방법 논문

HIV-1에 감염된 T 세포에서 소포체 스트레스 및 풀린 단백질 반응을 측정하고 HIV-1 복제에서 그 역할을 분석합니다.

3.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66522

⸱

2024년 6월 14일

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

이 논문에서

요약

여기에서는 특히 HIV-1 감염에 중점을 두고 소포체(ER) 스트레스 및 풀린 단백질 반응(UPR) 활성화를 측정하기 위한 몇 가지 확립된 방법에 대해 설명합니다. 이 기사에서는 또한 ER 스트레스/UPR이 HIV-1 복제 및 바이러스 감염성에 미치는 영향을 조사하기 위한 일련의 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

바이러스 감염은 비정상적인 단백질 축적으로 인해 소포체(ER) 스트레스를 유발하여 풀림 단백질 반응(UPR)을 유발할 수 있습니다. 바이러스는 숙주 UPR을 조작하기 위한 전략을 개발했지만, 문헌에서 HIV-1 감염 중 UPR 조절 및 그 기능적 중요성에 대한 자세한 이해가 부족합니다. 이러한 맥락에서 현재 기사에서는 T 세포에서 HIV-1 감염 중 ER 스트레스 수준과 UPR을 측정하기 위해 실험실에서 사용하는 프로토콜과 UPR이 바이러스 복제 및 감염성에 미치는 영향에 대해 설명합니다.

티오플라빈 T(ThT) 염색은 단백질 응집체를 검출하여 세포의 ER 응력을 검출하는 데 사용되는 비교적 새로운 방법입니다. 여기에서는 ER 스트레스를 감지하고 정량화하기 위해 HIV-1에 감염된 세포에서 ThT 염색을 위한 프로토콜을 설명했습니다. 또한, 기존의 면역블로팅 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하여 BiP, 인산화 IRE1, PERK 및 eIF2α와 같은 UPR 마커의 수준, XBP1의 접합, HIV-1 감염 세포에서 ATF6, ATF4, CHOP 및 GADD34의 절단을 측정함으로써 ER 스트레스도 간접적으로 감지되었습니다. 우리는 ThT 형광이 UPR 활성화 지표와 상관 관계가 있음을 발견했습니다. 이 기사는 또한 녹다운 실험과 약리학적 분자의 사용을 통해 ER 스트레스 및 UPR 조절이 HIV-1 복제에 미치는 영향을 분석하는 프로토콜을 보여줍니다. HIV-1 유전자 발현/복제 및 바이러스 생산에 대한 UPR의 영향은 각각 Luciferase 리포터 분석과 p24 항원 포획 ELISA로 분석하였으며, 비리온 감염력에 대한 영향은 감염된 리포터 세포의 염색으로 분석하였다. 종합적으로 이 일련의 분석법은 HIV-1 감염 중 풀린 단백질 반응 경로에 대한 포괄적인 이해를 제공하여 복잡한 역학을 드러냅니다.

서론

후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)은 CD4+ T-림프구의 수가 점진적으로 감소하여 면역 반응의 점진적인 실패를 초래하는 것이 특징입니다. 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)은 AIDS의 원인 병원체입니다. 이 바이러스는 포지티브한 의미의 단일 가닥 RNA 바이러스로, virion 당 두 개의 RNA 사본이 있으며 retroviridae 과에 속합니다. 숙주 세포 내에서 고농도의 바이러스 단백질 생산은 세포의 단백질 접힘 기계에 과도한 스트레스를 가합니다1. ER은 진핵 세포의 분비 경로에 있는 첫 번째 구획입니다. 그것은 단백질을 생산, 변경 및 분비 경로와 세포 외 공간 표적 부위로 전달하는 일을 담당합니다. 단백질은 수많은 번역 후 변화를 겪으며 아스파라긴 결합 당화(asparagine-linked glycosylation) 및 분자 내 및 분자 간 이황화 결합(intra- and intermolecular disulfide bonds creation)을 포함하여 ER에서 자연스러운 형태로 접힙니다2. 따라서 고농도의 단백질이 ER 내강에 존재하며 이들은 응집 및 잘못 접히기 매우 쉽습니다. 향상된 단백질 합성 또는 단백질 돌연변이를 요구하는 열 충격, 미생물 또는 바이러스 감염과 같은 다양한 생리적 조건은 ER에서의 단백질 축적 증가로 인해 ER 스트레스를 유발하여 ER 내강 항상성을 방해합니다. ER 스트레스는 고도로 보존된 적응 신호 전달 경로 네트워크인 풀림 단백질 반응(UPR)3을 활성화합니다. UPR은 풀린 단백질 부담과 접힘 용량을 정렬하여 정상적인 ER 생리적 상태를 되돌리기 위해 사용됩니다. 이는 ER의 크기와 ER에 상주하는 분자 샤페론 및 폴다아제의 증가로 인해 발생하며, 그 결과 ER의 접힘 능력이 향상됩니다. UPR은 또한 translational level에서 global protein synthesis attenuation을 통해 ER의 단백질 부하를 감소시키고 ER-associated degradation(ERAD)을 상향 조절하여 ER에서 풀린 단백질의 클리어런스를 증가시킵니다4,5.

ER 스트레스는 3개의 ER 상주 막관통 단백질, 즉 Protein kinase R(PKR) 유사 소포체 키나아제(PERK), 활성화 전사 인자 6(ATF6) 및 이노시톨 필요 효소 유형 1(IRE1)에 의해 감지됩니다. 이러한 모든 이펙터는 결합 단백질(BiP)/78kDa 포도당 조절 단백질(GRP78)이라고도 하는 샤페론 열충격 단백질 패밀리 A(Hsp70) 멤버 5(HSPA5)에 결합하여 비활성 상태로 유지됩니다. ER 스트레스와 풀린/잘못 접힌 단백질의 축적에 따라 HSPA5는 해리되어 이러한 effector의 활성화를 유도한 다음 ER 스트레스를 해결하는 데 도움이 되는 일련의 다운스트림 표적을 활성화하고 극한 조건에서 세포 사멸을 촉진합니다6. HSPA5에서 분리되면 PERK가 자가인산화되고 키나아제 활성이 활성화됩니다7. 키나아제 활성은 eIF2α를 인산화하여 번역 감쇠를 일으켜 ER8의 단백질 부하를 낮춥니다. 그러나, 인-진핵생물 개시 인자 2α(eIF2α)가 존재하는 경우, 특정 mRNA에서 번역되지 않은 열린 판독 프레임(예: ATF4, 조절 스트레스 유발 유전자)이 우선적으로 번역됩니다. ATF4 및 C/EBP 상동 단백질(CHOP)은 스트레스 유발 유전자를 조절하고 세포사멸 및 세포 사멸 경로를 조절하는 전사 인자입니다 9,10. ATF4 및 CHOP의 표적 중 하나는 성장 정지 및 DNA 손상 유도 단백질(GADD34)로, 단백질 인산가수분해효소 1과 함께 peIF2α를 탈인산화하고 병진 감쇠(translational attenuation)에 대한 피드백 조절자역할을 한다 11. ER 스트레스 하에서 ATF6는 HSPA5에서 분리되고 골지 국소화 신호가 노출되어 골지 장치로 전위됩니다. 골지체에서 ATF6는 site-1 프로테아제(S1P) 및 site-2 프로테아제(S2P)에 의해 절단되어 절단된 형태의 ATF6(ATF6 P50)를 방출한다. 그런 다음 ATF6 p50은 핵으로 전위되어 단백질 접힘, 성숙 및 분비에 관여하는 유전자의 발현과 단백질 분해를 유도합니다12,13. ER 스트레스 동안 IRE1은 HSPA5에서 분리되고 다중화 및 자동 인산화14. IRE1의 인산화는 RNase 도메인을 활성화하여 X-box 결합 단백질 1(XBP1)15,16의 mRNA의 중앙 부분에서 26개의 뉴클레오티드의 접합을 매개합니다. 이것은 transactivation 기능을 부여하는 새로운 C-terminus를 생성하고, 기능성 XBP1s 단백질을 생성하며, 이는 여러 ER 스트레스 유발 유전자를 제어하는 강력한 전사 인자입니다17,18. 이러한 전사 인자의 결합된 활동은 ER 항상성 회복을 목표로 하는 유전자 프로그램을 활성화합니다.

ER 스트레스 및 UPR을 감지하는 다양한 방법이 있습니다. 이들은 UPR 마커(19, 20)를 분석하는 종래의 방법을 포함한다. 다양한 비전통적인 방법에는 UPR의 산화 환원 상태 측정과 ER 루멘의 칼슘 분포 측정과 ER 구조 평가가 포함됩니다. 전자 현미경을 사용하여 세포와 조직의 ER 스트레스에 대한 반응으로 ER 내강이 얼마나 커지는지 확인할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 시간이 많이 걸리고 전자 현미경의 가용성에 따라 달라지므로 모든 연구 그룹에서 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 또한 ER의 칼슘 플럭스와 산화 환원 상태를 측정하는 것은 시약의 가용성으로 인해 까다롭습니다. 또한, 이러한 실험의 판독값은 매우 민감하며 세포 대사의 다른 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다.

UPR 출력을 모니터링하기 위한 강력하고 간단한 기술은 UPR의 다양한 신호 경로의 활성화를 측정하는 것이며 다양한 스트레스 시나리오에서 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. UPR 활성화를 측정하기 위한 이러한 종래의 방법들은 경제적이고, 실현 가능하며, 다른 알려진 방법들에 비해 더 짧은 시간에 정보를 제공한다. 여기에는 단백질 수준에서 IRE1, PERK 및 eIF2α의 인산화와 같은 UPR 마커의 발현을 측정하기 위한 면역블로팅, ATF6의 P50 형태를 측정하여 ATF6의 절단, HSPA5, 스플라이스 XBP1, ATF4, CHOP 및 GADD34와 같은 다른 마커의 단백질 발현을 측정하기 위한 RT-PCR뿐만 아니라 mRNA 수준을 측정하기 위한 RT-PCR과 XBP1 mRNA의 스플라이싱이 포함됩니다.

