방법 논문

Assessing Rat Diaphragm Motor Unit Connectivity Outcome Measures: as Quantitative Biomarkers of Phrenic Motor Neuron Degeneration and Compensation(쥐 다이어프램 운동 단위 연결성 결과 측정, 골격막 운동 뉴런 퇴행 및 보상의 정량적 바이오마커로서의 측정)

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DOI:

10.3791/66568

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2024년 4월 19일

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1NextGen Precision Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Sciences, University of Missouri, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Missouri, 4Department of Neurology, University of Missouri, 5Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 6Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구에서는 랫트 다이어프램 모터 유닛 연결성을 정량화하기 위해 모터 유닛 수와 크기를 추정하는 in vivo 방법을 제시합니다. 이러한 기술에 대한 단계별 접근 방식에 대해 설명합니다.

초록

인공호흡근 기능의 상실은 운동 뉴런 손상 및 신경 퇴행(예: 각각 경추 척수 손상 및 근위축성 측삭 경화증)의 결과입니다. 횡격막 운동 뉴런은 중추 신경계와 근육 사이의 최종 연결 고리이며, 각각의 운동 단위(단일 운동 뉴런에 의해 신경이 분포된 근육 섬유 그룹)는 신경근 환기 시스템의 가장 작은 기능 단위를 나타냅니다. 복합 근육 활동 전위(CMAP), 단일 운동 단위 전위(SMUP) 및 운동 단위 수 추정(MUNE)은 시간이 지남에 따라 동물 모델에서 운동 단위 무결성을 종단적으로 평가할 수 있도록 확립된 전기생리학적 접근 방식이지만 대부분 사지 근육에 적용되었습니다. 따라서 이 연구의 목적은 횡격상 MUNE, 모터 단위 크기(SMUP로 표시) 및 CMAP를 종단적으로 정량화하는 데 사용할 수 있는 전임상 설치류 연구의 접근 방식을 설명한 다음 운동 뉴런 손실 모델에서 이러한 접근 방식의 유용성을 입증하는 것입니다. 운동 뉴런 손상 및 질병의 신경 손상, 퇴행 및 재생에 대한 민감하고 객관적이며 번역 관련성이 높은 바이오마커는 실험 연구 발견을 임상 테스트에 크게 지원하고 가속화할 수 있습니다.

서론

횡격막 운동 뉴런(Phrenic motor neuron, MN)은 C3에서 C6 근육 수준까지 확장되며, 중추신경계(CNS)에서 횡격막근(diaphragm muscle)1까지의 최종 연결을 형성한다. 횡격막 운동 단위(MU)는 단일 척추 MN과 신경 분포된 횡격막 근육 섬유로 구성되어 호흡 신경근계의 가장 작은 기능 단위를 형성합니다. 환기 기능은 횡격막 MU 풀 2,3의 협응 활성화를 통해 달성되는 횡격막 근육의 적절한 수축을 필요로 합니다. 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 포함한 많은 신경계 질환은 심각한 환기 장애를 초래하며, 궁극적으로 사망 원인에 기여한다4.

생체 내 운동 단위(MU) 풀의 무결성을 평가하고 모니터링하기 위해 여러 전기생리학적 접근 방식을 사용할 수 있습니다. 복합 근육 활동 전위(CMAP)는 말초 신경 자극 후 특정 근육 또는 근육 그룹의 모든 근육 섬유의 합산된 탈분극을 반영하며 ALS 5,6 및 척수성 근위축증(SMA)7,8,9을 포함한 다양한 신경근 상태에 민감합니다. CMAP 평가의 한계는 부수적 발아가 MU 손실10이 존재하는 경우에도 CMAP 진폭과 면적을 유지할 수 있다는 것이다. 이러한 제한을 극복하기 위해 모터 단위 번호와 크기11을 모두 평가하기 위해 CMAP 기술이 수정되었습니다. 또한, 전기생리학적 시스템에 의한 다이어프램 CMAP의 기능적 평가를 조사하는 생체 내 연구는 모터 단위 수 추정을 위해 설명된 다이어프램 CMAP 기록 기법을 활용하는 것이 또한 실현 가능할 수 있음을 시사했다12.

