방법 논문

동종이식 거부 반응 연구를 위한 간절개술을 활용하는 이주제 보조 전체 간 쥐 이식 모델

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DOI:

10.3791/66516

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2024년 3월 8일

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1Department of Surgery, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Surgery, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin-Madison, 4UW Carbone Cancer Center, 5William S. Middleton Memorial Veterans' Hospital

이 논문에서

요약

여기에 설명된 쥐 이소성 보조 간 이식 프로토콜은 간 동종이식 거부 반응의 메커니즘을 탐색하기 위한 실용적인 조사 도구를 제공합니다. 이 모델은 쥐의 정형소 간 이식의 수술 장애물과 동물의 스트레스를 완화하는 데 도움이 됩니다.

초록

소동물 이식 모델은 전임상 연구에서 실현 가능한 치료 개입을 조사하는 장기 내성 연구에 필수적입니다. 쥐 간 이식(LTx) 프로토콜은 일반적으로 수혜자의 원래 간을 제거하고 기증자 간으로 대체하는 정형외과 모델을 사용합니다. 기술적으로 까다로운 이 수술 절차는 고급 미세 수술 기술을 필요로 하며 장시간의 무간 및 하체 허혈로 인해 더욱 복잡합니다. 이로 인해 무간 또는 하체 허혈 시간 없이 더 빠르게 수행할 수 있는 덜 복잡한 이종 요법의 개발이 촉진되어 이식 동물의 수술 후 스트레스를 줄일 수 있습니다.

이 이종성 LTx 프로토콜에는 두 가지 주요 단계가 포함됩니다: 기증자 쥐에서 간을 절제하고 간 전체를 수혜자 쥐에 이식하는 것입니다. 기증자의 간을 절제하는 동안 외과의는 상간대정맥(SHVC)과 간동맥(HA)을 결찰합니다. 수혜자 측에서 외과의는 왼쪽 신장을 제거하고 기증자의 간을 문맥(PV), 하부간대정맥(IHVC) 및 담관이 신장 혈관을 향하도록 배치합니다. 또한, 외과의는 간의 IHVC로 수혜자의 신정맥을 끝에서 끝까지 문합하고 스텐트를 사용하여 PV를 신장 동맥과 동맥화합니다. 간절개술은 담관을 수혜자의 요관으로 문합하여 담즙이 방광을 통해 담즙이 배출될 수 있도록 하여 담즙 배출에 사용됩니다.

평균 이식 시간은 130분, 냉허혈 기간은 약 35분, 온열 허혈 기간은 25분 미만이었습니다. 신유전자 이식으로 인한 보조 간의 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신 조직학(eosin histology)은 이식 후 30일 동안 유의한 실질 변화 없이 정상적인 간세포 구조를 보여주었다. 대조적으로, 이식 후 8일 후 동종 이식편 표본은 Banff Schema 거부 반응 활성 지수 점수가 9로 광범위한 림프구 침투를 보여주었습니다. 따라서 이 LTx 방법은 정소성 LTx에 대한 낮은 이환율 거부 모델을 용이하게 합니다.

서론

소동물 LTx는 간 거부 반응을 일으키는 기전을 조사하는 데 매우 유용한 모델입니다. 쥐에서 문맥 동맥 삽입술을 동반한 이소성 보조 간 이식(HALT-PVA)은 1968년 Lee와 Edgington1에 의해 소개되었는데, 당시 수혜자의 신장 정맥과 동맥을 사용하여 이식된 보조 간을 재혈관화한다고 보고했습니다. 그 후, Hess 등[2]은 기증자 담관 연결을 재구성하는 것과 함께 본래 간과 기증자 간 크기를 줄임으로써 본래 간과 보조 간 간의 기능적 경쟁을 완화하여 프로토콜을 강화하여 이식편의 장기 생존을 초래했습니다. 커프 문합 3,4의 도입으로 추가적인 개선이 이루어졌으며, Schleimer 등5은 생리학적 문맥 흐름을 얻고 이식편의 과관류 또는 저관류를 피하기 위해 혈류를 조절하기 위한 최적의 스텐트 직경을 결정했습니다. 다른 연구자들은 이식 혈액 공급을 위해 비장6 또는 총장골7 동맥을 사용하여 방법을 크게 변경했으며, 일부는 정맥혈8 또는 간 동맥9을 통한 동맥혈만 사용하여 보조 간 이식편에 공급하는 모델을 개발했습니다.

