Investigating retinal circuits and molecular localization by pre-embbedding immunoelectron microscopy (면역전자 현미경 사전 임베딩을 통한 망막 회로 및 분자 국소화 조사)

요약

이 프로토콜은 망막의 시냅스 회로 및 단백질 국소화를 탐색하는 데 중점을 두고 면역전자 현미경을 사전 삽입하는 세부 단계를 간략하게 설명합니다.

초록

망막은 다양한 신경 회로를 형성하는 수많은 세포로 구성되어 있으며, 이는 시각 경로의 첫 번째 단계를 구성합니다. 각 회로는 고유한 특징과 뚜렷한 신경 전달 물질로 특징지어지며 그 역할과 기능적 중요성을 결정합니다. 망막의 구조 내에 있는 복잡한 세포 유형을 감안할 때, 망막에 있는 신경 회로의 복잡성은 연구에 대한 도전을 제기합니다. 원뿔과 간상 경로 사이의 연결과 같은 망막 회로 및 누화, 마우스 망막에 있는 물질 P와 같은 면역 반응성의 존재와 같은 정확한 분자 국소화(신경 전달 물질 또는 신경 펩티드)를 더 잘 조사하기 위해 우리는 시냅스 연결 및 조직을 탐구하기 위해 사전 내장 면역 전자 현미경(immuno-EM) 방법을 사용했습니다. 이 접근 방식을 통해 특정 세포 간 시냅스 연결과 정확한 분자 국소화를 정확히 찾아낼 수 있으며 그 기능을 탐구하는 데 안내 역할을 할 수 있습니다. 이 글에서는 프로토콜, 사용된 시약 및 (1) 망막 고정 준비, (2) 사전 삽입 면역염색, (3) 수정 후 및 삽입을 포함한 자세한 단계에 대해 설명합니다.

서론

망막에 있는 신경 회로의 복잡성은 구조 내의 다양한 세포 유형을 고려할 때 연구에 대한 도전을 제시합니다 ^1,2. 초기 단계에는 서로 다른 세포 간의 시냅스 연결을 식별하고 특정 신경 전달 물질 또는 신경 펩티드의 세포 국소화를 결정하는 것이 포함됩니다. 분자 생물학이 발전함에 따라 새로운 단백질이 도입됨에 따라 단백질의 기능을 이해하고 망막 회로와 시냅스 연결을 분석하는 데 단백질의 정확한 위치 파악이 중요해지고 있습니다 ^3,4,5.

광학 현미경의 제한된 해상도로 인해 전자 현미경(EM)은 일반적으로 신경 세포의 세포 내 구조를 감지하는 데 사용됩니다. EM은 세포 초미구조 ^6,7,8,9를 관찰하기 위해 사용되는 기존의 투과 전자 현미경(TEM)과 함께 다양한 분류가 있습니다. EM의 공간 해상도와 단백질¹⁰에 특이적으로 결합하는 항체의 화학적 식별 능력을 결합한 면역 전자 현미경(immuno-EM)은 망막^11,12에서 시냅스 연결 및 세포 내 단백질 국소화를 조사하기 위한 최적의 독점적인 방법으로 두드러집니다.

Immuno-EM 기법은 embedding과 antibody incubation의 순서에 따라 pre-embedding과 post-embedding 방식으로 나눌 수 있습니다. post-embedding 방법과 비교하여, pre-embedding 접근법은 대규모 및 장거리 식별이 가능하여⁽13,14,15), 축삭돌기 및 수상돌기와 같은 세포 돌기를 연구하기 위한 최적의 접근법을 제공합니다. 또한 이 기술은 강력한 신호와 넓은 시야를 제공하므로 세포질의 단백질 발현 및 분자 국소화에 대한 포괄적인 조사에 유리합니다. 이 방법은 전체 세포질, 세포 또는 망막에서 볼 수 있는 화학적으로 식별된 구조를 보장하는 데 특히 유용한 것으로 입증되었습니다.

