방법 논문

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

2.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66566

⸱

2024년 4월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

이 논문에서

요약

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

초록

폐 이식 후 합병증은 주로 이식편에 반응하는 숙주 면역 체계와 관련이 있습니다. 이러한 면역 반응은 공여자와 수혜 세포 사이의 누화에 의해 조절됩니다. 이러한 과정을 더 잘 이해하려면 전임상 동물 모델을 사용해야 하며, 이식편 내 면역 세포 이동을 실시간으로 연구할 수 있는 능력의 도움을 받습니다. Intravital 이광자 현미경은 광손상을 최소화하면서 최대 수백 미크론 깊이의 조직과 장기를 이미징하는 데 사용할 수 있으며, 이는 단일 광자 컨포칼 현미경에 비해 큰 이점을 제공합니다. 프로모터 특이적 형광 단백질 발현 및/또는 생체 내 이광자 현미경 검사 중 형광 염료 표지 세포의 입양 전달과 함께 형질전환 마우스의 선택적 사용을 통해 생리학적 환경 내에서 단일 세포를 동적으로 연구할 수 있습니다. 우리 그룹은 쥐의 폐를 안정화하는 기술을 개발했으며, 이를 통해 미성숙한 폐와 정형외과적으로 이식된 폐 이식편에서 세포 역학을 이미지화할 수 있었습니다. 이 기술을 사용하면 혈관 조직 및 간질에서의 세포 거동을 자세히 평가할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 세포 집단 간의 상호 작용을 검사할 수 있습니다. 이 절차는 폐 이식 후 염증 및 내성 반응을 조절하는 면역 메커니즘을 연구하기 위해 쉽게 배우고 적용할 수 있습니다. 또한 다른 병원성 폐 질환에 대한 연구로 확장될 수 있습니다.

서론

폐 이식은 말기 폐 질환을 앓고 있는 많은 환자에게 마지막 선택입니다. 그러나 폐 이식 후 장기 생존율은 다른 고형 장기 이식에 비해 낮습니다. 5년 생존율은 ~60%-70%1에 불과하며, 심장2의 경우 80%-90%, 신장3의 경우 85%-90%입니다. 원발성 이식편 기능 장애, 항체 매개 거부 반응 및 만성 폐 동종 이식편 기능 장애와 같은 폐 이식 후 많은 합병증은 동종 이식편에 대한 숙주 면역 반응에 기인합니다. 예를 들어, 우리 그룹은 호중구가 이식에 의한 허혈-재관류 손상 후 폐 동종 이식편으로 빠르게 모집되고 혈액 단핵구를 둘러싼 동적 클러스터를 형성한다는 것을 보여주었습니다4. 기증자 세포와 수용 세포 간의 누화는 해로운 동종 면역 반응 5,6,7을 담당하며, 살아있는 동물 모델에서 이러한 동적 세포 상호 작용을 연구할 수 있는 능력은 매우 중요합니다.

이광자 현미경은 조직의 광표백을 최소화하면서 최대 수백 미크론의 깊이에 대한 고해상도 생체 내 이미징을 가능하게 합니다 8,9. 그것은 신피질(10,11), 피부(12,13) 및 신장(14,15)을 포함한 다양한 조직 및 해부학 부위에 사용됩니다. 보다 최근에는 폐 및 심장 4,16,17과 같은 비 정적 기관에 적용되었습니다. 이 프로토콜에서는 쥐 기형외과 좌측 폐 이식 후 이미지 안정화, 환기 및 관류 폐 이식편을 시행하는 기술을 설명합니다. 이식 모델의 주요 이점은 기증자와 수혜자를 개별적으로 유전적으로 조작할 수 있다는 것입니다. 개별 세포 집단은 knock-in 형광 단백질 발현, 형광표지 세포5의 입양 전달 또는 형광 표지 항체의 정맥 주사를 통해 세포 특이적 마커 4,16,17,18에 결합하는 형질전환 마우스 균주를 시각화할 수 있습니다.

이미징 중에 폐를 안정화하기 위해 이 프로토콜은 폐를 커버글라스에 접착하는 것을 포함하며, 다른 그룹에서는 맞춤형 가역 진공 장치(19)를 사용한 흡입 안정화를 설명했습니다. 당사의 프로토콜은 이미징 영역이 더 넓고 현미경 실험실에서 일반적으로 구할 수 있는 재료(커버글라스 및 접착제 포함)를 사용하여 설정하는 것이 상대적으로 용이하다는 등 여러 가지 장점이 있습니다. 이 접착 기술은 상부 표면에서 폐를 제한하기 때문에 인공호흡 움직임을 줄이고 더 깊은 이미징을 가능하게 할 것으로 예상됩니다. 이 생체 내 이미징 기술을 통해 면역 세포의 행동과 상호 작용을 실시간으로 자세히 관찰할 수 있으며, 이는 폐 이식 후 염증 반응과 내성 반응을 조절하는 면역 메커니즘 연구에 기여합니다.

프로토콜

모든 동물 취급 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals) 지침에 따라 수행되었으며 워싱턴 대학교 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 마취 및 삽관

참고: 앞서 설명한 바와 같이 Orthotopic 마우스 좌측 폐 이식이 수행됩니다20,21. 20-25g C57BL/6 (B6) 마우스의 폐를 성별 및 연령이 일치하는 B6 수혜자에게 이식합니다. 나6. LysM-GFP 리포터 마우스는 폐 이식편으로의 호중구 침윤을 시각화하기 위해 선별된 실험의 수혜자로 사용됩니다. 수혜자 마우스는 폐 이식 직후 이미지화할 수 있습니다.

