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방법 논문

닭의 위장관에서 혐기성 박테리아의 배양을 강화하기 위한 전략

2.4K 조회수

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DOI:

10.3791/66570

⸱

2024년 5월 10일

 ,  ,  , 
1Institute of Animal Science, University of Hohenheim, 2HoLMiR - Hohenheim Center for Livestock Microbiome Research, University of Hohenheim

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 혐기성 장내 세균의 분리를 개선하기 위한 두 가지 방법론을 제시합니다. 첫 번째는 다양한 배양 배지를 사용하여 다양한 범위의 박테리아를 분리하는 데 중점을 둡니다. 두 번째는 생태학적 중요성을 완전히 이해하기 위해 미오이노시톨을 동화시킬 수 있는 특정 미생물 그룹의 배양 단계에 초점을 맞춥니다.

초록

닭의 위장관(GIT)은 숙주의 생리, 소화, 영양소 흡수, 면역 체계 성숙 및 병원체 침입 방지에 중추적인 역할을 하는 수조 개의 미생물이 서식하는 복잡한 생태계입니다. 최적의 동물 건강과 생산성을 위해서는 이러한 미생물의 특성을 분석하고 그 역할을 이해하는 것이 필수적입니다. 가금류의 GIT는 프로바이오틱스 응용 분야가 될 수 있는 미생물의 보고를 보유하고 있지만, 대부분의 다양성은 아직 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 배양되지 않은 미생물 다양성에 대한 이해를 높이려면 이러한 미생물을 배양하기 위한 공동의 노력이 필요합니다. GIT 집락 미생물의 분리 및 배양은 세포, DNA 및 대사 산물을 포함한 재현 가능한 물질을 생성하여 환경의 대사 과정에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 배양하지 않으면 자연 환경에서 이러한 유기체의 역할은 불분명하고 설명 수준에 국한됩니다. 우리의 목표는 동물 생리학, 동물 영양학, 균유전체학, 사료 생화학 및 현대 재배 전략의 다학제 지식을 활용하여 닭의 GIT에서 다양한 범위의 혐기성 미생물의 분리를 개선하는 것을 목표로 하는 재배 전략을 구현하는 것입니다. 또한, 우리는 격리 성공에 영향을 미치는 것으로 알려진 샘플링, 운송 및 미디어 준비를 위한 적절한 관행의 사용을 구현하는 것을 목표로 합니다. 적절한 방법론은 일관된 무산소 환경, 최적의 대기 조건, 적절한 숙주 배양 온도 및 고유한 요구 사항에 부합하는 특정 영양 요구 사항에 대한 제공을 보장해야 합니다. 이러한 방법론을 따름으로써 배양은 분리에 대한 재현 가능한 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 분리 절차를 용이하게 하여 닭의 GIT 내 복잡한 미생물 생태계에 대한 포괄적인 이해를 촉진할 수 있습니다.

서론

미생물 연구에서 배양의 부활은 이전에는 부분적으로만 설명되고 정량화되었던 대사 가설을 테스트하기 위한 자료를 제공함으로써 메타게놈 연구의 통찰력을 보완했습니다. 장내 세균의 배양은 미생물-숙주 상호작용에 대한 향후 연구를 지속하고, 표적 집락화 연구를 촉진하며, 분자 상호작용 연구를 개선할 수 있는 자료를 제공한다 1,2,3. 위장 미생물에 대해 얻은 지식은 식단 공식에 영향을 미치고 영양소 가용성을 향상시킴으로써 동물의 영양과 복지를 개선했습니다4. 이러한 이해는 프리바이오틱스와 프로바이오틱 상호작용을 활용하는 성능 향상에 기여했습니다. 그러나 생화학적 및 물리화학적 조건이 어떻게 상호 작용하고 미생물 프로필과 그 구조에 영향을 미치는지에 대한 완전한 이해를 얻으려면 심층적인 연구가 필요합니다. 이 목표를 달성하기 위해서는 배양이 필수적이며, 위장 환경 내 미생물 군집의 복잡한 역학을 탐구하는 데 중요한 도구 역할을 합니다.

