열충격 단백질 70의 샤페론 기능을 연구하기 위한 대장균 기반 보완 분석

Summary

이 프로토콜은 열 충격 단백질 70(Hsp70)의 샤페론 활성을 보여줍니다. 대장균 dnaK756 세포는 기능적으로 손상된 Hsp70을 가지고 있어 열 스트레스에 취약하기 때문에 분석의 모델 역할을 합니다. 기능성 Hsp70의 이종 도입은 세포의 성장 결핍을 구제합니다.

Abstract

열충격 단백질 70(Hsp70)은 세포 내에서 다른 단백질의 접힘을 촉진하여 분자 샤페론을 만드는 보존된 단백질입니다. Hsp70은 정상적인 조건에서 자라는 대장균 세포에 필수는 아니지만, 이 샤페론은 고온에서 자라는 데 없어서는 안 될 필수 요소입니다. Hsp70은 보존성이 높기 때문에 다양한 종의 Hsp70 유전자의 샤페론 기능을 연구하는 한 가지 방법은 Hsp70이 결핍되어 있거나 기능적으로 손상된 네이티브 Hsp70을 발현하는 대장균 균주에서 이질적으로 발현하는 것입니다. E. coli dnaK756 세포는 λ 박테리오파지 DNA를 지원할 수 없습니다. 또한, 그들의 네이티브 Hsp70(DnaK)은 GrpE(Hsp70 뉴클레오티드 교환 인자)에 대한 친화력이 감소하는 동안 상승된 ATPase 활성을 나타냅니다. 그 결과, 대장균 dnaK756 세포는 30°C에서 37°C 사이의 온도에서 적절하게 성장하지만 고온(>40°C)에서는 사멸합니다. 이러한 이유로, 이 세포들은 Hsp70의 샤페론 활성을 연구하기 위한 모델 역할을 합니다. 여기에서는 Hsp70의 셀룰로 샤페론 내 기능을 연구할 수 있는 보완 분석을 수행하기 위해 이러한 세포를 적용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

Introduction

열충격 단백질은 단백질 접힘을 촉진하고, 단백질 응집을 방지하며, 단백질 잘못 접힘을 역전시킴으로써 분자 샤페론으로서 중요한 역할을 합니다 ^1,2. 열충격 단백질 70(Hsp70)은 단백질 항상성 ^3,4에서 중심적인 역할을 하는 가장 두드러진 분자 샤페론 중 하나입니다. DnaK는 대장균 Hsp70 상동체⁵입니다.

Hsp70의 샤페론 활성을 탐구하고 이 샤페론 ^6,7,8을 표적으로 하는 억제제를 스크리닝하기 위해 다양한 생물물리학적, 생화학적, 세포 기반 분석법이 개발되었습니다. Hsp70은 고도로 보존된 단백질입니다. 이러한 이유로, Plasmodium falciparum(말라리아의 주성분)과 같은 진핵 생물의 여러 Hsp70이 대장균 ^6,9에서 DnaK 기능을 대체하는 것으로 보고되었습니다. 이러한 방식으로 대장균에서 Hsp70의 이종 발현을 포함하는 대장균 기반 보완 분석법이 개발되어 세포 보호 기능을 탐색했습니다. 일반적으로 이 분석에는 DnaK가 결핍되어 있거나 기능적으로 손상된 네이티브 DnaK를 발현하는 대장균 세포의 활용이 포함됩니다. DnaK는 정상적인 조건에서 대장균 성장에 필수적인 것은 아니지만, 세포가 고온이나 다른 형태의 스트레스와 같은 스트레스 조건에서 성장할 때 필수적입니다^10,11.

