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방법 논문

임신한 쥐를 위한 수영 운동 프로토콜 및 관리 방법

1.9K 조회수

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DOI:

10.3791/66577

⸱

2024년 4월 5일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Exercise Physiology, Beijing Sport University, 2Laboratory of Sports Stress and Adaptation of General Administration of Sport, Beijing Sport University, 3Key Laboratory of Physical Fitness and Exercise, Ministry of Education, Beijing Sport University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 훈련 후 임신한 쥐를 위한 쥐 사육 방법, 수영 훈련 절차 및 번식 후 수유 프로토콜을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 임신 중 산모의 운동이 자손과 그 기본 메커니즘에 미치는 영향을 연구하기 위한 동물 모델을 제공합니다.

초록

건강과 질병의 발달 기원 개념은 당뇨병, 심혈관 질환 및 암과 같은 만성 비 전염성 질병에 대한 초기 환경의 영향을 강조합니다. 동물 모델을 사용한 연구는 영양 부족, 영양 과잉, 비만, 화학 물질 또는 저산소증에 대한 노출과 같은 모성 요인이 태아 발달 및 태아 건강에 어떻게 영향을 미치는지 조사하여 저체중아, 고혈압, 이상지질혈증 및 인슐린 저항성과 같은 문제를 유발합니다. 가임기 여성의 과체중 및 비만 유병률이 증가하고 있다는 점을 감안할 때 효과적인 중재가 중요합니다. 임신 중 산모의 운동은 산모와 태아 모두에게 유익하고 질병의 위험을 줄이는 핵심 중재로 부상했습니다. 이 연구는 임신한 쥐에 대한 세 가지 운동 모델의 차이점을 비교합니다: 자발적 바퀴 달리기, 전동 러닝머신 및 수영. 수영은 안전하고 통제된 강도 수준으로 인해 가장 유익한 선택입니다. 이 프로토콜은 쥐 사육 방법, 임신 중 수영 훈련 및 번식 후 간호 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 다양한 쥐와 생쥐 종에 적합한 이 모델은 자손의 건강과 세대 간 건강에 대한 모성 운동의 이점을 연구하는 데 유용합니다.

서론

DOHaD(Developmental Origins of Health and Disease) 개념은 지난 20년 동안 등장했으며, 이 개념은 초기 발달 과정의 환경적 영향이 만성 비전염성 질환(NCD), 특히 당뇨병, 심혈관 질환 및 일부 유형의 암과 관련된 후기 병태생리학적 과정의 위험에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다1. 태아 발달의 가장 가소성 단계인 자궁 내 환경에 자손이 노출되는 시기에는 유전자와 환경의 상호작용 및 자궁태반 관류가 태아 재프로그래밍의 중요한 요소이다2. 선행 연구에서는 주로 동물모델을 활용하여 모계의 영양 부족, 영양 과잉, 임신 중 비만, 태아의 화학물질 또는 저산소증에 대한 노출과 같은 해로운 영향이 태아 발달 및 자손의 장기적 표현형 효과에 미치는 영향을 조사했다3. 이로 인해 저체중아가 태어나고 성장이 늦어지며 자손에게 혈압 상승, 이상지질혈증, 인슐린 저항성 등의 부작용이 발생했다4. 가임기 여성의 과체중 및 비만 비율이 급속히 증가하고 있기 때문에 이러한 해로운 모성 장애의 세대 간 전염을 방지하기 위한 효과적인 중재를 수립하는 것이 시급히 필요하며, 이는 인구 건강에 중요한 영향을 미칩니다 5,6.

운동은 오랫동안 제2형 당뇨병, 고혈압 및 기타 여러 질병에 대한 중요한 예방 요법으로 인식되어 왔다7. 임신 중 운동은 산모에게 유익한 영향을 미치고, 자손에게도 유익한 영향을 주어 모계가 자손에게 질병을 전염시키는 것을 줄인다8. 수년간의 연구는 임신성 당뇨병 9,10과 같은 일반적인 임신 상태의 상당한 감소를 포함하여 운동의 안전성과 심오한 이점을 입증했습니다. 산모와 태아의 안전과 관련하여, 운동 훈련과 수유 후 프로토콜을 실시하는 것은 어려운 일이다.