인간의 장과 관련된 미생물에 대한 광범위한 연구 및 임상 배양 연구5와 대조적으로, 가축의 미생물에 대한 보고는 주로 분리를 위해 제한된 범위의 배지를 사용했으며, 이는 잠재적으로 분리물의 다양성을 제한할 수 있었다 2,3. 또한, Tanaka et al. 및 Kawasaki et al.에 의해 밝혀진 바와 같이, 배지 제형의 개선과 인산염 및 염과 한천의 상호 작용에 대한 연구는 장내 마이크로바이옴 연구에서 아직 구현되지 않았습니다 6,7,8,9.

반필수 물질로 간주되는 마이오이노시톨(MI)은 다양한 대사, 생리학 및 조절 과정에서 중추적인 역할을 하는 것으로 보고되었습니다10,11. 여기에는 뼈 무기질화, 유방 근육 발달, 세포 신호 전달, 배란 및 생식 촉진, 신경 신호 조절, 가금류의 포도당 항상성 및 인슐린 조절 조절 작용에 대한 관여가 포함됩니다10,11. MI는 해당과정(glycolysis/gluconeogenesis) 과정, 시트르산 회로(citric acid cycle) 및 펜토스 포스페이트 경로(pentose phosphate pathway)를 포함한 중추적인 생화학적 과정 내에서 상호 변환을 통해 전구체로서의 역할을 합니다. 또한, 이는 글리세로인지질 대사에 더 많이 관여하는 포스파티딜이노시톨(PI)의 전구체 역할도 한다12. MI의 대사가 뼈 안정성과 동물 성능의 변화로 이어진다고 보고된 연구는 거의 없습니다. 여기에는 사료 전환율 및 체중 증가의 향상이 포함되며, 동물 내에서 흡수 및 활용 후 그 영향을 입증합니다13,14. 그러나 MI 대사의 경로와 가금류 대사에 미치는 영향은 여전히 파악하기 어렵다15. 또한, MI 이용, 특히회장 16,17,18,19와 같은 대사 활동이 높은 영역에서 MI 이용에 대한 박테리아의 잠재적 역할을 제안하는 연구는 거의 없습니다.

동물의 GIT에서 박테리아를 배양하기 위한 노력은 게놈 데이터베이스를 강화하고 연구를 확장하며 게놈 기반 가설을 검증하고 이러한 자원의 생태학적 중요성을 이해하는 것을 목표로 합니다20. 이 연구의 목적은 닭의 GIT에서 박테리아 배양 전략을 개선하여 미오이노시톨을 동화하고 대사하는 생태학적 관심 그룹의 격리 다양성과 표적 격리를 향상시키는 것입니다.

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프로토콜

프로토콜은 샘플링, 박테리아 분리, 식별 및 얻은 미생물의 보존의 네 부분으로 나뉩니다. 독일 튀빙겐 레지에룽스프레시디움(Regierungspräsidium Tübingen)의 윤리 위원회에서 동물 사용에 대한 승인 허가를 발급했으며, 승인 번호는 HOH50/17 TE 및 HOH67-21TE입니다.

