방법 논문

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제

4.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66529

⸱

2024년 4월 26일

 ,  , 
1Department of Biology, Indiana University Indianapolis

이 논문에서

요약

이 기사에서는 6X-histidine 태그로 라벨링된 인간 재조합 단백질인 flap endonuclease 1(FEN1)의 친화성 정제 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 태그된 단백질의 정제를 위해 두 개의 뚜렷한 고정화된 금속 이온 컬럼을 사용하는 것을 포함합니다.

초록

단백질의 기능적 특성을 규명하려면 생화학적 분석을 수행하기 위해 단백질을 고순도로 상당한 양으로 발현하고 정제해야 합니다. 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템을 사용하면 복잡한 단백질 혼합물을 고분해능으로 분리할 수 있습니다. FPLC에서 적절한 정제 매트릭스 선택, 단백질 샘플의 온도 조절, 매트릭스에 대한 샘플의 유속 및 용리 속도 관리와 같은 다양한 파라미터를 조정함으로써 단백질의 안정성과 기능을 보장할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 박테리아 배양에서 생산된 6X-His 태그 플랩 엔도뉴클레아제 1(FEN1) 단백질을 정제하기 위한 FPLC 시스템의 다양성을 입증합니다. 단백질 정제 효율성을 개선하기 위해 적절한 컬럼 패킹 및 준비, 시료 루프를 사용한 시료 주입, 컬럼에 대한 시료 적용 유속, 시료 용리 파라미터 등 여러 고려 사항에 중점을 둘 것입니다. 마지막으로, 크로마토그램을 분석하여 높은 수율의 단백질을 함유한 분획을 식별하고 적절한 재조합 단백질 장기 보관을 위한 고려 사항을 식별합니다. 단백질 정제 분석법의 최적화는 단백질 분석의 정밀도와 신뢰성을 개선하는 데 매우 중요합니다.

서론

세포 생물학을 이해하기 위해 수많은 전략을 사용할 수 있습니다. 한 가지 접근법은 유전적 돌연변이를 유전자에 도입한 다음 모델 유기체에서 결과적으로 발생하는 표현형 변화를 평가하는 하향식 전략입니다. 반대로, 환원주의적 접근법은 특정 단백질의 분자 메커니즘 및 효소 기능의 초기 설명과 다른 세포 구성 요소와의 상호 작용의 특성화를 수반합니다. 그 후, 이 단백질이 생물학적 경로에 미치는 영향을 평가합니다. 각 연구 접근 방식에는 고유한 장점과 한계가 있지만 생물학적 경로에 대한 포괄적인 이해를 달성하려면 학제 간 연구가 필요합니다.

DNA가 생명체의 유전적 청사진이기 때문에 DNA 복제 및 게놈 유지의 메커니즘을 이해하는 것은 70년 이상 동안 활발한 관심 분야였습니다. DNA 복제 분야의 연구는 수많은 복제 단백질의 개별 구조와 기능에 관한 풍부한 데이터를 산출했습니다. 기계론적 측면과 생화학적 활성 분석을 포괄하는 이러한 연구는 이러한 단백질의 정제를 통해 실현 가능해졌으며, 이를 통해 체외 환경에서 세심한 검사를 수행할 수 있습니다. 결과적으로, 단백질 정제는 DNA 복제에 대한 기계론적 통찰을 밝히기 위한 대부분의 연구 노력에서 없어서는 안 될 유비쿼터스 기술로 부상하고 있습니다.

이 논문은 박테리아 세포에서 과발현된 6X-히스티딘으로 태그된 DNA 복제 단백질을 분리하는 방법을 제시합니다. 관심 단백질은 인간 플랩 엔도뉴클레아제 1(FEN1)로, 후행 가닥 복제에서 중추적인 역할을 하고 염기 절제 복구(BER)1,2,3과 같은 DNA 복구 경로에도 중요한 참여자인 구조 특이적 뉴클레아제입니다. FEN1의 주요 기능은 DNA 복제 또는 BER 중에 발생하는 중간체인 5' 변위된 플랩 구조의 기저부를 절단하는 것입니다. 초기에 FEN1의 효소 활성을 평가하는 생화학적 조사는 뉴클레아제가 플랩 구조의 유리 5'-인산염 말단을 인식한 다음 플랩을 따라 기저부까지 따라가다가 절단하는 "추적" 메커니즘을 제안했습니다4. 후속 연구에 따르면 FEN1은 "스레딩" 메커니즘을 통해 작동하며, 여기서 먼저 플랩의 바닥에 결합한 다음 절단 전에 활성 부위를 통해 자유 5' 끝을 나사산으로 꿰는 것으로 나타났습니다(그림 1)5. 재조합 FEN1을 과도하게 발현하고 분리할 수 있는 능력은 이러한 돌파구를 촉진하여 연구자들이 생화학 및 구조 조사에 이를 사용할 수 있도록 했습니다.