데이비드11외 심혈관 건강 연구에 적용할 수 있는 동물 운동 모델을 설명했습니다. 일반적으로 사용되는 세 가지 운동 모델인 자발적 바퀴 달리기, 전동 러닝머신 및 수영에는 장점과 단점이 있습니다. 자발적으로 달리는 바퀴는 쥐의 운동 행동을 밀접하게 모방하여 쥐가 일주기 리듬에 따라 움직일 수 있도록 합니다. 그러나 이러한 종류의 운동은 강도와 지속 시간을 보다 정확하게 조절해야 합니다. 전동 러닝머신은 운동 강도, 볼륨 및 지속 시간을 제어할 수 있지만 때로는 전기 자극이 필요하여 동물에게 신체적, 심리적 스트레스를 유발할 수 있습니다. 수영은 쥐의 타고난 수영 능력으로 인해 설치류 연구에서 널리 사용되며, 이는 또한 발과 꼬리에 대한 전기 자극이나 기계적 손상을 피할 수 있습니다12. 산전 운동 모델에 대한 연구에서(13,14), 수영은 일반적으로 사용되는 운동 방식이다. 임신이 진행되고 쥐의 복부가 부풀어 오르면 러닝 머신과 바퀴 달리기 운동으로 인해 복부가 단단한 표면과 반복적으로 접촉 할 수 있습니다. 대조적으로, 수영의 물 환경은 부력을 제공하여 임신한 동물의 운동 관련 부상 위험을 줄입니다.

이 프로토콜은 쥐 사육 방법, 임신 중 수영 훈련을 수행하는 방법, 훈련 후 임신한 쥐를 위한 번식 후 수유 프로토콜을 제시합니다. 이 임신한 수영 훈련 모델은 광범위한 쥐와 생쥐 종에 적용될 수 있으며, 따라서 동물 기반 모델을 사용하여 자손의 건강에 대한 모성 운동의 유익한 효과와 여러 세대에 걸친 운동의 이점을 조절하는 메커니즘을 연구하는 향후 연구에 유용한 설치류 모델을 제공할 수 있습니다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 베이징 체육 대학의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며 미국 국립보건원(NIH) 지침과 중국 동물 보호법 및 기관 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 쥐의 짝짓기와 먹이 주기