본 연구는 천연 간과의 기능적 경쟁이 동종이식 거부 반응을 방해하지 않을 것이라는 가설을 세웠기 때문에 천연 간 또는 보조 간의 크기 축소를 포함하지 않는 흐름 조절 슐라이머 모델10 을 기반으로 프로토콜을 개발했습니다. 이식편의 위치를 찾기 위해 수혜자의 왼쪽을 선택했는데, 이는 수혜자의 신장 혈관과 기증자 간 혈관 사이에 최적의 방향을 제공했기 때문입니다. 초기에는 간십이지장절개술을 통해 담즙 재건을 시도했지만, 이 임상시험은 "담도 배액은 간 이식의 아킬레스건"이라는 Schleimer의 주장을 확인시켜주었을 뿐입니다10. 이로 인해 수혜자의 요관과 함께 스텐트를 사용하여 담관을 끝에서 끝까지 문합하여 방광을 통해 담즙을 배출할 수 있는 새로운 기술이 개발되었습니다. 간절개술의 주목할 만한 이점은 소변을 관찰하여 이식편 간 기능을 매일 모니터링할 수 있다는 것입니다. 담즙을 생성하는 간 이식편은 소변을 밝은 노란색으로 착색합니다. 그림 1 은 HALT-PVA 방법의 개략도를 나타냅니다.

정형소성 쥐 LTx에 비해 이종소성의 중요한 장점은 간질환 또는 하체 전허혈 시간이 없다는 점과 관련이 있으며, 이는 이종외 이식자가 더 빠르고 쉽게 회복할 수 있도록 합니다. 또한 정형소적 방법을 활용한 LTx 면역학적 연구는 종종 수혜자의 심각한 거부 또는 사망에 실험적 종점으로 의존하는데, 이는 거부 반응으로 인해 동종이식편이 기능을 중단하더라도 동물이 건강을 유지하는 이소성 이식의 경우에는 그렇지 않습니다. 헤테로토피 방법의 이러한 두 가지 특징은 연구 동물이 경험하는 고통, 고통 및 괴로움을 최소화하고 그들의 복지를 개선하기 위한 틀을 촉진하는 국제 3R의 이니셔티브(Replacement, Reduction, and Refinement)11의 원칙을 지원합니다.

여기에 보고된 HALT-PVA 모델은 전임상 연구에서 간 동종이식 거부 반응을 조사하기 위한 실용적이고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 유용한 실험 기술은 쥐에서 정소성 LTx의 상당한 수술 요구와 동물 스트레스를 극복하는 데 도움이 됩니다. 앞으로 우리는 이 방법을 사용하여 급성 면역 거부 반응의 메커니즘을 조사하는 동시에 간 동종 이식 거부 반응을 억제하기 위한 새로운 표적과 치료 전략을 모색할 계획입니다.

프로토콜

동물들은 기관 지침에 따라 위스콘신 대학교(University of Wisconsin, UW)-매디슨 의학 연구소(Madison Institute for Medical Research)의 동물 보호 시설에서 특정 병원체가 없는 조건에서 사육되고 수용되었습니다. 연구 프로토콜(No. M006022)은 UW 의과 대학 및 공중 보건 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 모든 동물은 윤리적으로 대우되었습니다.

1. 동물

  1. 205-235g 무게의 성인 루이스 암컷 쥐와 250-280g 무게의 루이스 수컷 쥐를 기증자 쥐로 사용하십시오. 체중이 365-420g인 성인 수컷 Lewis 및 Brown Norway 쥐를 수신자로 사용합니다.
  2. 루이스 기증자를 루이스 수혜자에게 이식하여 합성유전자 이식을 수행하고, 동종 이식은 브라운 노르웨이 수혜자에게 이식된 루이스 기증자를 활용했습니다.
  3. 모든 수술은 이중 헤드 현미경을 사용하여 두 사람이 수행합니다.