  1. 케타민(80-100 mg/kg)과 자일라진(8-10 mg/kg)의 복강내 투여로 마우스를 재마취합니다. 추가적인 통증 조절을 위해 서방형 부프레노르핀(0.5-1.0mg/kg)을 피하로 투여합니다. 발 꼬집기로 적절한 마취 깊이를 확인합니다.
    참고: 폐 이식과 계획된 생체 내 영상 촬영 사이의 시간이 2시간 미만인 경우 초기 케타민 용량의 50%로 마취제를 재투여할 수 있습니다.
  2. 전기 클리퍼를 사용하여 왼쪽 가슴 전체의 머리카락을 제거하고 가슴을 닦아 과도하게 자른 머리카락을 제거합니다.
  3. 각막 건조를 방지하기 위해 약물이 아닌 안과 연고를 쥐의 눈에 바릅니다.
  4. 앞서 설명한 대로 20G 혈관카테터로 마우스를 구강삽관합니다21.
  5. 분당 120회의 호흡과 0.5cc의 일회 호흡량으로 실내 공기를 환기시킵니다.
  6. 전체 절차 동안 1% 이소플루오란을 기관내로 전달합니다.
  7. 이미징 중 혈관을 시각화하려면 이미징 최소 5분 전에 50μL의 인산염 완충 식염수에 20μL의 655nm 비표적 양자점(q-dots)을 정맥 주사합니다.

2. 영상촬영을 위한 좌측 폐의 수술 준비

  1. 마우스를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다( 그림 1A 참조).
  2. 0.75% 요오드와 70% 에탄올의 혼합물로 흉부 피부를 3회 소독합니다.
  3. 세 번째 늑간 공간을 통해 왼쪽 흉곽 절개술(마우스 폐 이식에서)을 다시 엽니다( 그림 1A 참조).
  4. 1.5cm x 1.5cm 크기의 왼쪽 흉곽 절개 부위의 피부와 연조직을 제거합니다( 그림 1B 참조).
  5. 갈비뼈를 절제하기 전에 먼저 지혈을 달성하기 위해 미세혈관을 혈전화시키기 위해 갈비뼈를 ~10초 동안 고정합니다( 그림 1C, D 참조).
  6. 3번째에서 5번째 갈비뼈의 일부를 절제하여 폐를 절제할 수 있을 만큼 충분히 큰 이미징 창을 만듭니다(두개골 쪽으로 ~0.8cm, 전후방으로 ~1.0cm, 그림 1D, E).
  7. 전기 소작으로 갈비뼈 가장자리에서 추가 출혈을 막습니다.
    참고: 이미징 기간 동안 과도한 출혈을 피하기 위해 갈비뼈의 절단 가장자리에서 지혈을 달성하는 것이 중요합니다.
  8. 오른쪽 가슴 아래에 작은 돌기(세로로 4번 접은 4cm x 4cm 거즈)를 놓습니다( 그림 1E 참조).
  9. 면봉을 사용하여 폐 이식편을 가슴에서 들어 올리고 폐의 아래쪽을 식염수에 적신 거즈 1cm x 3cm 스트립에 놓습니다( 그림 1F 참조).
    알림: 이 식염수 적신 거즈 스트립은 폐가 미끄러지는 것을 방지하고, 폐의 습한 환경을 유지하고, 절제된 갈비뼈의 날카로운 모서리로부터 폐를 보호하고, 폐를 심장 운동과 분리합니다. 원주 이미징 챔버가 폐에 적용되면(섹션 3에 설명된 그림 1G, H) 이미징 기간 동안 열린 흉강에서 발생하는 열 및 체액 손실이 최소화되어야 합니다.

3. 이미징 챔버 준비

참고: 이미징 챔버는 맞춤형으로 제작됩니다( 그림 2A 참조). 이 이미징 챔버는 베이스 플레이트와 상단 플레이트로 구성되며, 그 사이에 마우스가 배치되고 양쪽에 스프링이 장착된 볼트로 제자리에 고정됩니다(그림 2B). 상판에는 직경이 ~2cm 인 원형 컷아웃이 있습니다. 상반구 전면에 있는 이 구멍에 해당하는 크기의 검은색 O 링이 배치되어 대물 렌즈를 보호합니다(그림 2C). 24mm x 50mm 커버글라스를 고진공 그리스를 사용하여 상판 뒷면에 부착하여 방수 밀봉을 생성합니다. 이 커버글라스는 아래의 폐에 부착되고 위의 이미징 매체(즉, 물)를 유지하여 이미징 창 역할을 합니다. 원형 이미징 창 내에 진공 그리스가 들어가지 않도록 합니다. 커버글라스는 새로운 이미징 실험이 있을 때마다 교체됩니다. 베이스 플레이트는 열전대 온도 프로브를 사용하여 35-37 °C로 가열됩니다(그림 2A).