친화성 크로마토그래피는 DNA를 정제하는 데 일반적으로 사용되는 분리 방법입니다. 이 기술은 수지에 고정된 리간드에 대한 표적 단백질의 가역적 결합 친화도를 사용하여 관심 단백질을 특이적으로 포획합니다. 가장 널리 사용되는 생체 친화성 중 하나는 아미노산, 히스티딘 및 니켈 및 코발트와 같은 금속 이온 간의 강력한 상호 작용이므로 Ni2+ 또는 Co2+로 충전된 수지에 포착할 수 있습니다.

6-9개의 히스티딘 잔기(His) 문자열을 암호화하는 DNA 염기서열은 관심 단백질(N-말단 또는 C-말단)을 암호화하는 플라스미드 구조체에 자주 통합되며, 단백질에 6X-His-tag 또는 poly-His tag를 태그합니다. 그런 다음 His-tagged 단백질은 친화성 크로마토그래피의 하위 유형인 IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography)로 쉽게 정제할 수 있으며, 이 경우 수지의 금속 이온이 친화성 태그로 단백질을 포획하고 나중에 적절한 용리제를 사용하여 용출할 수 있습니다. Ni2+ 및 Co2+ 와 같은 전이 금속 이온은 N,N,N'-트리스-(카르복시메틸)-에틸렌디아민 또는 니트릴로트리아세트산(NTA) 그룹6에서 파생된 아가로스 또는 실리카겔 매트릭스에 고정화할 수 있습니다.

금속 리간드는 물리적, 화학적, 생물학적 요인에 의한 분해에 대해 견고하고 다른 유형의 리간드 6,7에 비해 이러한 이점을 유지하는 것으로 알려져 있습니다. 또한, His-tag는 상대적으로 작은 태그이며 단백질 구조나 기능에 큰 영향을 미치지 않는다7. 그러나 박테리아 발현 시스템에서는 염색체로 발현되는 많은 단백질이 금속 이온에 대한 친화성을 가지며 표적 단백질과 공동 정제할 수 있습니다. 니켈과 코발트는 IMAC 매트릭스에 사용되는 전형적인 금속 이온입니다. Ni-NTA 수지와 TALON 코발트 기반 수지는 His-태그 단백질의 정제에 일반적으로 사용됩니다.

Ni-NTA와 TALON 비교
Ni-NTA와 TALON의 각각의 금속 이온은 NTA 리간드를 통해 수지에 고정됩니다. Ni-NTA는 최대 100mg/mL의 단백질과 결합하는 더 높은 결합 능력을 갖는 것으로 생각됩니다. 이로 인해 단백질 수율이 높아질 수 있지만 오염 단백질이 공동 정제될 수 있다는 주의가 있습니다. 대조적으로, 수지는 His-태그된 단백질에 대해 더 높은 결합 특이성을 가지며 더 높은 순도의 분획물을 생산할 수 있을 수 있습니다. 이 연구에서는 참조된 자동 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템인 NGC 시스템( 재료 표 참조)을 사용하여 두 수지의 정제 효율을 비교하는 것을 목표로 합니다.

버퍼 및 호환성Buffers and compatibility
완충액은 세포 용해, 시료 전처리, 수지 평형화 및 수지에서 포집된 단백질의 용리를 위한 단백질 정제 중에 필요합니다. 최대 100mM 농도의 Tris, MOPS 및 HEPES 완충액은 Ni-NTA 수지에 대해 알려진 호환 가능한 완충액입니다. 완충액에는 단백질의 산화와 단백질 응집을 방지하기 위한 환원제가 포함되는 경우가 많습니다. 그러나 임계값 한계를 초과하면 환원제는 수지에서 금속 이온을 제거할 수 있습니다. 베타-메르캅토에탄올(BME) 또는 디티오트레이톨(DTT)과 같은 환원제의 권장 농도는 위에서 언급한 니켈 및 코발트계 수지에 대해 1mM 미만입니다.

hFEN1 정제를 위한 완충액은 NaCl, BME, 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF), EDTA 및 글리세롤을 함유하는 트리스 완충액입니다. NaCl은 단백질을 수용성 형태로 유지하고 DNA 결합과 같은 분자 상호 작용을 방해합니다. BME는 산화된 단백질을 감소시켜 단백질 응집을 방지합니다. PMSF)는 표적 단백질의 프로테아제 매개 분해를 방지하는 프로테아제 억제제입니다. EDTA는 시료에서 2가 양이온을 제거하여 뉴클레아제 및 프로테아제에 대한 접근을 방지합니다. 글리세롤은 수성 형태의 단백질의 안정성을 향상시킵니다. 또한 lysis buffer에는 완전한 프로테아제 억제제 정제가 포함되어 있어 세포 용해 중 프로테아제가 분해되는 것을 방지하여 표적 단백질을 최대한 보호할 수 있습니다. 평형 및 용출 완충액에는 이미다졸이 함유되어 있으며, 용출 완충액에는 이미다졸이 용출 중에 수지에서 결합된 단백질을 대체하기 위해 더 많은 양이 포함되어 있습니다.

