방법 논문

Rats에서 유래한 Decellularized Spleen Matrix의 제작

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DOI:

10.3791/66520

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2024년 2월 9일

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1National Local Joint Engineering Research Center for Precision Surgery and Regenerative Medicine, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 2Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 3Center for Regenerative and Reconstructive Medicine, Med-X Institute, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 4Department of Graduate School, Xi'an Medical University

이 논문에서

요약

탈세포화된 비장 매트릭스(DSM)는 간 조직 공학 분야에서 유망한 응용 분야를 보유하고 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 비장 채취, 관류를 통한 탈세포화, 결과 DSM을 평가하여 특성을 확인하는 것을 포함하는 쥐 DSM을 준비하는 절차를 간략하게 설명합니다.

초록

간 이식은 말기 간 질환의 주요 치료법입니다. 그러나 기증 장기의 부족과 불충분한 품질로 인해 대체 요법의 개발이 필요합니다. 탈세포화된 간 기질(DLM)을 활용하는 생체 인공 간(BAL)이 유망한 솔루션으로 부상하고 있습니다. 그러나 적절한 DLM을 소싱하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 탈세포화 비장 기질(DSM)의 사용은 BAL의 기초로 연구되어 쉽게 사용할 수 있는 대안을 제공합니다. 이 연구에서는 쥐의 비장을 채취하고 동결-해동 주기와 탈세포화 시약을 사용한 관류를 조합하여 탈세포화했습니다. 이 프로토콜은 DSM 내에서 세포외 기질(ECM)의 미세 구조와 구성 요소를 보존했습니다. 완전한 탈세포화 공정에는 약 11시간이 소요되어 DSM 내에서 온전한 ECM을 얻을 수 있었습니다. 조직학적 분석을 통해 ECM의 구조와 조성을 유지하면서 세포 성분이 제거되는 것을 확인했습니다. 제시된 프로토콜은 DSM을 획득하기 위한 포괄적인 방법을 제공하여 간 조직 공학 및 세포 치료에 잠재적인 응용 분야를 제공합니다. 이러한 발견은 말기 간 질환 치료를 위한 대체 접근법 개발에 기여합니다.

서론

간 이식은 말기 간 질환에 대한 유일한 최종 치료법으로 남아있습니다 1,2,3. 그러나 기증 장기의 심각한 부족과 품질 저하로 인해 대체 치료법의 필요성이 높아졌다4. 재생 의학 분야에서는 탈세포화 간 매트릭스(DLM)를 활용하는 생체 인공 간(BAL)이 유망한 솔루션으로 부상했습니다 5,6,7. DLM은 복잡한 미세혈관 네트워크와 ECM의 구성 요소를 포함한 원래의 간 구조를 보존하여 간 질환을 완화할 수 있는 이식 가능한 BAL을 만들기 위한 골격을 제공합니다.

이러한 약속에도 불구하고 이 기술의 채택은 특히 적합한 DLM을 소싱하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 인간 유래 DLM은 공급이 부족한 반면 동물에서 유래한 DLM은 질병 전염 및 면역 거부 반응의 위험이 있습니다. 혁신적인 접근 방식으로, 우리의 연구는 BAL 8,9,10,11의 기초로 탈세포화 비장 매트릭스(DSM)의 사용을 탐구했습니다. 비장은 문맥 고혈압, 외상성 파열, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 심장사 후 헌혈과 같은 다양한 의료 상황에서 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 따라서 비장은 연구 목적으로 간보다 더 널리 이용할 수 있습니다. 비장 절제술을 받은 환자는 심각한 질환을 앓고 있지 않아 비장의 불필요 가능성을 더욱 확인시켜줍니다. 비장의 미세환경, 특히 세포외 기질과 정현파는 간의 미세환경과 유사합니다. 따라서 비장은 간세포 이식 연구에서 세포 접착 및 증식에 적합한 장기입니다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 이전 연구에서 DSM은 DLM과 유사한 미세 구조 및 구성 요소를 공유하고 알부민 및 요소 생성을 포함한 간세포의 생존 및 기능을 지원할 수 있음을 입증했습니다. 또한 DSM은 골수 중간엽 줄기 세포의 간 분화를 향상시켜 개선되고 일관된 기능을 제공하는 것으로 나타났습니다.