1. 혐기성 박테리아 배양을 위한 샘플 획득

  1. 동물의 유지 관리
    1. 임시 상업적인 옥수수 기반 식단 (Legehennen / Junghennenfutter; 재료 표 참조)으로 동물을 유지하고 Hohenheim 대학의 실험 기지에서 사육합니다.
  2. 수송 용액의 준비
    1. 검체 채취 1-2일 전에 1.00g/L 티오글리콜산나트륨, 0.10g/L 염화칼슘 이수화물(CaCl2.2H 2O), 시스테인21 0.5% 및 0.1% 레사주린 나트륨 용액을 함유한 수송 용액을 준비합니다.
    2. 매체의 pH를 25°C에서 6.0 ± 0.2로 조정하고 121°C에서 15psi 압력에서 15분 동안 오토클레이브합니다.
    3. 매체가 약 50°C로 냉각된 후 배지 병의 캡을 구멍과 고무 마개가 있는 멸균 나사 캡으로 교체합니다. 두 개의 멸균 주사기 바늘을 고무 마개에 서로 다른 위치에 삽입하고 바늘 중 하나에 소수성 주사기 필터(0.22μm)를 부착합니다.
      알림: 캡 교체와 바늘 및 필터 삽입은 LAF(Laminar Air Flow) 내에서 수행해야 합니다.
    4. 100% 질소(N2) 튜브를 주사기 필터에 부착하고 N2 가스를 1psi에서 1분 동안 병에 살포합니다.
    5. 그 후, 배지 병과 멸균 Hungate 튜브를 혐기성 스테이션으로 옮기고 수송 매체를 무균 방식으로 Hungate 튜브로 옮깁니다. Hungate 튜브를 상단까지 완전히 채워 내부에 공기가 없는지 확인합니다.
  3. 도축 및 시료 채취
    1. 도축 과정 중에는 전체 절차 동안 장갑, 마스크, 플라스틱 실험실 앞치마 및 멸균 수술 기구를 사용하여 오염을 방지하기 위해 축 조건을 유지하십시오. 또한 에탄올과 티슈를 사용하여 작업대를 적절하게 소독하여 멸균 환경을 유지하십시오.
    2. 실험 스테이션에서 35 % N2 , 35 % CO2 및 30 % O2 로 구성된 병에 든 가스 혼합물을 사용하여 10 주령의 Lohmann 산란계를 마취하고 즉시 목을 베십시오.
      참고: 마취 및 희생은 동물 복지 및 과학적 절차에 정통한 실험실 동물 기술자가 수행해야 합니다. 이를 통해 희생 절차가 윤리 표준, 법적 규정 및 안전 지침을 준수하도록 보장합니다.
    3. GIT 절편의 해부를 진행하기 전에 멸균 켈리 지혈제(켈리 클램프라고도 함)를 사용하여 필요한 장 분절, 즉 작물, 회장 및 jejunum을 확보합니다. 그림 1).
      알림: 동물의 해부는 수의사 또는 닭의 해부학적 구조에 익숙한 잘 훈련된 사람이 수행해야 합니다.
    4. 각 개별 섹션을 수송 매체로 채워진 별도의 Hungate 튜브로 옮기고 뚜껑을 제대로 닫습니다. 필요한 경우 튜브에 추가 수송 매체를 추가하여 남아 있는 공기를 대체합니다.
      알림: 단면의 이동은 중요한 단계이며 산소에 장기간 노출되는 것을 방지하기 위해 단면의 지연 또는 개방을 최소화하는 것이 중요합니다
  4. 샘플의 운송
    1. Hungate 튜브의 운송을 주의해서 다루고 파손 위험을 방지하기 위해 스티로폼 상자 안에 넣으십시오. 외부 온도가 15 °C 미만인 경우 보온팩을 사용하여 샘플의 온도를 유지하십시오. 운송 시간이 4시간을 초과하지 않도록 하십시오.
    2. 추가 과정을 위해 튜브를 혐기성 스테이션 내부로 조심스럽게 옮깁니다.

