Lung-on-chip 모델은 공기-액체 계면과 내피 세포 관류를 모방하여 폐 생리학 연구에 중요한 혈류 및 영양소 교환을 시뮬레이션함으로써 기존 2D 배양을 능가합니다. 이는 폐 연구의 관련성을 높여 호흡기 감염에 대한 이해와 치료를 촉진할 수 있는 역동적이고 생리학적으로 정확한 환경을 제공합니다.
이 논문에서
요약
초록
우리는 인간의 폐포 구조와 기능을 복제하도록 설계된 고급 면역 역량 있는 폐-온-칩 모델을 소개합니다. 이 혁신적인 모델은 인간 허파꽈리의 환경을 모방한 공기-액체 인터페이스를 지원하는 미세유체 관류 바이오칩을 사용합니다. 조직 공학은 내피 세포, 대식세포 및 상피 세포를 포함한 주요 세포 구성 요소를 통합하여 폐포의 대표 조직 모델을 만드는 데 사용됩니다. 이 모델은 바이러스, 박테리아 및 곰팡이를 포함한 다양한 병원체에 대한 점막 면역 반응에 대한 심층적인 검사를 용이하게 하여 폐 면역에 대한 이해를 증진합니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 이 폐포-온-칩 모델을 감염 연구를 위한 강력한 체외 플랫폼으로 확립하기 위한 세부 정보를 제공하여 연구원이 폐 환경 내에서 병원체와 숙주의 면역 체계 간의 복잡한 상호 작용을 면밀히 관찰하고 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 혈류 및 내피 세포의 생체 역학적 자극을 포함한 인간 폐포의 주요 생리학적 상태를 시뮬레이션하기 위한 미세유체 기반 기술의 적용을 통해 달성되며, 상피 세포가 공기에 사실적으로 노출되는 데 중요한 공기-액체 인터페이스를 유지함으로써 달성됩니다. 이 모델 시스템은 면역형광 염색, 사이토카인 프로파일링, 콜로니 형성 단위(CFU)/플라크 분석과 같은 다양한 표준화된 분석법과 호환되므로 감염 중 면역 역학에 대한 포괄적인 통찰력을 얻을 수 있습니다. 폐포-온-칩은 다공성 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 막으로 분리된 인간 원위 폐 상피 세포(H441) 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 포함한 필수 세포 유형으로 구성되며, 상피층과 내피층 사이에 1차 단핵구 유래 대식세포가 전략적으로 배치되어 있습니다. 조직 모델은 체외에서 폐 면역 반응과 관련된 미묘한 요인을 해부하고 분석하는 능력을 향상시킵니다. 가치 있는 도구로서 폐 연구의 발전에 기여해야 하며, 호흡기 감염의 발병 기전을 연구하고 잠재적인 치료 개입을 테스트하기 위한 보다 정확하고 역동적인 체외 모델을 제공해야 합니다.
서론
인간의 폐는 폐포 점막의 면역 반응 사이의 복잡한 상호 작용과 함께 호흡과 면역 방어에 놀라운 역할을 합니다1. 효율적인 면역 반응을 생성하는 폐포의 능력은 폐 감염을 예방하고 폐 건강을 확보하는 데 매우 중요합니다. 폐는 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 알레르기 및 미립자 물질을 포함한 광범위한 잠재적 위험에 지속적으로 노출되어 있기 때문에 폐포 점막 면역 반응의 복잡성을 이해하는 것은 호흡기 감염, 염증성 질환의 메커니즘을 발견하고 폐 질환을 치료하는 데 매우 중요합니다1.