헤파린으로 처리된 DSM을 사용함으로써 효과적인 단기 항응고 및 부분적인 간 기능 보상을 입증할 수 있는 기능성 BAL을 설계했습니다11. 결과적으로 이 3차원 DSM은 간 조직 공학 및 세포 치료의 발전에 중요한 가능성을 가지고 있습니다. 이 연구에서는 ECM의 미세 구조와 구성 요소를 보존하는 쥐 비장을 채취하고 DSM을 준비하는 자세한 방법을 제시합니다.

프로토콜

이 연구는 Xi'an Jiaotong University의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 비장 적출

  1. 무게가 250-280g인 수컷 Sprague Dawley 쥐를 사용하십시오. 온도와 습도가 조절되는 방에 쥐를 수용하고 수술 전 금식을 제외하고는 즉시 음식과 물을 제공하십시오.
  2. 수술 1시간 전에 진통제로 부프레노르핀(0.05mL/kg)을 피하 주사합니다. 이소플루란 흡입으로 쥐를 마취시킵니다. 플렉시글라스 상자에서 유도 마취를 위해 5% 이소플루란의 1.5L/min의 유속을 사용하고 마스크를 통해 2% 이소플루란의 0.6-0.8L/min의 유속으로 마취를 유지합니다. 발가락을 끼워 마취의 깊이를 확인합니다.
  3. 전기 면도기를 사용하여 복부 전체의 피부를 면도하십시오. 수술 테이블에 쥐를 누운 자세로 고정합니다. 음경 등쪽 정맥을 통해 헤파린화 식염수 2mL(헤파린 1,000U)를 주입하여 전신 항응고를 달성합니다. 포비돈 요오드 용액으로 면도한 피부를 소독하고 멸균 드레이핑 천으로 덮습니다.
  4. 수술용 가위를 사용하여 복부를 십자형으로 절개하고, 지혈 겸자로 스트레칭하여 복강을 노출시키고, 간을 횡격막 쪽으로 뒤집습니다. 위장관을 복부 오른쪽으로 바깥쪽으로 펴고 촉촉한 거즈로 덮습니다.
  5. 비장 위인대를 조심스럽게 분리하고 절단하여 비장 하부를 노출시킵니다.
    참고: 약 3.0cm x 0.6cm x 0.6cm 크기의 붉은색을 띤 길쭉한 구조로 나타나는 비장은 왼쪽 복부에서 확인할 수 있습니다.
  6. 비장 동맥을 따라 절개하여 총간동맥, 위십이지장 동맥, 비장 동맥을 점차적으로 분리하고 노출시킵니다. 위십이지장 동맥과 총간동맥을 결찰하고 절단하면서 주변 조직을 점진적으로 해리합니다.
  7. 비장을 오른쪽으로 뒤집어 복부 대동맥을 노출시킵니다. 부드럽게 둔하게 절제하고 면봉을 사용하여 복부 대동맥과 복강 줄기를 노출시킵니다. 셀리악병 줄기의 가지 위와 아래에 약 3cm 길이의 3-0 실크 봉합사를 놓고 셀리악 줄기의 가지 위에 약 10cm 길이의 6-0 실크 봉합사를 놓습니다.
  8. 복부 대동맥을 복강 줄기의 가지 아래와 위로 합자합니다. 동맥 가지를 작게 절개합니다. 6-0 실크 봉합사를 부드럽게 들어 올리고 24G 정맥 카테터를 복강 줄기를 따라 비장 동맥에 삽입한 다음 결찰하고 고정합니다.
  9. 4mL/분의 속도로 주사기 펌프를 사용하여 헤파린화 생리식염수(25U/mL)를 50mL 부피로 주입합니다. 동시에 주입된 액체가 비장 밖으로 흐를 수 있도록 유출 채널로 문맥을 절단합니다. 동물은 exsanguination에 의해 안락사됩니다.
  10. 비장의 주변 조직을 조심스럽게 절개하여 췌장이 손상되지 않도록 하면서 주요 부속 혈관을 보존합니다.
  11. 비장 주변에 누출이 있는지 확인한 다음 비장과 췌장을 제거하고 생리식염수로 헹굽니다.
    참고: 쥐의 비장과 췌장은 밀접하게 연결되어 있으며 췌장은 비장 동맥을 감싸고 있습니다. 비장을 따로 제거하면 수많은 작은 혈관을 결찰하는 것이 어려울 수 있습니다. 이 절차에서는 비장을 췌장과 함께 제거합니다. 탈세포화 후 비장과 췌장이 투명해지고 미세혈관이 보이게 되어 혈관이 온전한 비장의 보존을 용이하게 합니다.
  12. 비장을 생리식염수로 채워진 50mL 원심분리 튜브에 넣고 -80°C 냉동고에 보관합니다.
    알림: 비장 동맥에 삽입된 비장과 정맥 카테터는 관류 실험 중 편리한 연결을 위해 함께 냉동 보존됩니다.