2. 혐기성 세균의 분리

  1. 배양 배지 준비
    참고: 설명된 방법은 배양 배지 준비에 대한 다양한 고려 사항을 제시합니다. 표 1 은 미생물의 다양한 분리를 위해 용액이 어떻게 분할되는지에 대한 예를 보여줍니다.
    1. 4개의 용액 그룹에서 사용할 매체 제형의 성분을 나눕니다: 탄소원, 질소원, 한천 및 광물원. BHI(Brain-Heart infusion)와 같은 리치 배지의 경우 분리가 항상 가능한 것은 아닙니다( 표 1의 배지 2의 예 참조). 이러한 경우, 한천 또는 추가 용액의 별도 준비 및 오토클레이브를 확인하십시오.
    2. 필요한 최종 배지부피의 1 /4, 예를 들어 총 배지 부피 1L에 대해 250mL로 탄수화물 용액을 준비합니다. 표 1의 매체 1의 예에 따라 2g의 포도당과 0.5g의 전분을 증류수 250mL에 용해시킵니다.
    3. 필요한 최종 배지부피의 1 /4(예: 총 배지 1L 부피의 경우 250mL)로 단백질 용액을 준비합니다. 표 1의 매체 1의 예에 따라 10g의 펩톤을 증류수 250mL에 용해시킵니다.
    4. 최종 배지 부피의 45% 내지 48%로, 예를 들어, 총 1 L의 배지 부피에 대해 450 내지 480 mL에 한천 용액을 준비한다. 표 1의 mediu 1의 예에 따라, 15g의 한천을 증류수 450 내지 480 mL에 용해시킨다.
    5. 배지의 최종 부피가 1L일 때 왼쪽 20-50mL 용량의 배지에 미네랄 용액을 준비합니다. 표 1의 배지 1의 예를 따라, 0.5g의K2HPO4를 증류수 20 내지 50 mL에 용해시킨다.
    6. 단백질 용액, 한천 용액 및 미네랄 용액을 121°C에서 21psi 압력에서 15분 동안 고압멸균합니다. 탄수화물 용액을 110°C에서 5psi에서 30분 동안 고압멸균합니다.
    7. 모든 용액이 멸균되면 50°C로 냉각하고 멸균 조건에서 구멍이 있는 캡과 고무 마개가 있는 적절한 오토클레이브 유리병에 혼합합니다. 그런 다음 1.2.3 및 1.2.4 단계를 따르십시오.
      알림: 용액의 혼합은 LAF 내부에서 수행해야 합니다.
    8. 매체가 혼합되고 가스가 제거되면 혐기성 스테이션 내부의 멸균 페트리 접시 또는 튜브에 붓습니다.
  2. 혐기성 박테리아의 분리
    참고: 다음 방법론은 닭의 소화관에 서식하는 광범위한 혐기성 박테리아를 배양하기 위한 격리 전략을 설명합니다.
    1. 상업 공급업체에서 제공하는 80%N2 (품질 수준 5.0), 15%CO2 (품질 수준 3.0) 및 5%H2 (품질 수준 5.0)로 구성된 병에 든 가스 혼합물이 포함된 혐기성 스테이션으로 샘플을 옮깁니다( 재료 표 참조).
    2. 혐기성 스테이션 내부에서 고압멸균 겸자를 사용하여 hungate 튜브의 섹션을 멸균 페트리 접시로 옮깁니다.
    3. 멸균 가위를 사용하여 단면을 조심스럽게 자르고 멸균 주걱을 사용하여 장 분절에서 약 1g의 digesta 함량을 추출합니다.
      참고: 1g의 분해 성분을 섭취한 후 남은 분해 효소를 폐기하여 표적 분리를 위해 해당 수송 매체 튜브에 옮깁니다.
    4. 멸균 생리학적 용액(0.85% NaCl)을 사용하여 10배 연속 희석을 수행합니다.