차세대 크로마토그래피(NGC) 시스템
고속 유속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 위해 설계된 이 자동화된 중압 크로마토그래피 시스템은 두 개의 펌프를 사용하여 두 개의 서로 다른 버퍼를 동시에 펌핑하며 250μL에서 100mL에 이르는 광범위한 시료 부피를 주입할 수 있습니다. 시료 루프(이 시스템에서는 Dynaloop라고 함)를 사용하면 더 큰 부피의 시료를 주입할 수 있습니다. 이 시스템은 Chromlab 소프트웨어를 사용하여 작동할 수 있으며, 이를 통해 맞춤형 분석법 생성, 정제 실행 조작, UV 피크 및 단백질 분획 분석을 용이하게 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 시료 전처리

  1. 재조합 FEN1을 정제하기 위해, 이전에 Ononye et al.8에 의해 기술된 바와 같이 BL21(DE3) 세포에서 구조체(pET-FCH-FEN1)를 발현시킨다.
    1. LB 배지(표 1)에 1% 야간 배양액을 접종하고 OD가 0.6이 될 때까지 37°C에서 세포를 성장시킵니다.
    2. 0.4M 이소프로필-베타-D-티오갈락토사이드(IPTG)로 유도하고 추가로 3시간 동안 배양액을 성장시킵니다.
    3. 5,000× g 에서 4°C에서 15분 동안 배양액을 원심분리하여 세포를 수확합니다. 펠릿을 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
    4. 정제 당일, -80°C 냉동고에서 세포 펠릿을 제거하고 얼음에서 해동시킨 다음 펠릿을 100mL의 용해 완충액에 재현탁시킵니다(표 1).
      알림: 세포 용해물은 단백질 분해를 방지하기 위해 취급 중에는 항상 얼음 위에 놓아야 합니다. 해동이 완료되면 전체 정제 과정을 같은 날에 완료해야 합니다. 세포 용해물은 밤새 냉장고에 보관해서는 안 됩니다.
  2. 현탁액을 250mL 비커로 옮기고 15분 동안 35% 진폭에서 30초 동안 켜고 30초 꺼진 상태로 얼음에서 초음파 처리합니다.
    알림: 제조업체의 설정을 참조하여 진폭을 식별하십시오.
  3. 초음파 처리 된 샘플을 원심 분리기 튜브로 옮기고 27,000 × g 에서 4 ° C에서 30 분 동안 회전시켜 깨끗한 용해물을 얻습니다. 샘플이 주입될 때까지 4°C 냉장고의 얼음 위에 세포 용해물을 놓습니다.

2. 친화도 열 준비

  1. 컬럼(Ni-NTA 수지용 1개, 코발트계 수지용 1개)을 클램프 스탠드에 끼우고 컬럼이 기울어지지 않도록 가능한 한 직선으로 고정합니다. 컬럼 하단이 스토퍼로 연결되어 있는지 확인하고 컬럼 패킹 중 기포를 방지하기 위해 각 컬럼 하단에 1-2mL의 시작 버퍼를 추가합니다.
  2. 레진이 완전히 재현탁될 때까지 레진 병을 부드럽게 흔듭니다. 컬럼의 상단을 열고 기포가 포함되지 않도록 각 슬러리 10mL를 연속적으로 붓습니다. 컬럼의 기포를 피하기 위해 컬럼 가장자리에 고정된 금속 주걱 또는 유리 막대에 수지를 붓습니다.

3. 플로우 어댑터를 사용한 컬럼 패킹

  1. 기둥에서 스토퍼의 플러그를 뽑고 바닥을 튜브의 한쪽 끝에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝을 FPLC 시스템의 UV 포트에 연결합니다.
  2. 침대 지지 하우징이 플로우 어댑터 본체에 당겨졌는지 확인하고 플로우 어댑터 본체를 컬럼 상단으로 밀어 넣습니다(그림 2A). 캠 래치를 위치 1에 놓고 버퍼에 삽입되지 않도록 주의하면서 흐름 어댑터를 내립니다(그림 2B). 캠 래치를 위치 2로 전환합니다(그림 2B). 튜빙을 시스템에 연결하고 1-2분 동안 시동 버퍼의 흐름을 시작하여 튜빙의 공기를 제거하고 패킹 중 기포를 방지합니다.
  3. 래치를 다시 위치 1로 전환하고 기포가 포함되지 않도록 한 번의 부드러운 동작으로 흐름 어댑터를 버퍼로 내린 다음 래치를 다시 위치 2로 전환합니다. 이렇게 하면 일부 버퍼가 흐름 어댑터에 들어갈 수 있고 남아 있는 기포가 제거됩니다.
  4. 래치를 위치 3으로 전환하고 캠 베이스와 잠금 링을 조입니다(그림 2B).
  5. 10mL/분에서 완충액 흐름을 시작하여 컬럼을 충전합니다. 3분 동안 또는 레진이 잘 채워질 때까지 이 단계를 계속합니다.

