본 연구에서는 랫트 다이어프램 모터 유닛 연결성을 정량화하기 위해 모터 유닛 수와 크기를 추정하는 in vivo 방법을 제시합니다. 이러한 기술에 대한 단계별 접근 방식에 대해 설명합니다.
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방법 논문
Assessing Rat Diaphragm Motor Unit Connectivity Outcome Measures: as Quantitative Biomarkers of Phrenic Motor Neuron Degeneration and Compensation(쥐 다이어프램 운동 단위 연결성 결과 측정, 골격막 운동 뉴런 퇴행 및 보상의 정량적 바이오마커로서의 측정)
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
인공호흡근 기능의 상실은 운동 뉴런 손상 및 신경 퇴행(예: 각각 경추 척수 손상 및 근위축성 측삭 경화증)의 결과입니다. 횡격막 운동 뉴런은 중추 신경계와 근육 사이의 최종 연결 고리이며, 각각의 운동 단위(단일 운동 뉴런에 의해 신경이 분포된 근육 섬유 그룹)는 신경근 환기 시스템의 가장 작은 기능 단위를 나타냅니다. 복합 근육 활동 전위(CMAP), 단일 운동 단위 전위(SMUP) 및 운동 단위 수 추정(MUNE)은 시간이 지남에 따라 동물 모델에서 운동 단위 무결성을 종단적으로 평가할 수 있도록 확립된 전기생리학적 접근 방식이지만 대부분 사지 근육에 적용되었습니다. 따라서 이 연구의 목적은 횡격상 MUNE, 모터 단위 크기(SMUP로 표시) 및 CMAP를 종단적으로 정량화하는 데 사용할 수 있는 전임상 설치류 연구의 접근 방식을 설명한 다음 운동 뉴런 손실 모델에서 이러한 접근 방식의 유용성을 입증하는 것입니다. 운동 뉴런 손상 및 질병의 신경 손상, 퇴행 및 재생에 대한 민감하고 객관적이며 번역 관련성이 높은 바이오마커는 실험 연구 발견을 임상 테스트에 크게 지원하고 가속화할 수 있습니다.
서론
횡격막 운동 뉴런(Phrenic motor neuron, MN)은 C3에서 C6 근육 수준까지 확장되며, 중추신경계(CNS)에서 횡격막근(diaphragm muscle)1까지의 최종 연결을 형성한다. 횡격막 운동 단위(MU)는 단일 척추 MN과 신경 분포된 횡격막 근육 섬유로 구성되어 호흡 신경근계의 가장 작은 기능 단위를 형성합니다. 환기 기능은 횡격막 MU 풀 2,3의 협응 활성화를 통해 달성되는 횡격막 근육의 적절한 수축을 필요로 합니다. 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 포함한 많은 신경계 질환은 심각한 환기 장애를 초래하며, 궁극적으로 사망 원인에 기여한다4.
생체 내 운동 단위(MU) 풀의 무결성을 평가하고 모니터링하기 위해 여러 전기생리학적 접근 방식을 사용할 수 있습니다. 복합 근육 활동 전위(CMAP)는 말초 신경 자극 후 특정 근육 또는 근육 그룹의 모든 근육 섬유의 합산된 탈분극을 반영하며 ALS 5,6
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프로토콜
모든 절차는 미주리 대학교의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 수립한 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 실험은 11주에서 15주 사이의 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 대상으로 수행되었습니다. 이 쥐들은 쌍으로 수용되어 12:12 연암 주기에 따라 유지되었으며 표준 상업용 펠릿 식품과 HCl 처리된 물을 항상 이용할 수 있었습니다.
1. 동물 준비 및 마취 전달
- 쥐를 다루는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
- 3-5% 이소플루란으로 흡입 마취제를 투여하여 적절한 유도를 보장합니다. 쥐가 적절하게 마취되면 누운 자세로 놓고 1-3% 흡입 이소플루란으로 마취를 유지합니다. 집게를 사용하여 뒷다리 발패드에 부드럽게 압력을 가하여 금단 반응이 없는지 확인하여 마취 깊이가 충분한지 확인합니다.
알림: 쥐의 크기와 체중에 따라 마취 깊이를 모니터링하고 그에 따라 이소플루란 농도를 조정합니다. - 자동 온도 조절 가열판을 사용하여 37°C의 온도를 유지하여 CMAP 진폭 및 대기 시간에 영향을 줄 수 있는 온도 변화를 방지합니다.
- 동물용 석유 성분의....