보완 분석을 사용하여 Hsp70 기능을 연구하기 위해 개발된 대장균 균주에는 대장균 dnaK103(BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) 및 대장균 dnaK756이 있습니다. 대장균 dnaK103 세포는 기능하지 않는 잘린 DnaK를 생성하며, 따라서 세포는 30°C에서 적절하게 성장하는 반면, 균주는 추위와 열 스트레스에 민감합니다^12,13. 유사하게, 대장균 dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) 균주는 40°C 이상에서 성장하지 않는다^14,15. 대장균 dnaK756 균주는 32, 455 및 468 위치에서 3개의 글리신-아스파르테이트 치환을 특징으로 하는 돌연변이 네이티브 DnaK(DnaK756)를 발현하여 손상된 단백질 증식 결과를 유발합니다. 결과적으로, 이 균주는 박테리오파지 λ DNA¹⁴에 내성이 있다. 또한 E. coli dnaK756은 ATPase 활성이 상승하는 반면 뉴클레오티드 교환 인자인 GrpE에 대한 친화력은 감소합니다¹⁶. 대장균 DnaK 돌연변이 균주는 보완 접근법을 통해 Hsp70의 샤페론 활성을 조사하기 위한 이상적인 모델 역할을 합니다. DnaK는 스트레스가 많은 조건에서만 필수적이기 때문에 보완 분석은 일반적으로 고온에서 수행됩니다(그림 1). 이 연구에 대장균을 사용하는 것의 몇 가지 이점은 잘 특성화된 게놈, 빠른 성장, 낮은 배양 및 유지 관리 비용¹⁷을 포함합니다.

이 기사에서는 Hsp70의 기능을 연구하기 위해 E. coli dnaK756 세포를 사용하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 분석에 사용된 Hsp70은 야생형 DnaK와 키메라 유도체인 KPf(Plasmodium falciparum Hsp70-1 ^6,18의 C-말단 기질 결합 도메인에 융합된 DnaK의 ATPase 도메인으로 구성됨)입니다. KPf-V436F는 돌연변이가 근본적으로 기질에 결합하는 것을 차단하여 샤페론 활성을 폐지하기 때문에 이질적으로 음성 대조군으로 발현되었다⁹.

Protocol

1. 변환

알림: 배양, 피펫 팁 및 새로 준비되고 고압멸균된 배지에는 멸균 유리 용기를 사용하십시오. 2x 효모 트립톤(YT)[1.6% 트립톤(w/v), 1% 효모 추출물(w/v), 0.5% NaCl(w/v), 1.5% 한천(w/v)] 한천에서 대장균 세포의 배양을 준비합니다. 프로토콜에 사용되는 일반 시약 및 그 출처는 재료 표에 나와 있습니다.

1. 2.0mL 미세 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 50μL의 유능한 대장균 dnaK756세포를 분취하여 세포를 얼음 상태로 유지합니다.
2. 유능한 세포가 있는 2.0mL 마이크로 원심분리기 튜브에 pQE60/DnaK, pQE60/KPf 및 pQE60/KPf-V436F 플라스미드 DNA⁹를 10-50ng 분취합니다.
3. 유능한 세포와 플라스미드 DNA가 들어 있는 2.0mL 미세 원심분리기 튜브를 얼음 위에 30분 동안 보관합니다.
4. 유능한 세포-DNA 혼합물을 42°C에서 60초 동안 열충격하고 마이크로 원심분리기 튜브를 다시 얼음 위에 10분 동안 되돌립니다.
5. 950μL의 신선한 2x YT 육수(37°C에서 사전 배양)를 추가하고 37°C에서 1시간 동안 분당 150회전으로 흔들면서 배양합니다. 필요한 경우 회복을 촉진하기 위해 세포가 훨씬 더 오래 자라도록 두십시오.
   알림: 세포를 세게 흔들지 마십시오.
6. 세포 100μL를 피펫팅하고 50μg/mL 카나마이신, 각 균주에 대한 10μg/mL 테트라사이클린, 플라스미드 선택을 위한 100μg/mL 암피실린( 재료 표 참조)을 포함하는 2x YT 한천 플레이트에 펼칩니다.
7. 벤치탑 마이크로 원심분리기를 사용하여 나머지 셀(부피가 현재 약 900μL)인 셀을 5000 x g (4°C)에서 1분 동안 원심분리합니다.
8. 약 800 μL의 육수를 디캔팅하고 나머지 배지를 사용하여 펠릿 세포를 재현탁시킵니다.
9. 회수된 세포를 2x YT 한천 플레이트에 플레이트합니다.
10. 두 한천 플레이트를 37°C에서 하룻밤(또는 약 17시간) 동안 배양합니다.
    참고: 이 세포는 매우 느리게 성장하며 훨씬 더 오래 배양해야 할 수도 있습니다. 아주 작게 시작할 수 있는 군체를 발견하도록 주의하십시오. 원심분리(단계 1.7) 후 재현탁된 세포를 포함하는 플레이트는 세포의 형질전환 효율이 불량한 경우에 백업의 역할을 하며, 이 경우 펠릿화된 세포는 임의의 형질전환된 세포의 회수를 향상시킬 수 있다. 그러나, 형질전환 효율이 우수하다면, 농축된 세포가 도배된 한천 플레이트는 배양 시 과도하게 자란 배양으로 특징지어질 수 있으며, 이로 인해 단일 콜로니를 식별하기 어려울 수 있습니다. 이 경우 다른 한천 판은 간격이 좋은 군체가 자라는 판일 수 있습니다.