  1. 삽관된 마우스를 열린 왼쪽 가슴이 위를 향하도록 하여 이미징 챔버의 베이스 플레이트에 놓습니다( 그림 1G, H 참조). 실크 테이프로 마우스를 얼굴, 앞발, 꼬리에 고정합니다( 그림 1H 및 그림 2A 참조).
  2. 상판에 부착된 커버 유리의 바닥면( 그림 2C, 하단의 회색 원)에 접착제를 바르고 중앙에 0.8-1.0cm의 접착제가 없는 원을 남깁니다.
    참고: glue-free circle의 크기와 motion artifact의 양 사이에는 장단점이 있습니다. 따라서 원의 지름이 1.0cm를 초과하지 않는 것이 좋습니다.
  3. 커버글라스가 폐에 닿을 때까지 상판을 내리고 접착제가 폐 표면에 닿을 때까지 내립니다( 그림 1G 참조).
    알림: 왼쪽 폐는 이미징될 영역인 중앙에 깨끗하고 접착제가 없는 원이 있는 커버글라스에 접착됩니다.
  4. 커버글라스를 폐에 대고 1-2초 동안 폐를 팽창시켜 접착제 영역이 주변 조직에 부착되도록 합니다. 쥐의 기관내관에서 인공호흡기로 가는 유출 튜브를 폐색하여 폐 팽창을 달성합니다.
    알림: 과도한 압력 외상을 유발할 수 있으므로 폐를 1-2초 이상 팽창시키지 마십시오.
  5. 폐 조직에 가해지는 압력을 줄이기 위해 상판에서 약간 뒤로 물러납니다. 이미징 창 내의 폐 영역이 환기와 함께 움직이지 않도록 하십시오.
  6. 각 볼트 위에 나비 너트를 고정하여 상판의 양쪽 끝을 고정합니다( 그림 2B 참조).

4. 이광자 이미징

참고: 20x 또는 25x >1.0 NA(numerical aperture) 수침 대물렌즈가 있는 고정 스테이지, 정립 현미경을 생체 내 현미경 검사에 사용해야 합니다. 아래는 이 연구에서 B6에서 B6에 대해 사용된 설정입니다. LysM-GFP 655nm q-dot 혈관 라벨링을 사용한 좌측 폐 이식. 이 프로토콜을 적용할 때 현미경, 레이저 및 dichroic filter의 설정은 특정 실험의 요구 사항과 사용된 형광 리포터에 따라 조정할 수 있습니다.

  1. 전체 이미징 챔버를 삽관된 수용 마우스(B6, 왼쪽 폐가 B6에 이식됨)와 함께 놓습니다. 655nm q-dots가 있는 LysM-GFP)를 현미경 스테이지에 넣습니다( 그림 2A 참조).
  2. 480nm, 560nm 및 635nm 파장의 이색성 필터를 사용하면 GFP 리포터, q-dots 및 콜라겐에 의해 생성된 2차 고조파 생성(SHG) 신호(445nm)에서 신호를 적절하게 분리할 수 있습니다. 이러한 필터는 특정 실험에 따라 조정할 수 있습니다.
    참고: 콜라겐에 의해 생성된 SHG 신호는 폐포 공역을 나타내는 어두운 분화구와 같은 구조를 구분합니다( 그림 3의 흰색 화살표 참조).
  3. 티타늄-사파이어 펨토초 펄스 레이저를 890nm(근적외선 범위 내)로 설정하여 excitation합니다. 충분한 신호를 얻기 위해 가능한 가장 낮은 레이저 출력을 사용하십시오.
    알림: 신호 분리를 최대화하기 위해 특정 실험에 맞게 레이저 설정을 조정해야 합니다.
  4. ~1mL의 물을 도포하여 상판의 커버글라스를 완전히 덮고, 이는 O-링과 커버 글라스의 진공 그리스 씰에 의해 상판에 제자리에 유지됩니다( 그림 1G 및 그림 2C 참조).
  5. 현미경에 20x >1.0 NA Water Immersion Objective를 사용합니다. 대물렌즈가 특정 실험에 따라 조정되었는지 확인하십시오.
    참고: NA가 클수록 더 많은 빛을 수집하고 대비를 높이며 더 상세한 이미지를 얻을 수 있습니다. Water Immersion Objective는 물 또는 완충액이 생물학적 조직과 더 잘 호환되기 때문에 선호됩니다.
  6. 현미경의 대물렌즈를 물 속으로 내리고 폐 표면에 초점을 맞춥니다.
  7. 베이스 플레이트 히터를 활성화하고 온도를 35-37 °C로 유지합니다.
    알림: 조직 온도를 유지하거나 폐에 적절한 관류를 유지할 수 없는 우려가 있는 경우 베이스 플레이트 외에 상단 플레이트를 따뜻하게 하기 위해 두 개의 추가 저항기를 부착할 수 있습니다( 보충 그림 1 참조).
  8. 선택한 수집 소프트웨어로 이미지 스택을 획득합니다.
    알림: 획득하는 동안 방이 완전히 어둡게 되어 있는지 확인하며, 여기에는 암막 커튼/블라인드를 사용하고 모든 광원을 전략적으로 덮는 것이 포함될 수 있습니다.

5. 비디오 획득

참고: 다음 매개변수는 특정 실험에 따라 조정할 수 있습니다. 5.1-5.3 단계에서는 B6에서 B6에 사용되는 특정 매개 변수를 설명합니다. Lysm-GFP 쥐 좌측 폐 이식, 참조 가이드로 사용할 수 있습니다.