이 기사에서는 HIV-1 감염 세포에서 ER 스트레스 및 UPR 활성화를 모니터링하고 HIV-1 복제 및 감염성에서 UPR의 기능적 관련성을 결정하기 위한 검증되고 신뢰할 수 있는 프로토콜 세트에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 구할 수 있고 경제적인 시약을 사용하며 UPR 출력에 대한 설득력 있는 정보를 제공합니다. ER 응력은 단백질 응집체를 형성하기 쉬운 풀린/잘못 접힌 단백질의 축적의 결과입니다21. 이로써 HIV-1에 감염된 세포에서 이러한 단백질 응집체를 검출하는 방법을 설명한다. 티오플라빈 T 염색은 이러한 단백질 응집체를 검출하고 정량화하는 데 사용되는 비교적 새로운 방법입니다22. Beriault와 Werstuck 박사는 단백질 응집체를 검출하고 정량화하여 살아있는 세포의 ER 스트레스 수준을 측정하는 이 기술을 설명했습니다. 작은 형광 분자 티오플라빈 T(ThT)가 단백질 응집체, 특히 아밀로이드 피브릴에 선택적으로 결합하는 것으로 입증되었습니다.

이 기사에서는 HIV-1에 감염된 세포에서 ER 스트레스를 감지 및 정량화하기 위해 ThT를 사용하는 방법을 설명하고 UPR의 다양한 신호 전달 경로의 활성화를 측정하여 UPR을 모니터링하는 기존 방법과 연관시킵니다.

HIV-1 감염 중 UPR의 역할에 대한 포괄적인 정보도 부족하기 때문에 HIV-1 복제 및 바이러스 감염성에서 UPR의 역할을 이해하기 위한 일련의 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜에는 UPR 마커의 렌티바이러스 매개 knockdown과 약리학적 ER 스트레스 유발 물질을 사용한 치료가 포함됩니다. 이 논문은 또한 LTR(Long Terminal Repeat) 기반 루시페라아제 분석, p24 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 및 β-gal 리포터 염색 분석과 같이 HIV-1 유전자 발현, 바이러스 생산 및 생산된 바이러스의 감염성을 측정하는 데 사용할 수 있는 판독 유형을 보여줍니다.

이러한 프로토콜의 대부분을 사용하여 우리는 최근에 HIV-1 감염이 T 세포23의 UPR에 미치는 기능적 함의를 보고했으며, 해당 논문의 결과는 여기에 설명된 방법의 신뢰성을 시사합니다. 따라서 이 기사에서는 HIV-1과 ER 스트레스 및 UPR 활성화의 상호 작용에 관한 포괄적인 정보를 제공하는 일련의 방법을 제공합니다.

프로토콜

참고: 여기에 사용된 세포주는 HEK-293T 및 Jurkat J6(CD4+T 세포주)이며, 이는 인도 푸네의 NCCS에 있는 Cell Repository에서 얻은 것입니다. HIV-1 LTR(Long Terminal Repeat) 프로모터24 및 CEM-GFP(또 다른 CD4+ T 리포터 세포주)25 하에 β-갈락토시다아제 및 루시페라아제 유전자의 사본을 통합한 HeLa 유래 세포주인 TZM-bl은 미국 NIH AIDS Repository에서 획득되었습니다.

1. HIV-1 바이러스 재고 준비 및 보관

  1. HIV-1 바이러스 스톡 준비
    참고: HIV-1과 관련된 모든 실험에서 세계 보건 기구(WHO) 또는 질병 통제 예방 센터(CDC) 매뉴얼에서 사용할 수 있는 생물 안전성 관련 국제 지침을 실천하는 것이 좋습니다. 바이러스 취급 및 살아있는 바이러스에 대한 모든 실험은 최소한 BSL2 수준 격리 실험실에 있는 적절한 생물 안전 캐비닛에서만 수행되어야 합니다. 인산칼슘 포유류 transfection 키트를 사용한 감염성 HIV-1 입자 생산은 프로토콜의 이 부분에 설명되어 있습니다.
    1. HEK-293T 세포를 90mm 접시에 파종하고 10mL의 완전(10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 보충) DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 클래스 II 유형 A2 생물 안전 캐비닛에 넣고 세포의 합류가 50%-60% 사이가 되도록 37°C의 조직 배양 인큐베이터에서 약 12시간 동안 보관합니다.
    2. 다음 날, transfection 혼합물 만들기: 멸균 완충액에 pNL4.3(HIV-1의 분자 클론) 플라스미드 DNA 25μg, 2M CaCl2 86.8μL, 남은 멸균수를 함유한 용액 A를 준비하여 각 플레이트에 대해 최종 부피를 700μL로 만듭니다. 700플레이트에 2x HEPES 완충 식염수(HBS) 700μL가 포함된 용액 B를 준비합니다. 그런 다음 총 플레이트 수에 대한 계산을 조정합니다.
    3. 이제 Solution A를 지속적으로 소용돌이치면서 Solution B를 Solution A에 적하 방식으로 추가합니다. transfection mix의 총 부피는 이제 플레이트 한 개당 1.4mL가 됩니다.
      참고: 지속적인 와류(vortexing)가 발생하는 동안 용액 B를 용액 A에 정밀하게 적하하여 첨가하면 완벽한 transfection complex가 형성됩니다.
    4. 이 혼합물을 실온(RT)에서 약 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 새로운 9mL의 완전한 DMEM이 들어 있는 각 플레이트에 혼합물을 천천히 적하하고 플레이트를 CO2 인큐베이터로 옮깁니다. 8-10시간 후 기존 배지를 새 10mL의 완전한 DMEM으로 교체합니다.
    5. 매체 교체 후 24시간 후 원추형 튜브의 모든 플레이트에서 상층액(바이러스 입자 포함)을 수집합니다. 저속 탁상용 원심분리기(Table of Materials)를 사용하여 600 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
    6. 상층액을 폴리알로머 초원심분리기 튜브로 옮기고 초원심분리기의 스윙아웃 로터에 넣습니다(재료 표). 균형을 위해 튜브 홀더의 무게를 확인하고 필요한 경우 멸균 배지로 조정하십시오.
    7. 1,41,000 x g 의 초원심분리기, 4°C에서 2.5시간 동안 사용할 수 있습니다. 그런 다음 튜브를 조심스럽게 꺼내고 생물 안전 캐비닛 내부에서 상층액을 천천히 디캔팅합니다.
    8. 각 튜브의 펠릿(현재 농축된 바이러스)에 불완전한 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 1mL를 추가하고 펠릿을 제거하기 위해 격렬한 피펫팅을 수행합니다.
      알림: 초원심분리기 후의 펠릿은 육안으로 거의 보이지 않습니다. 따라서, 펠릿이 제대로 제거되도록 튜브 중앙에 RPMI 1640을 추가해야 합니다.
    9. 다음으로, 25mL의 바이러스 현탁액에 1M HEPES pH 7.4의 1μL를 추가합니다. 현탁액의 50μL를 1.5mL 원심분리 튜브에 분취하고 장기 보관을 위해 즉시 -80°C 냉동고에 보관합니다.
  2. 바이러스 농도 및 바이러스 감염률의 정량화
    참고: 바이러스의 감염력을 계산하려면 먼저 p24 Antigen Capture ELISA에 의해 수행되는 농도를 정량화하는 것이 중요합니다(제조업체의 지침에 따라 여기에 설명되어 있지 않습니다. 재료 표 참조). 이 과정은 바이러스의 농도를 스톡의 마이크로리터(ng/μL)당 나노그램으로 제공하며, 이는 TZM-bl 리포터 세포26에서 다음 실험을 통해 스톡 내 감염성 비리온 수를 식별하는 데 사용됩니다.
    1. 각 웰에 대해 500μL의 완전한 DMEM을 사용하여 24웰 플레이트에서 0.1 x 106 TZM-bl 세포를 계수하고 파종하고 세포 배양 인큐베이터에서 10-12시간 동안 보관합니다.
    2. 바이러스 정량을 위해 감염을 시작하기 전에 세포가 50%-60% 합류하는지 확인하십시오. 250 μL의 새로운 완전한 DMEM으로 기존 매체를 각 웰에 교체합니다.
      알림: 실험적 결함을 배제하기 위해 양성 대조군을 잘 유지하십시오.
    3. 중복으로 1ng, 0.1ng 및 0.01ng 감염에 필요한 스톡 바이러스의 양을 계산합니다. 웰에 적절한 양의 바이러스를 추가하고 플레이트를 인큐베이터의 37°C에서 4시간 동안 유지합니다.
    4. 500 μL의 불완전 DMEM으로 세포를 두 번 세척한 다음 500 μL의 완전 DMEM을 추가합니다.
    5. 매체 교체 36시간 후 β gal 염색 절차를 진행합니다.
      1. 기존 배지를 버리고 PBS 1mL로 세포를 두 번 세척합니다. 각 웰에 500μL의 고정 용액(PBS의 0.25% 글루타르알데히드)을 추가하여 세포를 고정하고 생물 안전 캐비닛 내부의 RT에서 5-7분 동안 배양합니다.
      2. 표 1과 같이 염색액을 준비한다. X-gal은 빛에 민감하므로 빛으로부터 멀리 두십시오.
      3. PBS 1mL로 세포를 한 번 세척합니다. 500 μL의 갓 준비된 염색 용액으로 세포를 덮고 37 °C의 어두운 곳에서 2-18 시간 동안 배양합니다.
      4. 나중에 반응을 중지하려면 PBS에서 500μL의 3% 디메틸 설폭사이드(DMSO) 500μL로 세포를 두 번 헹구고 세포를 500μL의 신선한 PBS에 보관합니다.
      5. 현미경 아래의 파란색 감염 세포( 그림 1A 참조)를 5개의 무작위 필드에 대해 10배 배율로 계산합니다. 5개 필드의 평균 개수를 구하고 필드 계수와 희석 계수를 곱합니다. 이는 바이러스 스톡에 있는 감염성 비리온 입자를 정량화합니다.
        참고: 24웰 플레이트의 경우 필드 계수는 75입니다.
구성 요소준비필요한 볼륨
증권 시세 표시기10x PBS 재고에서 1x PBS 준비14mL
포타슘 페리-페로 시안화물0.82g의 페리시아나이드 칼륨과 1.06g의 페로시아나이드 칼륨을 25x PBS 25mL에 녹입니다.0.75 mL
염화마그네슘1x PBS 1mL에 1M15 마이크로리터
엑스갈N,N-디메틸 포름아미드 30mL에 0.6mg을 녹입니다(어두운 곳에서).0.3 mL
합계 = 15mL