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결과
이 보고서에 요약된 CMAP, SMUP 및 MUNE 기술을 사용하면 최소 침습 전극 배치를 사용하여 횡격막 근육의 신경근 기능을 기록할 수 있습니다(그림 1). 진폭 및 면적의 매개변수는 최대 CMAP 크기를 특성화하는 데 사용할 수 있으며, 근육 그룹 출력의 전반적인 측정을 제공합니다(그림 2). 그러나 현재 방법에서는 CMAP와 SMUP 크기를 모두 정량화하기 위해 진폭에 의존합니다. CMAP, SMUP 및 MUNE는 신경근 질환의 다양한 랫트 모델에서 신경근 기능을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. MN 변성의 맥락에서 MU 손실을 입증하기 위해 랫트는 횡격막 MN 및 추가 CTB(25μg)를 표적으로 하기 위해 CTB-SAP(25μg)를 동반한 양측 흉막내 주사를 받았고, 대조군 랫트는 비접합 CTB(25μg) 및 SAP(25μg)1,27
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토론
ALS와 같은 MN 퇴행성 질환에서는 환기에 관여하는 MU를 평가하는 것이 중요하다28. ALS 환자에서 호흡기 MN 변성이 발생함에도 불구하고, MN 사망의 구체적인 발병 및 진행은 불완전하게 이해되고 있다 29,30,31. 이러한 측면의 중요성을 인식하여, 신경퇴행성 질환의 동물 모델에서 호흡 장애를 모방하기 위해 유전적 기반(예: SOD1 2,32) 및 비유전적 기반(예: CTB-SAP 흉막 내 주사 3,27,33) 모두의 다양한.......
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공개 사항
WDA는 NMD Pharma, Avidity Biosciences로부터 연구 자금을 지원받았으며 NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics, Catalyst Pharmaceuticals 및 Novartis로부터 컨설팅 비용을 받았습니다.
감사의 글
이 연구는 미주리 척수 손상/질병 연구 프로그램(NLN 및 WDA)의 척수 손상/질병 연구 프로그램 보조금으로 자금을 지원받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 유리 주사기 | Kent Scientific Corporation | SOMNO-2ML | |
| 50 mL, 모델 705 RN 주사기 | Hamilton Company | 7637-01 | 흉막 내 주사 실시에 활용 |
| 5008 - Formulab Diet | LabDiet | 0001325 | |
| 오토클레이브 가능 26 G 바늘 (26S RN 9.52 mm 40°C;) | Hamilton Company | 7804-04 | 흉막내 주사를 수행하는 데 사용 |
| 콜레라 독소 B-소단위체(CTB) | MilliporeSigma | C9903 | 흉막내 주사에 사용되어 생존한 운동 뉴런을 라벨링하는 데 사용 |
| 콜레라 독소 B-소단위체(CTB-SAP) | 고급 표적 시스템 | IT-14 | 운동 뉴런 사멸을 유발하는 흉막내 주사에 사용 |
| 분리형 케이블 | Technomed | 202845-0000 | 레코더 전극을 전기 진단 기계에 연결 |
| 2" x 2" 리드 포함 디스크 전극 | Cadwell | 302290-000 | 접지 전극 |
| 일회용 단극 바늘 28G | Technomed | 202270-000 | 음극 및 양극 자극 전극 기록 전극 |
| EMG 바늘 케이블(Amp/stim 스위치 박스) | Cadwell | 190266-200 | 단극 전극을 전기 진단 자극기에 연결 |
| 도움의 손길 철제 베이스가 있는 악어 클립 | 라디오 쉑 | 64-079 | 녹음 전극 배치 유지 |
| 이소플루란 (250 mL 병) | Piramal Healthcare | ||
| monoject 곡선 팁 관개 주사기 | Covidien 81412012 | 전극 젤 | |
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| Sierra Summit EMG 시스템 | Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA | 휴대용 전기 진단 시스템 | |
| SomnoSuite 저유량 디지털 마취 시스템 | Kent Scientific Corporation | SOMNO | 유출 방지, 증기 방지 병 상단 어댑터가 포함되어 있습니다. Y 어댑터 튜브; 숯 청소 필터 |
| Sprague-Dawley 쥐 | Envigo 식민지 208a, 인디애나폴리스, IN | ||
| 수의사 석유 기반 안과 연고 | Puralube | 26870 | 각막 손상을 피하기 위해 마취 중에 적용됩니다 |
참고문헌
- Mantilla, C. B., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nichols, N. L., Satriotomo, I., Harrigan, D. J., Mitchell, G. S. ....
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재인쇄 및 허가