  1. 비디오 속도 양방향 스캐너를 사용하여 x-y 스캔 크기를 512 x 512 픽셀로 설정합니다.
  2. xyz 스테퍼 유닛을 사용하여 단계당 평균 10프레임으로 21단계 z 스택의 타임랩스 기록을 획득합니다. 각 스택을 획득하는 데 약 20초가 걸리며, 여기에는 프레임 평균화에 필요한 시간, 스테퍼 모터가 이동하고 위치를 확인하는 데 필요한 시간, 100ms 지연이 포함됩니다.
    참고: 이 연구에 사용된 현미경의 양방향 스캐너는 30프레임/초의 비디오 속도로 작동합니다. 이는 특정 현미경 설정에 따라 다를 수 있습니다.
  3. 80개의 연속 z-stack을 획득하여 조직 실질 내 백혈구 이동에 대한 타임랩스 이미징을 얻습니다. 20초/스택에서 약 ~27분이 소요됩니다.
    알림: 스택 크기, 프레임 평균화, 레이저 출력 및 타임랩스 기록의 총 길이는 조직에 대한 과도한 레이저 노출을 방지하기 위해 최소화해야 합니다. 사용된 형광 리포터가 밝고(즉, GFP) 레이저 출력이 낮은 경우 ~27분 동안 20초 간격으로 10프레임 평균, 512 x 512픽셀 스캔으로 21단계 z-stack을 반복하는 것이 마우스에서 잘 견딜 수 있습니다. 더 긴 기간의 이미징이 필요한 경우 총 레이저 노출을 동일하게 유지하기 위해 스택당 획득 시간을 늘려야 합니다(즉, ~1.5시간 동안 스택당 1분). 이러한 설정은 사용된 형광 리포터에 따라 최적화해야 합니다.
  4. 이미지 획득이 끝나면 마우스를 안락사시킵니다. 안락사시키려면 케타민(80−100mg/kg)과 자일라진(8−10mg/kg)으로 쥐를 마취한 후 자궁경부 탈구를 수행합니다. 일반적인 이미징 제제는 최대 2시간 동안 마우스의 생존력을 쉽게 유지할 수 있습니다.
    알림: 이 기간을 연장하려면 추가 수분 보충, 이소플루란으로 마취, 온도 조절에 주의가 필요할 수 있습니다.
  5. Imaris로 완벽한 비디오 렌더링. 다른 이미징 소프트웨어(예: ImageJ)도 사용할 수 있습니다.
    참고: 이미지는 채널 누화를 제거하기 위해 대비 향상, 스무딩 및 채널 산술 연산을 사용하여 획득 후 처리될 수 있습니다.

결과

4 °C에서 1 시간의 저온 허혈성 보관 후 B6 마우스의 왼쪽 폐를 B6에 정형외과 이식했습니다. LysM-GFP 마우스4를 사용한 후, 위에서 설명한 바와 같이 생체 내 이광자 이미징을 수행하였다. 우리는 이식 후 2시간(그림 3A)과 24시간(그림 3B)의 두 시점에서 이미징을 수행했습니다. 혈관은 이미징 직전에 주입된 q-dots에 의해 빨간색으로 표시됩니다. 또한 24시간4에서 q-dots를 차지한 단핵구를 시각화할 수 있습니다. 녹색 표지가 부착된 수혜자 유래 호중구는 이식 후 24시간 시점의 해당 비디오에서 폐 이식편에 침투하는 것을 볼 수 있습니다(보충 비디오 1). 허파꽈리는 콜라겐의 SHG로 인해 어두운 분화구로 시각화할 수 있습니다( 그림 3의 흰색 화살표). 이식 후 24시간에는 이식 후 2시간에 비해 폐에 더 많은 호중구가 있는 것을 관찰할 수 있습니다(그림 3).

figure-results-1
그림 1: 이광자 이미징을 위한 마우스 준비. (A) 왼쪽 흉곽 절개술 위에 피부가 다시 열렸습니다. (B) 왼쪽 가슴 위로 절제된 피부 및 연조직. (씨,디) 갈비뼈는 분할하기 전에 10초 동안 고정되었습니다. (E) 왼쪽3-5번째 갈비뼈를 절제하여 두개골 쪽으로 ~0.8cm x 전후방으로 1.0cm 크기의 창을 만듭니다. (F) 왼쪽 폐를 왼쪽 가슴에서 들어 올려 거즈 스트립에 놓습니다. (G) 이미징 창이 있는 이미징 챔버가 왼쪽 폐 위에 있습니다. (아) 현미경 스테이지에 배치된 이미징 챔버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 이미징 챔버 설정. (A) 현미경 스테이지에 배치된 이미징 챔버. (B) 왼쪽 폐 위에 상판을 고정하기 위한 스프링 장착 볼트 메커니즘의 확대도. (C) O-링과 커버글라스가 적용된 상판의 전면 및 후면. 흰색 선은 커버글라스를 상판에 부착하기 위해 진공 그리스가 적용되는 영역을 나타냅니다. 회색 원은 커버 유리에 적용할 접착제 고리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: B6에서 B6로 마우스 왼쪽 폐 이식의 이광자 생체 내 이미징. 1시간 저온 허혈성 보관이 가능한 LysM-GFP 마우스. 이미징은 이식 후 (A) 2시간 및 (B) 24시간에 수행됩니다. 빨간색은 q-점을 나타냅니다. 녹색은 B6의 호중구를 나타냅니다. LysM-GFP 수혜자. 파란색은 콜라겐이 풍부한 폐포에서 추출한 SHG를 나타냅니다. 흰색 화살표는 폐포 영공을 나타냅니다. 눈금 막대는 20μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 추가 가열을 제공하기 위해 두 개의 저항이 부착된 상판. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 1: B6에서 B6로 이식된 마우스 왼쪽 폐의 이광자 타임랩스 이미징. 1시간의 저온 허혈성 보관이 있는 LysM-GFP 마우스, 이식 후 24시간에 수행. 빨간색은 q-점을 나타냅니다. 녹색은 LysM-GFP 수혜자의 호중구를 나타냅니다. 파란색은 콜라겐이 풍부한 폐포에서 두 번째 조화로운 세대를 나타냅니다. 눈금 막대는 20 μm를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이광자 여기(two-photon excitation)는 1931년 마리아 괴페르트-마이어(Maria Göppert-Mayer)의 박사 학위 논문에서 처음 설명되었으며, 나중에 핵 껍질 구조를 설명하여 노벨 물리학상을 수상했습니다22,23. 기존의 형광 현미경 검사는 방출 파장보다 더 짧고 에너지가 높은 여기 파장을 가진 단일 광자 여기(single-photon excitation)에 의존합니다. 단일 광자 현미경과 달리 이광자 현미경은 방출 된 형광 신호(24,25,26)보다 더 긴 파장을 가진 두 광자에 의한 동시 여기(excitation)를 포함합니다. 두 개의 개별 광자가 조직의 단일 초점을 여기시키기 위해 공동 국소화되어야 하기 때문에, 이광자 여기(two-photon excitation)는 공간적으로 작은 샘플 부피에 대해 이루어지며, 광학 절편(24,25,26)을 허용하고 초점(27)을 포함하는 평면의 위와 아래에서 광표백이 적습니다. 두 광자에 의한 동시 여기 확률은 매우 낮으므로 형광 방출 신호 25,26,27에 필요한 여기 강도를 달성하기 위해 펨토초 펄스 레이저가 필요합니다. 여기 레이저는 근적외선 범위(700-1100nm)에 있으며, 그 장점은 산란이 적어 빛이 조직(28) 내로 더 깊게 침투할 수 있다는 점이다. 이미징의 깊이는 레이저(24)의 진동 속도 및 출력에 따라 달라진다. 폐 내에서 ~500-600 μm의 이미징 깊이를 달성할 수 있습니다17. 따라서 이미징 깊이와 낮은 광표백의 조합은 이광자 현미경을 장기의 생체 내 이미징에 매우 적합하게 만듭니다.