표 1: TZM-bl 세포에서 β gal 염색에 필요한 성분 목록.

2. T 세포주의 HIV-1 감염

  1. 불멸의 T 세포주를 해동하고 배양합니다. 이 연구는 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 500μg/mL G418이 보충된 완전한 RPMI 1640 배지에서 배양된 CEM-GFP 세포주를 사용했습니다.
  2. 각 시점(감염되지 않은 상태, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간)에 대해 200만 개의 세포를 계산하고 가져옵니다. 감염되지 않은 세포를 100 x g 에서 5 분 동안 원심 분리하여 즉시 수확하고 세포 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.5 % NP40, 0.5 mM NaF, 1 mM DTT)을 첨가하고 프로테아제 억제제 칵테일, 0.5 mM 페닐 메틸 설포닐 플루오 라이드 (PMSF) 및 1x 인산 분해 효소 억제제 (1-3 백만 세포의 경우 50 μL) 또는 RNA 분리를 위해 Trizol 시약 (1-3 백만 세포의 경우 1 mL)에서 용해합니다 (표 참조). 재료).
  3. 폴리브렌(5μg/mL)을 함유한 완전한 RPMI 1640 배지 1mL로 100 x g 에서 RT에서 5분 동안 세포를 한 번 세척합니다. 1mL의 완전한 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
    참고: 폴리브렌은 포유류 세포에서 레트로바이러스 감염을 향상시키는 데 사용되는 양이온성 폴리머입니다.
  4. 완전한 배지를 함유한 폴리브렌 1mL에 800만 개의 세포를 재현탁시킵니다. 이제 400만 개의 비리온 입자에 필요한 바이러스 스톡의 부피를 계산하고, 바이러스 스톡을 추가하고, 완전한 배지를 추가하여 총 부피를 2mL로 구성합니다. 이것은 0.5의 MOI가 됩니다.
  5. CO2 인큐베이터 내부의 세포를 37°C에서 4시간 동안 유지하고 30-45분마다 간헐적으로 태핑합니다.
  6. 4시간 후, 세포를 회전시키고 적절한 폐기 방법을 사용하여 생물 안전 캐비닛 내부의 상층액을 조심스럽게 폐기합니다.
    참고: 이 단계부터 RT에서 5분 동안 100 x g 에서 세포를 원심분리합니다.
  7. 불완전한 배지 1mL로 세포를 두 번 세척합니다. 8mL의 완전한 배지에 세포를 재현탁시켜 100만 세포/mL가 됩니다.
  8. 6-웰 조직 배양 플레이트에서 필요한 수의 웰에 동일한 수의 세포를 파종하고 플레이트를 37°C로 유지되는 CO2 인큐베이터에 보관합니다.
  9. 다음 4일 동안 세포 용해 완충액을 추가하여 24시간마다 세포를 수확합니다. 또한 상층액을 수집하여 즉시 -80 °C 냉동고로 옮깁니다.
  10. 감염이 발생했는지 확인하려면 모든 시점에 대해 p24 항원 캡처 ELISA를 진행합니다. 시점에 대해 적절한 희석을 합니다(예: 초기 시점에 대해 더 낮은 희석, 1:50에서 1:500 사이의 이후 시점에 대해 더 높은). 감염 진행을 나타내는 그래프로 판독값을 표시합니다(그림 1B).

3. ER 스트레스를 결정하기 위한 티오플라빈 T 염색

  1. 감염되지 않은 각 100만 개 및 0.5 MOI에 감염된 CEM-GFP 세포(72시간 감염 세포 채취)를 RT에서 20분 동안 PBS에서 200μL의 4% 파라포름알데히드로 고정합니다.
  2. 100 x g 에서 5 분 동안 세포를 펠릿 아래로 펠릿하고 500 μL의 0.1 M 글리신으로 5 분 동안 처리 한 다음 500 μL의 PBS로 두 번 세척합니다. 100 μL의 PBS에 세포를 재현탁시킵니다.
  3. 유리 슬라이드, 필터 카드 및 샘플 챔버를 조립합니다. 100 μL의 재현탁 세포를 샘플 챔버에 추가하고 세포를 1000 x g 에서 4분 동안 회전시켜 세포를 세포원심분리기의 슬라이드에 부착합니다(재료 표).
    참고: 세포 현탁액이 너무 희석되면 세포원심분리기 원심분리 후 슬라이드에 충분한 세포가 고정되지 않습니다. 세포 현탁액이 매우 농축된 경우 세포가 뭉쳐지고 잘 분포되지 않을 수 있습니다.
  4. PBS에 0.1% Triton-X-100 방울(세포가 부착된 영역을 덮을 수 있을 만큼)을 사용하여 10분 동안 세포를 투과시키고 방울 방식의 PBS를 넣고 슬라이드를 기울여 조직으로 PBS를 닦아내어 세포를 두 번 세척합니다.
  5. 10μL의 5μM Thioflavin T로 30분 동안 세포를 배양합니다.
    알림: ThT로 배양 한 후에는 씻지 마십시오.
  6. 5μL의 마운팅 미디어(80% 글리세롤 v/v, 20% PBS v/v, 8mg/mL 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane[DABCO])를 사용하여 슬라이드를 장착하고 커버슬립을 넣고 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다. 슬라이드를 말리십시오.
    알림: 이 모든 단계에서 세포가 마르지 않도록 하십시오.
  7. 컨포칼 현미경에서 63x glycerol immersion lens로 고정 세포의 컨포칼 이미지를 촬영합니다( 재료 표 참조). GFP(예: 494 nm, Em. 519 nm) 및 ThT(예: 458 nm, Em. 480-520 nm)의 여기 및 방출 설정을 조정합니다.
    참고: 각 형광 채널은 채널 중복을 피하기 위해 동시가 아닌 순차적으로 이미징해야 합니다. GFP는 CEM-GFP 세포가 HIV-1 감염25에 발사하는 LTR 발기인의 규칙에 따라 GFP를 가지고 있기 때문에 HIV-1 감염의 표시로 가지고 갔다.
  8. 임계값 분석으로 정량화하기 전에 형광 이미지를 8비트로 변환합니다. Image J와 같은 소프트웨어를 사용하여 수동으로 각 셀의 강도를 정량화합니다(~50개 셀)27. 각 셀의 강도를 감염되지 않은 기준과 감염된 기준에 대한 Y축의 점으로 사용하여 그래프를 플로팅합니다.
  9. 이 프로토콜의 효과를 입증하기 위해, 예를 들어, 이 경우 Thapsigargin 치료(알려진 ER 스트레스 유발제)와 같은 양성 대조군을 취하십시오28. 12시간 동안 각각 1μL의 DMSO(vehicle control)와 100nM의 Thapsigargin으로 100개의 CEM-GFP 세포를 처리합니다.
  10. 감염된 샘플에 대해 언급한 대로 세포를 채취하고 ThT 염색을 처리합니다(단계 3.1-3.8).
    참고: 이러한 샘플의 경우 GFP 형광이 필요하지 않습니다. 따라서 ThT 형광만 컨포칼 현미경으로 캡처됩니다.