그러나, 포스트-임베딩 방법은 프리-임베딩 방법에 비해 침투 또는 확산이 낮지만, 민감하지 않다^16,17. 간단히 말해서, 세포질 또는 시냅스 말단에서 특정 신경전달물질의 국소화를 탐색하는 것이 목표인 경우, pre-embedding immuno-EM이 선호되는 방법입니다. 반대로, 막 수용체의 국소화를 확인하기 위해서는 post-embedding immunogold EM을 활용하는 것이 더 권장됩니다.

이러한 점을 고려하여, 우리는 원뿔과 간상 경로 간의 상호 작용을 포함한 망막 회로와 마우스 망막에서 물질 P-유사 면역 반응(SP-IR)의 분포 및 시냅스 조직과 같은 분자 국소화를 탐구하기 위해 사전 임베딩 면역-EM 방법을 선택합니다.

프로토콜

동물의 보살핌과 취급은 ARVO 지침에 따라 Wenzhou Medical University의 윤리위원회 규정에 의해 승인되었습니다. 이 연구에는 성체 마우스(C57BL/6J, 수컷 및 암컷, 8주에서 12주령)가 활용되었습니다. 연구에 필요한 장비 및 시약은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 망막 고정을 위한 준비

1. 다음 재료와 도구를 조립하십시오: 해부 현미경, 끝이 매우 가는 두 개의 집게, 가위, 1mL 주사기 바늘(바늘 크기: G26) 및 여과지.
2. 체중의 0.25mg/g에서 2,2,2-트리브로모에탄올을 복강내 주사하여 마우스를 깊게 마취합니다. 그 후, 쥐의 목을 베고 머리를 자른다¹⁶.
3. 팔꿈치 가위로 눈을 적출하고 0.1M 인산염 완충액(PB, pH 7.4)에 4% 파라포름알데히드-0.2% 피크르산이 함유된 유리 접시에 넣습니다.
4. 해부 현미경으로 1mL 주사 바늘을 사용하여 각막 변두리에 구멍을 뚫고 구멍을 따라 가위로 앞쪽 부분을 잘라냅니다. 그런 다음 집게로 안쪽 망막 표면에서 수정체를 제거합니다.
5. 두 개의 겸자를 사용하여 망막이 아이컵에서 완전히 분리될 때까지 공막을 조심스럽게 벗겨냅니다(맥락막에서 완전히 분리된 큐피 망막 조직). 그런 다음 망막을 네 조각으로 자릅니다.
6. 이 부분을 실온(RT)에서 2시간 동안 0.1M PB(pH 7.4)의 4% 파라포름알데히드-0.2% 피크린산에 고정한 다음 조직을 4°C에서 밤새 0.1M PB(pH 10.4)의 4% 파라포름알데히드로 옮깁니다.