이광자 현미경은 피부12,13, 림프절29, 정맥 내피30, 뇌 피질10,11, 신장14,15 및 간31,32와 같은 여러 조직 및 해부학적 부위에서 사용되었습니다. 예를 들어, 생쥐 진피에서, 무균 신체 손상 후 호중구 군집(neutrophil swarming)을 설명하기 위해 생체 내 이광자 이미징(intravital two-photon imaging)이 사용되어 왔다12. 정맥 혈전증의 모델에서, 혈액 단핵구와 호중구가 하대정맥(30)의 내피를 따라 기어가는 것을 시각화하였다. 인간 미세아교세포는 인간 뇌 오가노이드 모델33에 이종장기이식된 후 생체 내에서 성공적으로 이미징되었습니다. 이광자 현미경의 지속적인 발전으로 더 깊은 곳과 비정적 장기에서도 생체 내 이미징이 가능합니다. 예를 들어, 최대 1000 μm의 깊이는 Ti:Al2O3 재생 증폭기34를 사용하여 마우스의 신피질에서 이미지화되었습니다.

흉부 장기의 생체 내 이미징의 과제 중 하나는 이미지 안정화입니다. 박동하는 심장과 폐 호흡의 움직임으로 인해 모션 아티팩트는 이미지 품질을 크게 저하시킬 수 있습니다. 심장 및 폐 영상에 대한 여러 안정화 방법이 개발되었는데, 이에는 장기접착(4,7), 흡입-안정화(19,35,36,37) 및 후방 운동 보정(38)이 포함된다. 폐를 이미징하는 우리의 기술은 폐 표면을 안정화된 커버글라스에 붙이는 것에 의존합니다. 우리는 폐를 관류, 환기 및 정상 보온 상태로 유지하여 생체 내에서 발견되는 조건을 시뮬레이션합니다. Looney et al.19에 의해 기술된 흡입-안정화 방법과 비교하여, 이 프로토콜은 몇 가지 장점이 있다. 첫째, 특수 흡입 장치를 만들 필요가 없습니다. 대신, 당사의 이미징 챔버와 상판은 현미경 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 재료로 구성할 수 있습니다. 또한 흡입 장치(내경 4mm)와 비교하여 이 연구에 사용된 접착 기술은 더 큰 이미징 표면적(최대 10mm)을 허용합니다. 원주 접착을 사용하면 접착제 원 내의 폐 영역이 적절하게 제한되고 환기 동작이 최소화됩니다. 흡입 기술과 비교했을 때, 커버 글래스 접근법은 흉막하 모세혈관 혈류에 영향을 줄 수 있는 폐 표면의 볼록한 변형을 방지합니다. 우리 시스템의 단점은 흉막 실질 접합부를 손상시키지 않고 커버슬립을 제거할 수 없다는 것입니다. 따라서 여기에 사용된 접착제 기술로는 폐를 두 번 이미지화할 수 없는 반면, 흡입 기술은 연속 이미징을 허용합니다. 또한 개흉술을 사용하면 정상적인 음의 흉곽 내 압력이 손실되어야 하며, 이는 양압 환기와 결합되어 생리학적이지 않습니다. 추가 제한 사항, 이광자 이미징의 제한 사항은 아래에 설명되어 있습니다.