4. 다양한 UPR 마커의 활성화 및 발현 확인

참고: UPR 마커의 발현을 측정하기 위해 Immunoblotting과 RT-PCR의 두 가지 방법이 사용됩니다. 면역블로팅의 경우 감염 후 다양한 시점(감염 후 24시간, 48시간, 72시간, 96시간)에서 0.5 MOI HIV-1에 감염된 CEM-GFP 세포를 수확하고 세포 펠릿을 용해 완충액에 재현탁시킵니다(2.2단계에서 언급). 대안적으로, RT-PCR의 경우, 세포 펠릿을 트리졸 시약(1-300만 세포당 1mL)에 용해시킨다( 재료 표 참조). 용해 완충액 및 Trizol 시약에 재현탁된 세포는 추가 사용 시까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

  1. UPR 마커 분석을 위한 면역블로팅(Immunoblotting).
    1. 와류를 사용하여 간헐적으로 혼합하면서 용해 완충액의 재현탁 세포를 45분 동안 얼음 위에 유지합니다.
    2. 탁상용 고속 원심분리기를 사용하여 18000 x g 에서 15분 동안 세포를 펠릿으로 펠릿합니다( 재료 표 참조). 새 튜브에 상층액을 수집합니다.
    3. Bradford 또는 유사한 시약을 사용하여 각 샘플의 단백질 농도를 정량화합니다.
    4. 각 샘플에 대해 동일한 농도의 단백질을 취하고 Laemmli 완충액(6x 완충액: 250mM Tris-Cl pH 6.8, 10% SDS, 30% 글리세롤 및 0.02% 브로모페놀 청색, 5% β-메르캅토에탄올)에서 단백질 샘플을 준비합니다.
      참고: 각 UPR 마커에 대한 면역블로팅을 위해 최소 60-80μg의 단백질을 사용했습니다.
    5. 단백질 샘플을 96°C에서 5분 동안 끓인 후 짧게 회전시킵니다.
    6. 10%-12% SDS-PAGE 겔에서 단백질 샘플을 분해하고 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮깁니다( 재료 표 참조).
    7. 5% 무지방 분유 또는 소 혈청 알부민(BSA)으로 1-2시간 동안 차단하고 TBST(20mM Tris pH7.4 및 0.137M NaCl, 0.1% 트윈 20)로 두 번 세척하고 로커에서 4°C에서 밤새 UPR 마커( 재료 표 참조)에 대한 단백질 특이적 1차 항체로 프로브합니다. TBST로 블롯을 두 번 세척한 후 다음 날 1.5시간 동안 각각의 2차 항체로 프로브합니다.
    8. TBST로 블롯을 다시 세척하고 웨스턴 블롯 이미징 기기에서 화학발광 검출 기질( 재료 표 참조)을 사용하여 단백질 밴드를 시각화합니다.
  2. RT PCR
    1. Trizol 시약을 사용하여 세포에서 총 RNA를 분리합니다( 재료 표 참조).
    2. Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase(MMLV-RT)를 사용하여 동일한 농도의 RNA에서 cDNA를 준비합니다( 재료 표 참조).
    3. 유전자 특이적 프라이머와 함께 qRT-PCR을 사용하여 HSPA5, 스플라이싱된 XBP1, ATF4, CHOP 및 GADD34의 mRNA 발현 조절을 분석합니다(표 2). 간단히 말해서, cDNA 템플릿(100ng), 5μL의 SYBR Green 염료( 재료 표 참조) 및 각 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍의 10pmol을 포함하는 10μL 반응 혼합물을 준비합니다. 멸균 H2O를 사용하여 볼륨을 조정합니다.
    4. 95°C에서 3분 동안 초기 변성, 30초 동안 95°C, 30초 동안 55°C, 30초 동안 72°C의 40 사이클 후 용융 곡선 분석 프로그램을 사용하여 혼합물을 실행합니다. 하우스키핑 유전자(예: β-Actin)에 상대적인 표적 유전자 발현의 접힘 변화를 다음과 같이 계산합니다.
      접기 변화 = 2-Δ(ΔCT)
      여기서 ΔCT = CT (표적) − CT (가사 유전자)
      및 Δ(ΔCT) = ΔCT(처리됨) -ΔCT(대조군)
    5. XBP1의 스플라이싱을 추가로 확인하려면 감염되지 않은 샘플과 72시간 감염된 샘플로 반정량 RT-PCR을 수행합니다.
      참고: XBP-1 mRNA의 스플라이싱은 스플라이스 부위 전체에서 RT-PCR을 사용하여 연구됩니다.
    6. 다음 조건에서 고충실도 PCR 마스터 믹스 (재료 표 참조)를 사용하여 XBP1 프라이머 (표 2)로 cDNA를 증폭시킵니다 : 30 초 동안 98 ° C의 1 사이클, 15 초 동안 98 ° C의 5 사이클, 30 초 동안 65 * Δ-5 ° C, 30 초 동안 72 ° C, 15 초 동안 98 ° C의 30 사이클, 55°C에서 30초, 72°C에서 30초, 마지막으로 72°C를 10분 동안 연장하고 4°C에서 유지합니다.
    7. 50ng의 ethidium bromide/mL를 함유한 2.5% 아가로스 겔에서 앰플리콘을 분리하고 겔 doc 기기에서 시각화합니다. 스플라이싱된 XBP1 띠는 26개의 뉴클레오티드로 더 작습니다.

5. UPR 마커의 knockdown 및 HIV-1 LTR 기반 유전자 발현 및 바이러스 생산 분석

  1. UPR marker의 knockdown을 위한 shRNA 구조체의 준비
    1. pLKO.1-TRC 벡터 backbone(렌티바이러스 클로닝 벡터)을 사용하여 shRNA 구조체를 생성합니다29.
    2. 각 유전자(IRE1, PERK, ATF6 및 HSPA5)에 대해 두 개의 shRNA 구조를 구축합니다. 각 유전자의 mRNA를 표적으로 하는 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNAi 컨소시엄(https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library)에 의해 설계되었습니다(표 3).
      NOTE: 유사한 방식으로, 다른 UPR marker에 대해 shRNA 구조체를 만들 수 있습니다.
    3. 95°C에서 프라이머(정방향 및 역방향 각각 100nM)를 어닐링한 후 RT로 점진적으로 냉각합니다.
    4. 그런 다음 T4 DNA ligase를 사용하여 pLKO.1 벡터의 Age1 및 EcoRI 부위에 접합합니다( 재료 표 참조). DNA 염기서열 분석으로 염기서열을 확인합니다.
      참고: LacZ 유전자를 표적으로 하는 shRNA 구조체는 비표적 대조군으로 사용됩니다.
  2. HEK-293T 세포에서 PERK, ATF6, IRE1 및 HSPA5 knockdown, Luciferase assay 및 p24 ELISA
    1. 50 μL의 무혈청 배지에 shRNA 구조체(0.9 μg)와 폴리에틸렌시민(PEI)(DNA 1μg에 PEI 3μL)( 재료 표 참조)과 같은 transfection 시약의 혼합물을 준비하고 20분 동안 배양합니다.
    2. 플라스크가 포함된 합류 HEK-293T 세포에서 24웰 플레이트에 transfection 혼합물과 함께 ~0.25 x 106 세포를 트립시화하고 시드하여 총 부피가 125μL가 되고 CO2 인큐베이터에서 37°C에서 6시간 동안 배양합니다. 이 방법을 역형주입(reverse transfection)이라고 하며, 여기서 세포는 형질주입 혼합물과 함께 파종됩니다.
    3. 6시간 후 125μL의 완전한 배지를 웰에 추가하고 균일한 파종을 위해 세포를 재현탁합니다.
      참고: knockdown 실험의 경우, reverse transfection(단계 5.2.1-5.2.3)은 shRNA와 siRNA 모두에서 더 나은 효율성을 제공합니다.
    4. 24시간 후 두 번째 transfection을 수행합니다. 50 μL의 불완전한 매체에 pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) 및 pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3 : pLTR-Luc : pEGFPN1-1 : 1 : 0.5) 구조를 PEI (DNA 1 μg에 대한 PEI 3 μL)와 혼합하여 준비합니다. 혼합물을 RT에서 20분 동안 배양합니다. 기존 배지를 250μL의 신선하고 불완전한 배지로 교체하고 혼합물을 세포에 추가합니다.
      참고: HIV-1 LTR에 대한 리포터 벡터는 이전32년 실험실에서 pU3RIII30,31의 LTR을 pGL3basic으로 서브클로닝하여 개발되었습니다. pEGFP-N1을 사용한 GFP 발현을 이용하여 transfection 효율을 정규화하였다32.
    5. transfection 후 6시간 후에 500 μL의 완전한 DMEM으로 배지를 교체합니다. 면역블로팅 및 루시페라아제 분석을 위해 36시간 후에 세포를 채취합니다.
    6. 루시페라아제 분석의 경우, 세포를 펠렛화하고 상업적으로 조달된 루시페라아제 기질(50μL)에 재현탁시킵니다( 재료 표 참조). 재현탁 세포 용해물을 불투명한 96웰 플레이트에 추가하고 10-15분 동안 배양합니다. 광도계에서 루시페라아제 판독값을 얻습니다. 또한 동일한 샘플에서 GFP 형광을 측정하여 마이크로플레이트 마이크로모드 플레이트 리더(예: 494 nm, Em:519 nm)에서 루시페라아제 판독값을 정규화합니다.
    7. 그래프를 Y축에서 Luciferase 단위/GFP로 플로팅합니다.
      참고: 각 UPR 마커의 knockdown을 확인해야 하며, 각각 유전자 특이적 항체 또는 프라이머를 사용하여 면역블로팅 또는 qRT-PCR로 수행할 수 있습니다.
    8. 위에서 언급한 대로 p24 ELISA를 처리할 상층액을 수집합니다.
  3. UPR 마커 및 HIV-1 감염의 knockdown을 통한 안정적인 세포 생성.
    1. DNA 1 μg: PEI 3 μL의 비율로 PEI를 사용하여 각각의 shRNA(1 μg) 구조와 함께 각각의 shRNA(1 μg) 구조를 사용하여 6웰 플레이트에 파종된 HEK-293T 세포를 transfection하여 Lentivirus 입자를 준비합니다. 100 μL의 불완전 DMEM에서 혼합물을 준비하고 RT에서 20분 동안 배양합니다. 혼합물을 파종된 HEK-293T 세포의 전체 배지 1.8mL에 추가합니다.
      참고: HEK-293T 세포는 형질주입 최소 12시간 전에 형태를 얻고 약 60-70%의 합류도가 될 때까지 6웰 플레이트에 파종합니다.
    2. transfection의 24시간 후, 각 웰에 1mL의 완전한 DMEM을 추가합니다.
    3. 48시간 후에 상층액을 채취하고 -80°C 냉동고에서 보관한 다음 p24 ELISA를 수행하여 이러한 상층액에 바이러스가 있는지 확인합니다. 이 미처리 렌티바이러스 상층액을 J6 세포의 transduction에 사용하십시오.
    4. 각 대조군 및 유전자 특이적 녹다운 렌티바이러스에 대해 동일한 부피의 렌티바이러스 상층액(500μL)을 넣은 6웰 플레이트에 200만 개의 세포를 배양하고 폴리브렌(5μg/mL)이 있는 상태에서 새로운 완전한 RPMI 1640 배지를 추가하여 부피를 2mL로 구성합니다.
    5. 24시간 후 Puromycin(1μg/mL)을 각 웰에 추가하여 안정적인 세포를 선택합니다. 퓨로마이신을 첨가한 후 24시간마다 세포를 펠릿화하고 퓨로마이신이 든 신선한 배지 2mL를 추가합니다.
    6. 세포 사멸이 없을 때까지(~1주일) 이 작업을 수행합니다. 살아남은 세포는 원하는 유전자 knockdown을 가진 안정적인 세포입니다.
      참고: 각 유전자의 knockdown은 정기적으로 확인할 수 있으며, 마지막으로 면역블로팅 또는 qRT-PCR을 사용하여 Puromycin 함유 배지에서 살아남은 세포만 볼 수 있는 경우에도 확인할 수 있습니다.
    7. 섹션 2에 설명된 대로 LacZ 및 유전자 특이적 knockdown 세포를 0.5 MOI의 HIV-1로 감염시키고 감염 후 48시간 후에 세포를 수확합니다.
    8. 각 샘플에서 상층액을 채취하고 앞서 설명한 대로 p24-ELISA를 처리하고 세포를 처리하여 면역블로팅으로 knockdown 수준을 확인합니다.