2. 사전 임베딩 면역염색

1. 0.01 M PBS (pH 7.4)에서 각각 10 분 동안 6 회 세척 한 후, 망막 조직을 1 % 수소화 붕소 (NaBH₄)에 0.01 M PBS (pH 7.4)에서 30 분 동안 배양합니다.
2. 망막 절편을 0.01M PBS(pH 7.4)로 최소 6회 세척합니다. 한편, 여과지로 유리체를 제거한 다음 양날 면도날을 사용하여 망막을 100-300μm 사이의 작은 조각으로 자릅니다.
3. RT에서 0.1M PB(pH 7.4)의 5% 정상 염소 혈청(NGS)으로 1시간 동안 차단한 후 망막 절편을 1차 항체(Anti-rabbit PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100)과 함께 0.01M PBS(pH 7.4)의 2% NGS와 함께 셰이커에서 RT에서 2시간 동안 투여합니다. 그 후, 쉐이커에서 4 °C에서 96 시간 (5 일) 동안 배양합니다.
4. 0.01 M PBS(pH 7.4)에서 각각 10분 동안 6회 세척한 후, 1:200에서 염소 항-토끼 IgG와 같은 2차 항체와 0.01 M PBS(pH 7.4)의 2% NGS와 함께 셰이커에서 RT에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 쉐이커에서 4 °C에서 48 시간 (2 일) 동안 배양합니다.
   참고: 2차 항체는 대조군 실험에서 단독으로 적용되었습니다.
5. 망막 줄무늬를 0.01M PBS(pH 7.4)에서 각각 10분 동안 6회 세척한 후 ABC 키트의 시약 A와 시약 B로 1:100에 0.01M PBS(pH 7.4)에서 4°C에서 2일 동안 배양합니다. (시약 A와 시약 B 모두를 0.01M PBS로 희석하였다. 예: 용액: 6 μl; B 용액 : 6 μl; 0.01M PBS: 588μl, 총 600μl).
6. 망막 줄무늬를 0.05M Tris buffer(pH 7.2)로 각각 10분 동안 세 번 세척합니다. 그런 다음 DAB 키트의 5% 시약 1 및 5% 시약 3을 증류수에 넣고 실온에서 1시간 동안 망막 줄무늬를 사전 배양합니다. (비율: 예: 시약 1: 50 μl; 시약 3: 50 μl; 증류수: 900 μl, 총 1000 μl).
7. DAB로 망막 줄무늬를 염색합니다. DAB 키트의 3개 튜브에서 동일한 부피의 용액을 순서대로 추가합니다(시약 1-시약 2-시약 3). 해부 현미경을 사용하여 염색 상태를 관찰합니다. 세포가 갈색이 될 때 염색을 중지하십시오. 이 프로세스는 10-20분 정도 걸립니다.
8. 망막 줄무늬를 0.05M Tris buffer(pH 7.2)로 각각 10분 동안 3회 세척한 다음 0.01M PBS에서 10분 동안 6회 세척합니다.

3. 포스트 정착 및 임베딩

1. 실온(RT)에서 1-2시간 동안 2% 글루타르알데히드에 망막 줄무늬를 고정한 다음 0.01M PBS(pH 7.4)에서 각각 10분 동안 6회 세척합니다.
2. RT에서 1시간 동안 0.1M PB에 1% 오스뮴 테트라옥사이드(OsO₄)로 망막 줄무늬를 배양하고 어두운 곳에 보관합니다.
3. 증류수(ddH₂O)에서 각각 10분 동안 6회 세척한 후 RT에서 1시간 동안 우라닐 아세테이트로 망막 조직을 배양하고 이 조직을 염색하기 위해 어두운 곳에 보관합니다.
4. 망막 조직을 아세톤 용액(50%, 70%, 80%, 90%)에 각각 10분 동안 넣은 다음 100%를 10분 동안 두 번 넣습니다.
5. 망막 조직을 같은 부피의 우라닐 아세테이트와 에폭시 수지가 포함된 혼합물에 37°C 건조 오븐에서 1시간 동안 담근 다음 우라닐 아세테이트와 수지(1:4)가 포함된 혼합물을 37°C 건조 오븐에서 밤새 담근다.
6. 건조 오븐에서 45°C에서 1시간 동안 이쑤시개를 사용하여 망막 조직을 새 레진에 부드럽게 옮긴 다음 방향의 망막 줄무늬가 레진과 함께 임베딩 플레이트에 삽입됩니다.
7. 샘플을 45°C 건조 오븐에 3시간 동안 넣고 65°C 건조 오븐에 48시간 동안 넣습니다.
8. 임베딩 블록을 사다리꼴로 성형하고 초박편절기로 블록을 1μm 두께의 절편으로 자르고, 이 절대를 톨루이딘 블루로 염색한 다음 광학 현미경으로 관심 영역을 사전 스크리닝합니다.
9. 구리 그리드에서 초박형 섹션(70-90nm)을 수집하고 전자 현미경으로 볼 수 있습니다.

