultrex 랫 콜라겐 I | 트레비겐 | 3440-100-01 | |
| 배양 플레이트, PS, 48 웰, 뚜껑으로 처리된 TC, 멸균 | Max Scientific | 07-6048 | |
| 디메틸 설폭사이드 (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM - 고포도당 4.5 mg/mL | Corning | MT10-0130CV | |
| Dnase I - 등급 II | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum, FBS | Corning | MT35-010-CV | |
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| Hygromycin B (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10687010 | |
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| L-WRN cell | ATCC | CRL-3276 | |
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| 니코틴아미드 | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
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| 재조합 인간 FGF-산성 | Peprotech | 100-17A | |
| 소듐 바이카보네이트 용액 (NaHCO3) (7.5%) | 품질 생물학적 | 118-085-721 | |
| 스테인레스 스틸 수술용 칼날 no. 22 | Integra | 4-322 | |
| TrypLE Express | 깁코 | 12604-021 |
참고문헌
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research. Cancers (Basel). 11 (8), 1098(2019).
- Shannon, A. E., Boos, C. E., Hummon, A. B. Co-culturing multicellular tumor models: Modeling the tumor ....
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재인쇄 및 허가