증분 운동 단위 수 추정(MUNE) 기법은 1970년대 초 McComas et al.에 의해 인간의 신전근 digitorum brevis 근육에 대해 처음 소개되었습니다13. 증분 MUNE 접근법은 단일 모터 단위 반응의 지표로 양적, 전부 또는 전혀 없는 준최대값 증분을 기록하기 위해 점진적으로 증가하는 자극이 전달되는 기존 CMAP 기록 기법을 수정한 것입니다. 합산된 증분과 평균화된 증분은 단일 모터 단위 전위(SMUP)의 크기에 대한 추정치를 계산하는 데 사용되었습니다. 이 계산된 크기는 그런 다음 검사11에서 근육을 자극하는 MU의 수를 추정하기 위해 CMAP 진폭으로 나누어졌다. MUNE는 모터 단위 손실을 감지하고 모니터링하는 데 있어 높은 감도를 보여주므로 CMAP 진폭 또는 영역14,15와 같은 측정에서 관찰 가능한 변화가 발생하기 전에 모터 단위 기능 장애를 식별할 수 있습니다. ALS 환자에서 MUNE는 질병 발병, 진행 및 예후에 대한 중요한 바이오마커 역할을 하는 매우 민감성이 입증되었습니다16,17.

MUNE의 수많은 적응이 개발되어 신경 퇴행, 신경 손상 및 자연적인 노화 과정과 같은 조건에서 MU 기능을 평가하는 데 널리 사용됩니다 18,19,20,21. 초기 설명 이후, 전기생리학적 반응과 증분력(기계적) 측정을 모두 활용하는 다양한 적응이 인간 연구와 동물 모델 모두에서 사용되어 왔다22. MUNE는 근육과 운동 뉴런 연결성에 대한 비침습적 기능 평가를 제공합니다. MUNE를 종단적으로 적용하면 임상 및 전임상 환경 모두에서 질병 또는 유도된 표현형 진행을 이해하고 치료 중재의 보호 또는 재생 효과를 평가할 수 있습니다. MUNE 측정의 효과, 재현성 및 대부분의 인체에 걸친 MU 풀에 대한 기술의 임상적 관련성에 관계없이, 노력은 주로 설치류 근육 10,23,24,25의 사지 근육에 집중되어 왔다.

따라서 본 연구의 목적은 전임상 설치류 연구에서 MUNE, 운동 단위 크기(SMUP로 표시) 및 CMAP를 정량화하기 위해 종단적으로 사용할 수 있는 생체 내 평가로 복합 근육 활동 전위(CMAP), SMUP 및 횡상막 운동 단위 수(MUNE)를 얻는 접근 방식을 설명하는 것이었습니다. 또한, 횡격막 MN 퇴행성 제제인 콜레라 독소 B 단편이 사포린에 접합된 것(CTB-SAP)의 흉막 내 투여 후 횡격막 MU 수의 손실을 강조하는 대표적인 데이터를 제시합니다.

프로토콜

모든 절차는 미주리 대학교의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 수립한 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 실험은 11주에서 15주 사이의 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 대상으로 수행되었습니다. 이 쥐들은 쌍으로 수용되어 12:12 연암 주기에 따라 유지되었으며 표준 상업용 펠릿 식품과 HCl 처리된 물을 항상 이용할 수 있었습니다.

1. 동물 준비 및 마취 전달

  1. 쥐를 다루는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  2. 3-5% 이소플루란으로 흡입 마취제를 투여하여 적절한 유도를 보장합니다. 쥐가 적절하게 마취되면 누운 자세로 놓고 1-3% 흡입 이소플루란으로 마취를 유지합니다. 집게를 사용하여 뒷다리 발패드에 부드럽게 압력을 가하여 금단 반응이 없는지 확인하여 마취 깊이가 충분한지 확인합니다.
    알림: 쥐의 크기와 체중에 따라 마취 깊이를 모니터링하고 그에 따라 이소플루란 농도를 조정합니다.
  3. 자동 온도 조절 가열판을 사용하여 37°C의 온도를 유지하여 CMAP 진폭 및 대기 시간에 영향을 줄 수 있는 온도 변화를 방지합니다.
  4. 동물용 석유 성분의 연고를 눈에 바르면 눈이 건조해지는 것을 방지할 수 있습니다. 호흡수를 관찰하고 집게로 발패드에 압력을 가할 때 철수 반응을 확인하여 마취 깊이를 모니터링합니다.
  5. 가위를 사용하여 연구할 가슴과 목의 아래쪽 3분의 1에서 머리카락을 제거합니다. 전체 실험 동안 쥐의 호흡을 모니터링합니다.
    알림: CMAP 및 MUNE 녹음 및 마취 중단 후 쥐가 충분한 의식을 회복할 때까지 쥐를 방치하지 마십시오. 완전히 회복될 때까지 동물을 홈 케이지에 반환하지 마십시오.