4. FPLC 시스템의 시료 루프 프라이밍

  1. 시료 루프 상단의 튜브를 FPLC 시스템의 루프 E에 연결합니다(그림 3).
  2. 샘플 루프의 맨 아래에 있는 튜브를 FPLC 시스템의 폐기물 2에 연결합니다.
  3. 튜브의 한쪽 끝을 FPLC 시스템의 컬럼 포트에 삽입하고 다른 쪽 끝을 폐기물 병에 넣습니다.
  4. 펌프 A의 튜브를 여과된 이중 증류수(ddH2O)에 삽입합니다.
  5. 소프트웨어를 사용하여 펌프 설정 (그림 4A, 레이블 2)을 두 번 클릭하고 시스템 펌프 주입 루프 (그림 4C)를 선택합니다.
  6. 유속 설정(그림 4A, 1로 표시)을 클릭하고 유속을 10mL/min으로 변경합니다. %B 상자에 0%를 입력합니다(그림 4B).
  7. 흐름을 시작하여 샘플 루프를 물로 세척하면 슬라이딩 씰이 아래쪽으로 밀려납니다.
  8. 슬라이딩 씰이 샘플 루프의 바닥에 도달하면 흐름을 중지합니다. 펌프 A를 ddH2O에서 시작 버퍼로 전환합니다. 샘플 루프의 상단에서 튜브를 폐기물 2에 연결하고 하단에서 루프 E로 연결합니다. 컬럼 포트의 튜브를 폐기물에 그대로 둡니다.
  9. 10mL/분에서 흐름을 시작합니다. 유입되는 시작 버퍼에 의해 위쪽으로 밀려난 슬라이딩 씰이 샘플 루프의 상단에 도달하면 흐름을 중지합니다. 이제 시료 루프가 시료 주입 준비가 되었습니다.

5. 시료 주입

  1. 펌프 설정을 두 번 클릭하고 수동 부하 루프를 선택합니다(그림 4C).
  2. 루프 E에서 튜브의 나사를 풀고 폐기물 용기에 넣습니다.
  3. 컬럼 포트의 튜빙을 플로우 어댑터 상단의 튜빙에 연결합니다.
  4. 30mL 주사기를 사용하여 샘플을 추출합니다. 그런 다음 주사기를 주입 포트 어댑터에 부착합니다.
  5. 주사기를 주입 포트에 나사로 고정하고 샘플을 주입하여 샘플 루프에 눈에 띄게 주입되도록 합니다. SDS-PAGE 분석을 위해 -20°C의 마이크로 원심분리 튜브에 100μL의 시료(라벨 입력 용해물)를 보관합니다.
    참고: 총 샘플 부피에 따라 2-3번의 주입이 필요할 수 있습니다.
  6. 주입 포트를 컬럼 캡으로 막습니다.
  7. 샘플 루프의 하단에서 튜브를 루프 E 포트로 다시 연결합니다.
  8. 펌프 B의 튜브를 용출 버퍼에 넣습니다.

