이 프로토콜은 망막 광수용체 말단의 구조적 특징에 초점을 맞춰 부피 전자 현미경을 위해 망막 샘플을 준비하기 위한 자세한 단계를 설명합니다.
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방법 논문
부피 전자 현미경을 위한 망막 시료 준비
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
부피 전자 현미경(Volume EM)은 나노미터 수준의 정밀도로 세포 및 조직의 3D 구조를 시각화하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다. 망막 내에서 다양한 유형의 뉴런이 내부 및 외부 망상층에서 시냅스 연결을 설정합니다. 기존의 EM 기술은 망막 세포 내 소기관에 대한 귀중한 통찰력을 제공했지만, 정확한 측정을 방해할 수 있는 2D 이미지 데이터를 제공하는 데 한계가 있습니다. 예를 들어, 시냅스 전달에 중요한 3개의 뚜렷한 시냅스 소포 풀의 크기를 정량화하는 것은 2D에서 어려운 일입니다. Volume EM은 대규모의 고해상도 3D 데이터를 제공하여 솔루션을 제공합니다. 샘플 준비는 Volume EM에서 중요한 단계이며 이미지 선명도와 대비에 큰 영향을 미친다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 이러한 맥락에서 우리는 망막의 광수용체 축삭 말단의 3D 재구성을 위한 시료 준비 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에는 세 가지 주요 단계, 즉 망막 박리 및 고정, 시료 삽입 과정, 관심 영역 선택이 포함됩니다.
서론
망막은 얽히고설킨 뉴런 축삭돌기와 수상돌기로 빽빽하게 채워져 있으며, 수상돌기는 이들 사이에 시냅스를 형성합니다1. 현미경 검사는 미세하고 복잡하며 작은 구조를 가지고 있기 때문에 망막 해부학을 연구하는 데 없어서는 안될 도구입니다. 전자 현미경(EM)은 세포 내 소기관의 미세 구조와 나노미터 레벨2에서 특정 단백질의 정확한 국소화를 조사할 수 있는 탁월한 성능을 제공하지만, 2차원(2D) 평면으로 제한된 이미지를 생성하므로 주요 정보가 손실될 수 있습니다.
새로운 고분해능 부피 전자 현미경(Volume EM) 기술의 개발은 보다 포괄적이고 더 큰 규모의 3차원(3D) 구조 정보를 제공하는 데 도움이 됩니다. 일부 3D EM 방법은 최근에 다른 사람들에 의해 검토되었습니다 3,4,5. 3D EM을 사용하면 신경 세포 모양 및 연결성 세부 사항을 재구성할 수 있으므로 관심 구조를 정밀하게 정량적으로 분석할 수 있습니다. 이는 볼륨 EM....
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프로토콜
동물 관리 및 사용 프로토콜은 Wenzhou Medical University의 윤리 위원회의 승인을 받았으며 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology)에서 제정한 지침을 따랐습니다. 모든 마우스는 12시간 밝은 주기와 12시간 어두운 주기로 유지되었으며 표준 차우 식단을 제공받았습니다.
1. 망막 박리 및 고정
- 마우스(C57BL/6J, 수컷, 8주령, 20-25g)를 복강내로 2,2,2-트리브로모에탄올(체중 0.25mg/g)을 주입하여 마취합니다. 발가락을 꼬집은 후 뒷발을 후퇴시키지 않거나 깜박이는 반사가 없는 것으로 마취 깊이를 확인합니다. 그런 다음 마취 상태에서 경추를 탈구하여 동물을 안락사시킵니다.
참고: 트리브로모에탄올은 특히 단기 시술의 경우 소동물 모델에서 빠르고 신뢰할 수 있는 마취를 유도하는 데 있어 잘 문서화된 효능 때문에 선택되었습니다. 제약 등급의 마취제가 선호되지만 트리브로모에탄올은 특정 프로토콜에서 특정 이점을 제공하므로 적절하게 준비하고 투여할 때 적합한 대안이 됩니다. 안전하고 효과적인 사용을 보장하기 위해 모든 예방 조치를 취했습니다.....