in vitro에서 호흡기의 감염 및 염증 관련 과정을 연구하려면 폐포 환경과 면역 반응을 충실하게 모방할 수 있는 모델이 필요합니다. 2D 세포 배양 및 동물 모듈은 폐 면역 반응에 대한 생물의학 연구를 위한 필수 도구로 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 그러나 그들은 종종 인간 상황에 대한 번역 잠재력에 한계가 있습니다. Lung-on-chip 모델은 기존의 in vitro 모델과 in vivo 모델 간의 격차를 메우는 데 기여할 수 있으며 인간 특이적 면역 반응을 연구하는 새로운 접근 방식을 제공할 수 있습니다 2,3. Lung-on-chip 모델은 폐 세포가 호흡기의 생리학적 상태를 재현하고 보다 정확하고 견고한 조직 모델을 개발하는 데 필요한 공기-액체 인터페이스를 모방할 수 있습니다. 이 배양 기법을 사용하면 in vitro2에서 세포 분화, 기능 및 약물 또는 질병 관련 자극에 대한 반응을 정밀하게 검사할 수 있습니다.
이 연구에서는 내피 세포의 혈류 및 생체 역학적 자극을 모방하기 위해 관류를 적용하고 공기 위상에 노출된 상피 세포와 공기-액체 인터페이스를 통합함으로써 인간 폐포 환경을 요약하는 효과적인 도구로 인간 폐포의 미세유체 기반 모델을 제시합니다4. 우리는 특히 공기-액체 계면에 중점을 두고 인간 폐포의 물리적 구조와 생물학적 상호 작용을 모방하는 미세유체 관류 폐포 온 칩을 개발했습니다. 이 인터페이스는 호흡기 상피 세포의 분화에 중요한 역할을 하며, 이는 폐 환경을 정확하게 모델링하는 데 필수적입니다. 이 모델은 인간 원위 폐 상피 세포(H441)와 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사용하며, 다공성 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 막으로 분리되어 있으며 세포층 사이에 1차 단핵구 유래 대식세포가 있습니다. 이 설정은 폐포의 복잡한 세포 배열을 복제하며 폐 조직의 생리적 기능에서 중요한 요소인 공기-액체 계면을 정확하게 시뮬레이션하는 데 중요합니다.
모델 개발의 근거는 순환 면역 세포와 조직 상주 면역 세포를 모두 통합하는 것으로 확장됩니다. 이 접근법은 인간 호흡기 감염에 대한 염증성 숙주 반응을 정확하게 모방하도록 설계되어 병원체-숙주 상호 작용을 연구할 수 있는 동적 환경을 제공합니다. 대식세포의 존재는 즉각적인 면역 반응과 병원체와의 상호 작용을 검사할 수 있게 하며, 이는 호흡기 감염에 대한 첫 번째 방어선을 반영합니다. 또한, 바이오칩 플랫폼의 설계는 생체물리학적 및 생화학적 단서를 편리하고 정밀하게 조작할 수 있도록 하며, 이는 체외에서 폐포 기능을 복제하는 데 매우 중요합니다. 이러한 유연성은 인간 감염에 기여하는 요인을 분석하는 데 중요한 역할을 하며, 연구자가 다양한 질병 상태를 반영하도록 조건을 조정하거나 잠재적인 치료 개입을 테스트할 수 있도록 합니다. 고급 현미경 검사, 미생물 분석 및 생화학 폐수 분석을 포함한 여러 판독 기술과 플랫폼의 호환성은 유용성을 향상시킵니다. 이러한 기능을 통해 세포 행동, 병원체 증식 및 면역 반응의 효과 평가를 포함하여 감염에 대한 조직 반응을 포괄적으로 평가할 수 있습니다.
우리는 공기-액체 인터페이스를 복제하고 면역 세포를 통합하여 체외에서 인간 감염을 연구하는 데 중점을 둔 인간 폐포-온칩 모델을 만들고 활용하기 위한 자세한 프로토콜과 기술을 제시합니다.
프로토콜
HUVEC 세포는 탯줄에서 분리되어 4번 통로까지 사용됩니다. 일차 단핵구는 전혈에서 건강한 기증자로부터 분리됩니다. 이 연구는 독일 예나에 있는 예나 대학병원의 윤리 위원회(3939-12/13)의 승인을 받았다. 헬싱키 선언에 따르면, 연구를 위해 세포를 기증한 모든 개인은 정보에 입각한 동의를 했습니다.