6. FPLC 시스템 연결 소프트웨어를 사용한 분석법 생성 및 분석

  1. 홈 탭으로 이동하여 새 방법을 선택합니다.
  2. 왼쪽 열에서 Method settings(방법 설정 ) 탭을 선택하고 Column type(열 유형 ) 드롭다운 메뉴로 이동한 다음 Custom(사용자 지정 )을 선택합니다(그림 5).
  3. 컬럼 부피(5mL)를 입력합니다.
  4. 실행에 필요한 유속 (1mL/분)을 입력합니다.
  5. Unit selection(단위 선택)으로 이동하여 CV(column volumes)를 Method 기본 단위로 선택합니다.
  6. Inlet A(입구 A)가 Buffer A(버퍼 A)로 설정되고 Inlet B(입구 B)가 Buffer B(기본 설정)로 설정되어 있는지 확인합니다.
  7. 왼쪽 메뉴에서 Method Outline(메서드 개요 ) 탭을 선택합니다. 정제 단계를 equilibration(평형), Sample Application(샘플 적용), column wash(컬럼 세척) 및 elution(용리)의 순서로 추가합니다.
    1. 평형 상태에서 평형 부피를 10CV로 설정합니다. 버퍼 설정이 0% B로 유지되는지 확인합니다.
    2. Sample Application 탭에서, sample loop를 관찰하여 Sample volume을 설정합니다. 슬라이딩 씰의 위치는 시료 부피를 나타냅니다.
    3. 컬럼 세척에서 세척량을 5CV로 설정합니다. 이 단계에서 분수 수집을 비활성화합니다. 달리는 동안 비커에 세척액을 전체적으로 수집하십시오., 분수로 수집하지 마십시오.
    4. 용리를 위해 그래디언트 부피를 0% 버퍼 B에서 100% 버퍼 B까지 14CV로 설정합니다.
  8. 메서드를 저장하고 실행을 시작합니다.
  9. 분수 컬렉터가 첫 번째 분수의 위치에서 시작하는지 확인합니다.
  10. 실행 이름을 입력하고 시작을 클릭합니다.
  11. 평형 단계에서는 실시간 UV 곡선을 모니터링합니다. 모든 연결이 누출 없이 안전한지 확인하십시오. 폐기물 용기로 유입되는 버퍼를 찾아 전체 회로를 확인하십시오. 평형의 마지막 몇 분 동안 UV 곡선이 안정화되지 않은 경우 안정화가 달성될 때까지 평형 단계를 연장합니다(그림 6).
  12. 샘플 적용 시 폐기물 용기에 들어가는 튜브를 깨끗한 비커로 전환합니다. 이 단계에서 폐기물 튜브에서 흘러나오는 결합되지 않은 단백질을 플로우스루로 수집합니다( FT로 표시).
  13. UV 곡선이 급격히 증가하여 가능한 최대 판독값인 3,000mU에 도달할 수 있는지 확인합니다(그림 6).
    참고: 일반적인 곡선은 대부분의 샘플 적용 단계를 통해 3,000mU에서 정체됩니다.
  14. 컬럼 세척 중에는 수지에 결합된 단백질만 남아 있는 잔여 결합되지 않은 단백질이 씻겨 나갈 때 UV 곡선에서 급격한 감소를 확인합니다(그림 6). 세척 단계가 끝날 때까지 UV 곡선이 떨어지지 않으면 UV가 충분히 떨어질 때까지 홀드 단계를 클릭하여 단계를 연장합니다. 이 단계를 시작할 때 FT 비커 의 폐기물 튜브를 Wash라고 표시된 다른 깨끗한 비커로 옮깁니다.
  15. 용리 단계가 시작되면 분획 분취기가 제자리로 이동하고 분획 수집을 시작하는지 확인합니다. UV 곡선에서 피크를 찾아 단백질의 용리를 시각화합니다(그림 6).
  16. 실행이 완료되면 홈 탭으로 이동하여 실행 열기를 선택합니다. 실행을 열어 크로마토그램을 보고 상단 메뉴에서 피크 통합을 선택하여 실행 중에 얻은 피크를 표시합니다.
  17. Fractions 탭을 선택하여 용리된 단백질을 포함하는 분획을 시각화합니다.

7. SDS PAGE 분석

  1. 단백질을 함유한 각 분획 15μL를 5μL의 SDS 시료 로딩 버퍼와 혼합합니다(표 1). 샘플을 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
  2. 시료를 프리캐스트 겔에 로드하고 사전 염색된 단백질 마커와 함께 160V에서 45분 동안 실행합니다.
  3. Coomassie 브릴리언트 블루 염색 용액에 겔을 30분 동안 염색합니다(표 1).
  4. 젤을 ddH2O로 세척합니다(3회 반복).
  5. 탈색 용액에서 겔을 1시간 동안 탈색합니다(표 1).
  6. 단백질 밴드를 관찰하십시오. 1kDa 표시에서 FEN42를 감지합니다.
  7. FEN1을 포함하는 분획물을 풀하고 10kDa 원심 필터를 사용하여 풀을 농축합니다. 분취하여 -80°C 냉동고에 보관하십시오.

결과

hFEN1을 발현하는 BL21(DE3) 세포 용해물을 평형화된 Ni-NTA 및 TALON 수지를 통과시켰다. Ni-NTA 수지는 Ni2+ 이온으로 충전되어 높은 결합 능력을 가지고 있습니다. 그 결과 Ni-NTA 수지는 TALON 수지에 비해 더 많은 양의 FEN1을 산출하는 것으로 나타났습니다(그림 7). Ni-NTA 수지는 또한 다른 염색체로 발현되는 단백질에 비특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있습니다. 코발트계 수지를 통과한 세포 용해물은 Ni-NTA에 비해 순도는 높지만 수율이 낮게 정제되었습니다. 다른 많은 DNA 결합 단백질과 마찬가지로 FEN1은 불순물을 제거하기 위해 크기 배제 수지를 추가로 통과했습니다. hFEN1은 43kDa 마크에서 식별할 수 있습니다.