6. ER 스트레스 유발 물질로 처리 및 HIV-1 복제에 미치는 영향 분석

참고: HIV-1 복제 중 UPR의 과자극 효과를 확인하기 위해 약리학적 유도 분자인 Thapsigargin을 사용할 수 있습니다.

  1. Thapsigargin 치료에 따른 세포 생존율 측정.
    참고: Thapsigargin의 세포 독성은 MTT 시약에 의해 결정됩니다( 재료 표 참조).
    1. 100 μL의 완전한 RPMI 1640을 포함하는 96 웰 플레이트에서 웰당 25,000-30,000개의 CEM-GFP 세포를 시드합니다. 배지에 100nM Thapsigargin을 첨가하고 37°C에서 인큐베이터에서 배양합니다.
      참고: 1μL의 DMSO로 처리된 세포는 차량 대조군으로 사용하였습니다.
    2. 48 시간 후 각 웰에 10 μL의 MTT (5 mg / mL)를 첨가하고 5 % CO2 로 37 ° C에서 포르마잔 결정을 형성하기 위해 4 시간 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
    3. 4시간 후 100μL의 이소프로판올을 사용하여 결정을 용해시켜 자주색을 형성하고 분광 광도계를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정합니다.
    4. 아래 주어진 방정식에 따라 세포 생존율 백분율을 계산하십시오.
      % 세포 생존율 = (대조군OD570 - 처리OD570)/ 대조군OD570 x 100
  2. Thapsigargin의 전처리 및 p24 ELISA에 의한 HIV-1 감염 진행 분석.
    1. 1mL의 완전한 RPMI 1640이 포함된 12웰 플레이트에 100만 개의 CEM-GFP 세포를 시드하고 37°C로 유지되는 CO2 인큐베이터에서 12시간 동안 100nM의 Thapsigargin 또는 1μL의 DMSO(차량 제어)로 세포를 처리합니다. 12시간 후 완전한 RPMI 1640으로 세포를 세척하고 앞에서 설명한 대로 0.5 MOI의 HIV-1로 감염시킵니다.
    2. 면역 블로팅을 위해 감염 후 24시간, 48시간, 72시간과 같은 다양한 시점에서 세포를 채취합니다.
    3. 각 샘플에서 상층액을 수집하고 앞에서 설명한 대로 p24 ELISA를 수행합니다.
    4. 샘플의 p24 농도를 Y축으로, 해당 시점을 X축으로 하여 그래프를 플로팅합니다.
    5. 면역블로팅(immunoblotting)을 사용하여 UPR 마커의 수준을 측정하여 Thapsigargin 처리로 인한 ER 스트레스 유도를 분석합니다. 이 연구는 HSPA5를 마커로 사용했습니다.

7. UPR이 비리온 감염성에 미치는 영향을 결정하기 위한 TZM-bl β-gal 감염성 분석

참고: 비리온 감염도에서 UPR의 역할을 이해하기 위해 녹다운의 상층액과 Thapsigargin을 사용한 처리는 p24 ELISA에 의해 측정된 p24 농도를 기반으로 섹션 1.2에 설명된 대로 TZM-bl β-gal 감염성 분석에 사용할 수 있습니다.

  1. 각 샘플에서 동일한 농도의 p24로 TZM-bl 세포를 감염시키고 β gal 염색을 수행합니다. 현미경으로 파란색으로 감염된 세포를 5개의 무작위 필드에 대해 10배 배율로 계산합니다.
  2. 위 단계에서 각 샘플에 대한 5개 필드의 개수를 평균으로 구합니다.
  3. 아래와 같이 접기 변화를 계산하십시오.
    접기 변경 = 테스트 샘플의 평균 파란색 세포 수/대조 샘플의 평균 파란색 세포 수.

결과

이 연구에서는 T 세포의 HIV-1 감염 시 체외 응급실 스트레스 및 UPR 활성화를 연구하기 위한 자세한 프로토콜을 설명했습니다(그림 2). 이 연구는 또한 HIV-1 복제 및 바이러스 감염성에서 UPR의 기능적 관련성을 분석하는 방법을 설명합니다(그림 3).

이를 위해 Thioflavin T로 염색하여 세포 내부의 단백질 응집체를 관찰하여 HIV-1 감염으로 인한 ER 스트레스를 분석했습니다. 그림 4A에서 볼 수 있듯이 ThT의 강도는 감염되지 않은 세포와 감염된 세포의 단백질 응집체를 나타냅니다. 유사하게, 양성 대조군으로서 그림 4B 는 Thapsigargin 처리된 세포의 ThT 염색을 나타냅니다. 향상된 ThT 강도는 더 많은 단백질 응집체의 존재를 시사하며, 이는 향상된 ER 스트레스와 관련이 있습니다.

또한, 이 관찰을 검증하기 위해 UPR 마커 분석과 관련된 보다 일반적인 방법이 사용되었습니다. UPR 활성화는 처음에 기본 효과기인 IRE1, ATF6 및 PERK의 활성화에 의해 분석되었습니다. IRE1의 활성화는 그림 5A와 같이 감염 후 서로 다른 시점에서 수확된 감염되지 않은 세포와 감염된 세포의 용해물을 면역블로팅하여 phospho-IRE1 수준을 분석하여 측정했습니다. pIRE1/총 IRE1 수준의 증가는 IRE1의 활성화를 시사합니다. 마찬가지로, PERK의 활성화는 감염되지 않은 세포와 감염된 세포의 phospho-PERK 수준으로 측정되었습니다(그림 5B). ATF6의 활성화는 면역블로팅에 의한 ATF6 P50 형태의 발현 수준으로 정량화하였다(그림 5C). UPR의 또 다른 중요한 마커는 마스터 레귤레이터와 ER 샤페론인 HSPA5입니다. HSPA5의 수준은 그림 5D와 같이 면역블로팅(immunoblotting)에 의해서도 분석되었다. sXBP1, peIF2α, ATF4, CHOP 및 GADD34와 같은 다른 UPR 마커에 대해서도 특정 항체를 사용하여 유사한 프로토콜을 따랐습니다(보충 그림 1). XBP1 mRNA의 스플라이싱은 정량적 RT-PCR(그림 5E)과 반정량적 RT-PCR 모두로 분석할 수 있습니다. 정량적 RT-PCR은 스플라이싱을 구체적으로 식별할 수 없었기 때문에 반정량적 RT-PCR이 사용된 스플라이싱 분석과 쌍을 이뤘습니다(그림 5F). 위에서 언급한 프로토콜을 사용하여 qRT-PCR 데이터가 semi-qRT-PCR 데이터와 일치함을 관찰했습니다. sXBP1에 대해 수행된 qRT-PCR과 유사하게, 이 프로토콜은 mRNA 수준에서 HSPA5, ATF4, CHOP 및 GADD34와 같은 UPR의 다른 마커 분석에 사용되었습니다(보충 그림 2)

다음으로, HIV-1 복제 및 바이러스 감염성에서 UPR의 역할을 조사하기 위해 특정 UPR 마커인 PERK 및 HSPA5를 knockdown했습니다. 언급된 프로토콜을 사용하여 HEK-293T 세포(그림 6A)와 J6 세포(그림 6B) 모두에서 이러한 마커를 상당한 수준으로 knockdown했습니다. 이러한 knockdown cell을 사용하여 각 샘플에서 Luc/GFP 발현 비율로 표시되는 HIV-1 LTR 기반 유전자 활성(그림 6A)의 knockdown 효과를 조사했습니다. 바이러스 생산은 도 6B에 나타난 바와 같이 상층액의 p24 ELISA에 의해 측정되었다. 생성된 바이러스의 감염도는 그림 1A와 같은 방식으로 β gal 염색 프로토콜을 사용하여 분석할 수도 있습니다.

