방법 논문

부피 전자 현미경을 위한 망막 시료 준비

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DOI:

10.3791/66589

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2024년 5월 24일

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 망막 광수용체 말단의 구조적 특징에 초점을 맞춰 부피 전자 현미경을 위해 망막 샘플을 준비하기 위한 자세한 단계를 설명합니다.

초록

부피 전자 현미경(Volume EM)은 나노미터 수준의 정밀도로 세포 및 조직의 3D 구조를 시각화하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다. 망막 내에서 다양한 유형의 뉴런이 내부 및 외부 망상층에서 시냅스 연결을 설정합니다. 기존의 EM 기술은 망막 세포 내 소기관에 대한 귀중한 통찰력을 제공했지만, 정확한 측정을 방해할 수 있는 2D 이미지 데이터를 제공하는 데 한계가 있습니다. 예를 들어, 시냅스 전달에 중요한 3개의 뚜렷한 시냅스 소포 풀의 크기를 정량화하는 것은 2D에서 어려운 일입니다. Volume EM은 대규모의 고해상도 3D 데이터를 제공하여 솔루션을 제공합니다. 샘플 준비는 Volume EM에서 중요한 단계이며 이미지 선명도와 대비에 큰 영향을 미친다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 이러한 맥락에서 우리는 망막의 광수용체 축삭 말단의 3D 재구성을 위한 시료 준비 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에는 세 가지 주요 단계, 즉 망막 박리 및 고정, 시료 삽입 과정, 관심 영역 선택이 포함됩니다.

서론

망막은 얽히고설킨 뉴런 축삭돌기와 수상돌기로 빽빽하게 채워져 있으며, 수상돌기는 이들 사이에 시냅스를 형성합니다1. 현미경 검사는 미세하고 복잡하며 작은 구조를 가지고 있기 때문에 망막 해부학을 연구하는 데 없어서는 안될 도구입니다. 전자 현미경(EM)은 세포 내 소기관의 미세 구조와 나노미터 레벨2에서 특정 단백질의 정확한 국소화를 조사할 수 있는 탁월한 성능을 제공하지만, 2차원(2D) 평면으로 제한된 이미지를 생성하므로 주요 정보가 손실될 수 있습니다.

새로운 고분해능 부피 전자 현미경(Volume EM) 기술의 개발은 보다 포괄적이고 더 큰 규모의 3차원(3D) 구조 정보를 제공하는 데 도움이 됩니다. 일부 3D EM 방법은 최근에 다른 사람들에 의해 검토되었습니다 3,4,5. 3D EM을 사용하면 신경 세포 모양 및 연결성 세부 사항을 재구성할 수 있으므로 관심 구조를 정밀하게 정량적으로 분석할 수 있습니다. 이는 볼륨 EM에 의해 얻어진 데이터가 더 체계적이고 완전하며 정확하다는 것을 보여줍니다.

시각 신호 6,7에서 초기 뉴런을 구성하는 망막 광 수용체는 광 수용체의 말단에서 2 차 양극성 및 수평 세포의 수상돌기와 시냅스를 형성하여 흥분 신호 8,9를 촉진합니다. 원뿔 척추경(cone pedicles)과 간상구형(rod spherules)이라고 하는 이 말단은 미토콘드리아(mitochondria), 시냅스 리본(synaptic ribbons), 시냅스 소포(synaptic vesicles)의 세 가지 중요한 구성 요소를 포함합니다. 이전의 연구는 주로 리본 시냅스의 일반적인 구조에 집중되어 있었지만, 미토콘드리아, 리본, 소포 풀을 포함한 주요 구성 요소의 미세 구조와 말단 10,11,12,13의 공간 조직에 대한 연구는 현저히 부족했습니다. 각 구성 요소에 대한 정확하고 체계적인 분석과 함께 광수용체 단자 내의 상호 연관성에 대한 이해는 공간 구성을 밝히고 시각 처리 기능을 종합적으로 파악하는 데 필수적입니다. 광수용체에서 미토콘드리아는 주로 내부 분절, 세포체 및 말단에 존재합니다. 우리는 여기서 말단 광수용체의 미토콘드리아에 초점을 맞췄습니다. 고해상도(x, y, z 해상도 < 5nm)와 상대적으로 큰 부피 플럭스 4,14를 자랑하는 부피 EM의 한 유형인 집속 이온 빔 주사 전자 현미경(FIB-SEM)은 광수용체 단자의 3D 구조를 정확하게 시각화하기 위한 강력한 도구입니다.