    5. 희석액 10-4에서 10-7로 희석된 샘플 0.1mL를 멸균 및 적절하게 라벨이 부착된 페트리 접시 미디어 플레이트에 분주하고 멸균 Drigalski 스파텔로 펴 바릅니다.
    6. 혐기성 스테이션 내부에서 플레이트를 39°C에서 24-48시간 동안 배양합니다.
      알림: 인큐베이터 내부에서 배양할 때 페트리 접시를 혐기성 스테이션에서 꺼내기 전에 페트리 접시를 밀폐 상자에 옮기십시오.
  3. 특정 박테리아 그룹의 표적 분리.
    참고: 다음 방법론은 잠재적으로 MI를 동화시킬 수 있는 혐기성 박테리아에 대한 분리 전략을 설명합니다.
    1. 농축 배지, 최소 한천 배지 및 최소 배지 배지의 제조를 위해 단계 2.1에 설명된 지침을 준수하여 표 2 및 표 3에 명시된 조성을 따르십시오. 고압멸균 공정 후 0.2mL/L의 필터 멸균 비타민 혼합물(조성물에 설명된 대로)을 최소 한천 배지와 최소한의 육수 배지에 추가합니다.
    2. 10-15초 동안 와류 믹서를 사용하여 초기 샘플을 균질화합니다. 그 후, 피펫을 사용하여 균질화된 샘플을 5%의 비율로(예: 농축 배지의 부피가 10mL인 경우 균질화된 샘플 0.5mL를 접종)하여 농축 배지가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 갓 접종한 샘플을 혐기성 스테이션 내부에서 39°C에서 24시간 동안 배양합니다.
    3. 배양 후 10-15초 동안 와류 믹서를 사용하거나 피펫팅하여 농축된 튜브를 완전히 혼합합니다. 그 후, 혼합된 샘플을 5%의 속도로 멸균 최소 배지로 옮긴 다음 39°C에서 24시간 동안 배양합니다.
    4. 멸균 식염수(즉, 0.85% NaCl)에 샘플을 1:10 희석으로 시작하여 1:1000 희석까지 연속적으로 희석합니다. 각 희석 후에는 와류 믹서를 10-15초 동안 사용하거나 피펫팅하여 실온에서 샘플을 완전히 균질화합니다.
    5. 멸균 및 혐기성 조건에서 희석된 샘플 1mL를 Petri 접시로 옮깁니다. 약 15-20mL의 녹은 최소 한천 배지를 페트리 접시에 붓고 균일한 혼합을 위해 수평으로 부드럽게 휘젓습니다.
      참고: 한천의 온도는 덩어리가 없고 샘플이 열에 의해 죽는 것을 방지하기 위해 약 45°C여야 합니다. 매체 주입은 혐기성 조건에서 수행되어야 합니다.
    6. 한천 응고 후 페트리 접시를 혐기성 스테이션 내부 또는 인큐베이터에서 거꾸로 된 위치에서 39°C에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 배양 후 박테리아 군집은 배지에 박힌 뚜렷하고 작은 점으로 나타납니다.
      알림: 인큐베이터 내부에서 페트리 접시를 배양할 때 혐기성 스테이션에서 꺼내기 전에 플레이트를 밀폐 상자에 옮기십시오.
    7. 멸균 접종 루프를 사용하여 개별 박테리아 콜로니를 조심스럽게 선택하고 최소한의 배지가 있는 별도의 튜브로 옮깁니다.
    8. 콜로니를 개별 튜브로 옮긴 후, 접종된 튜브를 39°C에서 24시간 동안 혐기성으로 배양합니다. 배양 후 매체의 탁도가 증가하면 박테리아가 성장하고 있음을 나타냅니다.
      알림: 미디어 병을 혐기성 스테이션 내부로 옮기기 전에 매번 2.1.7단계에서 앞서 언급한 대로 가스를 제거해야 합니다. 2-8단계는 혐기성 스테이션 내부에서 수행해야 합니다.