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결과
그림 1A 는 전통적인 화학적 이중 고정 방법을 사용하여 제조된 망막 광수용체 말단의 이미지를 보여주고, 그림 1B 는 OTO 방법을 사용하여 제조된 망막 광수용체 말단의 이미지를 보여줍니다. 둘 다 FIB-SEM에 의해 샘플링되었습니다. OTO 방법을 사용하면 세포막 구조를 최대한 유지할 수 있음을 명확하게 알 수 있으며, 소포의 윤곽까지 명확하게 볼 수 있습니다. 또한 OTO 방법을 사용하여 얻은 이미지의 대비도 더 선명합니다.
그림 2 는 광수용체 말단의 초구조적 특성을 재구성하는 데 사용되는 실험적 워크플로우를 보여줍니다. 재구성은 M-원뿔 척추경, S-원뿔 척추경, rod1 spherules 및 rod2 spherules를 포함한 4가지 유형의 광수용체 말단에 초점을 맞췄습니다. 주요 강조점은 미토콘드리아, 시냅.......
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토론
망막 조직에서 광수용체의 말단 구조를 분석하기 위해 OTO의 Volume EM 샘플 준비 프로토콜을 구현했습니다. 초점은 망막의 박리 및 고정부터 광수용체 축삭 말단의 3D 재구성 결과를 보여주는 것까지 전체 절차를 자세히 설명하는 것이었습니다.
망막 조직의 특징은 뇌 조직과 달리 지역적 차이가 없다는 데 있습니다. 3개의 층으로 이루어진 뉴런 세포체와 2층의 시냅스 연결로 구성된 망막은 뉴런 및 시냅스 구성 요소의 복잡성에도 불구하고 규칙적이고 계층적인 구조를 나타낸다(20). 망막을 절개할 때는 후속 시료 전처리 단계에서 균일한 대비를 보장하기 위해 얇은 스트립을 최소화하는 것이 필수적입니다. 중요한 관심 구조인 광수용체 축삭 말단은 망막의 바깥쪽 망상층(OPL)에 위치합니다. 망막의 계층적이고 조직화된 특성으로 인해 표적 구조의 효율적인 국소화가 가능하여 EM 중 정확한 .......
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공개 사항
저자는 공개하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국가핵심연구개발프로그램(National Key Research and Development Program of China, 2022YFA1105503), 국가핵심신경과학연구소(State Key Laboratory of Neuroscience, SKLN-202103), 중국저장자연과학재단(Zhejiang Natural Science Foundation of China, Y21H120019)의 보조금으로 일부 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 아세톤 | 전자 현미경 과학 | 10000 | |
| Amira 6.8 | Thermo Fisher Scientific | ||
| CaCl2 | Sigma | C-2661 | |
| 임베딩 몰 | Beijing Zhongjingkeyi Technology | GP10590 | |
| Epon 수지 | 전자 현미경 과학 | 14900 | |
| 에탄올 | 시그마 | 64-17-5 | |
| 글루타르알데히드 | 전자 현미경 과학 | 16020 | |
| Helios NanoLab 600i 듀얼 빔 SEM | FEI | ||
| L-아스파르트산 | 시그마 | 56-84-8 | |
| 질산납 | 시그마 | 10099-74-8 | |
| Na2HPO4.12H2O | 시그마 | 71650 | 인산염 완충액 |
| NaH2PO4의 구성 요소. H2O | Sigma | 71507 | 인산염 완충액의 구성 요소 |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 157-8 | |
| 페로시아나이드 칼륨 | 시그마 | 14459-95-1 | |
| 카코딜레이트 나트륨 | 시그마 | 6131-99-3 | |
| 스퍼터 코터 | Leica | ACE200 | |
| Thiocarbohydrazide | Sigma | 2231-57-4 | |
| Uranyl acetate | TED PELLA | CA96049 |
참고문헌
- Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).
- Harris, J. R. Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey. Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).
- Varsano, N., Wolf, S....
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재인쇄 및 허가