결과

그림 1 은 면역 반응(IR)이 발견되지 않은 단백질 키나아제 C 알파(PKCα) 또는 SP에 대한 1차 항체를 배양하지 않은 대조군 실험의 예를 보여줍니다.

그림 2 는 마우스 망막의 PKCα-IR을 보여줍니다. PKCα는 망막의 모든 간상간상간이중극성세포(rod bipolar cell, RBC)에 대한 마커 역할을 한다(¹⁸). 전자 현미경(EM) 수준에서 RBC는 PKCα-IR을 통해 식별할 수 있으며, 이는 높은 전자 밀도를 가진 디아미노벤지딘(DAB) 반응 생성물로 시각화됩니다. 그림 2A 는 외엽상층(OPL)에서 막대 말단과 시냅스를 형성하는 PKCα 양성 RBC 수상돌기를 보여주며, 그림 2B 는 PKCα 양성 RBC 수상돌기가 원뿔 말단에 시냅스 후 위치하는 원뿔-RBC 시냅스를 보여줍니다. 또한 DAB 반응 생성물은 내부 망상층(IPL)에서 RBC 말단(그림 2C) 및 축삭돌기(그림 2D)를 식별하는 데 도움이 됩니다.

그림 3 은 생쥐 망막의 IPL에서 시냅스 전후 연결에서 물질 P(SP)의 발현을 보여줍니다. SP-IR 무축삭 세포는 SP-음성 무축삭 세포(그림 3A) 및 SP-IR 무축삭 돌기(데이터 미표시)에 대한 시냅스전(presynaptic)입니다. 또한, SP-IR 무축삭 세포는 각각 IPL의 하위층 3(S3) 및 하층 5(S5) 수준에서 시냅스 후 양극성 말단에 있습니다(그림 3B, C). 우리의 이전 연구는 SP-IR 무축삭 세포 과정이 IPL¹⁹의 다른 과정에 시냅스 출력을 형성하는 시냅스 분석을 자세히 설명합니다. 특히, SP의 세포 내 국소화는 대부분 시냅스전 말단의 시냅스 소포에서 발견됩니다(그림 3).

그림 1: 대조군 실험의 면역 전자 현미경 사진. OPL(B)에 두 개의 리본(화살촉)이 있는 원뿔 척추경(CP)과 OPL(B)에 하나의 리본이 있는 막대 구형(RS) 모두 염색이 나타나지 않았습니다. 스케일 바: 500nm(A), 200nm(B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 마우스 망막에서 PKCα 항체로 표지된 면역 전자 현미경 사진. (A) RS는 OPL에서 하나의 PKCα 양성 RBC(화살표는 면역 반응성을 나타냄) 및 두 개의 수평 세포(H)와 연결됩니다. (B) CP는 OPL에서 PKCα 양성 RBC와 연결됩니다. (C) 및 (D)는 각각 IPL에서 PKCα 양성 RBC 말단과 축삭돌기를 보여줍니다. 스케일 바: 200 nm (A), 500 nm (B), 500 nm (C), 500 nm (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 마우스 망막의 IPL에서 SP 항체로 표지된 면역 전자 현미경 사진. (A) SP-IR 무축삭 세포(A+)는 SP 음성 무축삭 세포(A-)에 대한 시냅스전(presynaptic)입니다. SP-IR 무축삭 세포는 각각 IPL의 S3(B) 및 S5(C) 레벨의 바이폴라 말단으로부터 입력을 받았습니다. 스케일 바: 200 nm (A), 200 nm (B), 200 nm (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 논문에서는 시냅스 회로와 단백질 국소화의 성공적인 관찰을 위한 세 가지 중요한 단계, 즉 (1) 빠르고 약한 고정, (2) 사전 임베딩 면역염색, (3) 사후 고정 및 임베딩에 대해 설명했습니다.