2. 간 보조 기증자 조달 절차

  1. 유도 챔버에서 5% 이소플루란 흡입으로 기증자 쥐를 마취합니다. 쥐의 체중을 기록하고 전기 가위기로 복부를 면도하십시오.
  2. 마취 원뿔에 코를 대고 가열된 수술 패드 위에 쥐를 누운 자세로 놓고 테이프로 팔다리를 고정합니다. 75% 알코올로 복부를 소독하고 이소플루란을 2%로 낮춥니다.
  3. 가위를 사용하여 치골에서 xiphoid까지 세로로 정중선 피부와 근육을 절개합니다. 세로 절개의 중간 지점 근처에서 왼쪽과 오른쪽으로 측면으로 확장한 다음 복벽과 xiphoid process의 양쪽에 견인기를 설치합니다.
  4. 촉촉한 면봉을 사용하여 장을 복부 왼쪽으로 후퇴시키고 스프링 가위를 사용하여 간에 붙어있는 위인대를 자른 다음 축축한 거즈로 장을 고정합니다. 따뜻한 식염수를 적신 작은 멸균 거즈로 간을 덮습니다.
  5. 축축한 면봉을 사용하여 간을 수축시키고 팔시폼, 삼각, 간위, 간십이지장 인대를 절개합니다. 다음으로, 양극성 겸자로 소작하고 왼쪽 외측과 전방 미상엽 사이의 식도 주위 혈관을 나눕니다.
  6. 앵글 핀셋 또는 바늘 홀더를 사용하여 다이어프램보다 아래쪽 SHVC 뒤를 절개 한 다음 SHVC 아래에 5-0 실크 봉합사를 통과시키고 나중에 사용할 수 있도록 이중 매듭을 느슨하게 묶습니다.
  7. 하측 우측 측엽을 위쪽으로 후퇴시키고 인대를 절단하고 축축한 거즈 아래에서 움직이지 못하게 합니다. IHVC를 후복막 조직에서 우측 신정맥까지 분리하고 IHVC에 최대한 가까운 6-0 실크 봉합사로 우측 부신 정맥을 결찰합니다. 나중에 이식편을 제거할 때 이 정맥을 나누십시오.
  8. 27G 수압 해부 바늘(그림 2A)을 사용하여 PV를 주변 결합 조직에서 분리하고 7-0 실크 봉합사를 사용하여 결찰 및 분할하여 유문 및 비장 정맥에서 분리합니다.
  9. 6-0 실크 봉합사로 분리하고 결찰하고 PV 아래를 통과하는 곳에 가깝게 총간동맥을 분할합니다.
  10. 위십이지장 동맥의 분기부에서 5-0 실크 봉합사로 담관을 결찰하면서 담관 주변의 지방 조직을 가능한 한 보존합니다. 특히, 담관을 적절한 간 동맥에서 분리하지 말고 전체 길이를 가능한 한 짧게 유지하십시오.
  11. 스프링 가위를 사용하여 결찰부 근위부의 담관 벽을 작게 절개합니다. 담관 내강에 직경 0.0215인치 x 5mm 길이의 폴리이미드 튜브 스텐트를 삽입하고 6-0 실크 봉합사로 고정하여 나중에 사용할 수 있도록 봉합사의 한쪽 끝을 길게 둡니다. 5-0과 6-0 결찰 사이를 절단하여 담관을 나눕니다.
  12. 문합 중 혈관을 정렬하는 데 도움이 되도록 수술용 염료 펜으로 IHVC 및 PV의 윗면을 표시한 다음 가능한 한 간 원위부에 있는 미세 혈관 클램프로 문맥을 고정합니다.
  13. 26G 바늘이 달린 20mL 주사기를 마이크로 클램프 근처의 PV에 삽입하고 10-15mL의 얼음처럼 차가운 헤파린 식염수로 간을 관류합니다. 동시에 스프링 가위를 사용하여 IHVC를 가능한 한 오른쪽 신장 정맥에 가깝게 나눕니다.
  14. 마이크로 클램프에 근접한 PV를 해부하고, SHVC 주위에 이전에 배치된 5-0 봉합사를 조이고, 횡격막을 절개하여 흉곽내 대정맥을 절제하여 스프링 가위를 사용하여 간을 절제합니다.
  15. 간 뒤쪽에 남아 있는 인대를 절개하고 이전에 결찰된 부신 정맥을 나누면서 계속합니다. 절제된 간을 얼음 위에 차가운 식염수에 넣습니다.