  1. 특정 병원체가 없는(SPF) 등급의 10주 된 Wistar 암컷 쥐와 11주 된 Wistar 수컷 쥐를 구입합니다.
  2. 적응형 먹이 구현: Wistar 쥐에게 표준 설치류 식단을 즉시 먹이고 지정된 먹이 시설에서 일주일 동안 수돗물을 사용할 수 있도록 합니다. 모든 쥐가 12°C의 일정한 온도와 22-45%의 습도에서 45시간 명암 주기로 수용되도록 합니다.
  3. 암컷 쥐의 발정을 조사하십시오.
    1. 깨끗한 유리 현미경 슬라이드, 직경 2mm 면봉, 식염수(0.9% NaCl) 및 현미경을 포함한 장비 및 재료를 준비합니다.
    2. 각 현미경 슬라이드에 날짜와 쥐 식별 정보를 라벨을 붙입니다.
    3. 오후 6시에서 7시 사이에는 스트레스를 최소화하기 위해 암컷 쥐를 부드럽게 제지하십시오. 엄지와 검지로 꼬리 밑부분을 잡고 다른 손가락으로 쥐의 요추에 압력을 가합니다.
    4. 꼬리 끝을 들어 올려 질을 노출시킵니다. 면봉에 식염수를 적신 후 팁을 질에 넣고 팁을 부드럽게 굴려 질 분비물을 채취합니다.
    5. 면봉 끝을 슬라이드를 가로질러 굴려 같은 부위에 다시 바르지 않도록 합니다.
    6. 현미경으로 도말을 검사하고 저배율 대물렌즈(10x)를 사용하여 세포를 찾아 관찰합니다.
      참고: 발정기에는 질 분비물에서 더 큰 상피핵이 사라지고 그 자리에 편평상피가 박리되어 각질화된 상피세포가 쌓여 둔덕에 쌓입니다.
    7. 각 쥐의 발정 주기의 단계를 기록하십시오.
  4. 오후 7시에서 8시 사이에 수컷과 암컷 쥐를 짝짓기 케이지에 넣습니다.
    알림: 암컷 쥐는 짝짓기를 위해 발정기 또는 발정기에 있어야 합니다.
  5. 둘째 날인 오전 7시에서 8시 사이에 짝짓기 케이지에 교미 플러그가 있는지 검사합니다. 교미 케이지의 바닥에서 교미 플러그가 발견되면 1.3.4-1.3.6 단계에서 설명한 것과 동일한 방법에 따라 암컷 쥐에 대한 질 분비물 도말을 만듭니다.
    참고: 교미 플러그는 수컷 쥐의 정낭 및 전립선 분비물과 질 분비물이 결합된 유백색 또는 황색을 띤 젤라틴 물질입니다.
  6. 암컷 쥐의 임신 확인 : 짝짓기 케이지에서 교미 플러그를 찾은 후 질 분비물 도말에서 정자를 관찰하십시오. 이 날을 임신 1일(GD1)로 지정합니다.
  7. 임신한 쥐를 별도의 케이지에 격리합니다.
    참고: 임신 초기에는 임신한 쥐가 환경에서 낯선 수컷 화학 신호를 만나거나 낯선 수컷 쥐와 동거하는 것을 방지하는 것이 필수적입니다.
  8. 쥐의 임신 기간은 일반적으로 21-23일 동안 지속됩니다. GD1에서 GD20까지 쥐의 체중을 측정하고 기록합니다.
  9. GD20에서 임신한 쥐의 케이지를 깨끗한 케이지로 교체하고 의료용 흡수성(쥐와 비슷한 크기)을 케이지에 넣습니다. 7일 동안 생존할 수 있도록 충분한 물과 먹이를 공급하고 케이지를 조용한 곳에 두십시오.
    참고: 쥐 분만 후 최소 1주일 동안은 케이지를 교체하지 마십시오. 깨끗한 케이지로 바꿀 때는 더러운 케이지에서 사용한 흡수성 솜을 새 케이지로 옮겨 쥐가 자손의 냄새를 인식할 수 있도록 합니다.
  10. 산후 21일째 되는 날에는 새끼를 성별에 따라 분리하여 두 개의 우리에 넣는다.
    알림: 21일 된 새끼의 크기가 더 작기 때문에 경질 사료 펠릿을 케이지 내부의 유리 페트리 접시에 넣으십시오.