FIB-SEM과 SBF-SEM(Serial Block Face Scanning Electron Microscope)은 모두 시료 표면을 스캔하여 조직 이미지를 얻기 위한 SEM을 기반으로 하는 Volume EM입니다. 표본 표면의 초구조적 특징은 전자빔이 샘플을 스캔할 때 2차 또는 후방 산란 전자(BSE)의 강도에 의해 생성되는 대비를 통해 드러납니다(15). 본질적으로, SEM에서 수지 포매 조직 샘플의 단면 표면에서 BSE 또는 2차 전자를 검출하면 임베디드 샘플16,17의 이미지를 얻을 수 있습니다. BSE 또는 2차 전자의 생성량이 적으면 시료 표면에 대한 정보만 얻을 수 있습니다. 일관된 대비와 고품질 연속 이미지를 얻으려면 시료에 중금속이 충분히 증착되어야 합니다. 따라서 특정 시료 전처리 프로토콜은 연속 이미징에 SEM을 활용할 때 후속 분할, 3D 재구성 및 분석에 매우 중요합니다. 오스뮴-티오카르보하이드라지드-오스뮴(OTO) 분석법은 생물학적 시료의 3D 전자 현미경을 위한 일반적인 시료 전처리 방식으로, 지질 함유 막의 구조를 보존하고 우수한 대비를 유지합니다18,19.

여기에서 우리는 Volume EM을 사용하기 위한 망막 샘플 준비를 위한 OTO 방법을 개발했습니다. 이 프로세스는 특히 망막을 절제하고, 망막 조직에 대한 최적의 고정 시간을 결정하고, 3D 샘플 준비의 특정 절차 및 주의 사항을 자세히 설명하는 데 중점을 둡니다. 또한 대상 구조의 세분화 및 3D 재구성은 이 확장된 응용 분야에서 필수적인 단계입니다. 망막은 작고 물질을 얻기 어려운 구조이기 때문에 EM을 위해 신속하고 정확한 작동이 필요하며, 정해진 시간과 즉시 사용할 수 있도록 새로운 시약을 준비해야 합니다.

프로토콜

동물 관리 및 사용 프로토콜은 Wenzhou Medical University의 윤리 위원회의 승인을 받았으며 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology)에서 제정한 지침을 따랐습니다. 모든 마우스는 12시간 밝은 주기와 12시간 어두운 주기로 유지되었으며 표준 차우 식단을 제공받았습니다.

1. 망막 박리 및 고정

  1. 마우스(C57BL/6J, 수컷, 8주령, 20-25g)를 복강내로 2,2,2-트리브로모에탄올(체중 0.25mg/g)을 주입하여 마취합니다. 발가락을 꼬집은 후 뒷발을 후퇴시키지 않거나 깜박이는 반사가 없는 것으로 마취 깊이를 확인합니다. 그런 다음 마취 상태에서 경추를 탈구하여 동물을 안락사시킵니다.
    참고: 트리브로모에탄올은 특히 단기 시술의 경우 소동물 모델에서 빠르고 신뢰할 수 있는 마취를 유도하는 데 있어 잘 문서화된 효능 때문에 선택되었습니다. 제약 등급의 마취제가 선호되지만 트리브로모에탄올은 특정 프로토콜에서 특정 이점을 제공하므로 적절하게 준비하고 투여할 때 적합한 대안이 됩니다. 안전하고 효과적인 사용을 보장하기 위해 모든 예방 조치를 취했습니다. 이 연구는 사용과 관련된 잠재적 위험을 완화하기 위해 적절한 준비, 관리 및 모니터링을 보장함으로써 윤리적 고려 사항을 준수합니다.
  2. 구부러진 가위로 눈을 제거하고 인산염 완충액(PB, 0.1M, pH 7.4)에 2% 글루타르알데히드와 2% 파라포름알데히드가 포함된 혼합 용액에 눈을 담그십시오.
  3. 해부 현미경 아래에서 겸자를 사용하여 눈의 전방 분절과 유리체를 제거합니다.
  4. 망막이 아이컵에서 완전히 분리될 때까지 두 개의 집게로 공막을 벗겨냅니다.
  5. 면도칼로 망막을 100 - 200 μm 두께의 스트립으로 빠르게 자르고 파스퇴르 피펫으로 망막 스트립을 인산염 완충액(PB, 0.1 M, pH 7.4)에 2% 글루타르알데히드와 2% 파라포름알데히드를 함유한 새로운 마이크로 원심분리기(EP) 튜브에 넣고 로테이터의 실온(RT)에서 2시간 동안 처리합니다. 완료 후 튜브를 4 ° C에서 24 시간 동안 고정하도록 배치하십시오.