3. 보조 간 수혜자 이식 절차

  1. 유도 챔버에서 5% 이소플루란 흡입으로 수용 쥐를 마취합니다. 쥐의 체중을 기록하고 전기 가위기로 복부를 면도하십시오.
  2. 마취 원뿔에 코를 대고 가열된 수술 패드 위에 쥐를 누운 자세로 놓고 테이프로 팔다리를 고정합니다. 눈 윤활제를 바르고 75% 알코올로 복부를 소독한 다음 이소플루란을 2%로 낮춥니다.
  3. 가위를 사용하여 치골에서 치골까지 세로 정중선 피부와 근육을 절개 한 다음 복벽 양쪽에 견인기를 설치하십시오.
  4. 촉촉한 면봉을 사용하여 장을 복부 오른쪽으로 후퇴시키고 적신 거즈로 덮습니다. 또 다른 촉촉한 거즈를 바르고 위, 비장, 간을 덮어 왼쪽 신장과 신장 혈관을 노출시킵니다.
  5. 27G의 수압 박리 바늘과 뭉툭한 집게를 사용하여 왼쪽 신장 정맥과 신장 동맥을 분리하고 양쪽 혈관에서 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다.
  6. 생식선과 부신 정맥을 분리하고 6-0 실크를 사용하여 일시적으로 신장 정맥 근위부를 접합합니다. 양극성 겸자를 사용하여 대동맥/VC와 신장 사이의 신장 정맥과 동맥을 분리하는 모든 마이크로 곁가지를 소작합니다.
  7. 하극에서 6-0 실크 봉합사로 요관을 동원하고 결찰합니다. 신장 정맥과 동맥을 수술용 염료 펜으로 표시하여 문합 중에 혈관의 방향을 잡고 꼬인 부분이 없는지 확인합니다.
  8. 신장 동맥과 신장 정맥을 미세혈관 클램프로 대동맥과 VC에 최대한 가깝게 고정합니다. 혈관 분기점을 지나 스프링 가위로 신장 동맥을 절제하고 VC와 신장 사이의 약 절반 지점에서 신장 정맥을 나눕니다. 주변 결합 조직에서 왼쪽 신장을 동원하여 제거합니다.
  9. 27G 수압 해부 바늘을 사용하여 두 혈관을 헤파린 식염수로 세척하여 남아 있는 혈액을 모두 제거합니다.
  10. 스프링 가위로 신장 동맥 분기점의 포크에 있는 작은 물고기 입 구멍을 잘라 깔때기 모양의 구멍을 만들고 26G 카테터에서 절단한 8mm 스텐트를 삽입합니다(그림 2B). 6-0 실크 봉합사로 스텐트를 고정하고 나중에 사용할 수 있도록 봉합사의 한쪽 끝을 길게 둡니다.
  11. 기증자의 간을 소개하고 PV, IHVC 및 담관이 수혜자의 왼쪽 신장 정맥 및 동맥을 향하도록 배치합니다. 9-0 나일론 봉합사를 사용하여 IHVC-신장 정맥 연결부의 반대쪽에 두 개의 스테이 봉합사를 설치합니다.
  12. 혈관의 너비를 비교하고 기증자의 IHVC와 비슷한 너비가 될 때까지 스프링 가위를 사용하여 신장 정맥 면에 작은 물고기 입을 절개합니다(그림 2C).
  13. 9-0 나일론 봉합사를 사용하여 혈관의 앞벽과 뒷벽을 가로질러 9개 또는 10개의 실행 봉합사로 간 IHVC를 신장 정맥에 끝에서 끝까지 문합합니다. 또는 커프 방법을 사용하여 이 문합을 완료합니다 3,4.
  14. 신장 동맥이 IHVC 아래에 있는지 확인하고(그림 2D), 이전에 신장 동맥에 삽입한 스텐트를 간 문맥에 삽입하고 봉합사의 한쪽 끝을 동맥의 반대쪽 실에 부착할 수 있도록 길게 남겨둔 후 6-0 실크 봉합사로 고정합니다. 스텐트에서 미끄러지지 않도록 끝을 함께 그립니다.
  15. 먼저 신장 정맥의 마이크로 클램프를 제거한 다음 신장 동맥의 마이크로 클램프를 제거합니다.
  16. 간을 재관류하는 동안 거즈와 면봉을 사용하여 특허 문합이 이루어질 때까지 문합 부위 주위에 가벼운 압력을 가합니다(그림 2D). 이전에 부신과 생식선 정맥에 배치된 임시 결찰을 제거합니다.
  17. 주변 결합 조직에서 왼쪽 요관 끝으로 약 10mm 아래로 조심스럽게 동원하여 상당한 양의 지방 조직이 부착되도록 합니다. 스프링 가위를 사용하여 이전에 배치 한 5-0 결찰에 가까운 요관 벽을 작게 절개합니다.
  18. 이전에 담관에 부착된 폴리이미드 스텐트를 요관 벽에 만들어진 작은 절개 부위에 삽입합니다. 6-0 실크 봉합사로 고정하고 한쪽 끝을 스텐트의 담관 쪽에 있는 긴 실로 묶어 양쪽 끝을 단단히 잡아당깁니다.
  19. 장을 원래 위치로 되돌리고(그림 2E), 2-3mL의 식염수를 세척하고, 3-0 실크 러닝 봉합사를 사용하여 복부를 두 겹으로 닫습니다.
  20. 0.1mg/kg 부프레노르핀을 피하주사하고, 수혜자를 깨끗하고 가열된 케이지에 넣고, 동물을 동물 사육 시설로 돌려보내기 전에 1-2시간 동안 회복을 모니터링합니다.