figure-results-1
그림 1: hFEN1에 의한 플랩 절단 메커니즘: 추적 대 스레딩. FEN1(노란색으로 표시)은 처음에는 플랩 구조의 5' 끝에 결합되어 플랩 베이스(왼쪽)까지 추적되는 것으로 생각되었습니다. 이후 연구에 따르면 FEN1은 먼저 플랩 베이스에 결합하고 활성 부위(오른쪽)를 통해 5' 플랩을 끼우는 것으로 나타났습니다. 약어: hFEN1 = 인간 플랩 엔도뉴클레아제 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 플로우 어댑터. (A) 컬럼 패킹 및 정제 공정에 사용되는 플로우 어댑터의 구성 요소; (B) O-링을 조이거나 풀고 어댑터를 제자리에 고정하는 데 사용되는 캠 래치의 세 위치. 확대된 이미지는 위에서 아래로 위치 1,2, 3에서 O-링의 상태(느슨한/팽팽한)를 보여줍니다. 이미지는 9의 허가를 받아 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: Fast protein 액체 크로마토그래피 시스템의 주입 모듈. 주입 모듈의 다양한 포트는 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템을 컬럼, 시료 루프 및 폐기물에 연결합니다. 이미지는 10의 허가를 받아 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 시스템 제어. (A) 흐름 설정을 조작할 수 있고 흐름 경로를 볼 수 있는 시스템 제어 탭; (B) 유량 설정 창; (C) 펌프 설정 창. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 분석법 설정 창. 컬럼 유형(column type), 컬럼 부피(column volume), 분석법 기본 단위(method base unit) 및 실행에 대한 유속(flow rate)과 같은 정제 세부 정보를 입력할 수 있는 창입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: FPLC 중 UV 곡선의 개략도: UV 곡선은 정제 단계에 따라 상승 및 하강합니다. 평형을 시작할 때 UV 곡선은 튜브에 기포나 오염 물질이 존재하기 때문에 왜곡될 수 있습니다. 평형이 계속됨에 따라 곡선은 평평한 선으로 안정화되어야 합니다. 시료 주입 중에 수지에 결합되지 않은 단백질이 흘러 나오면 최대 임계값에 도달할 때까지 UV 곡선이 상승합니다. 잔류 결합되지 않은 단백질을 씻어내는 세척 단계는 UV 측정에서 점진적인 감소를 보여줍니다. 마지막으로, 용리 단계에서 표적 단백질이 용리되면 UV 곡선에서 피크가 보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: SDS PAGE 겔 이미지. Lane 1-Molecular weight 마커; 레인 2-1% Ni-NTA 입력(셀 용해물); Ni-NTA 수지로부터의 레인 3-1% 플로우스루; Ni-NTA 수지로부터 정제된 레인 4-hFEN1; 레인 5-1% 입력(세포 용해물); 코발트계 수지로부터의 레인 6-1% 플로우스루; 코발트 기반 수지로부터 정제된 Lane 7-hFEN1; 검은색 화살표는 42.5kDa에서 FEN1을 나타냅니다. 약어: SDS-PAGE = 소듐 도데실 설페이트; MW = 분자량; hFEN1 = 인간 플랩 엔도뉴클레아제 1; NTA = 니트릴로트리아세트산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

버퍼 및 용액구성 요소
용해 완충액50mM 트리스-HCl [pH 8.0]
500mM NaCl
1mM 베타 메르캅토에탄올(BME)
1mM 페닐-메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)
1mM 방전성 암
1 정제 완전한 프로테아제 억제제
10mM 이미다졸
10% 글리세롤
평형/세척 버퍼50mM 트리스-HCl [pH 8.0]
500mM NaCl
1mM BME
1mM PMSF
10mM 이미다졸
10% 글리세롤
용리 완충액50mM 트리스-HCl [pH 8.0]
500mM NaCl
1mM BME
1mM PMSF
1M 이미다졸
10% 글리세롤
SDS 샘플 로딩 버퍼900 μL 4x Laemmli 시료 완충액
100 μL BME
Coomassie 브릴리언트 블루 염색 용액50 % ddH2O
40% 메탄올
10% 아세트산
0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250
탈색 용액50 % ddH2O
40% 메탄올
10% 아세트산

표 1: 버퍼 구성.