2. 샘플 임베딩 공정

  1. 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.4)에서 각각 15 분 동안 5 회 세척 한 후, 0.1 M sodium cacodylate에 1.5 % 페로 시아나이드 칼륨과 1 % OsO4 (PB, pH7.4)를 함유 한 용액으로 4 mM CaCl2 와 함께 얼음 위의 어두운 곳에서 1.5 시간 동안 배양합니다.
    참고: 어두운 배양과 인산염 부족은 샘플의 침전과 아티팩트를 방지할 수 있습니다.
  2. 망막 스트립을 ddH2O에서 각각 10 분 동안 3 번 세척 한 다음 ddh2O의 1 % thiocarbohydrazide로 RT의 어두운 곳에서 30 분 동안 처리합니다.
  3. ddH2O에서 각각 15분 동안 3회 헹군 후 RT의 어두운 곳에서 45분 동안 2% OsO4(PB, PH 7.4)로 망막 스트립을 배양합니다.
  4. ddH2O에서 각각 15분 동안 3회 세척한 후 레티나 스트립을 1% 수성 우라닐 아세테이트에 4°C의 어두운 곳에서 밤새 담그십시오.
  5. 다음 날, ddH2O에서 각각 15분 동안 3회 세척한 후 레티나 스트립을 L-아스파르트산(0.03M, pH 5.5)에 0.66% 질산납으로 65°C에서 40분 동안 처리합니다.
  6. ddH2O에서 각각 15분 동안 3회 세척한 후 각 용액에서 30분, 50%, 70%, 90% 및 100%의 오름차순 에탄올 농도로 망막 스트립을 20분 동안 탈수합니다.
  7. 레티나 스트립을 동일한 에탄올과 아세톤을 함유한 혼합 용액으로 20분 동안 처리한 다음 아세톤을 각각 20분씩 2회 세척합니다.
  8. RT에서 밤새 어두운 곳에서 7:3의 비율로 아세톤/레진을 혼합한 아세톤/레진을 레티나 스트립에 침투시킨 다음 RT에서 24시간 동안 어두운 곳에서 3:7로 아세톤/레진을 침투시킵니다.
    참고: 수지의 정확한 조성은 Epon812 10.06mL, DDSA 4mL, MNA 5.94mL 및 DMP-30 0.2mL입니다.
  9. 다음날 튜브를 교체하고 45 °C에서 24 시간 동안 순수한 수지로 망막 스트립에 침투시킵니다. 다음날 레진을 다시 교체하고 60°C에서 48시간 동안 레티나 스트립을 삽입합니다.
    알림: 온도를 높이는 목적은 침투를 향상시키는 것입니다.

3. 관심 영역 선택

  1. 레진 블록을 1μm 두께의 절편으로 자르고, 1% 톨루이딘 블루로 절편을 염색하고, 광학 현미경으로 망막의 일반적인 구조를 관찰하여 대략적인 관심 영역을 선택합니다.
  2. 스퍼터 코팅기를 사용하여 수지 블록을 백금으로 코팅한 다음 0.23nA의 전류와 30kV의 가속 전압에서 집속 이온 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 70nm 두께의 단면으로 밀링합니다.
  3. 정확한 관심 영역을 식별하기 위해 2000x 배율의 FIB-SEM을 사용하여 섹션을 사전 스크리닝합니다.
  4. 빔 전류가 0.69nA이고 가속 전압이 2kV인 FIB-SEM을 사용하여 데이터를 수집합니다. 다른 매개변수는 체류 시간 = 2μs, 복셀 크기 = 1.8nm x 1.8nm x 15nm입니다.