4. 수술 후 후속 조치

  1. 수술 후 2일차부터 동종 이식 수혜자에게 헤파린(1IU/g)을 매일 피하 주사합니다.
  2. 수술 후 2일차부터 합성유전자 이식 수혜자에게 격일로 헤파린(1IU/2g)을 피하주사합니다.

결과

현재 29쌍의 쥐가 HALT-PVA 프로토콜을 확립하는 데 사용되었으며, 17건의 신유전자 이식 및 12건의 동종 이식이 사용되었습니다. syngeneic 이식된 간은 70%의 성공률로 지정된 8일 또는 30일 실험 종료점까지 생존한 반면, 동종 이식된 간은 50%의 성공률로 지정된 3일 또는 8일 종료점까지 생존했습니다. 실패에는 수술 합병증으로 인해 죽은 쥐와 수혜자가 살아남았음에도 불구하고 실패한 보조 간이 포함됩니다.

수술 시간은 평균 130분이었으며, 냉허혈 시간은 약 35분, 온간 허혈 시간은 25분 미만이었다. 수술 중 합병증이 없는 경우, 수혜자는 10-20분 이내에 깨어나 활동하기 시작했고, 1시간 이내에 물을 마시고 걷기 시작했으며, 24시간 후에는 정상적인 건강한 쥐처럼 행동했습니다.

신유전자 간 이식편은 이식 후 30일 동안 우수한 색상 및 담관 개통을 보였으며(그림 3), Hematoxylin 및 eosin(H&E) 조직학은 8일 및 30일 시점 모두에서 유의한 실질 변화 없이 정상적인 간세포 구조를 보여주었습니다(그림 4A, B). 단 3일 후, 동종 이식의 조직학적 검사에서 상당한 문맥 염증이 나타났고(그림 4C), 8일간의 동종 이식에서는 광범위한 림프구 침윤을 동반한 급성 세포 거부 반응이 나타났습니다(그림 4D).

대표적인 동종 및 신유전자 LTx 검체는 이사회 인증을 받은 간 병리학자에 의해 평가되었으며, Banff Schema 거부 반응 활성 지수(RAI)12를 사용하여 거부 반응 점수를 매겼습니다. 병리학적 평가는 8일 및 30일 syngeneic 이식 모두에서 Banff RAI가 0인 거부 반응이 없는 것으로 확인되었으며, 8일 동종 이식편은 Banff RAI 점수 9로 심하게 거부되었습니다(표 1).