또한, ER 스트레스의 화학적 유도제인 Thapsigargin을 사용하여 UPR의 과자극이 HIV-1 복제, 바이러스 생성 및 비리온 감염성에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 주어진 농도에서 Thapsigargin의 세포 독성은 MTT 분석 (그림 7A)을 사용하여 분석되었으며, 이는 원하는 농도에서의 세포 독성이 유의하지 않다는 것을 보여줍니다. HSPA5에 대한 면역블로팅은 ER 스트레스에 대한 약물의 효과를 분석하기 위해 수행되었습니다(그림 7B). 그 결과, 100nM Thapsigargin의 12시간 전처리가 항상 HSPA5의 발현을 유도했음을 보여줍니다. p24 ELISA는 바이러스 생성에 미치는 영향과 생성된 바이러스의 감염성을 보여주며, 이는 앞서 설명한 대로 분석할 수 있습니다.

figure-results-1
그림 1: 비리온 감염성 정량화 및 감염 진행 분석. (A) TZM-bl 기반 β-gal 분석에 의한 비리온 감염성 정량화. 바이러스의 감염도는 TZM-bl 세포에 1ng, 0.1ng 및 0.01ng의 바이러스를 첨가한 후 β gal 염색하고 청색 세포의 수를 계수하여 측정했습니다. 배율 : 10x. (B) 배양 상청액의 p24 항원 캡처 ELISA를 기반으로 0.5 MOI HIV-1 감염 CEM-GFP 세포의 감염 진행 분석. CEM-GFP 세포를 0.5 MOI의 HIV-1에 감염시키고, 상층액을 p24 ELISA로 처리하였다. 오차 막대는 평균 ± S.E 값으로 표시됩니다. 별표는 유의 수준을 나타내며, 스튜던트 t-검정으로 분석한 결과 ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001, ****=p ≤ 0.0001로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: HIV-1 감염이 ER 스트레스 및 UPR에 미치는 영향을 분석하기 위해 따라야 할 단계의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: HIV-1 복제, 바이러스 생성 및 바이러스 감염성에 대한 UPR의 영향을 분석하기 위해 따라야 할 단계의 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: ThT 염색을 사용하여 HIV-1 감염으로 인한 T 세포의 ER 스트레스 수준 분석. (A) CEM-GFP 세포를 HIV-1의 0.5 MOI에 감염시키고 감염 후 72시간 후에 수확하였다. 세포를 고정하고 티오플라빈(Thioflavin) T. GFP 발현은 감염된 CEM-GFP 세포를 나타냅니다. 그래프는 감염되지 않은 세포와 HIV-1에 감염된 세포의 경우 Thioflavin T의 강도를 보여줍니다. n = 3 개의 생물학적 복제물에서 ~ 50 개 세포의 데이터가 그래프에 표시됩니다. (B) CEM-GGP 세포를 DMSO 및 TG로 12시간 동안 처리하였다. 세포를 고정하고 티오플라빈 T로 염색하였다. 그래프는 DMSO 및 TG 처리된 세포의 경우 Thioflavin T의 강도를 보여줍니다. n = 3 개의 생물학적 복제물에서 ~ 50 개 세포의 데이터가 그래프에 표시됩니다. 오차 막대는 평균 ± S.E 값으로 표시됩니다. 별표는 유의 수준을 나타내며, 스튜던트 t-검정으로 분석한 결과 ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001, **** = p ≤ 0.0001로 표시됩니다. UN: 감염되지 않음; IN: 감염됨; TG: 탑시가르긴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: HIV-1에 감염된 T 세포에서 다양한 UPR 마커의 발현 분석. (A-E) HIV-1(0.5 MOI)에 감염된 CEM-GFP 세포를 4일까지 24시간마다 수거하고, 후술하는 바와 같이 다양한 분석을 위해 처리하였다. (A) IRE1의 활성화는 pIRE1의 면역블로팅에 의해 분석되었습니다. (B) PERK의 활성화는 pPERK의 면역블로팅에 의해 분석되었습니다. (C) ATF6 P50 형태의 면역블로팅에 의해 ATF6의 활성화를 분석하였다. (D) ER chaperone HSPA5의 발현은 면역블로팅 HSPA5에 의해 분석되었다. (E) 특정 실시간 프라이머를 사용하여 sXBP1의 qRT-PCR에 의해 XBP1의 스플라이싱을 분석하였다. (F) semi-qRT-PCR에 의한 XBP1의 스플라이싱을 분석하기 위해 RT-PCR을 사용하여 XBP-1 mRNA를 스플라이스 부위 전체에서 증폭하고 밴드를 시각화했습니다. 오차 막대는 평균 ± S.E 값으로 표시됩니다. UN: 감염되지 않았습니다. IN: 감염됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: HIV-1 복제 및 바이러스 생성에 대한 UPR의 역할 분석. (A) HEK-293T 세포에서 PERK(왼쪽 패널) 및 HSPA5(오른쪽 패널)를 녹다운하고 HIV-1 LTR 기반 유전자 활성을 분석하기 위해 루시페라아제 분석을 수행했습니다. 면역블롯은 각 단백질의 knockdown 수준을 보여줍니다. (B) J6 세포에서 PERK(왼쪽 패널) 및 HSPA5(오른쪽 패널)를 녹다운하고, 수집된 상층액으로 p24 ELISA를 수행하여 바이러스 생성을 분석했습니다. 면역블롯은 각 단백질의 knockdown 수준을 보여줍니다. 오차 막대는 평균 ± S.E 값으로 표시됩니다. 별표는 유의 수준을 나타내며, 스튜던트 t-검정으로 분석한 결과 ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001, ****=p ≤ 0.0001로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 화학적 ER 스트레스 유발제인 Thapsigargin이 HIV-1 감염 진행에 미치는 영향 분석. (A) 100nM Thapsigargin으로 처리한 CEM-GFP 세포의 세포 생존율. 세포 생존율은 MTT 분석으로 분석됩니다. (B) 12시간 동안 100nM의 TG로 전처리된 CEM-GFP 세포는 0.5MOI의 HIV-1에 감염되고 감염 후 24시간, 48시간 및 72시간 시점에서 수확되었습니다. 면역블롯은 TG가 HSPA5 발현에 미치는 영향을 보여주는 반면, 그래프는 p24 ELISA에 의해 분석된 바이러스 생성을 보여줍니다. 오차 막대는 평균 ± S.E 값으로 표시됩니다. 별표는 유의 수준을 나타내며, 스튜던트 t-검정으로 분석한 결과 ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001, ****= p ≤ 0.0001로 표시됩니다. TG: 탑시가르긴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: UPR의 다양한 다운스트림 마커 발현 분석. 면역블로팅으로 분석한 (A) sXBP1, (B) eIF2α의 인산화, (C) ATF4, (D) CHOP 및 (E) GADD34의 발현. (A-E) HIV-1의 0.5 MOI에 감염된 CEM-GFP 세포를 감염 후 24시간, 48시간, 72시간, 96시간에 수거하여 면역블로팅에 사용하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: qRT-PCR에 의한 mRNA 수준의 다양한 UPR 마커 분석. (서기-인도) HIV-1의 0.5 MOI에 감염된 CEM-GFP 세포를 4일째까지 24시간마다 수거하여 (A) HSPA5, (B) ATF4, (C) CHOP 및 (D) GADD34의 qRT-PCR에 사용하였다. 오차 막대는 평균 ± S.E 값으로 표시됩니다. 별표는 유의 수준을 나타내며, 스튜던트 t-검정으로 분석한 ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001, **** = p ≤ 0.0001로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

건설하다프라이머 서열 5' - 3'
XBP1 접합 분석 F쿵쿵��
XBP1 접합 분석 RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
스플라이스 XBP1 FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
스플라이스 XBP1 RATCCATGGGGGAGTGTGTGTGTGTGT
HSPA5 여CACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RTGATTGTCTTTTGTCAGGGGT
ATF4 FAGTCCCTCCAACAACAGCAA
ATF4 R꺄그그캣ctggcatggtt
찹 FCAGTGTCCCGAAGGAGAAAG
챠프 RCAGAGCTGGAACCTGAGGAG
갓34 F아가카그챠챠챠��
갓34 RCTGGGCTCCTCCT그트
액틴 F아가아
액틴 RGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

표 2: RT-PCR 분석에 사용되는 프라이머 목록. F: 앞으로; R: 역방향

shRNA 구조체프라이머 서열 5' - 3'
퍽 SH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG
특전 SH1R아
퍽 SH2 FCCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG
특전 SH2R아
ATF6 SH1 FCCGGCCCAGA아
ATF6 SH1 R아
ATF6 SH2 FCCGGCCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGGAACTCTTCGCTTTGGACTAGGTTTTTG
ATF6 SH2 R아
IRE1 SH1 FCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGGAATTAAGCAGGTTTTTG
IRE1 SH1 R아
IRE1 SH2 FCCGGCCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTGTGTGTGT
IRE1 SH2 R아
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATACTAGA아
HSPA5 SH1 R아
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG
HSPA5 SH2 R아
라크Z FCCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG
락Z R아

표 3: shRNA 구조체 생성에 사용되는 프라이머 목록. F: 앞으로; R: 역방향

토론

본 프로토콜의 범위는 (i) HIV-1 바이러스 스톡의 취급 및 바이러스 농도 및 바이러스 감염성 측정, (ii) T 세포의 HIV-1 감염 및 ER 스트레스 및 UPR의 다양한 마커에 대한 영향 평가, (iii) UPR 마커의 knockdown 효과 및 HIV-1 LTR 주도 유전자 활성에 대한 효과, 바이러스 생산 및 바이러스 감염성 및 (iv) 약리학적 분자를 사용하여 UPR을 과도하게 자극하고 HIV-1 복제에 미치는 영향을 분석합니다. 현재의 프로토콜 세트를 사용하여 HIV-1과 UPR의 상호 작용에 대한 포괄적인 정보를 얻을 수 있습니다. 이 연구에 나열된 프로토콜은 수행하기 쉽고 비용 효율적이며 신뢰성이 높습니다.