생체 내 이미징 중에 흉부가 열려 있는 동안에는 가능한 한 생리적 환경에 가깝게 유지하는 것이 중요합니다. 마우스가 놓인 베이스 플레이트는 35-37 °C의 온도로 유지됩니다. 베이스 플레이트만 가열하면 마우스 코어 온도(직장 프로브를 통해 측정)가 몇 시간에 걸쳐 잘 조절된다는 것을 발견했습니다. 우리의 경험에 따르면 세포 운동성과 행동은 온도가 32°C 이하로 떨어질 때만 눈에 띄게 영향을 받으며, 이 설정에서는 이러한 현상이 발생하지 않을 수 있습니다. 이 이미징 챔버의 초기 설정 중에 조직 정상 체온증 또는 폐 관류를 유지하는 데 어려움이 있는 경우 베이스 플레이트 외에 상단 플레이트를 따뜻하게 하기 위해 두 개의 추가 저항기를 부착할 수 있습니다(보충 그림 1). 이미징 챔버가 최적화되면 각 이미징 실험 중에 마우스의 내부 온도를 정기적으로 모니터링할 필요가 없습니다. 또한, 열린 흉강에 식염수를 적신 거즈를 놓고 촬영할 폐 부위 주변의 접착제 폐색 고리를 조합하면 촬영 중 체액 손실을 최소화하는 데 효과적이라는 것을 발견했습니다.

중요한 기술적 고려 사항은 흉부 영상 창을 만들 때 갈비뼈 절제 중에 우수한 지혈을 달성하는 것입니다. 왼쪽 3번째에서 5번째 갈비뼈의 일부를 절제하며, 이 절단된 갈비뼈에서 지속적인 출혈은 이미징 중 쥐의 생존을 손상시킵니다. 이를 방지하려면 먼저 갈비뼈를 절제할 위치에 근접하게 고정하여 10초 동안 미세혈관을 혈전화하는 것이 좋습니다(그림 1C,D 참조). 그런 다음 갈비뼈를 절제한 후 갈비뼈의 절단된 가장자리를 전기 소작으로 충분히 응고시켜야 합니다. 마지막으로, 이미징 중에 왼쪽 폐를 식염수에 적신 거즈 스트립(그림 1F 참조) 위에 올려 놓아 날카로운 갈비뼈 가장자리가 폐에 구멍을 뚫는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 이러한 기술적 고려 사항의 조합을 통해 폐 손상이나 정상적인 관류 패턴의 손실 없이 몇 시간 동안 최소한의 움직임 아티팩트로 폐 실질 내 면역 세포 이동에 대한 선명한 비디오를 캡처할 수 있습니다.

이광자 현미경은 전염병 및 멸균 염증 모델을 연구하기 위해 폐에서 사용되었습니다. 한 그룹은 이광자 이미징을 사용하여 인플루엔자 바이러스에 감염된 쥐 폐의 반복적인 도전에 따른 상주 기억, B 세포 운동성 및 이동을 연구했습니다39. 또한 이광자 현미경은 피부, 신장 및 췌장 섬 이식에 사용되었습니다40,41,42,43. 이식 모델을 사용하면 기증자와 수혜자를 유전적으로 변경하여 각각의 세포 집단을 연구할 수 있습니다. 우리가 알기로는, 우리 그룹은 쥐 폐 이식에서 생체 내 이광자 이미징을 처음으로 수행했습니다4. 우리는 이식 매개 허혈-재관류 손상 후 빠른 호중구 모집 및 군집을 관찰했으며, 이는 혈액 단핵구의 약리학적 고갈로 감소했다4. 후속 연구에서 우리는 수혜자 비장 유래 단핵구가 IL-1B44의 생산을 통해 호중구 외래를 촉진한다는 것을 보여주었습니다. 이 연구에서 생체 내 이미징을 통해 이식 후 염증 반응을 줄이기 위한 가능한 치료 표적으로 호중구 유출의 업스트림 조절자를 발견할 수 있었습니다45. 또한, 이종성 이식 후 쥐의 심장을 박동하는 데 생체 내 이미징을 수행했습니다16. 심근으로의 호중구 모집을 시각화한 결과, 심장 이식 세포의 강낭세포 사멸이 심장 이식 후 염증을 유발한다는 것을 발견했다46. 우리는 이식된 대동맥궁에 유사한 안정화 기법을 적용하여 죽상동맥경화반으로의 단핵구 이동을 시각화했다47. 이 연구는 비정적 이식 흉부 장기의 생체 내 이미징의 타당성과 유용성을 입증했습니다.

마지막으로, 다양한 세포 유형과 폐 실질을 시각화하는 방법에 대해 논의할 가치가 있습니다. 세포를 라벨링하기 위해 두 가지 주요 방법이 사용됩니다 - 1) 형광 단백질의 knock-in 돌연변이가 있는 형질전환 마우스 균주와 2) 세포를 염색하기 위한 형광 라벨링 항체. 이광자 현미경으로 면역 세포를 식별하기 위해 일반적으로 사용되는 형질전환 마우스 균주에는 호중구(48)에 대한 LysM-GFP, 다양한 간질성 대식세포 집단에 대한 CX3Cr1-GFP(49,50), 고전적 단핵구(51)에 대한 CCR2-GFP, B 세포(52)에 대한 CD19-tdTomato, 조절T 세포에 대한 Foxp3-GFP가 포함됩니다. 특히, CX3Cr1만으로는 세포를 명확하게 식별하기에 충분하지 않지만, 이는 간질성 대식세포와 일치하는 세포 형태 및 위치에 의해 도움이 될 수 있습니다. 폐포 대식세포는 자가형광53,54, 독특한 형태 및 거동(즉, 타임랩스 기록의 시간 해상도에서 운동성 부족)으로 인해 라벨링 없이 이미징할 수 있습니다. 자가형광성인 호산구와 비교하여, 폐포 대식세포는 890nm 여기(excitation)에서 더 크고 상당히 밝다(excitation 54). 대안적으로, 폐포 대식세포는 염료 응집체(54)의 폐내 투여를 통해 그들의 식세포 기능에 기초하여 표지될 수도 있다.