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그림 1: 쥐 HALT-PVA 절차의 개략도. PV는 스텐트를 사용하여 좌측 신장 동맥과 동맥화하고, IHVC는 좌측 신정맥을 끝에서 끝까지 문합하며, 담관은 스텐트를 사용하여 요관에 부착합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 수술 절차. (A) PV의 수압 해부. 27G의 수압 해부 바늘로 주변 결합 조직에서 PV를 분리합니다. (B) 동맥 스텐트 삽입. 동맥 스텐트는 신장 동맥 분기점의 갈림길에 있는 작은 깔때기 모양의 개구부 절단부에 삽입됩니다. (C) 신장 정맥을 넓히는 것. 문합을 위한 기증자 IHVC의 더 큰 너비와 일치시키기 위해, 두 번의 체류 봉합사가 자리잡은 후 수혜자의 신장 정맥 면에 작은 물고기 입 절단이 이루어집니다. (D) 문합 직후 관류된 간 이식편. 신장 정맥과 IHVC 아래에 신장 동맥과 PV 연결을 배치하는 것은 이식편의 혈전증을 예방하는 데 중요합니다. (E) 쥐 HALT-PVA in situ. 보조 간은 장으로 돌아가기 전에 복부의 왼쪽 벽에 위치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 이식 후 30일의 Syngeneic HALT-PVA. (A) 30일이 지난 후 보조 간은 천연 간과 유사한 색상과 질감을 갖게 되며, (B) 담관 및 PV 스텐트는 특허를 유지하고 제한이 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 보조 간 이식편의 조직학. 문맥 염증 및 림프구 침윤을 나타내는 (C) 3일 및 (D) 8일 동종 이식편과 함께 정상적인 간세포 구조를 보이는 (A) 이식 후 (B) 3일 및 (B) 3일 후 합성 이식편의 H&E 염색. 눈금 막대 : 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

동종 Tx문맥 염증담관 부상정맥내막 염증밴프 라이
3일(LT-34)2237
3일(LT-38)1001
8일(LT-20)3339
8일(LT-40)3339
Syngeneic Tx의
8일(LT-13)0000
8일(LT-19)0000
30일(LT-28)0000
30일(LT-32)0000

표 1: 밴프 스키마. 동종 및 syngeneic rat LTx의 거부 활성 지수(RAI).

토론

간 이식은 말기 간 질환 환자를 위한 유일한 치료 옵션이며, 미국에서는 매년 약 9,000건의 LTx가 시행되고 있습니다13. 불행히도 LTx 수혜자의 최대 25%에서 면역학적 거부 반응이 나타나며, 이러한 거부 반응은 이식된 장기와 환자에게 해롭습니다14,15. LTx 이후의 결과를 개선하기 위해서는 장기 거부 반응을 연구하고 거부 반응을 줄이기 위한 전략을 구현하기 위한 혁신적인 모델의 개발이 필요합니다.

정소성 쥐 간 이식과 비교했을 때, 현재의 이종소 모델은 확립하기가 매우 쉽습니다. 기술적 난이도의 정도는 절차에서 가장 어려운 단일 단계, 즉 신장 정맥에 대한 IHVC의 종단 간 문합을 고려하여 가장 잘 계산됩니다. 이 연결에 대한 우리의 개인적인 선호는 전통적인 봉합을 사용하는 반면 다른 사람들은 커프 시스템이 더 편리하다고 생각하는 것입니다 3,4; 어느 쪽이든, 어떤 방법으로든 3mm 정맥의 종단 간 문합에 익숙한 사람은 이 절차를 수행하는 데 필요한 모든 기술을 갖추고 있습니다. 이중 두부 현미경을 사용할 수 있기 때문에 우리는 이러한 수술을 두 사람과 함께 하는 것을 선호합니다. 그러나 이것은 단독으로 수행되었기 때문에 이 프로토콜의 성공을 위한 요구 사항은 아닙니다.

이 모델의 주요 수술 후 합병증은 이식편 간의 혈전증이며, 이는 세 가지 원인에 의해 유발됩니다. 첫째, 동맥 스텐트 자체가 스텐트 끝에 혈류에 와류 난류를 일으키는 버나 불규칙성이 있는 경우 혈전증을 유발할 수 있습니다. 스텐트는 가위가 아닌 날카로운 면도기로 절단한 다음 현미경으로 검사하여 결함이 없는지 확인해야 합니다. 둘째, 신장 동맥/PV 스텐트 문합이 신장 정맥/IHVC 문합 위에 위치하면 혈류를 제한하고 혈전증을 유발합니다. 동맥 스텐트의 최종 배치는 IHVC 아래에 있어야 합니다( 그림 2D 참조). 셋째, 항응고제인 헤파린을 사용한 수술 후 치료는 동종 이식의 혈전증을 예방하는 데 필수적이며, 저용량의 헤파린도 합성유전자 이식편에서 혈전증의 위험을 제거하는 데 도움이 됩니다.