1. 1일차: 바이오칩 준비
- 바이오칩은 다양한 크기와 모델로 제공됩니다. 여기서 실험하려면 BC002 모델을 사용합니다. 바이오칩을 유리 페트리 접시에 넣고 접시를 채우고 모든 구멍을 멸균 70% 에탄올(EthOH)로 씻어냅니다. 실온에서 45분 동안 배양합니다. 그 후, 멸균 ddH2O로 충치를 2배 세척하고 ddH2O를 제거합니다.
- 파란색 팁이 있는 1,000μL 피펫을 사용하여 콜라겐 IV 용액을 양쪽 캐비티를 통해 콜라겐 IV 용액을 부드럽게 세척하여 멸균 콜라겐 IV 용액(0.5mM 아세트산에서 0.5mg/mL, 마그네슘 및 칼슘 PBS(+/+)이 함유된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수에 1:100 농도 사용)로 양쪽 캐비티의 바이오칩 멤브레인을 코팅합니다. 37 °C 및 5 % CO2에서 15 분 동안 배양합니다.
참고: 전체 프로토콜에서 파란색 필터(P1000) 팁이 있는 1,000μL 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 필터 팁 개구부의 직경은 채널을 연결하는 포트의 개구부를 완전히 덮고 있어 칩에 기포가 삽입되는 것을 방지합니다. - 30분 배양 후 멸균 PBS(+/+)로 하부 및 상부 챔버를 2배 세척하여 남은 콜라겐과 아세트산을 씻어냅니다.
- 1:100(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(10,000U/mL)을 첨가하여 EC 배지를 준비합니다. 각 캐비티의 상부 챔버를 250μL의 EC 매체로 채우고 하부 챔버를 150μL의 EC 매체로 채웁니다.
- 합류 T25 플라스크에서 HUVEC 수확: 마그네슘 및 칼슘 PBS(-/-)가 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 5mL로 세척하고 PBS(-/-)에 0.25% 트립신 + 1mM EDTA 1mL를 추가하고 37°C에서 3분 동안 배양합니다. 5mL의 PBS(+/+) + 5% FCS를 추가하고 50mL 원뿔형 튜브에 실온(RT)에서 5분 동안 350 x g 에서 원심분리하여 트립신 활성을 중지합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 EC 배지에 재현탁시킵니다.
- 세포 계수를 수행할 때 1:10 연속 희석을 사용합니다. 재현탁 세포 펠릿 10μL를 90μL의 세포 배지에 추가합니다. 샘플을 조심스럽게 결합하십시오. 10μL의 트리판 블루 염색이 있는 미세 원심분리기 튜브를 사용합니다. 세포 계수 챔버 슬라이드를 사용하여 세포 용액을 트리판 블루(1:1)로 희석합니다. Neubauer Chamber 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 수동으로 세포를 계수합니다. 세포 수를 측정하고 농도를 200 μL당 0.4 x 106 세포로 조정합니다.
- 바이오칩의 상부 챔버에 있는 내피 세포 배지를 부유 HUVEC가 포함된 200μL의 EC 배지로 교체합니다. 채널 또는 챔버에 기포가 형성되지 않도록 부드럽게 피펫팅합니다. 바이오칩이 있는 유리 페트리 접시를 37°C 및 5% CO2에 놓습니다.
2. 2일차: 세포층 확인
- 2일차에는 상부 챔버에서 HUVEC 세포층의 밀도를 육안으로 확인합니다. 상부 챔버에서 300μL의 EC 배지로 매체 교환을 수행합니다. 세포막에서 세포가 분리되지 않도록 부드럽게 피펫팅합니다. 24시간 후에 매일 미디어 교환을 수행합니다. 바이오칩이 있는 유리 페트리 접시를 37°C와 5% CO2로 다시 놓습니다.
3. 3일차: 하부 챔버 준비
- 내피 세포층의 밀도를 육안으로 확인합니다. 이 시점에서 합류층과 조약돌과 같은 형태의 존재를 결정합니다(그림 1). 상부 챔버에서 300μL의 EC 배지로 매체 교환을 수행합니다.