우리는 고정이 성공적인 pre-embedding immuno-EM 접근법을 위한 핵심 단계라고 제안합니다. 따라서 여기에서 새로운 고정제와 빠른 고정의 중요성을 강조하며, 이 원리를 조직 준비에 중요한 "4F 원리"라고 명명합니다. 그러나 향상된 항체 침투와 효과적인 고정을 모두 달성하는 것은 도전 과제입니다²⁰. 이 문제를 해결하기 위해 글루타르알데히드는 항원 결정 인자를 방해하고 면역염색에 영향을 미칠 수 있으므로 항체 침투를 개선하기 위해 초기 고정 중에 글루타르알데히드를 피크르산으로 대체했습니다²¹. 대조적으로, 피크르산은 막 구조와 조직 무결성²²을 더 잘 보존하지만, 고정 효능이 저하됩니다. 세 번째 단계에서는 조직 고정을 최적화하기 위해 2% 글루타르알데히드를 고정 후에 사용했습니다.

여기에 제시된 프로토콜의 요점은 다음과 같은 5단계를 포함합니다: (1) 조기 고정: 항원 결정 인자에 대한 중단을 최소화하면서 항체 침투를 개선하기 위해 초기 단계에서 피크르산을 활용합니다. (2) 고정 후: 면역염색 후 조직 고정을 향상시키기 위해 2% 글루타르알데히드를 사용합니다. (3) 환원 치료: 0.1 M PB(pH 7.4)에 1% NaBH₄ 조직을 30분 동안 배양하여 면역 반응성을 많이 회복하고 항원 및 항체의 면역 반응성을 개선하여 양성 신호를 강화합니다²³. (4) 조직 준비: 효과적인 항체 배양을 촉진하고 균일한 신호를 보장하기 위해 유리체를 제거하고 망막 조직을 작은 스트립으로 절단합니다. (5) 또한, 망막 조직을 최대한 조심스럽게 다루어야 하며, 전체 시술 과정에서 후속 관찰을 손상시킬 수 있는 손상을 피해야 합니다. 이러한 측정은 사전 임베딩 면역-EM 방법의 성공에 총체적으로 기여하며, 이를 통해 원뿔-RBC 시냅스⁽²⁴), SP-IR 분자 국소화(¹⁹) 및 마우스 망막(²⁵)에서 α-Syn의 정확한 발현과 같은 다양한 측면을 연구할 수 있습니다.

첫 번째 항체를 배양하기 전에 비특이적 신호 간섭을 제거하기 위해 2% NGS로 망막 스트립을 차단하는 것이 필수적입니다. 첫 번째 항체의 농도는 항체 자체를 기반으로 결정해야 하며, 일반적으로 동결 절편 염색에 사용되는 농도보다 높으며 사전에 최적화해야 합니다. 1차 항체 배양 기간 동안에는 적층된 망막 스트립과 항체의 완전한 접촉을 보장하여 적층된 부분의 불완전한 침투를 방지하기 위해 미세 원심분리기 튜브의 지속적인 회전이 필요합니다. 신호를 증폭하기 위해 DAB는 표준 DAB 염색 전에 사전 배양되었으며 특정 염색 시간은 일반적으로 10-20분 범위였습니다. 시간이 너무 짧으면 신호가 너무 약하여 관찰할 수 없을 수 있으며, 너무 길면 거짓 양성 신호가 발생하여 정확한 판단에 영향을 줄 수 있습니다. 일반적으로 염료의 배양 시간은 조직의 표면 색상 (갈색에서 짙은 갈색)에 직접적으로 의존합니다.