2. 임산부 수영 훈련 프로그램

  1. 모든 실험용 암컷 쥐를 대상으로 5일 동안 적응 훈련을 실시합니다.
    1. 높이가 20cm 이상인 투명 플라스틱 용기를 준비하고 34± 1°C에서 10cm의 물을 채웁니다.
    2. 쥐의 꼬리 끝을 잡고 들어 올린 다음 쥐를 물에 넣으십시오.
    3. 15분 적응 훈련 중에는 5분마다 수온을 면밀히 모니터링하고 따뜻한 물을 추가하여 온도를 유지합니다.
    4. 훈련이 끝나면 쥐를 34± 1°C의 깨끗한 물로 옮겨 털을 씻습니다. 그런 다음 쥐를 수건으로 케이지로 옮기고 헤어 드라이어를 사용하여 털을 말리십시오.
      알림: 소음과 더운 환경은 쥐에게 스트레스를 유발할 수 있습니다. 따라서 온도 조절이 가능한 조용한 헤어 드라이어를 사용하는 것이 좋습니다.
    5. 친절하게 쥐를 각각의 우리에 돌려주십시오.
  2. 쥐 짝짓기(1.3-1.6단계 수행).
  3. 1.7단계 후 임신한 쥐를 좌식 그룹(SED)과 운동 그룹(EX)으로 무작위로 배정합니다.
  4. 모든 훈련 세션 전에 매일 쥐의 무게를 잰다.
    참고: 적응 훈련 중 쥐의 체중 감량은 3g/day를 초과해서는 안 됩니다. 산전 훈련 중에는 쥐의 체중이 점차 증가해야합니다. 쥐가 하루에 3g 이상을 감량하는 경우 회복할 수 있도록 일일 훈련 시간을 50% 줄입니다.
  5. GD1부터 GD20까지 EX를 위한 산전 수영 훈련을 주 6일, 아침 8:00부터 9:00까지 실시합니다.
    1. 지름 50cm, 최소 높이 50cm의 원형 물통을 준비하고 34 ± 1°C의 온도에서 40cm의 물을 채웁니다.
    2. GD1에서 GD5까지 처음에는 하루에 20분 동안 수영 훈련을 수행하고 점차 하루에 60분으로 늘리십시오.
    3. GD6부터 GD20까지 일주일에 6일 동안 하루에 60분씩 운동 훈련을 계속하십시오.
    4. 사후 관리는 2.1.4-2.1.5단계를 참조하십시오.
    5. 운동 후에는 EX 쥐에게 설치류 해바라기씨 5g을 주어 영양을 공급하십시오.
  6. 매일 EX 훈련 중에 SED 쥐를 적응 훈련과 동일한 물 환경에 놓습니다(2.1.1단계). SED 쥐가 EX 쥐와 같은 시간을 물 환경에서 보내게 하십시오. 운동 후에는 SED 쥐에게 설치류 해바라기씨 5g을 주어 영양 공급과 진정 효과를 줍니다.
  7. 각 수영 훈련 세션 후에는 물통과 수건을 포함하여 자외선으로 모든 장비를 청소하고 소독하십시오.

3. 태아의 신체적 특징

  1. GD20.5 아침에 암컷 쥐를 3% 이소플루란으로 마취하고 CO2 챔버에서 안락사시킵니다.
  2. 수술용 칼을 사용하여 쥐의 하복부를 절개합니다. 절개 부위가 복부 양쪽으로 기울어져 자궁이 완전히 노출되도록 합니다.
  3. 집게와 가위를 사용하여 자궁을 조심스럽게 열어 태아와 태반을 노출시킵니다. 가위로 인한 태아와 태반의 손상을 방지하기 위해 집게를 사용하여 태아를 둘러싼 얇은 양막을 부드럽게 분리합니다.
  4. 멸균 거즈를 사용하여 혈액과 점액을 제거하여 태아의 몸을 청소하십시오. 태아와 태반을 해부학적 위치에 따라 순차적으로 분리한 다음 무게를 잰다.
  5. 태아의 성별을 결정하기 위해 항문과 생식기 사이의 거리를 관찰하십시오. 남자 태아는 여자 태아보다 거리가 더 멀다. 나중에 참조할 수 있도록 태아의 성별과 수를 기록하십시오.
  6. 평평하게 누운 상태에서 캘리퍼스를 사용하여 태아의 길이를 측정합니다. 태아는 아직 살아 있기 때문에 해부 후 말릴 수 있으므로 몸을 펴서 측정하십시오.
    참고: 실험 결과의 일관성과 측정 방법의 일관성을 보장하기 위해 동일한 실험자가 전체적으로 동일한 표준을 유지합니다. 태아는 기관에서 권장하는 지침에 따라 안락사시켰으며, 필요에 따라 추가 분석을 위해 조직 샘플을 채취하였다.