여기에 보고된 syngeneic 이식편에 비해 동종 이식의 생존율이 낮은 것은 동맥 스텐트의 혈전증을 유발하는 거부 보조 간의 혈전성 특성을 반영합니다. 동종 이식에서 스텐트의 혈전형성을 방지할 수 있는 헤파린 투여 방법을 찾기 위해 여러 번의 시도가 필요했습니다. 처음에는 수술에서 살아남은 처음 6명의 동종이식술 수혜자 중 50%가 혈전증으로 인해 보조 간이 실패했지만, 헤파린 투여량이 증가함에 따라 다음 마지막 3명의 동종 이식은 혈전증 없이 생존했습니다. 앞으로 효과적인 헤파린 용량을 결정함에 따라 동종 이식의 성공률이 크게 증가할 것으로 기대합니다. 마찬가지로, 대부분의 신유전자 실패는 개발 초기에 발생했으며, 우리는 신유전자 이식의 성공률도 향상될 것으로 기대합니다.

우리는 Lewis to Brown Norway LTx의 급성 거부 모델을 사용했는데, 이는 Brown Norway to Lewis 균주 조합이16을 거부하지 않기 때문입니다. 이러한 거부 반응 모델과 함께 정소외 이식 방법을 사용할 때 간 거부 반응이 발생하면 수용 동물은 우울증에 걸리고 활동성을 잃으며 14일 이내에 죽기 전에 식사를 중단하면서 심각한 이환율을 겪는다는 점은 주목할 만하다16. 그러나 이 이종성 LTx 모델에서는 사망이 종점으로 사용되지 않으며 이환율이 발생하지 않습니다. 동물은 보조 간이 완전히 거부 된 경우에도 실험 기간 동안 건강하고 활동적인 상태를 유지합니다. 의심할 여지 없이, 이 이종적 LTx 모델은 수용 동물이 경험하는 고통, 고통 및 괴로움을 최소화하는 데 크게 기여합니다.

최근 정상온열 체외 간 관류(NEVLP)의 발전은 임상 이식 전에 간을 보관하는 방법의 흥미로운 발전입니다 17,18,19. NEVELP 기간 동안 기증자의 간은 생리적 활동을 재개하여 이식 전에 치료적 개입을 할 수 있습니다20,21. NEVLP는 또한 가장자리 장기(나이가 많거나 비만인 기증자의 간 또는 심장사 후 기증자로부터 조달한 간)의 생존 가능성을 평가하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다22,23. 흥미롭긴 하지만, NEVLP24,25 이후 쥐의 간을 이식할 수 있는 실험실은 소수에 불과합니다. 이는 동물에 대한 수술 스트레스와 NEVLP와 이식을 위해 간을 준비해야 하는 높은 기술적 요구 때문일 수 있습니다. 대조적으로, 이 원고에 요약된 헤테로토픽 LTx 수술 기법은 기술적으로 덜 까다롭고 동물에게 스트레스를 덜 유발합니다. 따라서 NEVLP의 소동물 모델 및 후속 이식에 실행 가능한 옵션이 될 수 있습니다.

결론적으로, 우리는 향후 이식 거부 반응 연구에 도움이 될 수 있는 저이환율의 대체 간 이식 모델을 제시합니다.

공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(NIH)의 지원을 받아 DA에 수여된 K08AI155816 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-0 실크 봉합사에티콘C013D
5-0 실크 넥타이정밀 과학 도구18020-50
6-0 실크 넥타이정밀 과학 도구18020-60
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참고문헌