3. 혐기성 세균의 동정

  1. 효소 용해 프로토콜22에 따라 배양 시간 24시간에서 48시간의 배양물에서 DNA를 추출합니다.
  2. 배양액을 3000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.
  3. PBS 2mL를 현탁하여 펠릿을 인산염 완충 식염수(PBS)로 2x 세척합니다. 10-15초 동안 와류 믹서를 사용하여 샘플을 균질화합니다. 3000 x g 에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리 단계를 반복하고 상층액을 조심스럽게 폐기합니다.
  4. 세포 펠릿을 PBS pH 7.4 0.2mL에 현탁시키고 50°C에서 1U의 라이소자임 및 1U의 재조합 뮤타놀리신으로 30분 동안 배양한 후 56°C에서 5μL의 proteinase K로 30분 동안 배양합니다.
  5. 각 튜브에 4μL 단위의 RNAseA를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 원심분리기 튜브를 21168 x g 에서 1분 동안 상층액을 회수하고 마그네틱 비드를 사용하여 정제합니다.
  6. dsDNA 정량 키트에 대한 제조업체 지침( 재료 표 참조)에 따라 형광 측정 방법으로 DNA 정량을 수행합니다.
    참고: 추출된 DNA는 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
  7. 표 4에 나타낸 조건에 따라 프라이머(27f 및 1492r(23)를 사용하여 PCR 증폭을 위한 템플릿으로 DNA 샘플을 사용한다. PCR 반응이 성공적이었는지 확인하기 위해 1X TAE 완충액과 1% 아가로스를 사용하여 표준 아가로스 겔 전기영동 방법에 따라 아가로스 겔 전기영동을 수행합니다.
  8. 프라이머, 뉴클레오티드 및 기타 오염 물질을 제거하기 위해 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다.
  9. Sanger 염기서열분석을 위한 PCR 제품을 적합한 염기서열분석 서비스 제공자에게 보냅니다.
    참고: 염기서열분석과 함께 서비스 제공업체는 추가 비용을 지불하고 PCR 산물의 정제를 포함한 서비스를 제공할 수도 있습니다. PCR 산물은 4 °C 또는 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
  10. 크로마토그램 파일(일반적으로 ABI 또는 SCF 형식)과 함께 FASTA 형식으로 염기서열분석 결과를 얻은 후 생물정보학 도구를 사용하여 염기서열을 분석합니다. 염기서열 분석 소프트웨어를 사용하여 크로마토그램 파일을 열고 시각화할 수 있습니다.
    참고: 크로마토그램의 전반적인 품질은 과도한 노이즈가 없는 명확하고 뚜렷한 피크를 기준으로 확인되었습니다
  11. BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 도구24 및 Refseq 게놈 데이터베이스를 사용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 비중복 GenBank 16S 리보솜 RNA 데이터베이스에서 앰플리콘을 비교하고 밀접하게 관련된 종에 정렬합니다.
    참고: NCBI BLAST를 사용하는 경우 검색 창에서 전체 FASTA 시퀀스를 복사하십시오.

4. 순수한 세균 배양물의 보존

  1. 원심분리(10분 동안 3000 x g ) 또는 플레이트의 액식 배양에서 바이오매스 수집을 통해 24시간에서 48시간의 잘 자란 배양액에서 박테리아 세포를 수확합니다.
  2. 적절한 등장성 멸균 용액(NaCl 0.85%)에 세균 배양을 현탁시키고 세균 용액을 3000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세척합니다.
  3. 상층액을 버리고 박테리아 펠릿을 소량의 멸균 등장 용액(0.5mL)에 재현탁시킵니다. 성장 배지 잔류물을 제거하려면 1회를 반복합니다.
  4. 펠릿을 0.8 mL - 1 mL의 멸균 배양 배지 농축액에 재현탁시키고 와류 믹서로 5-10초 동안 또는 피펫팅으로 균질화합니다.
  5. 0.5mL의 세포 현탁액을 멸균 및 적절하게 라벨링된 1mL cryovial에 옮기고 0.5mL의 오토클레이브 50% 글리세롤 용액을 추가합니다. 와류 믹서를 사용하여 극저온을 균질화하고 -80°C의 냉동고 랙에 보관합니다(그림 3).
    알림: 극저온을 -80°C로 옮기기 전의 모든 단계는 혐기성 스테이션 내부에서 수행해야 합니다.