앞서 언급한 바와 같이 신호를 향상시키기 위해 액체 질소에서 조직을 동결하여 실험을 수행했지만, 18,26,27 이 방법은 양성 신호를 증폭했지만 망막 세포의 막구조 불량을 초래했습니다(데이터 표시 안 됨). 이러한 구조적 저하로 인해 세포 유형을 정확하게 식별하기가 어려웠습니다. 이를 고려하면 망막 조직이 반복적으로 얼지 않았습니다. 양성 신호를 향상시키기 위해 항체의 배양 시간을 적절하게 연장했습니다. 제안된 프로토콜은 이전의 장점을 결합하여 한천 임베딩에 비해 단계를 단순화합니다. 이는 단백질의 항원 결정 인자를 보호할 뿐만 아니라 세포막의 무결성을 보존합니다. 가장 중요한 목표는 전체 경로에 걸쳐 신경 전달 물질의 시냅스 연결 및 세포 국소화를 탐구하는 것입니다. 따라서, 프로토콜의 DAB 반응 산물은 은 강화 처리를 거치지 않았으므로, 신경전달물질 특이적 시냅스 연결 및 경로를 조사하는 데 더 적합하다²⁸.

현재 초구조적 수준에서 경로 또는 신경전달물질을 화학적으로 식별할 수 있는 방법은 제한적입니다. 그러한 방법 중 하나는 상관 광 및 전자 현미경(CLEM)^29,30이지만, 이는 매우 작은 영역에 국한되어 전체 경로에 걸쳐 연결을 식별할 수 있는 능력이 부족합니다. 사전 임베딩 immuno-EM의 강점은 강력한 신호, 넓은 범위, 장거리 분석 포지셔닝 및 추적 능력에 있습니다 13,14,15. 그러나 이 방법에는 확산 신호와 같은 제한 사항도 있어 덜 구체적입니다. 막 수용체, 특히 막에 있는 수용체의 정확한 국소화를 위해서는 post-embedding immunogold EM을 사용하는 것이 더 적합할 수 있습니다. 이 기술은 금 입자의 직접 계수를 가능하게 하여, 이들 막 수용체(¹⁶)의 수 및 변동성의 분석을 용이하게 한다.

미래에는 사전 임베딩 면역-EM과 볼륨 EM의 통합은 식별된 신경 회로의 장기 탐색을 위한 효과적인 방법으로서 유망하며, 이 방법의 추가 개발을 위한 미래 전망을 나타냅니다. 볼륨 EM은 특정 구조를 식별하기 위해 형태학에 의존하는 구조 재구성에 중점을 두며 정확한 화학적 식별이 부족합니다^31,32. pre-embedding immuno-EM과 volume EM을 결합하면 3차원 재구성 중에 특정 구조 또는 물질을 식별할 수 있어 신경 회로 식별에 대한 보다 포괄적이고 시각적으로 직관적인 접근 방식을 제공할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mL 주사기 바늘	강델라이
1% OsO4	전자 현미경 과학	19100
2,2,2-트리브로모에탄올	시그마-알드리치	T48402
8% 글루타르알데히드	전자 현미경 과학	16020
8% 파라포름알데히드	전자 현미경 과학	157-8
아세톤	전자 현미경 과학	10000
안티 토끼 PKC	시그마-알드리치	P4334
안티 래빗 SP	Abcam	ab67006
DAB 기판 키트	MXB Biotechnologies	KIT-9701/9702/9703
팔꿈치 가위	Suzhou66 비전 회사	54010
전자 현미경	필립스	CM120
Epon 수지	전자 현미경 과학	14910
펑프	Suzhou66 비전 회사	S101A
Millipore 필터 페이퍼	Merck Millipore
Na2HPO4· 12H2O	시그마	71650	인산염 완충액
NaH2PO4·의 구성 요소; H2O	Sigma	71507	인산염 완충액의 구성 요소
피크르산	전자 현미경 과학	19550
소듐 보로하이드라이드 (NaBH4)	Sigma	215511
Tris	Solarbio	917R071
초박절기	Leica
Uranyl acetate	전자 현미경 과학	22400
VACTASTAIN ABC 키트, Peroxidase (Rabbit IgG)	Vector Laboratories	PK-4001