2. 비장 탈세포화

  1. 멸균 용기에서 동결-해동 과정을 3회 반복하여 비장 세포를 용해합니다.
    참고: 동결-해동 사이클은 스캐폴드 탈셀룰라화에 사용되는 물리적 방법입니다. 비장 조직을 -80°C의 냉동고에 밤새 넣어 얼린 다음 저온 환경에서 제거하고 실온 또는 37°C 수조에 넣어 해동합니다. 이 동결 및 해동 과정이 3-6회 반복되어 세포막을 파괴하고 세포 용해를 일으킵니다.
  2. 연동 펌프, 2L 리저버, 내경 2.4mm의 실리콘 튜브 및 버블 트랩으로 구성된 클린 벤치 내에 관류 시스템을 설정합니다(그림 1).
  3. 관류 시스템에 탈이온수(ddH2O)를 채우고 10분 동안 계속 작동시킵니다.
  4. 채취한 비장을 ddH2O 충전 용기에 조심스럽게 옮깁니다.
  5. 비장 동맥에 삽입된 정맥 카테터에 실리콘 튜브를 연결합니다.
  6. 30분 동안 2mL/분의 속도로 ddH2O로 관류를 시작합니다.
  7. 30분 동안 4mL/분의 속도로 ddH2O로 계속 관류합니다.
  8. 4시간 동안 0.1%(w/v) SDS 솔루션으로 관류.
  9. 1%(v/v) Triton X-100 용액을 2시간 동안 관류합니다.
  10. DSM을 세척하기 위해 4시간 동안 4mL/분의 속도로 PBS를 관류합니다.
    알림: 모든 액체의 단방향 관류를 위해 연동 펌프를 사용합니다.
  11. 관류가 완료된 후 췌장과 비장 사이의 혈관 가지를 결찰하고 경절한 다음 췌장을 제거합니다. -20°C에서 10% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 PBS에 담근 깨끗하고 밀봉된 50mL 원심분리기 튜브에 DSM을 보관하여 향후 실험에 사용할 수 있습니다.

결과

이 프로토콜은 쥐 비장의 탈세포화를 위해 반복적인 동결-해동 주기와 탈세포화 시약을 사용한 관류의 조합을 활용했습니다. 비장의 완전한 탈세포화는 약 11시간 내에 달성되었습니다(그림 2A). 탈세포화 과정을 통해 비장의 색은 점차 짙은 빨간색에서 얼룩덜룩하고 밝은 빨간색으로 변하고 결국에는 흰색 반투명 모양으로 변했습니다(그림 2B). 전체적인 형태는 비교적 온전하게 유지되었으며 혈관 구조가 눈에 띄었습니다(그림 2B).

Hematoxylin-eosin 염색을 통해 세포 성분이 제거된 것을 확인하여 DSM 내에서 온전한 ECM을 드러냈습니다. 이것은 그림 3A에서 볼 수 있듯이 세포핵과 세포질 요소가 보이는 본래의 비장(脾臟)과 극명한 대조를 이룹니다. 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 염색 및 잔류 DNA 측정(DSM: 10.1 ± 4 ng/mg 건조 중량, 천연 비장: 6,200 ± 300 ng/mg 건조 중량)을 통해 세포의 부재를 추가로 확인했습니다. 주사 전자 현미경 이미지는 비장에서 림프구를 완전히 제거한 후 벌집 구조를 보여주는 DSM의 초구조적 특성을 보여주었습니다(그림 3C). 이것은 비장의 탈세포화가 정상 비장의 초구조와 구조를 보존한다는 것을 나타냅니다. DSM 내에 존재하는 중요한 ECM 단백질에 대한 보다 포괄적인 평가를 위해 Masson trichrome(그림 3B) 및 면역형광 염색이 사용되었습니다. 구체적으로, 콜라겐 I(그림 3D)과 피브로넥틴(그림 3E)이 분석 대상이었습니다. 그 결과, ECM의 구조적 및 기저막 구성 요소가 모두 본래의 비장과 유사하게 유지되는 것으로 나타났습니다.