2. 전극 배치 및 설정

  1. 그림 28과 같이 한 쌍의 단극 바늘 전극을 배치하여 CMAP, SMUP 및 MUNE를 기록합니다.
    1. 활성(E1) 바늘 전극을 마지막 늑골 경계선보다 아래쪽인 중간 쇄골선 위에 피하로 배치하고 기준(E2) 바늘 전극을 xyphoid process와 마지막 흉골 연골 사이의 각도로 피하로 배치합니다.
      알림: 바늘 전극은 횡격막 근육에 삽입되어서는 안 됩니다. 대신, 그들은 피하 부위에 위치해야 합니다.
  2. 경동맥 시트에서 횡격막 신경을 자극하기 위해 한 쌍의 28G 단극 바늘 전극을 신경 자극을 위한 음극 및 양극으로 사용하고 약 1cm 떨어진 전방근과 중간 비늘근 사이의 외측 목에 피하로 배치합니다. 자극 바늘의 위치가 네 번째 경추(C4) 아래 높이에 있는지 확인하십시오.
    알림: 횡격막 신경 또는 기타 구조의 손상을 방지하기 위해 자극 전극을 너무 깊게 삽입하지 마십시오. 그림 1 은 전극 배치를 보여줍니다.
  3. 접지 전극의 경우 꼬리에 일회용 표면 전극을 놓습니다.

3. 데이터 수집

  1. 프레닉 CMAP
    1. 0.1ms의 지속 시간과 60에서 100mA 범위의 강도를 가진 단상 음극 구형파 펄스를 적용하여 횡격막 CMAP 반응을 기록하여 횡격막 CMAP 반응을 기록합니다.
    2. 반응의 진폭이 더 이상 증가를 보이지 않을 때까지 자극 강도를 점진적으로 증가시키면서 CMAP 반응을 얻습니다. 초최대대 자극을 보장하려면 자극 강도를 최대 반응을 이끌어내는 데 사용되는 수준의 약 120%로 높이고 추가 반응을 기록합니다. CMAP 크기가 더 이상 증가하지 않으면 이 응답을 최대 CMAP로 간주합니다.
      알림: CMAP 기록 중 동시 근육 활동 소음을 최소화하려면 호기 중에 자극을 전달하는 것이 좋습니다.
    3. CMAP의 피크 대 피크 진폭을 밀리볼트(mV) 단위로 측정하고 문서화합니다(그림 2).
      참고: CMAP 진폭은 베이스-피크 및 피크-피크로 평가할 수 있습니다. 임상 전기 진단 시스템은 등전 기준선에서 초기 음의 피크까지 계산되는 베이스-피크를 평가하기 위해 기본적으로 설정되는 경우가 많습니다.
  2. 평균 단일 모터 단위 전위(SMUP) 크기 및 MUNE 계산
    1. 증분 자극 기법을 사용하여 평균 SMUP 크기를 계산합니다.
      1. 증분 반응을 이끌어내려면 1Hz 주파수에서 0.1ms 지속 시간으로 준최대값 자극을 투여하고 최소 전부 또는 전무 반응이 달성될 때까지 0.03mA 단위로 강도를 점진적으로 증가시킵니다. 2mA에서 10mA 사이의 자극 강도로 초기 반응을 얻습니다.
      2. 초기 반응이 2mA에서 10mA 사이의 자극 강도로 발생하지 않는 경우 자극 음극의 위치를 수정하여 목의 횡격막에서 더 가깝게 또는 더 멀리 이동하여 필요한 자극 강도를 각각 줄이거나 높입니다.
      3. 첫 번째 증분 응답이 2mA에서 10mA 범위의 자극 강도로 달성되는 경우 첫 번째 반응을 저장하고 점진적으로 더 높은 자극 강도로 추가 증분을 획득하여 0.03mA 단위로 조정하여 3.2.2단계에서 다음 기준을 충족하는 총 9개의 추가 증분을 달성합니다.
        참고: 각 SMUP는 이전 증분에서 각 증분을 빼서 정량화됩니다.
    2. 증분 반응을 측정하는 동안 각 증분이 다음 기준을 충족하는지 확인하십시오.
      1. 증분 응답의 초기 음수 피크가 최대 CMAP 응답의 음수 피크와 시간적으로 일치하는지 확인합니다.
        참고: 호흡 주기의 배경 소음으로 인해 관찰된 미세한 움직임은 실험의 특성에 내재되어 있습니다. 그러나 실시간 관찰 중에 SMUP가 일관되게 존재하면 특정 CMAP에 대한 SMUP의 신원을 확인할 수 있습니다.
      2. 횡격막은 호흡에 관여하는 동적 근육이기 때문에 각 호흡 주기는 기본 움직임을 유도할 수 있습니다. 따라서 세 개의 중복 반응에서 일관성을 확인하여 각 증분 반응에서 분획의 안정성과 부재를 확인합니다.
        알림: 낮은 진폭으로 유발된 전위, 특히 첫 번째 SMUP를 호흡 활동으로 인한 배경 소음과 구별하려면 경계를 늦추지 않고 3-4번의 호흡 주기를 관찰하는 것이 중요합니다. 또한 정확도를 위해 피크를 CMAP의 피크와 정렬해야 합니다.
      3. 각 증분이 뚜렷하고 이전 증분보다 커야 합니다. 따라서 증분 응답을 실시간으로 시각적으로 구별하여 이전에 기록된 증분 위에 겹쳐지는 것을 관찰할 수 있습니다.
        참고: 각 진폭에서 자극을 여러 번 반복하여 증분의 일관성을 보장하고 사전 정의된 기준을 준수하도록 할 수 있습니다.
      4. 앞서 언급한 기준에 따라 각 증분을 육안으로 확인한 후 증분 진폭이 25μV 이상인지 확인합니다. 증분이 25μV 미만인 경우 측정값을 버리고 응답을 다시 평가합니다.
      5. 10개의 증분 응답을 기록한 후 각 증분 응답의 진폭이 10개 증분 모두의 결합된 진폭의 1/3보다 크지 않은지(최종 응답의 총 진폭을 나타냄)를 확인합니다. 이 기준이 충족되지 않으면 10개의 증분 반응에 대한 측정을 반복합니다.
        알림: 1/3의 임계값은 각 증분 응답이 단일 모터 장치의 활성화를 나타낸다는 가정을 기반으로 합니다. 증분 응답의 진폭이 10개 증분 모두의 결합된 진폭의 1/3을 초과하는 경우, 이는 응답이 단일 모터 장치의 활성화에만 전적으로 기인하지 않을 수 있음을 시사합니다. 대신, 추가 모터 단위의 모집 또는 전기 노이즈 또는 인공물과 같은 비특이적 활동의 존재에 의해 영향을 받을 수 있습니다22,26.
      6. SMUP의 평균 진폭을 추정하려면 10개 증분의 값의 평균을 구하십시오. 평균 SMUP 진폭을 측정하는 또 다른 방법은 최종 증분 응답의 전체 진폭을 총 증분 수11로 나누는 것입니다.
    3. 최대 CMAP 진폭(피크-피크)을 평균 SMUP 진폭(피크-피크)으로 나누어 MUNE를 결정합니다. 특정 전기생리학 시스템에서 SMUP는 마이크로볼트(μV)로 기록되는 반면 CMAP는 일반적으로 밀리볼트(mV)로 표시됩니다. 필요한 경우 MUNE를 계산하기 전에 CMAP 및 SMUP 측정값을 동일한 단위로 변환합니다.
      참고: 피크 투 피크 CMAP, 평균 SMUP 및 MUNE는 일반적으로 클리닉 근전도 시스템에 의해 자동으로 계산됩니다.
      figure-protocol-1
      CMAP = 복합 근육 활동 전위
      SMUP = 단일 모터 단위 전위
      MUNE = 모터 단위 번호 추정