UPR은 스트레스에 민감한 신호 전달 경로이기 때문에 이를 수행하는 데는 다소 섬세한 단계가 포함됩니다. 모든 실험에서 결과의 일관성을 얻기 위해 긴 통로 셀을 피하는 것이 좋습니다. 또한 박테리아 및 효모 오염을 방지하기 위해 모든 세포 배양 기술에서 멸균 상태를 유지하는 것이 중요한데, 이는 실험과 해당 결과를 방해할 수 있기 때문입니다. 또한 후속 배양을 포함하여 실험 중에 세포를 취급할 때 가혹하거나 장기간의 온도 변화를 방지하고 세포가 처음부터 건강하고 스트레스를 받지 않는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 변경으로 인해 셀에 추가 스트레스가 발생하여 결과가 변경될 수 있습니다. UPR은 민감한 신호 경로이므로 시점을 가능한 한 고정된 상태로 유지해야 하며, 시점을 약간만 변경해도 결과가 달라질 수 있습니다.

단백질 응집체를 검출하고 ER 응력을 측정하는 데 사용되는 ThT 염색 방법22, HIV-1 감염 세포의 ER 스트레스 수준을 매우 명확하게 보여줍니다. ThT 염색은 ER 스트레스와 상관 관계가 있는 단백질 응집체의 검출을 기반으로 합니다. 그러나 단백질 응집체의 개입 없이 개별 UPR 신호 경로가 직접 활성화될 수 있기 때문에 UPR 활성화가 항상 단백질 응집체와 상관될 수 있는 것은 아니라는 점에 유의해야 합니다. 따라서 이 ThT 염색 방법이 ER 응력 수준에 대한 아이디어를 제공하더라도 UPR 활성화에 대한 심층 분석을 위해서는 항상 UPR 마커에 대한 추가 분석을 통해 검증해야 합니다. 또한, ThT 염색의 sub-cellular localization을 추가로 정의하기 위해, ER을 마킹하는 경우 KDEL과 같은 마커를 사용할 수 있습니다. 또한 많은 경우 ER 응력으로 인해 세포 크기와 모양이 변경되므로 ThT 강도를 정량화하는 동안 세포 면적을 고려할 수도 있습니다. 민감도가 높고 신뢰할 수 있으며 비용 효율적인 상업용 유전자 특이 항체의 가용성은 생명 과학 분야의 여러 측면에 혁명을 일으켜 세포 내 단백질 수준을 보다 쉽게 분석할 수 있게 했습니다. 또한 요즘에는 고감도 유형의 장비를 사용하여 블롯의 단백질 띠를 시각화하고 빠르고 쉽게 정량화할 수 있습니다. 따라서, UPR 마커의 활성화는 면역블로팅(immunoblotting)에 의해 쉽게 분석될 수 있다. 그러나 UPR 마커 단백질의 발현이 상대적으로 낮기 때문에 발현을 분석하기 위해 상당한 농도의 단백질을 사용해야 합니다. 또한, 1차 항체의 희석은 비특이적 결합(nonspecific binding)과 블롯(blots)의 배경 노이즈(background noise)를 피하기 위해 사용된 세포의 단백질 발현에 따라 적절하게 최적화되어야 합니다. 또한 에서 볼 수 있듯이 그림 4C, ATF6 항체는 다클론성이며 여러 비특이적 밴드를 제공합니다. 세척 및 항체 농도의 적절한 최적화는 이러한 비특이적 밴드를 어느 정도 줄이기 위해 필요합니다. 블롯은 차단 용액, 1차 항체 및 2차 항체에서 배양 후 배경 및 비특이적 밴드를 줄이기 위해 적절하게 세척해야 합니다. 블롯을 개발하는 동안 얻은 결과에서 패턴을 적절하게 시각화하기 위해 밴드의 과포화를 피해야 합니다. 이 방법 기사의 광범위한 초점을 살펴보면, 우리는 일반적인 면역 블로팅 기술에 대한 자세한 방법 및 문제 해결에 초점을 맞추지 않았습니다. 그러나 Mahmood와 Yang의 방법 기사를 참조 할 수 있습니다33 뿐만 아니라 Ghosh et al.34 같은 위해. 오늘날 RT-PCR은 매우 일반적으로 사용되는 방법이기 때문에 쉽게 구할 수 있는 프라이머와 RT-PCR 기계는 특정 UPR 마커를 분석하기 위한 데이터를 제공합니다. 그러나 RT-PCR을 위해 RNA 및 cDNA를 준비할 때는 매우 민감한 방법이므로 주의를 기울여야 하며, 시료 품질 및 피펫팅의 약간의 차이로 인해 판독값에 큰 변동이 발생할 수 있습니다. RNA 샘플에서 모든 DNA 또는 단백질 오염을 제거해야 합니다. 또한 피펫팅 오류를 줄일 수 있도록 항상 qRT-PCR에 대해 샘플을 세 번에 나누어 채취하십시오. qRT-PCR에 사용되는 DNA의 농도는 30을 초과하는 것은 이상적이지 않은 것으로 간주되므로 각 샘플의 CT 값이 30 미만이 되도록 최적화해야 합니다. 위양성 판독을 피하기 위해 qRT-PCR에 대해 항상 음성 제어를 유지해야 합니다. XBP1의 스플라이싱은 qRT-PCR과 semi-qRT-PCR 모두에 의해 분석될 수 있습니다. qRT-PCR은 스플라이싱을 정확하게 보여주지 않기 때문에 데이터를 검증하고 스플라이싱된 XBP1과 스플라이싱되지 않은 XBP1의 상대적인 비율을 결정하기 위해 항상 qRT-PCR과 별도로 semi-qRT-PCR을 수행해야 합니다. 스플라이싱된 XBP1과 스플라이싱되지 않은 XBP1의 크기 차이가 단지 26 nt이기 때문에, 겔을 분리하기 위해 더 높은 비율의 아가로스 겔을 사용해야 합니다. 또한 더 나은 분리를 위해 밴드는 낮은 전압과 더 긴 지속 시간에서 해결되어야 합니다. XBP1의 접합을 관찰하기 위하여 대중적인 요즘에는 또 다른 방법은, 이용하는 접합 분석실험입니다 Pst1 cDNA의 제한 효소 분해 및 XBP1 스플라이싱의 더 나은 시각화 제공35. 이 방법은 HIV-1 감염 샘플에서 XBP1의 접합을 시각화하기 위해서도 사용할 수 있습니다. 면역블로팅 및 RT-PCR에서 얻은 결과는 ThT 염색 결과를 검증하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 5에 나타난 대표적인 결과는 HIV-1 감염 시 UPR 활성화가 도 4에 나타난 향상된 ThT 염색과 상관관계가 있음을 시사한다. 그러나 UPR을 분석하기 위해 면역블로팅 및 RT-PCR을 사용하는 것의 한계는 엄격하고 개별 UPR 유전자가 비 ER 스트레스 요인에 의해 독립적으로 수정될 수 있으므로 여러 유전자 산물을 모니터링해야 한다는 것입니다. 또한 이러한 방법은 다양한 UPR 마커를 확인하여 ER 스트레스를 간접적으로 측정합니다. 그렇기 때문에 ThT 염색과 면역블로팅 및 RT-PCR에 의한 UPR 마커 분석을 함께 사용하여 HIV-1 감염이 T 세포의 ER 스트레스 및 UPR 활성화에 미치는 영향을 분석할 수 있습니다.