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그림 1: 실험 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 탈세포화(decellularization) 및 총체적인 형태학적 변화의 워크플로우. (A) 탈세포화된 비장 매트릭스 준비 워크플로우. 비장의 완전한 탈세포화는 대략 11시간 내에 이루어졌다. (B) DSM 준비 중 비장의 총 형태학적 변화. 이 과정에서 비장의 색은 점차 짙은 붉은색에서 얼룩덜룩하고 연한 빨간색으로 변하고 결국에는 흰색의 반투명한 모양으로 변했습니다. (나) 1. 반복적인 동결-해동 주기 후 및 탈세포화 전. 2. 탈이온수로 1시간 동안 헹궈낸 후 3. 4시간 동안 SDS로 관류 후. 2시간 동안 Triton으로 관류 후. 약어: DSM = decellularized spleen matrix; SDS = 소듐 도데실 설페이트; PBS = 인산염 완충 식염수; PS = 페니실린-스트렙토마이신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 탈세포화된 비장 기질의 형태학적 관찰. (A) H&E 염색; (B) 마손 트리크롬 염색; (C) SEM; (D,E) 콜라겐 I 및 피브로넥틴의 면역형광 염색; (F) DAPI 염색. 스케일 바 = 50 μm (A, B, D-F), 5 μm (C). 약어: DSM = decellularized spleen matrix; H&E = 헤마톡실린-에오신; SEM = 주사 전자 현미경; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

BAL은 말기 간 질환의 치료를 위한 효과적인 접근법이며, 특히 현재 기증 장기의 부족으로 인해 간 이식이 방해를 받는 경우에 효과적이다6. BAL을 생성하기 위한 유망한 옵션은 고유 간의 자연적인 ECM과 혈관 구조를 보존하는 DLM을 활용하는 것입니다. 그러나 인간 DLM의 희소성과 동물 DLM과 관련된 감염 및 면역원성의 잠재적 위험은 상당한 한계를 제시합니다. 이 문제를 해결하기 위해 BAL 8,9,10,11의 대체 골격으로 탈세포화 비장 매트릭스(DSM)를 사용하는 새로운 전략을 제안합니다. 비장은 다양한 임상 상황에서 더 쉽게 접근할 수 있으며 간과 유사한 특성을 보입니다. 이 연구에서는 쥐의 비장을 채취하고 ECM의 미세 구조와 구성 요소를 보존하는 DSM을 준비하는 자세한 방법을 제시합니다.

이상적인 탈세포화 방법은 ECM(12,13,14)의 원래 구조, 조성 및 기계적 특성을 유지하면서 세포 성분을 제거하는 것입니다. 탈세포화 방법은 물리적, 화학적, 효소적 처리를 포함하며, 각각의 고유한 장점과 단점이 있다15. 이러한 방법은 세포 구성 요소를 부분적으로 제거할 수 있지만 나머지 ECM의 구성, 구조 및 기능을 손상시킬 수도 있습니다. 탈세포화의 품질은 세포 밀도, 매트릭스 두께 및 다양한 조직 공급원에 걸친 조직 형태의 변화에 의해 영향을 받을 수 있습니다.

현재까지 탈세포화 공정에 대한 황금 표준은 없습니다. 전형적으로, 이러한 방법들 중 어느 하나를 단순히 사용하는 것만으로는 ECM에 대한 부작용을 최소화하고 세포 함량의 제거를 최대화하는데 부적절하다. 결과적으로 가장 효과적인 접근법은 조직 특성에 의존하므로 이러한 방법의 조합이 필요합니다. 이 연구에서는 물리적 방법(동결-해동 주기 및 관류)과 화학적 방법(SDS 및 TritonX-100)을 결합하여 쥐의 비장을 탈세포화하는 프로토콜을 활용했습니다.

동결-해동 주기는 세포 용해와 ECM16에서 세포의 빠른 분리를 촉진합니다. 동시에, 본래의 혈관구조를 통한 관류는 탈세포화 효율을 크게 향상시키고 원래의 혈관 네트워크(17)를 보존한다. 이온 세제로 기능하는 도데실 황산나트륨(SDS)은 세포막과 핵막을 모두 능숙하게 용해시켜 세포질 및 핵 구성 요소를 보다 포괄적으로 제거합니다. 그러나 이 과정은 또한 당사미노글리칸(GAG)과 콜라겐의 고갈로 인해 ECM 초세구조에 손상을 입힙니다.

