방법 논문

Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells의 세포외 소포체의 정제 및 특성 분석

DOI:

10.3791/66585

⸱

2024년 5월 3일

 ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital, 2School of Medicine, Nankai University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC) 배양 및 상층액 수집부터 초원심분리를 사용한 세포외 소포체(EV) 추출에 이르기까지 모든 절차를 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(ADSC)는 다양한 조직과 장기의 재생 및 재건을 촉진할 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 이들의 재생 기능은 세포 간 접촉 및 세포 측분비 효과에 기인할 수 있습니다. 파라크린 효과는 세포가 짧은 거리에서 상호 작용하고 정보를 전달하는 중요한 방법이며, 여기서 세포외 소포체(EV)는 운반체로서 기능적인 역할을 합니다. 재생 의학 분야에서 ADSC EV는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 여러 연구에서 이러한 방법의 효과에 대해 보고했습니다. EV를 추출하고 분리하는 다양한 방법은 현재 원심분리, 침전, 분자 크기, 친화도 및 미세유체역학과 같은 원리를 기반으로 설명됩니다. 초원심분리는 EV를 분리하기 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 그럼에도 불구하고 초원심분리 중 예방 조치를 강조하기 위한 세심한 프로토콜은 여전히 부재합니다. 이 연구는 ADSC 배양, 상층액 수집 및 EV 초원심분리와 관련된 방법론과 중요한 단계를 제시합니다. 그러나 초원심분리가 비용 효율적이고 추가 치료가 필요하지 않음에도 불구하고 낮은 회수율 및 EV 응집과 같은 몇 가지 불가피한 단점이 여전히 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

대부분의 ADSC는 지방 조직에서 유래하며 심근, 뼈 및 피부를 포함한 다양한 조직과 장기의 재생 및 재건을 촉진하는 것으로 입증되었습니다1. 최근 연구에 따르면 ADSC의 재생 기능은 세포 간 접촉과 세포의 파라크린 효과에 기인할 수 있습니다2. 파라크린 효과는 세포가 짧은 거리에서 상호 작용하고 정보를 전달하는 중요한 수단이며, 이 기능은 세포외 소포체(EV)를 통해 달성됩니다.

EV는 셀에 의해 생성되는 이중층 멤브레인 구조로, 직경이 40nm에서 160nm(평균 약 100nm) 사이입니다. 그들은 사이토카인 생산, 세포 증식, 세포 사멸 및 신진 대사와 같은 다양한 세포 기능에 영향을 미칩니다 3,4. 뼈 재생 촉진, 구강 점막 조직 재생, 조직 이식 후 지방 조직 생존, 피부 상처 복구를 포함한 ADSC EV의 기능에 대한 수많은 연구가 수행되었습니다 5,6,7,8. 재생 의학 분야에서 ADSC EV의 엄청난 잠재력은 분명합니다. 상층액에서 EV를 추출하고 분리하기 위한 다양한 방법이 존재하며, 원심분리, 침전, 분자 크기, 친화도 및 미세유체역학에 기반한 기술과 같은 방법이 있습니다. 초원심분리 방법은EV9를 분리하기 위한 황금 표준으로 널리 간주됩니다. EV 분리를 위한 초원심분리의 기본 원리는 시료의 입자가 다양한 침강 계수를 가지므로 별개의 분리층에서 침강 및 응집이 발생한다는 사실에 기반을 두고 있습니다. 그럼에도 불구하고 초원심분리 중 주의사항을 강조하는 세부 프로토콜은 아직 확립되지 않았습니다.

따라서 본 연구는 ADSC 배양, 상층액 채취 및 EVs 초원심분리 절차 및 요점을 논리적인 정보 흐름과 명확하고 공식적인 언어로 객관적으로 설명합니다. 이는 향후 실험에 대한 귀중한 참고 자료를 제공합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜 단계의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 미디어 준비

  1. 기초 배양 배지 450mL, 엑소좀이 없는 소 태아 혈청 50mL, 삼중 항생제 5mL를 사용하여 엑소좀이 없는 ADSC용 배양액을 준비합니다.

2. ADSC의 소생 및 배양

알림: ADSC를 소생시킵니다.