2. 셀 도금

1. 형질전환체에서 단일 콜로니를 채취하여 50μg/mL의 카나마이신, E. coli dnaK756 세포 선택을 위한 10μg/mL의 테트라사이클린, 플라스미드 선택을 위한 100μg/mL 암피실린이 보충된 2x YT 국물 10mL에 접종합니다.
   참고: 플라스크(≥50mL)를 사용하여 배양액을 교반할 때 폭기를 보장합니다. 접종물을 37°C에서 밤새(17시간) 동안 분당 150회전으로 흔들면서 배양합니다.
2. 다음날 아침 OD₆₀₀에서 흡광도 판독을 수행합니다.
3. 세포 얼룩을 준비하기 위해 75% 에탄올을 사용하여 작업대 표면을 청소합니다.
4. 2mL 마이크로 원심분리 튜브를 사용하여 2x YT 브로스를 사용하여 OD₆₀₀ 판독값 2.0으로 배양액을 표준화합니다.
   알림: 이 단계는 다양한 샘플에서 셀 밀도를 표준화하는 데 중요하므로 OD 판독값이 올바르게 수행되었는지 확인하십시오.
5. 2mL 마이크로 원심 분리 튜브를 사용하여 10⁰에서 ^10-5까지 세포의 연속 희석액을 준비합니다.
6. 40°C로 설정된 오븐에서 세포를 발견하는 데 사용할 한천 플레이트를 배양하여 수증기가 빠져나갈 수 있도록 뚜껑을 부분적으로 열고 플레이트를 건조시킵니다.
   알림: 세포가 균일하게 분리된 거리에서 발견되도록 하려면 발견 부위의 템플릿이 인쇄된 종이에 선을 그립니다.
7. 50 μg/mL 카나마이신, 10 μg/mL 테트라사이클린, 100 μg/mL 암피실린 및 0.5 mM IPTG(재조합 단백질의 발현 유도용)가 보충된 한천 플레이트에 연속적으로 희석된 세포 2μL를 스포팅합니다( 재료 표 참조).
8. 각 검체를 두 개의 별도 플레이트(하나는 37°C, 다른 하나는 43.5°C에서 배양)에 놓습니다.
   알림: 한천 플레이트를 뚫지 마십시오.
9. 환경 영향을 최소화하기 위해 실험 샘플과 동일한 플레이트에 대조 샘플을 스폿합니다.
10. 세포가 성장하기 시작하기 전에 과정이 완료되도록 스포팅을 신속하게 수행하면 왜곡된 성장 패턴이 생성될 수 있습니다.
    알림: 얼룩을 발견할 때 에어로졸은 플레이트를 오염시킬 수 있으므로 피하는 것이 중요합니다. 오염을 방지하기 위해 스포팅 사이에 플레이트를 닫아 두는 것도 중요합니다.
11. 한 플레이트는 37°C(허용 성장 온도)에서 배양하고 다른 플레이트는 43.5°C의 비허용 성장 온도에서 배양합니다.
    알림: 응축된 물이 얼룩덜룩한 군체를 제자리에서 씻어낼 수 있으므로 증기가 뚜껑에 모이는 것을 방지하기 위해 접시를 거꾸로 향하게 배양하십시오.
12. 모든 플레이트를 동시에 인큐베이터에 넣고 다음 날 아침까지 인큐베이터를 열지 마십시오.
    알림: 플레이트를 배양하는 동안 인큐베이터 도어를 여러 번 여는 것은 권장되지 않습니다. 이는 인큐베이터에 공기가 접근하면 세포 성장에 부정적인 영향을 미치는 온도 변동이 발생할 수 있기 때문입니다.