결과

이 보고서에 요약된 CMAP, SMUP 및 MUNE 기술을 사용하면 최소 침습 전극 배치를 사용하여 횡격막 근육의 신경근 기능을 기록할 수 있습니다(그림 1). 진폭 및 면적의 매개변수는 최대 CMAP 크기를 특성화하는 데 사용할 수 있으며, 근육 그룹 출력의 전반적인 측정을 제공합니다(그림 2). 그러나 현재 방법에서는 CMAP와 SMUP 크기를 모두 정량화하기 위해 진폭에 의존합니다. CMAP, SMUP 및 MUNE는 신경근 질환의 다양한 랫트 모델에서 신경근 기능을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. MN 변성의 맥락에서 MU 손실을 입증하기 위해 랫트는 횡격막 MN 및 추가 CTB(25μg)를 표적으로 하기 위해 CTB-SAP(25μg)를 동반한 양측 흉막내 주사를 받았고, 대조군 랫트는 비접합 CTB(25μg) 및 SAP(25μg)1,27를 투여받았습니다.

그림 3에서는 흉막내 CTB-SAP 주입 7일 후 성체 대조군 쥐와 성체 쥐(12주)의 결과를 비교했습니다. CTB-SAP의 흉막내 주사 후, 대조군 쥐에서 74개의 기능적 운동 단위의 정상 소견과 비교하여 MUNE는 60개의 추정된 기능적 운동 단위에서 감소합니다. 그러나 CTB-SAP 랫트의 CMAP 진폭(14.25mV 피크 투 피크)은 대조군(14. 5mV 피크 투 피크)에 비해 최소한의 변화를 보였는데, 이는 부수적 발아로 인한 것으로 보입니다. 그림 4에서 다이어프램 CMAP, SMUP 및 MUNE는 양측으로 획득되었으며 주입 후 7일(n = 14), 14(n = 14), 21(n = 6) 및 28(n = 14)일 후에 기준선/사전 주입(n = 14)에서 평균을 냈습니다. 그림 4에서는 그룹 간의 기준선 차이가 발견되지 않았습니다. MUNE는 CTB-SAP 랫트에서 MUNE가 ~40% 감소하면서 시간(p < 0.05), CTB-SAP(p < 0.001) 및 상호 작용 시간 x CTB-SAP(p < 0.01)에 대해 유의한 변화를 보였습니다. CTB-SAP 랫트의 평균 SMUP는 시간(p < 0.05) 및 CTB-SAP(p < 0.01)에 따라 유의한 변화를 보였지만 SMUP 진폭의 ~50-60% 증가와 유의한 상호 작용은 없었습니다. CMAP는 큰 변화를 보이지 않았습니다.