이 기사의 두 번째 부분에서는 HIV-1 복제에 대한 UPR의 영향을 이해하는 것과 관련된 프로토콜을 다룹니다. 이 논문에 기술된 UPR 마커의 knockdown에 사용된 역형주입 방법은 UPR 마커의 발현을 현저히 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. 프로토콜에서 언급한 바와 같이, GFP 형광은 루시페라아제 분석을 위한 루시페라아제 판독을 정규화하는 데 사용되었습니다. 그러나, 많은 경우에, GFP 독서는 또한 특정한 유전자 transfection에 의해 영향을 받을 수 있습니다36따라서 이 경우 RFP, YFP 또는 총 단백질 농도와 같은 다른 형광 마커를 사용하여 루시페라아제 판독값을 정규화할 수 있습니다. 또한, TZM-bl 세포와 같이 세포가 용해되기 어려운 일부 경우에는, 루시페라아제 기질을 첨가하기 전에 추가적인 용해 시약을 첨가할 수 있다. 결과에서 나타난 바와 같이, 루시페라아제는 결과(그림 6A 왼쪽 패널)을 PERK(그림 6B 왼쪽 패널)에서 PERK knockdown이 HIV-1 유전자 활성과 바이러스 생성을 크게 감소시킵니다. HSPA5의 경우, HSPA5의 knockdown은 LTR 유도 유전자 활성(그림 6A 오른쪽 패널) 루시페라아제 분석 결과에 따라 p24 ELISA에 따른 바이러스 생성에 영향을 미치지만(그림 6B 오른쪽 패널). 이러한 방식으로, 이러한 결과는 서로 다른 UPR 마커가 HIV-1 LTR 주도 유전자 활동 및 바이러스 생성에 다른 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. ELISA에 의해 상층액에서 측정된 p24 항원은 주로 배양 상층액에서 방출되는 바이러스 입자의 농도를 나타냅니다. 따라서 연구자들은 일상적으로 p24 항원 포획 ELISA 결과를 세포 상층액에서 바이러스 생성의 간접적인 지표로 사용해 왔습니다37. 따라서, 세포에서의 루시페라아제 분석과 상층액의 p24 ELISA를 함께 사용하여 HIV-1 LTR 주도 유전자 활성 및 바이러스 생성에 대한 효과를 결정할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 유전자 특이적 shRNA를 사용하여 HIV-1 LTR 기반 유전자 활성 및 바이러스 생산에 대한 다른 UPR 마커의 효과를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. p24 ELISA 및 루시페라아제 분석의 판독과 관련된 모든 실험에서 적절한 희석과 배양 시간이 유지되고 이상치 범주에 속하는 값을 고려하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 예를 들어, p24 ELISA를 수행하는 동안 OD450 0.1-2 사이의 값이 이상적인 것으로 간주됩니다. HIV-1 복제에서 UPR의 역할을 조사하는 두 번째 접근법은 ER 스트레스 유도제인 Thapsigargin이나 ER 스트레스 억제제인 TUDCA와 같은 약리학적 분자를 사용하는 것입니다. 이러한 약물은 다양한 상황에서 UPR을 연구하는 데 매우 일반적으로 사용됩니다38,39,40,41. 이 기사에서는 Thapsigargin 치료를 위한 프로토콜을 시연하고 T 세포의 HIV-1 감염 진행에 미치는 영향을 분석했습니다. 어떤 실험든지를 위해 약을 사용하기 전에, 사용될 세포주에 있는 약을 위한 복용량의 범위에 대한 세포 생존력을 시험하는 것이 강하게 추천됩니다. 주어진 세포주에서 ~80% 미만의 세포 생존율을 제공하는 농도는 피해야 합니다. 또한, 세포 생존도 분석의 경우 이미 스트레스를 받은 세포는 적절한 판독값을 보여주지 못하고 세포 파편으로 인해 탁도가 생성되고 잘못된 판독값을 제공할 수 있으므로 항상 건강한 세포를 선택해야 합니다. 이 연구에서 언급된 프로토콜은 감염 후 72시간 동안 바이러스 복제에 대한 Thapsigargin의 효과를 보여주며, 이는 시간 경과에 따른 바이러스 복제에 대한 약물의 효과에 대한 더 나은 이해를 제공합니다. 또한 감염 후 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간과 같은 더 짧은 시간 간격을 사용하여 약물이 바이러스 복제에 미치는 영향을 보이기 시작하는 가장 빠른 시점을 추가로 분석할 수 있습니다.

UPR은 단백질 분해 및 막 역학에도 관여하기 때문에42,43, UPR이 비리온의 감염성에 역할을 할 수 있습니다. 세포에 의해 생성된 바이러스의 감염성도 주어진 프로토콜을 사용하여 분석할 수 있습니다. 위에서 언급한 프로토콜은 또한 HIV-1 감염이 ER 스트레스 및 UPR에 미치는 영향과 생물학적으로 보다 관련성 있는 연구를 위해 인간 PBMC에서의 기능적 관련성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. HIV-1 감염에서 ER-UPR의 기능을 이해하는 것은 수많은 심각한 질병의 발병에 대한 ER-UPR의 관여에 대한 인식이 높아짐에 따라 필수적입니다. 이 일련의 방법을 사용하여 얻은 정보는 HIV-1과 UPR 간의 상호 작용에 대한 중요한 이해를 제공함으로써 이 미개척 분야에 추가될 것입니다.

공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

우리는 교내 지원을 위해 인도 정부 생명공학부의 국립 세포 과학 센터에 감사드립니다. AT와 AD는 인도 정부 생명공학부 국립 세포 과학 센터(National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of India)로부터 받은 박사 학위 연구 지원에 감사드립니다. DM은 인도 정부 SERB의 JC Bose National Fellowship에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아크릴아마미드Biorad, 미국1610107
AgaroseG-Biosciences, 미국RC1013
과황산암모늄Sigma-Aldrich, 미국A3678
항-ATF4 항체세포 신호 기술, 미국11815웨스턴 블롯 검출 희석-1:1000
항-ATF6 항체Abcam, 영국ab122897웨스턴 블롯 검출 Dilution-1:1000
anti-CHOP 항체세포 신호 기술, 미국2897웨스턴 블롯 검출 Dilution-1:1000
anti-eIF2α 항체Santa Cruz Biotechnology, USAsc-11386웨스턴 블롯 검출 Dilution-1:2000 
항-GADD34 항체Abcam, 영국ab236516웨스턴 블롯 감지 Dilution-1:1000
anti-GAPDH 항체Santa Cruz Biotechnology, USAsc-32233웨스턴 블롯 감지 Dilution-1:3000 
항-HSPA5 항체세포 신호 기술, 미국3177웨스턴 블롯 감지 Dilution-1:1000
항-IRE1 항체세포 신호 기술, 미국3294웨스턴 블롯 감지 Dilution-1:2000
안티-마우스 HRP 결합 항체 Biorad, 미국1706516웨스턴 블롯 검출 Dilution- 1:4000
anti-peIF2α 항체Invitrogen, USA44-728G웨스턴 블롯 검출 Dilution-1:1000
anti-PERK 항체Cell Signaling Technology, USA5683웨스턴 블롯 검출 Dilution-1:2000
anti-pIRE1 항체Abcam, UKab243665웨스턴 블롯 검출 Dilution-1:1000
anti-pPERK 항체Invitrogen, USAPA5-40294웨스턴 블롯 검출 Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate 항체Biorad, USA1706515웨스턴 블롯 검출 Dilution- 1:4000
anti-XBP1 항체Abcam, UKab37152웨스턴 블롯 검출 Dilution-1:1000
벤치탑 고속 원심분리기Eppendorf, USA5804R로터- F-45-30-11
벤치탑 저속 원심분리기Eppendorf, 미국5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, 미국1610201
소 혈청 알부민(BSA)MP biomedicals, 미국160069
Bradford 시약Biorad, 미국5000006
CalPhos 포유류 형질주입 키트Clontech, Takara Bio, 미국631312바이러스 재고 준비
CEM-GFPNIH, AIDS 저장소, 미국3655
Clarity ECL 기판Biorad, 미국1705061화학발광 검출 기판
Clarity max ECL 기판Biorad, 미국 1705062화학발광 검출 기판
공초점 레이저 스캐닝 현미경올림푸스, 일본모델:FV3000
사이토스핀 원심분리기Thermo Fisher Scientific, 미국ASHA78300003
DMEMInvitrogen, 미국11995073
DMSOSigma-Aldrich, 미국D2650
dNTPPromega, 미국U1515
DTTInvitrogen, 미국R0861
EDTAInvitrogen, 미국12635
EtBrInvitrogen, 미국15585011
소태아 혈청Invitrogen, 미국16000044
G418Invitrogen, 미국11811023
글루타르알데히드 25%Sigma-Aldrich, 미국G6257감염성 분석
글리신Thermo Fisher Scientific, 미국Q24755
HEK-293TNCCS, 인도
HIV-1 감염성 분자 클론 pNL4-3NIH, AIDS Repository, 미국114
도립 현미경Nikon, 일본모델: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, 미국1715124
Jurkat J6NCCS, 인도
마그네슘Sigma-Aldrich, 미국M8266감염성 분석
MMLV-RT Invitrogen, 미국28025013
MTT 시약Sigma-Aldrich, 미국M5655세포 생존도 분석
N,N-디메틸 포름아미드Fluka Chemika40255감염성 분석
NaClThermo Fisher Scientific, 미국Q27605
NaFSigma-Aldrich, 미국201154
NP40Invitrogen, 미국85124
P24 항원 포획 ELISA 키트ABL, 미국5421
PageRuler prestained protein ladderSci-fi Biologicals, 인도PGPMT078
파라포름알데히드Sigma-Aldrich, 미국P6148
pEGFP-N1Clontech, 미국632515
페니실린/스트렙토마이신Invitrogen, 미국151140122
포스파타제 억제제Sigma-Aldrich, 미국4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC bufferNEB, USAM05532
pLKO.1-TRCAddgene, USA10878Lentiviral cloning vector
pMD2.GAddgene, USA12259VSV-G envelope vector
PMSFSigma-Aldrich, USAP7626
폴리에틸렌이민(PEI) Polysciences, Inc., USA23966
페리시아나이드 칼Sigma-Aldrich, 미국244023감염성 분석
페로시아나이드 칼Sigma-Aldrich, 미국P3289감염성 분석
프로테아제 억제제 프로테아제 억제제Sigma-Aldrich, USA 
psPAX2Addgene, 미국12260렌티바이러스 패키징 플라스미드
PuromycinSigma-Aldrich, 미국P8833안정 세포 선택
PVDF 멤브레인Biorad, 미국1620177
랜덤 프라이머Invitrogen, 미국48190011
RPMI 1640Invitrogen, 미국22400105
SDSSigma-Aldrich, 미국L3771
Steady-Glo 기질Promega, 미국E2510Luciferase assay
T4 DNA ligaseInvitrogen, 미국15224017
TEMEDInvitrogen, 미국17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, 미국T9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, 미국596200
TrisThermo Fisher Scientific, 미국Q15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, 미국T8787
TrizolInvitrogen, 미국15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, 미국P1379
TZM-blNIH, AIDS Repository, 미국8129
초원심분리기Beckman Optima L90K, 미국330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, 미국15520-018감염성 분석
염화륨 륨 5056489001

참고문헌

  1. Levy, J. A. HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , ASM Press. (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855(1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374(2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156(2021).

재인쇄 및 허가

태그

TThioflavin TUPRRT PCRP24 ELISA
HIV-1에 감염된 T 세포에서 소포체 스트레스 및 풀린 단백질 반응을 측정하고 HIV-1 복제에서 그 역할을 분석합니다.
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.