3. 재조합 단백질의 발현 확인

1. 멸균 루프를 사용하여 형질전환된 E. coli dnaK756 세포의 동일한 콜로니에서 나머지 세포의 일부를 채취합니다.
2. 50 μg/mL 카나마이신, 10 μg/mL 테트라사이클린, 100 μg/mL 암피실린이 보충된 10 mL YT 육수에 세포를 접종합니다. 분당 150회전으로 흔들면서 37°C에서 하룻밤(17시간) 동안 배양합니다.
3. 3.2단계에서 언급한 대로 필요한 항생제가 들어 있는 멸균 2x YT 육수 90mL에 배양액을 옮깁니다. 세포가 중간 로그 단계(OD₆₀₀ = 0.4-0.6)로 성장하도록 합니다.
4. 유도 전에 2mL의 시료 배양을 채취합니다(0시간 유도 시료).
5. IPTG를 최종 농도 1mM에 첨가하여 단백질 생성을 유도하고 37°C에서 세포를 다시 배양합니다.
6. 유도 후 6시간 후에 두 번째 2mL 샘플을 채취합니다.
7. 5000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 원심분리기 온도를 4°C로 유지하십시오.
8. 상층액을 버리십시오.
9. 펠릿을 PBS 완충액(137mM NaCl, 27mM KCl, 4.3mM_Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)에 재현탁시키고-20°C에서 보관합니다.

4. SDS-PAGE와 서부 얼룩 분석

1. 앞서 설명한 대로 2x 10% SDS 겔을 준비합니다¹⁹.
2. 단백질 밴드를 보기 위해 Coomassie 염색을 사용하여 후속 염색을 위해 SDS-PAGE 겔 중 하나를 보관하십시오. 두 번째 SDS-PAGE 겔을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다.
3. 재현탁 시료 80μL를 분취하여 20μL의 4x Laemmli SDS 로딩 버퍼와 혼합합니다.
4. 현탁액을 100°C에서 10분 동안 끓입니다. 그런 다음 각 샘플의 10μL를 프리캐스트 SDS 겔에 로드합니다( 재료 표 참조).
5. SDS 러닝 버퍼 (25mm Tris, 250mm 글리신, 250 % (w / v) SDS)의 1x 용액에서 120V의 전압을 사용하여 1 시간 동안 실온에서 전기 영동을 수행합니다.
6. Coomassie 염색( 재료 표 참조)으로 겔을 1시간 동안 염색한 다음 탈색 완충액(증류수 중 50%(v/v) 메탄올, 10%(v/v) 아세트산)을 사용하여 2시간 동안 탈색합니다.
7. 겔 이미징 시스템을 사용하여 겔에 존재하는 단백질 띠를 시각화합니다( 재료 표 참조). 동일한 s로 다른 SDS-PAGE 겔을 다시 실행하십시오.amp위에서 언급한 프로토콜에 따라 les.
8. 전기영동 실행이 종료되면 SDS-PAGE 겔을 사용하여 앞서 설명한 대로 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다¹⁹.
9. 단백질이 전달된 니트로셀룰로오스 막을 세척 완충액(TBS-Tween, pH 7.4[50mM Tris, 150mM NaCl, 1%(v/v) Tween])에서 3회 세척합니다.
10. α-DnaK( 재료 표 참조)를 사용하여 DnaK를 검출하고 α-PfHsp70-1⁷을 사용하여 KPf 및 그 돌연변이인 KPf-V436F)를 각각 검출합니다.
11. 항체를 5% 무지방 우유에 1:2000 희석하여 사용하십시오. 4 °C에서 1 시간 동안 60 회전/분으로 흔들면서 배양합니다.
12. TBS-Tween에서 니트로셀룰로오스 멤브레인을 15분 안에 3회 세척하여 비특이적으로 결합된 항체를 제거합니다.
13. 이전 단계와 동일한 조건에서 2차 항체(α-rabbit, 재료 표 참조)에 멤브레인을 배양합니다. 그 다음에는 1차 항체와 동일한 조건에서 후속 세척이 뒤따릅니다.
14. ECL(enhanced chemiluminescence) 검출 시약을 사용하여 밴드를 분해합니다.
15. 겔 이미저를 사용하여 밴드를 시각화합니다.