이식 수혜자에서 면역 세포의 시각화는 형광 표지된 세포의 혈관 내 입양 전달 또는 세포 특이적 표면 마커에 대한 형광 표지 항체의 주입에 의해 수행될 수도 있습니다(18,55). 이광자 현미경 검사의 또 다른 고유한 이점은 콜라겐56과 같은 조직 내의 특정 복굴절 구조에 의한 SHG입니다. 이 현상은 폐포낭의 콜라겐 함량이 높기 때문에 폐포 영상에 특히 유용하며, 이는 추가적인 형광 염료 없이 폐포 구조의 본질적인 지표 역할을 합니다. 또한, 폐포는 655nm q-dots로 표시된 폐포 모세혈관에 의해 둘러싸여 있습니다. 마지막으로, q-dots(이 프로토콜에 설명된 대로) 또는 로다민 B 덱스트란의 정맥 주사로 혈관을 표지할 수 있습니다. 생체 내 2광자 현미경 실험을 설계할 때 블리드 스루(bleed-through) 및 채널 간 차별화 불량의 위험을 최소화하기 위해 4개 이하의 서로 다른 방출 채널을 사용하는 것이 좋습니다.

설명된 접착제 안정화 기술의 주요 한계 중 하나는 폐 표면에 잠재적인 조직 손상과 잔류 접착제 없이 폐에서 커버글라스를 제거할 수 없다는 것입니다. 따라서 폐는 여러 날에 걸쳐 여러 시점에서 촬영하는 것이 아니라 한 번만 촬영할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 한 그룹은 폐(57)의 연속적인 이미징을 가능하게 하는 반영구적인 흉부 이미징 윈도우를 설명했다. 그러나 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이 접근법은 장시간의 이미징에 대해 적절한 폐 안정화를 허용하지 않습니다. 이 기술은 여러 시간 동안 폐를 영상화할 수 있는 기능을 제공하여 이식 후 선천성 및 적응 면역 반응에 대한 주요 통찰력을 제공합니다.

이광자 이미징의 다른 한계로는 값비싼 초기 설치 비용과 시스템 유지 관리에 필요한 전문 지식이 있습니다. 스캔 필드는 immunofluorescent imaging에 비해 상대적으로 작습니다. 열 및 광 손상은 신중한 획득 파라미터 최적화 없이는 심각할 수 있습니다. 2광자 여기 점 확산 기능은 광범위하여 특히 z 차원에서 해상도를 다소 제한합니다. 또한 이광자 이미징을 위해서는 관심 세포를 형광 라벨링해야 하며, 일부 셀은 단일 세포 마커로 명확하게 라벨링할 수 없습니다. 동시에 이미징할 수 있는 신호의 수는 종종 4개 이하로 제한됩니다. 마지막으로, 마취, 수술 및 영상 촬영은 폐 이식 외에도 추가적인 염증 및 생리적 변화를 유발할 수 있으며, 이는 생리적 환경을 유지하기 위한 최선의 노력에도 불구하고 실험 결과와 해석을 혼란스럽게 할 수 있습니다. 향후 방향에는 생체 내 이미징의 최소 침습 방법(예: 소규모 개흉절개술 또는 기관지 내시경 접근법)의 개발이 포함됩니다.

결론적으로, 생체 내 이광자 현미경은 여러 질병 과정을 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다. 여기에서는 쥐 폐 이식 후 세포 이동과 서로 다른 세포 집단 간의 동적 상호 작용에 대한 생체 내 관찰을 가능하게 하는 신뢰할 수 있는 폐 고정화 및 이광자 이미징 기술에 대해 설명합니다. 이 기술은 이식 후 면역 환경에 대한 우리의 이해를 넓혔으며 폐 이식 및 기타 폐 질환 과정 연구에 없어서는 안될 도구가 될 것입니다.

공개 사항

저자는 관련 공개를 보고하지 않습니다.

감사의 글

이 연구는 NIH 1P01AI11650 및 Barnes-Jewish Hospital 재단의 보조금으로 지원됩니다. Washington University School of Medicine의 In Vivo Imaging Core에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.75% 포비돈-요오드AplicareNDC 52380-0126-2소독제용
1인치 20G IV 카테터TerumoSROX2025CA기관내관(ETT)용
1인치 실크 테이프Durapore3M ID 7100057168마우스를 위치에 고정하려면
20x 침수 긴 대물 렌즈OlympusN20X-PFH
3M Vetbond 접착제Medi-Vet.com10872커버 유리를 폐에 접착
655nm 비표적 양자점ThermoFisherQ21021MP혈관 라벨링용
70% 에탄올Sigma AldrichEX0281소독제용
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
Black O ring (2 cm)철물점N/A맞춤형 이미징용 챔버
볼트 (2)철물점N/A맞춤형 이미징 챔버용
황동 썸 너트 (2)하드웨어 매장N/A맞춤형 이미징 챔버용
부프레노르핀 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30통증 조절용
카멜레온 티타늄-사파이어 펨토초 펄스 레이저코히런트N/A
커버 유리(24mm x 50mm)Thomas Scientific1202F63맞춤형 이미징 챔버용
곡선형 모기 클램프 (1)Fine Science Tools13009-12
이중 채널 히터 컨트롤러Warner InstrumentsTC-344B
Fine scissors (1)Fine Science Tools15040-11
고정 스테이지 정립 현미경OlympusBX51WI
거즈 (1cm x 3cm로 절단)McKesson476709왼쪽 폐 아래에 놓기
위해 고진공 그리스다우 코닝N / A상판에 커버 유리를 부착하려면
Isoflurane 1 %Sigma Aldrich26675-46-7마취
용 케타민 염산염 100 mg / mLVedcoNDC 50989-996-06마취
용 금속 시트 (3cm x 7cm)철물점N/A맞춤형 이미징 챔버용
뾰족한 면 팁 어플리케이터Solon56225폐 조작 및 둔기 해부
Power Pro Ultra clipperOster078400-020-001
Puralube Vet 눈 연고Medi-Vet.com11897눈 건조를 방지하기 위해
작은 동물 인공호흡기Harvard 장치: 55-0000
스트레이트 펜치 (1)Fine Science Tools91113-10
3 채널 셔터 드라이버UniblitzVMM-D3공진 스캐너
xyz 광학 스테퍼 모터Prior ScientificOptiScan II
Xylazine 20 mg / mLAkornNDC 59399-110-20통증 조절