  1. Lee, S., Edgington, T. S. Heterotopic liver transplantation utilizing inbred rat strains. Am J Pathol. 52 (3), 649-669 (1968).
  2. Hess, F., Jerusalem, C., Van der Heyde, M. N. Advantages of auxiliary liver homotransplantation in rats. Arch Surg. 104, 76-80 (1972).
  3. Marni, A., Ferrero, M. Heterotopic liver grafting in the rat. A simplified method using cuff techniques. Transplantation. 39 (3), 329-331 (1985).
  4. Kobayashi, E., et al. Auxiliary heterotopic liver transplantation in the rat: a simplified model using cuff technique and application for congenitally hyperbilirubimemic Gunn rat. Microsurgery. 18 (2), 97-102 (1998).
  5. Schleimer, K., et al. Auxiliary liver transplantation with flow-regulated portal vein arterialization offers a successful therapeutic option in acute hepatic failure--investigations in heterotopic auxiliary rat liver transplantation. Transpl Int. 19 (7), 581-588 (2006).
  6. Qiao, J., Han, C., Zhang, J., Wang, Z., Meng, X. A new model of auxiliary partial heterotopic liver transplantation with liver dual artery supply. Exp Ther Med. 9 (2), 367-371 (2015).
  7. Li, J., Ren, J., Zhang, J., Meng, X. A. Modified kidney-sparing portal vein arterialization model of heterotopic auxiliary liver transplantation increases liver IL-6, TNF-α, and HGF levels and enhances liver regeneration: an animal model. BMC Surg. 2, 281-292 (2022).
  8. Ono, Y., et al. Regeneration and cell recruitment in an improved heterotopic auxiliary partial liver transplantation (APLT) model in the rat. Transplantation. 101 (1), 92-100 (2017).
  9. Wang, J., et al. Auxiliary partial liver grafting in rats: effect of host hepatectomy on graft regeneration, and review of literature on surgical technique. Microsurgery. 22 (8), 371-377 (2002).
  10. Schleimer, K., et al. Heterotopic auxiliary rat liver transplantation with flow-regulated portal vein arterialization in acute hepatic failure. J Vis Exp. (91), e51115(2014).
  11. Prescott, M. J., Lidster, K. Improving quality of science through better animal welfare: the NC3Rs strategy. Lab Animal. 46 (4), 152-156 (2017).
  12. Banff schema for grading liver allograft rejection: an international consensus document. Hepatology. 25 (3), 658-663 (1997).
  13. Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2020 Annual Data Report: Liver. Am J Transplant. 22, Suppl 2 204-309 (2022).
  14. Nacif, L. S., et al. Late acute rejection in liver transplant: a systematic review. Arq Bras Cir Dig. 28 (3), 212-215 (2015).
  15. Levitsky, J., et al. Acute rejection increases risk of graft failure and death in recent liver transplant recipients. Clin Gastroenterol Hepatol. 15 (4), 584-593 (2017).
  16. Gong, J., Cao, D., Chen, Y., Li, J., Gong, J., Zeng, Z. Role of programmed death ligand 1 and Kupffer cell in immune regulation after orthotopic liver transplantation in rats. Int Immunopharmacol. 48, 8-16 (2017).
  17. Ceresa, C. D. L., Nasralla, D., Coussios, C. C., Friend, P. J. The case for normothermic machine perfusion in liver transplantation. Liver Transpl. 24 (2), 269-275 (2018).
  18. Nasralla, D., et al. A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation. Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).
  19. Markmann, J. F., et al. Impact of portable normothermic blood-based machine perfusion on outcomes of liver transplant: The OCS liver PROTECT randomized clinical trial. JAMA Surg. 157 (3), 189-198 (2022).
  20. Goldaracena, N., et al. Anti-inflammatory signaling during ex vivo liver perfusion improves the preservation of pig liver grafts before transplantation. Liver Transpl. 22 (11), 1573-1583 (2016).
  21. Carlson, K. N., et al. Interleukin-10 and transforming growth factor-beta cytokines decrease immune activation during normothermic ex vivo machine perfusion of the rat liver. Liver Transpl. 27 (11), 1577-1591 (2021).
  22. Ig-Izevbekhai, K., Goldberg, D. S., Karp, S. J., Foley, D. P., Abt, P. L. Immunosuppression in donation after circulatory death liver transplantation: Can induction modify graft survival. Liver Transpl. 26 (9), 1154-1166 (2020).
  23. Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion Injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
  24. Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890(2019).
  25. Schlegel, A., Graf, R., Clavien, P. A., Dutkowski, P. Hypothermic oxygenated perfusion (HOPE) protects from biliary injury in a rodent model of DCD liver transplantation. J Hepatol. 59 (5), 984-991 (2013).

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