Results

그림 2는 각각 37°C 및 43.5°C의 허용 성장 온도에서 발견 및 배양된 세포를 포함하는 스캔된 한천의 이미지를 보여줍니다. 그림 2의 오른쪽에서 절제된 웨스턴 블롯 성분은 E. coli dnaK756 세포에서 DnaK, KPf 및 KPf-V436F의 발현을 나타냅니다. 예상대로, 37°C의 허용 성장 온도에서 배양된 모든 대장균 dnaK756 세포는 성장할 수 있었습니다. 그러나 43.5°C의 비허용 성장 조건에서는 이전에 보고된^바와 같이 DnaK 및 KPf를 이질적으로 발현하는 세포만 성장할 수 ^{있었습니다(}그림 2). 반면, KPf-V436F를 발현하는 세포는 37°C에서만 성장하고 43.5°C에서는 성장하지 못했습니다. 이는 DnaK와 KPf가 열 스트레스 조건에서 대장균 dnaK756 세포의 성장 결함을 복원할 수 있음을 보여줍니다. KPf-V436F를 이질적으로 발현하는 세포가 43.5°C에서 세포의 성장을 지원하지 못하는 것은 이 단백질의 샤페론 기능이 부족하다는 것을 보여줍니다. 이와 관련하여 KPf-V436F는 이상적인 음성 대조군 단백질 역할을 합니다.

그림 1: 이종적으로 발현된 단백질의 샤페론 기능을 연구하기 위해 E. coli dnaK756 세포를 사용한 보완 분석의 원리. 대장균 dnaK756은 열 스트레스로부터 세포를 보호할 수 없는 천연 DnaK756 단백질을 발현합니다. 기능적 이종 Hsp70의 도입은 열 스트레스에 노출되면 세포를 죽음에서 구출합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 열 스트레스로부터 E. coli dnaK756 세포를 보호하는 DnaK 및 KPf의 기능을 보여주는 보완 플레이트 분석. 형질전환된 세포를 37°C(허용적 성장 온도) 및 43.5°C(비허용적 성장 온도)에서 배양하였다. 세포를 표준화하고 연속 희석액으로 도금했습니다. 'N'은 '깔끔한'을 상징하며, 희석되지 않은 세포로 구성된 첫 번째 지점을 나타냅니다. 맨 오른쪽에는 세 가지 단백질의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 절제가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 이질적으로 발현된 Hsp70의 샤페론 기능을 탐색하는 데 있어 E. coli dnaK756세포의 유용성을 보여줍니다. 이 분석법은 셀룰로에서 Hsp70 기능을 표적으로 하는 억제제를 스크리닝하는 데 채택될 수 있습니다. 그러나 이 방법의 한 가지 한계는 대장균 에서 DnaK를 대체할 수 없는 Hsp70이 이 분석법과 호환되지 않는다는 것입니다. 일부 non-native Hsp70의 번역후 변형(post-translational modification)²¹의 부족은 대장균 시스템 내에서 기능의 부족을 설명할 수 있다. 효모 기반 보완 분석법⁽²²)은 대장균 기반 분석법의 일부 단점을 해결할 수 있다.