결과

그림 1A 는 전통적인 화학적 이중 고정 방법을 사용하여 제조된 망막 광수용체 말단의 이미지를 보여주고, 그림 1B 는 OTO 방법을 사용하여 제조된 망막 광수용체 말단의 이미지를 보여줍니다. 둘 다 FIB-SEM에 의해 샘플링되었습니다. OTO 방법을 사용하면 세포막 구조를 최대한 유지할 수 있음을 명확하게 알 수 있으며, 소포의 윤곽까지 명확하게 볼 수 있습니다. 또한 OTO 방법을 사용하여 얻은 이미지의 대비도 더 선명합니다.

그림 2 는 광수용체 말단의 초구조적 특성을 재구성하는 데 사용되는 실험적 워크플로우를 보여줍니다. 재구성은 M-원뿔 척추경, S-원뿔 척추경, rod1 spherules 및 rod2 spherules를 포함한 4가지 유형의 광수용체 말단에 초점을 맞췄습니다. 주요 강조점은 미토콘드리아, 시냅스 리본, 광수용체 말단 내의 시냅스 소포 풀과 같은 필수 구성 요소에 있었습니다.

그림 3 은 간상체 광수용체 말단에서 재구성된 미토콘드리아와 시냅스 리본을 보여줍니다. 특히, rod2 spherules의 시냅스 리본은 독특한 말굽 모양을 나타내며 일반적으로 spherule 당 단일 리본을 특징으로합니다. 더욱이, 그림 2 는 막대 구형에 있는 두 개의 미토콘드리아가 시냅스 리본 위에 위치한 말단의 중앙 공간 내에서 일관된 위치를 가지고 있음을 강조합니다. 모든 구조는 한 페이지씩 수동으로 추적되었습니다.

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그림 1: 전통적인 화학적 이중 고정 방법 및 OTO 방법에 대해 FIB-SEM을 사용하여 샘플링한 이미지의 예. (A) 전통적인 화학적 이중 고정 방법. (B) OTO 방법. 스케일 바: 1000nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: FIB-SEM을 사용하는 광수용체 말단의 3D 재구성 워크플로우. 3D 데이터 시각화 소프트웨어를 사용한 정렬에 따라 연속 이미지를 수동으로 분할하고 추가 분석을 위해 렌더링했습니다. (A) 원본 시리얼 이미지. (B) 정렬된 이미지. (C) 분할된 이미지. (D) 재구성된 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 3D 재구성. 대표적인 3D 재구성 이미지는 광수용체 말단을 흰색, 미토콘드리아를 주황색, 시냅스 리본을 파란색으로 묘사합니다. 스케일 바: 500 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

망막 조직에서 광수용체의 말단 구조를 분석하기 위해 OTO의 Volume EM 샘플 준비 프로토콜을 구현했습니다. 초점은 망막의 박리 및 고정부터 광수용체 축삭 말단의 3D 재구성 결과를 보여주는 것까지 전체 절차를 자세히 설명하는 것이었습니다.

망막 조직의 특징은 뇌 조직과 달리 지역적 차이가 없다는 데 있습니다. 3개의 층으로 이루어진 뉴런 세포체와 2층의 시냅스 연결로 구성된 망막은 뉴런 및 시냅스 구성 요소의 복잡성에도 불구하고 규칙적이고 계층적인 구조를 나타낸다(20). 망막을 절개할 때는 후속 시료 전처리 단계에서 균일한 대비를 보장하기 위해 얇은 스트립을 최소화하는 것이 필수적입니다. 중요한 관심 구조인 광수용체 축삭 말단은 망막의 바깥쪽 망상층(OPL)에 위치합니다. 망막의 계층적이고 조직화된 특성으로 인해 표적 구조의 효율적인 국소화가 가능하여 EM 중 정확한 샘플링을 용이하게 하고 후속 3D 재구성 결과의 정확성을 보장할 수 있습니다.