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결과

쥐 사육 방법 섹션(그림 1)에서는 번식 성공률을 높이기 위해 질 분비 슬라이드를 만들어 암컷 쥐의 발정 주기를 결정합니다. 쥐의 발정 주기는 4-5일 동안 지속되며 프로에스트러스, 에스트루스, 메테스트트루, 디스트루스가 포함됩니다. metestrus 또는 diestrus의 암컷 쥐는 수컷과 거리를 두는 등의 행동을 보입니다. 동시에 발정기에 있는 쥐는 짝짓기를 할 의향이 있으며 암컷 쥐의 배란은 대부분 발정이 끝날 때 발생합니다. 발정기 동안, 질 도말 샘플은 주로 핵이 형성된 상피 세포를 포함하며 간혹 각질화된 세포가 포함되어 있습니다. 발정기의 질 도말은 주로 각질화된 편평 상피 세포가 말뚝으로 뭉쳐져 있으며, 메테스트루스에서 볼 수 있는 상피 세포의 확대된 핵이 소실됩니다. metestrus에서 질 도말에는 주로 백혈구가 포함되어 있으며 몇 개의 각질화 된 상피 세포가 있습니다. 발정기는 백혈구가 우세하며 간혹 유핵 및 각질화된 상피 세포가 있는 것이 특징입니다(

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토론

본 연구는 임신한 쥐를 위한 구체적인 쥐 짝짓기 방법, 수영 훈련 프로토콜, 태아의 생리적 지표를 평가하기 위한 연구 방법 등 실현 가능한 운동 프로그램을 수립하는 것을 목표로 한다. 우리는 프로토콜을 통해 발생할 수 있는 잠재적 문제에 대한 해당 솔루션과 함께 연습을 통해 산전 수영 운동 훈련 모델을 개발했습니다(표 1). 이 프로토콜은 보다 실용적이고 연구자들이 산전 운동 모델을 수립하는 데 도움이 될 것입니다.

우리의 연구 결과는 우리가 고안한 쥐 임신 수영 훈련 프로그램을 사용하는 것이 쥐의 정상적인 임신 과정을 방해하지 않으며 부정적인 임신 결과로 이어지지 않는다는 것을 나타냅니다. 쥐의 임신 결과에 대한 산전 운동의 영향은 유산율과 새끼 크기를 측정하여 평가되었습니다. 이 연구는 산전 운동이 이러한 요인에 유의한 영향을 미치지 않는다는 결론을 내렸다

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감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32071174, 32200941, 32371183, 31771312)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
캘리퍼스Mitutoyo 측정 기구 (상하이) Co., Ltd530-101 N15태아 해부
원형 물 양동이NaliyaN/A쥐 수영
실험 수술 기구 Shenzhen RWD Life Technology Co., LTDSP0001-G태아 해부
유리 현미경 슬라이드Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., LTD80312-3161질 도말
유리 페트리 접시Merck Life TechnologiesBR455751-10EA자손 양육
헤어 드라이어PanasonicEH-WNE5H수영 후 관리
정보 카드Zhongke 생명 과학SS3쥐 짝짓기
IsofluraneShenzhen RWD Life Technology Co., LTDR510-22-10태아 해부
광 현미경올림푸스IX71-F22PH질 도말
짝짓기 케이지Zhongke Life ScienceSS3쥐 짝짓기
의료 흡수성 면Hongxiang Sanitary Materials Co., LTDN/A임신한 쥐는 출산 예정
설치류 마취 기계, 가스 마취Shenzhen RWD Life Technology Co., LTDR500IE태아 해부
설치류 사육 사료Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD1032임산부 쥐 먹이
설치류 유지 보수 사료Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD1022자손 양육
설치류 해바라기 씨JollyJP241영양 보충제
방음 면화Kufu 의료 기기N / A임신 한 쥐는 출산을 기다리고 있습니다
멸균 면봉 (직경 2mm)Kufu 의료 기기N / A질 도말
멸균 거즈Kufu 의료 기기N / A태아 해부
뇌졸중 생리적 식염수 (0.9 % NaCl)Shandong Hualu Pharmaceutical Co., LTDN/A질 도
온도계Beekman 유기체N/A쥐 수영 모니터링
수건그레이스N/A수영 후 관리
투명 플라스틱 용기NaliyaN/A수영 적응형 훈련
자외선Merck Life TechnologiesZ169633-1EA수영 후 관리
온수기HaierEC6001-Q6S쥐 수영
체중계Electronlc AcaleJM. A10001체중 측정
Wistar RatsVital river Laboratory Animal Technology Co., LTDN/A실험
말

참고문헌

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