토론

친화성 크로마토그래피는 DNA 결합 단백질을 정제하는 데 널리 사용되는 기술입니다. IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography)는 금속 이온을 사용하여 펩타이드 염기서열의 히스티딘 잔기를 포획하는 특정 유형의 친화성 크로마토그래피입니다. 이것이 "6X-His 태그" 또는 "poly-His 태그"가 정제할 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부착되는 이유입니다. 니켈과 코발트는 가장 일반적으로 사용되는 금속 이온이며 일반적으로 정제에 사용되는 BME 및 DTT와 같은 시약과의 호환성이 다양합니다. 1mM BME 또는 DTT의 농도에서 정제가 수행되었지만 이러한 시약의 사용은 여전히 신뢰할 수 없을 수 있습니다. 평형 중에 비호환성이 관찰될 수 있습니다. 수지를 통해 흐르는 완충액이 갈색으로 나타나면 금속 이온의 산화를 나타내며 수지에서 금속 이온을 제거할 수 있습니다. 이는 수지의 결합 능력을 크게 감소시킬 수 있습니다.

단백질의 높은 순도와 수율을 보장하기 위해 금속 이온과 His-tag 간의 친화성 상호 작용이 다른 가능한 전하 기반 상호 작용보다 선호되어야 합니다. 이렇게 하면 모든 단백질이 용리의 다른 단계에서 용리되는 대신 한 번에 용리됩니다. 이를 달성하기 위해 단백질은 정제 중에 매우 낮은 전하를 가져야 합니다. 완충액의 pH 값이 표적 단백질의 등전점에 더 가까우면 단백질의 전하를 낮게 유지할 수 있습니다. FEN1의 등전점이 약 8.8이므로 완충액은 pH 8로 유지됩니다.

Ni 이온으로 하전된 Ni-NTA 수지는 단백질 결합 능력이 더 큰 것으로 생각되며 코발트계 수지 TALEN에 비해 더 많은 양의 단백질을 생산할 것으로 예상됩니다. 이것은 또한 비특이적 단백질의 결합에 대한 더 큰 잠재력이 있고 따라서 순도가 낮다는 것을 의미합니다. TALON의 낮은 결합 능력은 더 높은 특이적 결합과 고순도 단백질의 수율로 보완됩니다. 이는 TALEN에 비해 Ni-NTA에서 정제된 단백질의 수율이 더 높다는 결과와 일치합니다.

수지에 관계없이, 순도와 수율은 컬럼 패킹에 의해 크게 영향을 받습니다. 효율적인 패킹은 NGC 자동 크로마토그래피 시스템9에 연결된 플로우 어댑터를 사용하여 달성할 수 있습니다. 충분히 높은 유속에서 플로우 어댑터는 수지를 효과적으로 패킹하고 컬럼에 완충액이 축적되는 것을 방지할 수 있습니다. NGC와 함께 flow adaptor를 사용하면 유속, 압력 및 용리 구배를 조절하고 단백질 분획을 효율적으로 수집할 수 있어 두 수지를 정확하게 비교할 수 있습니다.

Chromlab 소프트웨어를 통해 실행 조건을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다10. 유량은 실행 중 언제든지 변경할 수 있습니다. 샘플 적용 중에는 시스템 압력이 임계값(600psi)을 초과할 수 있습니다. 이 경우, 샘플 적용 단계에서 유속을 낮추면 압력을 줄일 수 있습니다. 이 소프트웨어는 또한 필요에 따라 모든 단계를 확장할 수 있는 홀드 단계 기능을 갖추고 있습니다. 이 기능은 컬럼 세척 및 용리 단계에서 특히 유용합니다. 컬럼 세척 중에는 UV 그래프가 아래로 내려가 거의 0에 도달할 것으로 예상되며, 이는 결합되지 않은 단백질의 대부분이 수지에서 씻겨 나갔다는 것을 의미합니다. UV 라인이 계속 상승하거나 램프 다운에 실패하는 경우 예상 그래프가 보일 때까지 세척 단계를 연장할 수 있습니다. 마찬가지로, 용출 중에 표적 단백질의 용리는 UV 그래프의 피크를 통해 시각화할 수 있습니다. 예기치 않게 피크가 보이지 않는 경우, 예상되는 피크가 관찰될 때까지 용리 단계를 연장할 수 있습니다.

팁과 트릭
평형 단계 동안, 완충액은 컬럼에 주입되어야 하고 폐기물 완충액은 폐기물 병으로 지속적으로 방출되어야 합니다. 이렇게 하면 모든 연결이 단단하고 누출되지 않습니다. NGC의 어느 곳에서든 누출이 발생할 경우, 누출의 원인이 누출이 발견된 곳과 다를 수 있으므로 해당 지역을 둘러싼 모든 항구를 점검해야 합니다. 흐름이 시작되었지만 버퍼가 컬럼에 유입되지 않는 경우 공기가 튜브 내에 갇혀 있을 수 있습니다. 계속 진행하기 전에 시스템을 제거합니다.