Volume EM은 나노 스케일에서 망막 내의 국소 신경 회로 및 시냅스 연결의 3차원 시각화를 용이하게 하며, 직렬 섹션21,22를 활용합니다. 이 기술을 사용하면 고해상도 3D 이미지를 자동으로 생성할 수 있으며 FIB-SEM은 생리학적 및 병리학적 활동의 복잡한 세부 사항을 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 따라서 전체 블록에서 안정적인 이미지 대비를 유지하는 것은 시료 전처리 과정에서 매우 중요합니다. 균일한 전도성을 달성하기 위해 당사는 주사 전자 현미경(SEM)18,23,24에서 콘트라스트를 향상시키는 효과로 널리 알려진 고전적인 접근 방식인 사전 임베딩 OTO 방법을 사용합니다. 이 방법은 티오카르보히드라지드(thiocarbohydrazide)와 결합된 이중 오스뮴 코팅을 포함하여 대형 시료에 대한 최적의 벌크 전도성을 보장합니다. 또한 이중 오스뮴 처리는 지질 막 구조의 우수한 보존에 기여하여 조사에 정밀도를 더합니다. 망막 샘플은 계층적이고, 조직 블록은 작고 침투하기 쉬우며, OTO 방법은 더 나은 세포막 윤곽과 균일한 이미지 대비를 유지할 수 있습니다.

이 프로토콜의 성공에 기여하는 몇 가지 중요한 요소가 있습니다. 첫째, 신속한 망막 채취와 정확한 고정 시간은 최적의 세포하 구조를 유지하는 데 가장 중요합니다. 둘째, 오스뮴과 티오카르보히드라지드의 적절한 농도를 보장하는 것은 시리즈 이미지의 막 구조에서 대비를 유지하는 데 필수적입니다. 특히 오스뮴은 지질 분자와 결합하여 BSE 신호를 향상시키는 데 중요한 역할을 합니다.

당사의 망막 시료 전처리 프로토콜은 사용자 친화적이고 추가 장비가 필요하지 않으며 처리 시간을 최소화합니다. 이러한 특성은 다른 Volume EM 기법에 대한 잠재적 적용 가능성을 강조하며, 다양한 실험 설정에서 다양성과 채택 용이성을 시사합니다. OTO의 방법은 FIB-SEM 이미지의 대비를 현저하게 향상시킵니다. 그러나 세포막에 대한 세부 사항, 특히 이중층 구조는 여전히 다소 흐릿하게 보일 수 있습니다. 당사의 현재 시료 전처리 체계는 세포 구조의 작은 세부 사항을 어느 정도 희생하는 것을 포함합니다. 향후 이러한 제한 사항을 해결하고 개선하기 위해 최적화된 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다.

공개 사항

저자는 공개하지 않습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가핵심연구개발프로그램(National Key Research and Development Program of China, 2022YFA1105503), 국가핵심신경과학연구소(State Key Laboratory of Neuroscience, SKLN-202103), 중국저장자연과학재단(Zhejiang Natural Science Foundation of China, Y21H120019)의 보조금으로 일부 지원되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402
아세톤전자 현미경 과학10000
Amira 6.8Thermo Fisher Scientific
CaCl2SigmaC-2661
임베딩 몰Beijing Zhongjingkeyi TechnologyGP10590
Epon 수지전자 현미경 과학14900
에탄올시그마64-17-5
글루타르알데히드전자 현미경 과학16020
Helios NanoLab 600i 듀얼 빔 SEMFEI
L-아스파르트산시그마56-84-8
질산납시그마10099-74-8
Na2HPO4.12H2O시그마71650인산염 완충액
NaH2PO4의 구성 요소. H2OSigma71507인산염 완충액의 구성 요소
OsO4TED PELLA4008-160501
파라포름알데히드전자 현미경 과학157-8
페로시아나이드 칼륨시그마14459-95-1
카코딜레이트 나트륨시그마6131-99-3
스퍼터 코터LeicaACE200
ThiocarbohydrazideSigma2231-57-4
Uranyl acetateTED PELLACA96049
드

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