재현 가능한 결과를 보장하기 위해서는 몇 가지 주요 단계가 중요합니다. 여기에는 도금 중에 각각의 플라스미드 구조에 의해 형질전환된 세포만 사용되도록 하는 것이 포함됩니다. 또한 단계 전반에 걸쳐 배양액의 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 더욱이, 스트레스를 받은 대장균 DnaK 세포는 과도한 필라멘트화에 취약하기 때문에¹⁰, 이러한 물리적 긴장이 광범위한 필라멘트화를 촉진하기 때문에 배양 중 격렬한 흔들림을 피하는 것이 중요하다. 과도하게 필라멘트된 세포는 OD₆₀₀에서 더 높은 거짓 겉보기 성장 판독값을 제공하여 배양 성장을 과대평가하고 도금 전 세포 표준화에 부정적인 영향을 미칩니다. Hsp70은 정상적인 조건에서 대장균 성장에 필수적인 것은 아니지만, 이 단백질이 결핍된 세포는 스트레스에 취약하다¹⁰. 이러한 이유로, 대장균 dnaK756 세포는 형질전환된 후 또는 글리세롤 스톡에서 회복되는 동안 훨씬 느리게 성장합니다. 또한 온도 변화에 매우 민감합니다. 따라서 도금된 한천 플레이트를 내부에 배치한 후에는 플레이트를 볼 때까지 인큐베이터 도어를 열지 않는 것이 중요합니다.

웨스턴 블롯 데이터는 E. coli dnaK756 세포에서 각각의 재조합 Hsp70 단백질의 발현을 확인하는 데 중요합니다. 각 단백질을 발현하지 못하면 비허용 성장 온도에서 자라는 세포에 대해 위음성 결과가 발생합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	샘플 로딩 염료
구성 요소 아세트산	Labchem	101005125	destainer
아크릴아미드	Sigma-Aldrich	8008300100	구성 요소 SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	구성
Agarose	Clever Scientific	14131031	인증 분자 생물학 아가로스
과황산 암모늄	시그마-알드리치	101875295	SDS-PAGE 젤
Ampicillin	VWR International	0339—EU— 25G	선택적 항생제
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	구성 요소 샘플 로딩 염료
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	유능한 세포 준비용
Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE 염료
이염기성 인산나트륨	시그마-알드리치	RB10368	PBS 완충액의 구성 요소
ECL	Thermofischer Scientific	32109	웨스턴 블롯 검출 시약
Ethidium Bromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA 삽입 염료
글리세롤	Merck	SAAR2676520L	샘플 로딩 염료 Glycine 구성 성분
	VWR International	10119CU	SDS
IPTG	Glentham 생명 과학 구성 요소	162IL	유도제
Kanamycin	Melford	K0126	선택적 항생제
염화 마그네슘	Merck	SAAR4123000EM	매체 및 액체 성장 분석의 구성
메탄올	Labchem	113140129	destainer
일염기성 인산칼륨	Merck	1,04,87,30,250	PBS 완충액의 구성
펩톤	Merck	HG000BX4.250	매체 및 액체 성장 분석의 구성
염화칼	Merck	SAAR5042020EM	PBS 완충액의 구성
PVDF 멤브레인	Thermofischer scientific	PB7320	웨스턴 블롯 멤브레인
염화나트륨	Merck	SAAR5822320EM	매체 및 액체 성장 분석의 구성 요소
나트륨 도데 실 황산염	VWR 국제	108073	발현 단백질을 해결하기 위해
Spectramax iD3	분리	373705019	자동 플레이트 리더
TEMED	VWR 국제	ACRO420580500	SDS 젤
Tetracycline	Duchefa Biochemies의 구성 요소	T0150.0025	선택적 항생제
Tris	VWR International	19A094101	SDS 젤
Tween20	구성 요소 Merck	SAAR3164500XF	Constituent for Western wash buffer
Western Transfer chamber	Thermofisher Scientific	PB0112	단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이동
효모 추출물	Merck	HG000BX6.500	매체 및 액체 성장 분석의 구성
요소&알파;-DnaK 항체	Inqaba	BK CAC09317	1차 항체
&알파;-토끼 항체	Thermofischer scientific	31460	2차 항체