  1. 매우 깨끗한 테이블의 자외선을 미리 켜고 30분 동안 소독합니다.
  2. 미리 37°C 수조에서 매체를 예열합니다.
  3. 액체 질소에서 동결된 ADSCs(P2) 튜브 3개를 회수하고 완전히 해동될 때까지 일정한 온도의 37°C 수조에서 교반합니다.
    알림: 냉동 튜브의 입구는 오염을 방지하기 위해 물과 접촉하지 않아야 합니다.
  4. 75% 알코올을 사용하여 냉동 보존 튜브를 소독한 다음 매우 깨끗한 테이블로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 흡입하고 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
  5. 원심분리기 튜브를 저속 원심분리기에 넣고 4°C에서 5분 동안 250 x g 으로 원심분리합니다.
  6. 10cm 배양 접시 4개를 준비하고 각 접시에 9mL의 배지를 넣습니다. 이름, 세포 유형, 생성 및 실험 날짜를 표시한 다음 37°C 자동 온도 조절 세포 인큐베이터에서 예열합니다.
  7. 원심분리기 튜브를 소독하고 매우 깨끗한 테이블로 옮깁니다. 피펫으로 상층액을 제거합니다.
  8. 4mL의 배지를 추가하고 용액(1 x 105 cells/mL)이 고르게 분산될 때까지 부드럽게 교반합니다.
    알림: 상층액을 추출할 때 세포 펠릿을 제거하지 않도록 주의하십시오.
  9. 각 접시에 세포 현탁액 1mL를 추가합니다. 크로스 방식으로 접시를 흔듭니다.
    알림: 플레이트를 평평한 표면에 놓고 5-6회 반복 동안 십자형(위, 아래, 왼쪽, 오른쪽으로 이동)으로 교반합니다. 원을 그리는 움직임은 중앙에 세포가 축적될 수 있으므로 피하십시오.
  10. 광학 현미경으로 40x 배율로 세포를 관찰한 다음 접시를 인큐베이터에 넣습니다.
    참고: 세포를 관찰하는 주요 목적은 고르지 않은 분포가 후속 성장에 영향을 미치기 때문에 세포가 고르게 분포되어 있는지 확인하는 것입니다.
  11. 세포에 대한 교환 매체를 준비합니다.
    1. 매우 깨끗한 테이블의 자외선을 미리 켜고 30분 동안 소독합니다.
    2. 미리 37°C 수조에서 매체를 예열합니다.
    3. 광학 현미경으로 40x 배율로 세포 상태를 관찰합니다. 합류 수준은 약 50%입니다.
      알림: 합류 수준은 세포가 벽에 부착되어 완전히 늘어난 후 페트리 접시의 표면적에 대한 세포가 차지하는 면적의 비율로 계산됩니다.
    4. 소독 후 배양 접시를 매우 깨끗한 테이블(생물안전 수준 2)로 옮기고 배지를 제거합니다.
    5. 각 배양 접시를 PBS 용액 2mL로 두 번 부드럽게 헹굽니다.
    6. 각 접시에 배지 10mL를 추가합니다. 접시를 인큐베이터로 옮깁니다.