시료 주입 중 시스템의 배압이 주입에 저항하는 경우 튜브를 루프 E에서 풀고 주입 기간 동안 폐기물 병에 넣어야 합니다. 프로그램을 시작하기 전에 루프 E에 다시 나사로 고정하는 것이 중요합니다. 실행 중에 평형 버퍼 또는 샘플이 컬럼에 축적되는 경우 실행을 일시 중지하고 흐름 어댑터를 제거해야 합니다. 튜브는 컬럼 바닥에서 나사를 풀어야 하며 완충액 또는 샘플이 통과할 수 있어야 합니다. 샘플이 흐르면 플로우스루로 수집해야 합니다.

SDS PAGE 겔에서 실행되는 분획이 높은 수준의 오염 단백질을 나타내는 경우 크로마토그램에서 볼 수 있는 피크의 양쪽에서 분획을 실행할 수 있습니다. 종종 저발현 단백질의 경우 순수한 분획은 UV에서 중요한 피크를 나타내지 않습니다.

니켈 기반 수지와 코발트 기반 수지의 특성 간의 차이점을 이해하면 정제된 단백질의 향후 응용 분야에 가장 적합한 수지를 선택할 수 있습니다. 예를 들어, 체외 생화학 분석에 사용되는 단백질은 가능한 가장 높은 순도를 가질 것으로 예상되며, 이는 코발트 기반 수지가 적합한 상황입니다. 그러나 단백질이 항체 생산에 사용되는 경우 공정에 상당한 수율의 정제된 단백질이 필요합니다. 이 경우 Ni-NTA 수지가 더 나은 옵션이 될 수 있습니다. 이 기사는 FEN1의 정제를 통해 이러한 수지의 차이점을 끌어내는 것을 목표로 했습니다.

공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 기타 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation, 1929346)과 미국암학회(American Cancer Society, RSG-21-028-01)의 보조금으로 이루어졌다. 또한 유용한 토론을 해주신 Balakrishnan 연구소 구성원분들께도 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4x Laemmli 시료 완충액BioRad1610747
Acetic acidMerckUN2789
베타-메르캅토에탄올(BME)SigmaM-6250
Chromlab 소프트웨어 버전 6.1.27.0BioRadNGC 시스템을 운영합니다.
MINI 프로테아제 억제제 정제Roche11836153001
Coomassie Brilliant BlueR SigmaB0149
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000
Econo-Column glassBioRad7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020
Flow adaptorBioRad7380014
GlycerolDot Scientific
ImidazoleDot ScientificDSI52000
메탄올Fisher ScientificA412
Mini PROTEAN TGX 젤BioRad4561084
NGC 크로마토그래피 시스템BioRad자동 액체 크로마토그래피 시스템 
Ni-NTA 아가로스Qiagen1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluorideDot ScientificDSP20270
PreScission Plus 단백질 이중 색상 표준 BioRad1610374
염화나트륨도트 사이언티픽DSS23020
TALON 금속 친화 수지Takara635502
Tris BaseDST60040
는 완전한 DSG22020

참고문헌

  1. Balakrishnan, L., Bambara, R. A. Flap endonuclease 1. Annu Rev Biochem. 82, 119-138 (2013).
  2. Asagoshi, K. FEN1 functions in long patch base excision repair under conditions of oxidative stress in vertebrate cells. Mol Cancer Res. 8 (2), 204-215 (2010).
  3. Lyamichev, V., Brow, M. A., Dahlberg, J. E. Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. Science. 260 (5109), 778-783 (1993).
  4. Bornarth, C. J., Ranalli, T. A., Henricksen, L. A., Wahl, A. F., Bambara, R. A. Effect of flap modifications on human FEN1 cleavage. Biochemistry. 38 (40), 13347-13354 (1999).
  5. Xu, Y., Potapova, O., Leschziner, A. E., Grindley, N. D., Joyce, C. M. Contacts between the 5' nuclease of DNA polymerase I and its DNA substrate. J Biol Chem. 276 (32), 30167-30177 (2001).
  6. Wen-Hui, K., Kuo, K., Chase, H. A. Exploiting the interactions between poly-histidine fusion tagsand immobilized metal ions. Biotechnol Lett. 33 (6), 1075-1084 (2011).
  7. Charlton, A., Zachariou, M. Immobilized metal ion affinity chromatography of native proteins. Methods Mol Biol. 421, 25-35 (2008).
  8. Ononye, O. E., Njeri, C. W., Balakrishnan, L. Analysis of DNA processing enzyme FEN1 and its regulation by protein lysine acetylation. Methods Mol Biol. 1983, 207-224 (2019).
  9. Econo-column flow adaptor instruction manual. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M7380014.pdf (2015).
  10. NGC Chromatography systems and ChromLab software instrument guide version 3.3. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10026252.pdf (2015).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

HisFEN1

관련 논문