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결과

운송 중 혐기성 상태 모니터링
소듐 레자주린(sodium resazurin)의 첨가로 인해, 샘플을 튜브로 이송하기 전에 수송 용액의 색상이 분홍색으로 변하는 것은 혐기성 조건의 유지가 중단되거나 실패했음을 나타냅니다. 따라서 그림 2에서 볼 수 있듯이 색상 변화를 보이는 튜브는 운송 중 사용을 자제하고 색상 변화가 없는 튜브만 사용했습니다.

염기서열분석 결과 분석
과도한 배경 잡음 또는 기준선의 중단, 신호 강도가 낮은 피크, 단일 위치에 여러 개 또는 겹치는 피크의 존재, 샘플의 오염, 불균일한 증폭 또는 염기서열분석 공정 중 문제를 나타내는 신선하고 순수한 배양을 사용하여 크로마토그램 데이터가 있는 분리체의 DNA 추출을 반복했습니다. NCBI에서 BLAST 검색을 수행할 때 가장 높은 퍼센트 ID와 높은 쿼리 커버를 보여주는 균주는 분리체와의 관련 ...

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토론

이 방법론의 목적은 샘플링 조건, 샘플 처리, 배지 배합 및 준비의 품질을 개선하여 혐기성 장내 박테리아의 배양을 향상시키는 것입니다. 배양 배지를 배합할 때 샘플의 물리화학적 조건(pH, 탄소, 질소 및 보조 인자의 가용성)을 고려해야 합니다. 돼지, 인간 또는 생쥐에서 얻은 박테리아 배양 수집과 비교했을 때1,26,27 닭에 대한 배지 선택에 대한 보고서는 다소 좁으며, 대변 및 caeca와 같은 고관심 부위에 대해서도 과소평가될 수 있다 2,28. 이러한 의미에서, 이 작업에 사용된 배지의 제형 및 제조는 다른 작업에서 시퀀싱 접근법에 의해 보고된 미생물의 대사 요구를 다루려는 80가지 다른 조...

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공개 사항

저자는 이 스크립트에 보고된 작업과 관련하여 경쟁하는 재정적 또는 개인적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자들은 Rehovot-Hohenheim 파트너십 프로그램과 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2를 인정합니다. 이 프로젝트는 연구 단위 P-FOWL (2601 용)의 일부로 개발되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산VWR20104.334
한천VWR97064-332
염화 암모늄Carl RothP726.1
혐기성 스테이션Don Whitley ScientificA35 HEPA
부티르산Merck8.0045.1000
염화칼슘 이수화물 VWR97061-904
원심분리기Eppendorf5424R
닭 라이소자임(무라미다아제)VWR1.05281.0010
시스테인VWR97061-204
포도당VWR90000-908
인산수소이칼Carl RothP749.1
EDTACarl Roth8043.2
Legehennen/ JunghennenfutterDeutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Dü 독일 셀도르프-
MagAttract HMW DNA KitQiagen67563
염화마그네슘Carl Roth2189.1
혼합 가스(80% N2(품질 수준 5.0), 15% CO2(품질 수준 3.0) 및 5% H2(품질 수준 5.0))Westfalen Gase GmbH, 독일-
Mutanolysin, 재조합 (동결 필리세이트)A & 생명공학1017-10L
Myo-inositolCarl Roth4191.2
PBS 1XChemSolute8418.01
Potassium dihydrogen phosphateCarl Roth3904.2
Propionic acidCarl Roth6026.1
QuantiFluor dsDNA 시스템PromegaE2671
RNAse A QIAGEN 리보뉴클레아제 A(RNase A) 19101
염화나트륨VWR27800.291
레사주린나트륨VWR85019-296
티오글리콜산나트륨시그마-알드리치 102933
대두 펩톤, GMO-Free, Animal-FreeVWR97064-186
ThermocyclerBio-RadT100
트립톤Carl Roth8952.1
Tween80Carl Roth9139.2
비타민 믹스 (보충제)VWR968290NL
VortexStar Lab07127/92930
효모 추출물Carl Roth9257.05
β-D-FructoseVWR53188-23-1
륨

참고문헌

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