3. ADSC 상층액 수집 및 EV 추출

  1. 매우 깨끗한 테이블의 자외선을 미리 켜고 30분 동안 소독합니다.
  2. 현미경으로 세포 상태를 관찰합니다. 합류 수준은 약 80%입니다.
  3. 소독 후 접시를 매우 깨끗한 테이블로 옮깁니다. 피펫으로 상층액을 조심스럽게 모아 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
    참고: 셀은 고정하거나 삭제할 수 있습니다. 멸균이 필요하지 않은 경우 수술대에서 다음 단계를 수행할 수 있습니다. 이 시점에서 실험을 일시 중지한 다음 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 실험이 중단된 경우 상층액을 4°C 냉장고에 일주일 이상 보관하지 마십시오. 장기 보관은 EV의 활동에 영향을 줄 수 있으므로 권장하지 않습니다. 최적의 접근 방식은 EV를 즉시 추출하는 것입니다.
  4. 원심분리기(300 x g, 10분, 실온에서)를 사용하여 부유 세포를 제거합니다. 피펫으로 상층액을 수집합니다.
    알림: 붓지 마십시오. 펠릿이 빨려 들어가는 것을 방지하기 위해 약간의 상청액을 남겨 두십시오.
  5. 세포 파편을 제거하기 위한 원심분리기(2000 x g, 10분, 4°C)한 다음 피펫으로 상층액을 계속 수집합니다.
    참고: 핵심 사항은 3.4단계와 동일합니다.
  6. 0.22um 멤브레인으로 상층액을 여과하여 큰 입자와 세포 파편을 제거합니다.
    알림: 여과하기 전에 상층액을 2mL의 멸균 PBS로 여과하여 필터 멤브레인을 적십니다.
  7. 초원심분리기 기계의 원심분리기(10,000 x g, 30분, 4°C).
  8. 다음으로, 1,00,000 x g 에서 4 ° C에서 70 분 동안 원심 분리하여 펠릿을 제거하고 상층액을 수집합니다.
    알림: 얻어진 EV는 순도를 높이기 위해 여러 번 원심분리로 정제되었습니다. 펠릿은 육안으로 보이지 않을 수 있습니다. 따라서 피펫을 부드럽게 작동하고 펠릿 수집을 방지하기 위해 바닥에 약간의 상층액을 남겨두는 것이 중요합니다.
  9. 피펫으로 상층액을 제거합니다. PBS 및 원심분리기(1,00,000 x g, 70분, 4°C)로 펠릿을 재현탁합니다.
    알림: 펠릿은 육안으로 보이지 않을 수 있습니다. 따라서 피펫으로 상층액을 흡입할 때 EV의 순도를 최대화하기 위해 상층액을 부드럽고 철저하게 제거하는 것이 중요합니다.
  10. 상층액을 제거하고 EV 펠릿을 얻습니다. 1mL의 PBS로 재현탁시키고 1mL 원심분리 튜브에 옮긴 다음 후속 검출을 위해 4°C 냉장고에 보관합니다.
    알림: 펠릿은 육안으로 보이지 않을 수 있습니다. 따라서 피펫으로 상층액을 흡입할 때 EV의 순도를 최대화하기 위해 상층액을 부드럽고 철저하게 제거하는 것이 중요합니다. 샘플이 장기간 필요하지 않은 경우 -80 °C 냉장고에 보관하십시오.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

먼저, ADSC의 형태10 및 표면 항체를 포함하여 ADSC를 특성화하고 식별했습니다. 그림 2A에 따르면 ADSC는 방추 모양으로 배열되어 조밀한 성장 후 소용돌이를 형성하는 것이 분명합니다. 배양된 세포를 지방형성(adipogenic), 골형성(osteogenic) 및 연골형성(chondrogenic) 세포로 분화하고 Oil Red O, Alizarin Red 및 Alcian Blue11로 염색하였다. 유도 분화 실험과 유세포 분석을 통해 이들이 실제로 다방향 분화가 가능한 ADSC임을 검증했습니다. 그러나 결과에서 세포의 22%가 CD45 양성이며, 이는 충분한 양성 및 음성 항체가 이를 뒷받침하기 때문에 결론에 영향을 미치지 않습니다(그림 2A, B).

다음으로, 추출된 EV를 식별하는 것이 필수적입니다. 그것은 주로 형태학, 입자 크기 및 마커 단백질의 세 가지 측면을 포함합니다. TEM 결과는 이중층 멤브레인(12 )이 있는 컵 모양의 EV 구조를 명확하게 보여줍니다(그림 3A). NTA는 EV의 입자 크기 분포가 약 50-150nm이고 농도는 약 1.6 x 1010 입자/mL임을 나타냅니다(그림 3B). 웨스턴 블롯 분석은 또한 CD9, CD63 및 TSG10113을 포함한 EV의 마커 단백질이 원활하게 발현됨을 보여줍니다(그림 3C).

figure-results-1
그림 1: 프로토콜 단계 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: ADSC의 특성화. (A) ADSC의 형태는 방추형입니다. ADSC는 각각 지방형성, 골형성 및 연골형성 분화를 위해 배지에서 배양되었습니다. 지방 분화는 Oil Red O 염색에 의해 확인되었습니다. 골형성 및 연골형성 분화는 각각 Alizarin Red 염색 및 Alcian Blue 염색에 의해 확인되었습니다. 스케일 바: 100 μm. (B) MSC 표면 마커(CD90, CD105, CD29 및 CD73) 및 조혈 세포 특이적 마커(CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR)에 대한 ADSC의 유세포 분석. 게이팅 전략: 먼저 빈 그룹에 동그라미를 칩니다. 이를 바탕으로 각 그룹의 표지된 항체에 따라 CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45, HLA-DR을 연속적으로 동그라미를 친다. 이 그림은 Han, Y. D. et al.13에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: EV의 특성화. (A) TEM 결과는 이중층 멤브레인의 컵 모양 EV 구조를 명확하게 보여줍니다. 스케일 바: 200nm. (B) NTA는 EV의 입자 크기 분포가 약 50-150nm이고 농도는 약 1.6 x 1010 입자/mL임을 나타냅니다. (C) 웨스턴 블롯에 의한 엑소좀의 TSG101, CD9, CD63 발현 검출. 이 그림은 Han, Y. D. et al.13에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