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그림 1: 전극 배치. (A) 자극 음극과 (B) 양극은 약 1cm 간격으로 전방근과 중근육 사이의 외측 경부에 피하로 삽입됩니다. (C) "활성" 전극(E1) 및 (D) "기준" 기록 전극(E2)은 시포돌기와 마지막 늑골 연골 사이의 각도를 따라 마지막 늑골 경계보다 아래쪽의 쇄골 중앙선 위에 위치합니다. 또한, (E) 일회용 디스크 전극은 아티팩트를 최소화하기 위해 접지로 꼬리에 위치합니다. BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 복합 근육 활동 전위. 좌측 반격막 근육에서 기록된 대표적인 CMAP 반응의 그림. CMAP 피크 대 피크 진폭은 음의 피크 전압에서 양의 피크 전압까지 결정됩니다. 약어: CMAP = 복합 근육 활동 전위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 대조군 쥐와 CTB-SAP 흉막내 주입 7일 후 성체 쥐의 두 가지 대표적인 CMAP 및 MUNE 기록. (A) 피크 대 피크 진폭이 14.5mV인 대조군 성체 쥐(생후 12주)의 좌 횡격막 복합 근육 활동 전위(CMAP). 화면 감도 = 1mV/분할 및 화면 지속 시간 1ms/분할. (B) 총 진폭이 1.940mV인 10개의 후속 증분 응답을 10으로 나누어 평균 SMUP 크기(0.194mV)를 결정합니다. 화면 감도 = 0.2mV/분할 및 스윕 속도 1ms/분할. 계산된 MUNE = 74 (MUNE=CMAP/평균 SMUP (14.5 mV/ 0.194 mV)) (C) CTB-SAP 주입 7일 후 Phrenic CMAP는 CMAP 피크 대 피크 진폭 14.25mV에서 거의 변화가 없음을 보여줍니다. 화면 감도 = 1mV/분할 및 스윕 속도 1ms/분할. (D) 총 피크 대 피크 진폭이 2.360mV인 10으로 나눈 10개의 후속 증분 응답을 통해 0.236mV의 평균 SMUP 크기를 얻습니다. 화면 감도 = 0.2mV/분할 및 1ms/분할의 스윕 속도. 따라서 계산된 MUNE는 60입니다. 약어: CMAP = 복합 근육 활동 전위; MUNE = 모터 단위 번호 추정; CTB-SAP = 사포린에 접합된 콜레라 독소 B 단편; SMUP = 단일 모터 유닛 전위. *전기 자극으로 인한 아티팩트를 보여줍니다. 전기 자극의 진폭과 CMAP의 대조와 증분 반응 사이의 대비로 인해 자극의 일부만 그래프로 표시했다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 접근성을 개선하기 위해 증분 응답의 시각화를 향상시키기 위해 블라인드 색상의 친근한 색상이 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: CTB-SAP 후 CMAP, SMUP 및 MUNE의 전기생리학적 평가. 그룹 간의 기준선 차이는 발견되지 않았습니다(CTB-SAP 및 대조군 모두에서 11주 된 수컷 쥐 7마리). (A) CMAP는 유의미한 변화를 보이지 않았다. (B) CTB-SAP 랫트의 평균 SMUP은 시간이 지남에 따라(p < 0.05) CTB-SAP의 경우 유의한 변화(p < 0.01)를 보였으며 유의한 상호 작용 없이 SMUP 진폭이 50-60% 증가했음을 나타냅니다. (C) CTB-SAP 투여 7일 후, 평균 MUNE는 ±102.58 ± 20.54에서 72.43 ± 15.59로 27.07% 유의하게 감소하였다. 이러한 하락세는 지속되어 28일 동안 11.75% 추가로 하락했습니다(MUNE: 60.64 ± 11.33, p < 0.01). 주입 후 7일, 14일 및 28일 후의 기준선에서의 모든 측정값은 14마리의 쥐로부터 얻었으며, n = 7마리의 쥐에게 복합 CTB-SAP를 주입하고 n = 7명의 쥐에게 비결합 CTB 및 SAP를 대조군으로 투여했습니다. 21일째에 6마리의 쥐가 사용되었다. CMAP, SMUP, MUNE 데이터는 평균으로 표시하고, 이원 ANOVA를 사용하여 비교를 수행하였다. 별표는 *p < 0.05, **p < 0.01과 같이 다양한 시점에서의 차이를 나타냅니다. 약어: CMAP = 복합 근육 활동 전위; MUNE = 모터 단위 번호 추정; CTB-SAP = 사포린에 접합된 콜레라 독소 B 단편; SMUP = 단일 모터 유닛 전위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