참고문헌

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Khush, K. K., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 37th adult heart transplantation report-2020; focus on deceased donor characteristics. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1003-1015 (2020).
  3. Wang, J. H., Skeans, M. A., Israni, A. K. Current status of kidney transplant outcomes: Dying to survive. Adv Chronic Kidney Dis. 23 (5), 281-286 (2016).
  4. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  5. Li, W., et al. Bronchus-associated lymphoid tissue-resident Foxp3+ T lymphocytes prevent antibody-mediated lung rejection. J Clin Invest. 129 (2), 556-568 (2019).
  6. Kurihara, C., et al. Crosstalk between nonclassical monocytes and alveolar macrophages mediates transplant ischemia-reperfusion injury through classical monocyte recruitment. JCI Insight. 6 (6), e147282(2021).
  7. Spahn, J. H., et al. DAP12 expression in lung macrophages mediates ischemia/reperfusion injury by promoting neutrophil extravasation. J Immunol. 194 (8), 4039-4048 (2015).
  8. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  9. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2 (11), 872-880 (2002).
  10. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  11. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  12. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Ashworth, S. L., Sandoval, R. M., Tanner, G. A., Molitoris, B. A. Two-photon microscopy: visualization of kidney dynamics. Kidney Int. 72 (4), 416-421 (2007).
  15. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9(+) cell to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203-12213 (2020).
  16. Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. J Clin Invest. 122 (7), 2499-2508 (2012).
  17. Nava, R. G., et al. Two-photon microscopy in pulmonary research. Semin Immunopathol. 32 (3), 297-304 (2010).
  18. Li, W., et al. Necroptosis triggers spatially restricted neutrophil-mediated vascular damage during lung ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (10), e2111537119(2022).
  19. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  20. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
  21. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
  22. Grzybowski, A., Pietrzak, K. Maria Goeppert-Mayer (1906-1972): two-photon effect on dermatology. Clin Dermatol. 31 (2), 221-225 (2013).
  23. Göppert-Mayer, M. Uber Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys. 401 (3), 273-294 (1931).
  24. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  25. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Diaspro, A., et al. Multi-photon excitation microscopy. Biomed Eng Online. 5, 36(2006).
  27. Williams, R. M., Piston, D. W., Webb, W. W. Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry. FASEB J. 8 (11), 804-813 (1994).
  28. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  29. Chtanova, T., et al. Dynamics of neutrophil migration in lymph nodes during infection. Immunity. 29 (3), 487-496 (2008).
  30. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  31. Stanciu, S. G., et al. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and Bag-of-Features image classification. Sci Rep. 4, 4636(2014).
  32. Hsiao, C. Y., et al. Improved second harmonic generation and two-photon excitation fluorescence microscopy-based quantitative assessments of liver fibrosis through auto-correction and optimal sampling. Quant Imaging Med Surg. 11 (1), 351-361 (2021).
  33. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126 (2023).
  34. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  35. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  38. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infect Immun. 82 (2), 864-872 (2014).
  39. MacLean, A. J., et al. Secondary influenza challenge triggers resident memory B cell migration and rapid relocation to boost antibody secretion at infected sites. Immunity. 55 (4), e718 718-733 (2022).
  40. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (31), 12863-12868 (2011).
  41. Camirand, G. New perspectives in transplantation through intravital microscopy imaging. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 6-12 (2013).
  42. Camirand, G., et al. Multiphoton intravital microscopy of the transplanted mouse kidney. Am J Transplant. 11 (10), 2067-2074 (2011).
  43. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17 (6), 744-749 (2011).
  44. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  45. Li, W., et al. Resolvin D1 prevents injurious neutrophil swarming in transplanted lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (31), e2302938120(2023).
  46. Li, W., et al. Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation. J Clin Invest. 129 (6), 2293-2304 (2019).
  47. Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-Brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (5), 1030-1036 (2018).
  48. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  49. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods Mol Biol. 1041, 307-317 (2013).
  50. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute Crit Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  51. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circ Res. 124 (2), 263-278 (2019).
  52. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), e134700(2020).
  53. Lohmeyer, J., Friedrich, J., Rosseau, S., Pralle, H., Seeger, W. Multiparameter flow cytometric analysis of inflammatory cells contained in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 172 (1), 59-70 (1994).
  54. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), e111 110-125 (2020).
  55. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  56. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  57. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).

재인쇄 및 허가

태그

생체 내 이미징폐 이식마우스 폐 이식편면역 세포 트래킹정위성 폐 이식호중구 침윤조절 T 세포이미징 윈도우폐 동종이식편
이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.