SDS의 농도 상승은 ECM 스캐폴드 내의 잔류 DNA 함량 감소 및 기계적 강도 감소와 상관관계가 있었습니다. 반대로, SDS의 더 낮은 농도는 교원질의 더 많은 양을 보존하고 ECM 단백질의 더 적은 변성을 유도했습니다. 이와 대조적으로, 비이온 세제 역할을 하는 Triton X-100은 지질-지질, 지질-단백질 및 DNA-단백질 상호 작용을 효과적으로 방해하여 세포막 용해에 대한 보다 가벼운 접근 방식을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 세포핵과 DNA를 완전히 제거하기에는 부적합한 것으로 판명되었다. 따라서 ECM의 원래 구조, 구성 및 성능을 유지하면서 세포 구성 요소를 완전히 제거하기 위해 저농도의 SDS 및 물리적 치료와 결합해야 합니다. 잔류 세제는 특정 세포 독성을 가질 수 있으므로 보관 전에 멸균 PBS 또는 증류수로 후처리 헹굼이 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

이 프로토콜의 한 가지 제한 사항은 잔류 SDS 및 Triton X-100에 대한 정량화가 없다는 것입니다. 이 결정은 우리 팀의 경험과 확증 보고서에 의해 알려졌으며, 이는 4시간 PBS 세척이 이러한 물질을 효과적으로 제거하기에 충분하다고 제안합니다. 또한, 이 프로토콜을 사용한 이전 세포 배양 실험에서는 세포 독성의 징후가 나타나지 않았습니다. 프로토콜의 비용을 최소화하기 위해 잔류 세제의 정량화를 포기하는 신중한 선택이 이루어졌습니다.

결론적으로, 이 프로토콜은 DSM 준비를 위한 실현 가능한 방법을 제시하여 효율성, 안정성 및 최소 침습성을 입증합니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 DSM은 비장의 고유한 구조, 구성 및 자연 혈관 네트워크를 유지합니다. 또한 세포 이식 및 3차원 동적 배양을 위한 발판을 제공하여 조직 공학 간의 연구를 발전시키기 위한 기반을 마련합니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 선언했습니다.

감사의 글

이 연구는 중국국가자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82000624), 산시성 자연과학 기초 연구 프로그램(2022JQ-899 & 2021JM-268), 산시성 혁신 역량 지원 프로그램(Shaanxi Province Innovation Capability Support Program, 2023KJXX-030), 산시성 중점 R&D 계획 대학 공동 프로젝트-중점 프로젝트(2021GXLH-Z-047), 시안교통대학교 제1부속병원 기관 재단(2021HL-42 & 2021HL-21)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마취 기계하버드 장치탁상용동물 마취
버블 트랩Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.기공 직경 : 5 μ m기포 방지
부프레노르핀TIPR 제약 책임 유한 공사진통제
지혈 집게상하이 의료 기기  Co., LtdJ31020수술 도구
Heparinized SalineSPH No.1 Biochemical & 제약 Co., LTD 혈전증의 형성을 예방합니다 
RWD생명 과학 Co.마취제: 마취 유도 및 유지 관리를 위해
페니실린-스트렙토마이신 공급자:Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C0222미생물 오염을 방지하기 위한 체외 항생제
연동 펌프Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd.BT100-1L
인산염 완충 식염수Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.4481228인산 완충기 소금 해결책
실리콘 관보정 더 긴 정밀도 펌프 Co., 주식 회사.2.4&시간; 0.8mm
실크 봉합사Yangzhou Jinhuan 의료 기기 공장6-0 및 3-0인합 혈관
나트륨 Dodecyl SulfateShanghai Titan Scientific Co., Ltd.151-21-3이온 세제, 세포와 핵막을 모두 용해
주사기 펌프Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., LtdBeneFusion SP5정맥 주입
Triton X-100Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.9002-93-1비이온 세제, 지질-지질, 지질-단백질 및 DNA-단백질 상호 작용을 방해합니다
정맥 카테터B. Braun Company24G비장 동맥 삽입

참고문헌

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