ALS와 같은 MN 퇴행성 질환에서는 환기에 관여하는 MU를 평가하는 것이 중요하다28. ALS 환자에서 호흡기 MN 변성이 발생함에도 불구하고, MN 사망의 구체적인 발병 및 진행은 불완전하게 이해되고 있다 29,30,31. 이러한 측면의 중요성을 인식하여, 신경퇴행성 질환의 동물 모델에서 호흡 장애를 모방하기 위해 유전적 기반(예: SOD1 2,32) 및 비유전적 기반(예: CTB-SAP 흉막 내 주사 3,27,33) 모두의 다양한 모델이 사용되었습니다. 따라서, 잠재적인 치료 효과를 진단, 모니터링 및 평가하기 위한 바이오마커를 식별하는 것이 이러한 모델에 유리하다. 또한 바이오마커는 전임상 연구 결과의 임상 번역을 용이하게 할 수 있습니다.

설치류 퇴행성 모델에서 신경 분포 MN의 수를 정량화하기 위해 역행 추적자 및 아데노바이러스를 포함한 다양한 라벨링 기술이 사용되었습니다 25,34,35,36. 이전에는 면역조직화학(immunohistochemistry)이 경추 척수(cervical spinal cord)의 전방 뿔(anterior horn)에 있는 횡격막 운동 뉴런(phrenic motor neuron)을 표지하는 데 사용되었습니다 2,3,33. 라벨링 기법은 MN 평가에 유용하지만, MU의 기능을 평가하는 데 한계가 있고 종단 평가에는 적합하지 않다37. 객관적인 전기생리학적 평가는 성공적인 종간 번역에 매우 중요하며, 특히 인간과 설치류 사이의 운동 시스템의 기능적 및 해부학적 특징에서 뚜렷한 구조적 차이를 고려한다38,39. 신경생물학적 차이를 통합하는 것은 설치류 모델의 결과를 환자에게 번역하는 데 어려움을 겪습니다. MUNE는 MN 기능의 객관적인 전기생리학적 측정 역할을 함으로써 이러한 장애물을 극복하며, MN 퇴행성 모델 실험 3,40에서 바이오마커로서 기능적 MU 연결성을 평가할 수 있습니다.

CMAP, SMUP 및 MUNE는 연구 연구 및 신경근 질환 환자 평가에 일반적으로 사용됩니다 9,10,11. 이러한 잠재적 바이오마커는 최소 침습적이므로 시간이 지남에 따라 동일한 개인 내의 기능을 종단적으로 평가할 수 있습니다. 중요한 것은 대뇌 피질 MN에 의한 MU의 활성화 또는 모집을 직접 측정하지는 않지만 MN 무결성 및 기능적 대응물인 MU에 대한 임상적으로 관련성 있는 추정치를 제공한다는 것입니다. MN 퇴행성 질환의 설치류 모델은 인간 질병의 기저에 있는 생리병리학적 메커니즘을 이해하고 효과적인 치료법의 전임상 발전을 위해 매우 중요합니다. 종 간 번역 가능한 결과 측정 및 바이오마커를 개발하면 유망한 전임상 결과를 임상시험으로 전환하는 것을 간소화하고 가속화할 수 있다11. 측정의 상대적인 복잡성을 감안할 때, 우리는 쥐의 팔다리에서 횡격막 근육에 이르기까지 이러한 기술을 조정하고 개선했습니다. 이 번역은 쥐 연구에서 더 광범위한 활용과 구현을 용이하게 하기 위해 시각적 형식으로 제공되었습니다.