공식적인 실험 과정에서 최상의 실험 결과를 얻기 위해서는 몇 가지 사항이 중요합니다. 이전 경험에 비추어 볼 때 가능한 최상의 세포 상태를 보장하는 통로 3-6 ADSC를 선택하는 것이 좋습니다. P3 이전에는 적혈구, 내피 세포 및 기타 기타 세포가 스크리닝되지 않았을 수 있습니다. P6 이후에는 세포가 점차 노화될 수 있으며, 이는 분비된 EV의 상태에 영향을 미칠 수 있습니다. 둘째, 가능한 한 많은 EV의 충분한 분비를 보장하기 위해 세포 밀도가 80%에서 90% 사이일 때 상층액을 수집해야 합니다. EV의 최대 순도를 유지하기 위해 연구원들은 처음 세 번의 원심분리 동안 주의를 기울여야 하며 불순물과 펠릿이 흡입되는 것을 방지하기 위해 액체 잔류물이 남지 않도록 해야 합니다. 마지막 두 번의 원심분리 동안, 펠릿을 보호하면서 상층액이 완전히 제거되었는지 확인하십시오.

초원심분리는 비용 효율적이며 추가 치료가 필요하지 않습니다. 이 기술은 EV 연구에서 널리 사용되어 왔으며 특성화 실험에서 확인된 바와 같이 EV를 얻는 데 만족스러운 효율성을 입증했습니다. 그럼에도 불구하고 몇 가지 불가피한 단점이 있습니다. 첫째, 전기차 회수율이 낮다. 둘째, EV는 때때로 집계되는 경향이 있습니다. 또한 비세포 구성 요소를 분리할 수 있으며 일부 EV는 공정 중에 파열되어 파편이 축적될 수 있습니다 14,15,16. 이러한 결함을 해결하기 위해 대부분의 연구는 EV12,13을 정화하는 데 중점을 둡니다. 그러나 이 프로토콜은 세포 배양에서 엑소좀 정제에 이르는 전체 과정을 다루는데, 이는 전체 과정이 최종 추출된 EV의 상태와 순도에 영향을 미친다고 믿기 때문입니다. 작동 중에는 앞서 언급한 지침을 준수하는 것이 중요합니다. 또한, 많은 연구에서 3D 배양이 2D 배양에 비해 EV의 분비를 자극하는 데 더 효과적이라는 것이 입증되었기 때문에 더 많은 상층액을 수집하고 3D 세포 배양을 구현하는 것이 도움이 될 수 있습니다17,18.

이 프로토콜은 초원심분리를 사용하여 ADSC에서 EV를 추출하는 프로세스를 간략하게 설명합니다. 실용적인 지침을 제공하고 실험자가 작업 중에 가능한 한 세부 사항을 피할 수 있도록 합니다. 요약하면, 이 프로토콜은 실험자가 샘플의 품질을 개선하는 데 도움이 되며 각 단계의 세부 사항에만 집중하는 것이 아니라 실험 전체를 고려해야 한다는 것을 상기시키는 역할을 합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언할 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82202473)의 일부 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Acros Organics의 Acrodisc 바늘 필터46520.22 μ
세포 배양을 위한 m 기초 배지OriCellBHDM-03011
EXO + 배양 보충제가 없는 태아 소 혈청(인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포용)OriCellHUXMD-05002
도립 현미경OLYMPUSLx70-S8F2
저속 원심 분리기안후이 USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.SC-3612
NormocinInvivoGenAnt-nr-05
Optima Max-XP 탁상용 초원심분리기Beckman Coulter393315
페니실린-스트렙토마이신-겐타마이신 용액(100x)SolarbioP1410
Supor 멤브레인

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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