우리의 경험에 비추어 볼 때, 임상 전기 진단 시스템은 이러한 맥락에서 설명된 연구에 매우 적합합니다. 이러한 적합성은 검사자와 전기 진단 시스템 사이의 인터페이스에서 향상된 인체 공학에서 비롯되어 편리한 제어를 용이하게 합니다. 우리 실험실 그룹에서는 두 개의 비스위치 증폭기 채널을 특징으로 하는 2채널 시스템을 사용합니다. 이 채널에는 24비트 아날로그-디지털 변환기가 장착되어 있으며 채널당 48kHz의 샘플링 속도로 작동합니다. 하드웨어 이득은 분할당 10nV에서 100mV까지의 범위 내에서 조정할 수 있습니다. 우리는 0.2Hz에서 5kHz에 이르는 범위의 저주파 필터를 사용했으며 고주파 필터 설정은 30Hz에서 10kHz 범위를 포함했습니다. 또한 0에서 100mA까지 강도를 조절하고 0.02에서 1ms까지 지속 시간을 조정할 수 있는 정전류 자극기를 사용했습니다. 대부분의 임상 시스템은 CMAP, SMUP 및 MUNE 반응을 기록하는 데 적합한 유사한 기능을 제공합니다. 이러한 시스템은 원하는 데이터의 정확한 기록을 보장하기 위해 적절하게 조정할 수 있습니다. 예를 들어, CMAP 진폭은 베이스-피크 및 피크-피크로 평가할 수 있습니다. 임상 전기 진단 시스템은 등전 기준선에서 초기 음의 피크까지 계산되는 베이스-피크를 평가하기 위해 기본적으로 설정되는 경우가 많습니다.

다이어프램에서 CMAP, SMUP 및 MUNE 응답을 얻는 프로세스에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 적절한 전극 깊이와 함께 일관되고 정확한 전극 배치는 진폭을 안정적으로 측정하고 기록 중 배경 소음을 최소화하는 데 필수적입니다. 자극 전극을 잘못 배치하면 의도하지 않은 결과가 발생할 수 있습니다. 자극 전극을 너무 뒤쪽에 배치하면 상완신경총 흥분에 대한 과장된 앞다리 근육 수축이 발생할 수 있으며, C4 수준 이상으로 배치하면 횡격막 신경의 자극이 더 어려워질 수 있습니다. 더 깊게 배치하면 경동맥이 손상되거나 미주 신경이 자극되어 잠재적으로 심장 전도도 문제를 일으킬 위험이 있습니다. 기록 전극을 마지막 갈비뼈보다 높거나 낮게 배치하면 늑간 또는 복직근 자극에 의한 측정이 각각 발생할 수 있습니다. 다른 근육에서 기록되지 않도록 CMAP 대기 시간의 다이어프램 음극 피크는 일반적으로 1.5-3.5ms이며 특징적인 모양은 그림 2에 나와 있습니다. 우리의 관찰에 따르면 바늘 전극은 다이어프램 근육에 대한 디스크 모양의 전극에 비해 더 일관된 CMAP, SMUP 및 MUNE 기록을 생성합니다. 이러한 향상된 일관성은 횡격막 근육의 돔 모양과 늑간 및 복직근과 같은 근접한 다른 근육의 존재에 기인합니다. 또한 바늘 전극의 유연한 배치는 또 다른 유리한 요소입니다. 전기 자극 강도와 관련하여, 우리는 횡격막 신경을 자극하기 위해 60-100mA 범위를 사용했는데, 이는 다른 운동 시스템에 대해 보고된 범위를 초과합니다. 이 차이는 뒷다리와 앞다리에 있는 좌골 신경과 상완 신경총의 더 표면적인 위치에 비해 목에 있는 횡격막 신경의 더 깊은 위치에서 발생합니다.

평균적인 SMUP를 얻는 것은 CMAP에 비해 더 큰 기술적 문제를 제기합니다. 밀리볼트가 아닌 마이크로볼트 범위의 응답 크기가 작을수록 배경 소음의 영향이 더 두드러집니다. 배경 소음을 완화하려면 접지 전극, 음극 및 양극을 조정하여 전극 배치를 최적화하는 것이 좋습니다. 또한 실험 설정에서 주변 전기 장치의 간섭이 최소화되었는지 확인하십시오. 세포 내 전기생리학 응용 분야에서 일반적으로 사용되는 패러데이 케이지는 이 설정에 필요하지 않습니다. 개별 SMUP 반응을 시각적으로 식별하는 것은 일관되고 반복 가능한 결과를 얻기 위해 연습이 필요한 어려운 기술입니다. 다이어프램은 역동적인 근육이기 때문에 기준선은 각 환기 주기에 따라 이동할 수 있습니다. 이전 SMUP과의 정렬을 보장하기 위해 SMUP 증분에 주의를 기울이는 것은 이 문제를 극복하는 데 중요한 요소입니다. 또한 SMUP가 최대 CMAP의 대기 시간 내에 시작되도록 하는 것이 정확한 레코딩을 위해 중요합니다.

횡격막 기록의 또 다른 도전은 이 근육의 비대칭적 특성이며, 이는 왼쪽에서 오른쪽으로 다양한 두께를 특징으로 하고 오른쪽에서 간에 의해 가해지는 압력에 의해 영향을 받는다(41). 이를 해결하기 위해 좌측 및 우측 반격막에 대해 별도로 전기생리학적 측정을 수행했습니다. 그런 다음 CMAP, SMUP 및 MUNE 응답에 대한 평균을 별도로 계산했습니다.

CMAP 반응은 특정 근육에서 근육 섬유의 집단적 탈분극을 반영하기 때문에 횡격막 근육 섬유에 대한 횡격막 MN에 영향을 미치는 모든 병리학은 CMAP 크기의 감소를 초래할 수 있습니다. 따라서 양측 반격막에서 평균 CMAP를 계산하면 호흡 신경근계의 전반적인 기능 상태에 대한 탁월한 평가를 제공할 수 있습니다. 부수적 발아(collateral sprouting)와 같은 보상적 변화는 MN 또는 운동 축삭 손실이 있는 경우에도 CMAP 크기의 보존으로 이어질 수 있다11. 개별 증분을 기록하면 단일 MU의 평균 출력(SMUP 크기)을 추정할 수 있어 호흡기 계통 MU의 기능 상태에 대한 보다 자세한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 따라서 MUNE 기법은 횡격막에 대한 횡격막 MN 또는 축삭돌기의 입력을 평가하는 데 필수적입니다. MN 질환을 연구하기 위한 치료법의 전임상 실험에 이러한 바이오마커를 적용하면 임상시험으로의 전환을 개선할 수 있는 잠재력이 있습니다.

공개 사항

WDA는 NMD Pharma, Avidity Biosciences로부터 연구 자금을 지원받았으며 NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics, Catalyst Pharmaceuticals 및 Novartis로부터 컨설팅 비용을 받았습니다.

감사의 글

이 연구는 미주리 척수 손상/질병 연구 프로그램(NLN 및 WDA)의 척수 손상/질병 연구 프로그램 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2 mL 유리 주사기Kent Scientific CorporationSOMNO-2ML
50 mL, 모델 705 RN 주사기Hamilton Company7637-01흉막 내 주사 실시에 활용
5008 - Formulab DietLabDiet0001325
오토클레이브 가능 26 G 바늘 (26S RN 9.52 mm 40°C;)Hamilton Company7804-04흉막내 주사를 수행하는 데 사용
콜레라 독소 B-소단위체(CTB)MilliporeSigmaC9903흉막내 주사에 사용되어 생존한 운동 뉴런을 라벨링하는 데 사용
콜레라 독소 B-소단위체(CTB-SAP)고급 표적 시스템IT-14운동 뉴런 사멸을 유발하는 흉막내 주사에 사용
분리형 케이블Technomed202845-0000레코더 전극을 전기 진단 기계에 연결
2" x 2" 리드 포함 디스크 전극Cadwell302290-000접지 전극
일회용 단극 바늘 28GTechnomed202270-000음극 및 양극 자극 전극 기록 전극
EMG 바늘 케이블(Amp/stim 스위치 박스)Cadwell190266-200단극 전극을 전기 진단 자극기에 연결
도움의 손길 철제 베이스가 있는 악어 클립라디오 쉑64-079녹음 전극 배치 유지 
이소플루란 (250 mL 병)Piramal Healthcare
monoject 곡선 팁 관개 주사기Covidien 81412012전극 젤
PhysioSuite 생리학적 모니터링 시스템과 RightTemp Homeothermic Warming포함 Kent Scientific CorporationPS-RT적외선 온난화 패드, 직장 프로브, 패드 온도 프로브
포함 Pro trimmer Pet 그루밍 키트Oster078577-010-003제모용 가위
사포린(SAP)고급 표적 시스템PR-01흉막내 주사에 활용(단독으로 주사 시 조절제)
Sierra Summit EMG 시스템Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA휴대용 전기 진단 시스템
SomnoSuite 저유량 디지털 마취 시스템Kent Scientific CorporationSOMNO유출 방지, 증기 방지 병 상단 어댑터가 포함되어 있습니다. Y 어댑터 튜브; 숯 청소 필터
Sprague-Dawley 쥐Envigo 식민지 208a, 인디애나폴리스, IN
수의사 석유 기반 안과 연고 Puralube26870각막 손상을 피하기 위해 마취 중에 적용됩니다
일회용 은 .

참고문헌

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Assessing Rat Diaphragm Motor Unit Connectivity Outcome Measures: as Quantitative Biomarkers of Phrenic Motor Neuron Degeneration and Compensation(쥐 다이어프램 운동 단위 연결성 결과 측정, 골격막 운동 뉴런 퇴행 및 보상의 정량적 바이오마커로서의 측정)
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