- 다음으로, 상피층을 형성하는 세포를 파종하기 위한 하부 챔버를 준비합니다. RPMI 배지 150μL로 하부 챔버를 부드럽게 세척합니다(1:100(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(10,000U/mL), 5% 태아 소 혈청, 1μM 덱사메타손 추가).
- 하부 챔버의 경우 캐비티당 200μL의 RPMI 배지(RPMI)에 현탁된 0.5 x 106 H441 세포를 시드합니다.
- H441 세포 채취
- 5mL의 PBS(-/-)로 세포를 한 번 세척합니다. PBS(-/-)에 0.25% 트립신 + 1mM EDTA 2mL를 추가합니다.
- 37 ° C 및 5 % CO 2에서 5 분 동안 세포를 배양합니다. 배양 시간은 층의 밀도에 따라 다릅니다. 5-7분 이내에 세포가 완전히 분리되어야 합니다.
- 10mL의 PBS(+/+) + 5% FBS로 트립신 활성을 중지하고 세포를 수집한 다음 200 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다.
- 원심분리 후 상층액을 버리고 펠릿을 RPMI 1mL에 재현탁시킨 다음 계산합니다.
- 챔버당 0.5 x 106 개의 세포를 파종하여 세포 용액을 하단 챔버에 부드럽게 피펫팅합니다. 모든 포트를 닫고 바이오칩을 거꾸로 뒤집어 세포가 PET 멤브레인에 부착할 수 있도록 합니다. 바이오칩을 거꾸로 보관하고 37°C 및 5%CO2의 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
4. 4일차 - 7일차: 세포 유지 및 단핵구 채취
- 상부 및 하부 챔버에서 매일 매체 교환을 수행합니다. 상부 챔버의 경우 300μL의 EC 매체로 매체 교환을 수행합니다.
- 하부 챔버에는 200μL의 RPMI+(RPMI 배지에 1:100(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(10,000U/mL), 10ng/mL GM-CSF, 10% 자가 인간 혈청, 1μM 덱사메타손)를 사용합니다. 7일째에 하부 챔버를 RPMI+로 세척하여 단핵구를 파종하기 위한 캐비티를 준비합니다.
- 종자 0.1 x 10 하부 챔버의 200 μL RPMI+에 현탁된6 개의 단핵구.
- 단핵구 채취
- 1mL의 PBS(-/-)로 세포를 세척하고 37°C에서 4mg/mL 리도카인 + 5mM EDTA를 함유하고 37°C 및 5%CO2를 포함하는 예열된 PBS(-/-)에서 7분 동안 배양합니다.
- 세포를 수집하고 350 x g 에서 7분 동안 원심분리하고 세포를 RPMI+ 1mL에 재현탁시키고 계수합니다. 세포가 멤브레인에 부착되도록 바이오칩 포트를 아래쪽으로 배치합니다.
5. 8일차: 바이오칩 관류
- 이 시점에서 바이오칩이 흐름에 연결되고 관류될 준비가 되었는지 확인합니다. 관류를 시작하기 전에 빈 인큐베이터를 준비하고 연동 펌프를 내부에 놓습니다.
- 바이오칩의 관류
- 멸균된 튜브를 바이오칩에 부착하기 전에 200μL의 PBS(+/+)로 튜브를 세척한 다음 200μL의 EC 매체로 세척합니다. 튜빙의 내경은 0.5mm이며 더 긴(20cm) 및 짧은(12cm) 면으로 두 개의 연동 펌프 스토퍼로 나뉩니다. 튜브를 옆으로 치워두고 매체를 위한 저장소를 준비합니다.
- 상부 및 하부 챔버에서 신선하게 준비된 각각의 세포 배양 배지로 세척하여 배지 교환을 수행합니다.
- 바이오칩의 출구 쪽에 저장소를 삽입하고 튜브가 있는 저장소를 바이오칩의 입구에 연결합니다(그림 2). 튜브를 저장소와 바이오칩에 연결하여 저장소와 바이오칩 사이에 원형 매체 관류가 있도록 합니다.
- 모든 것이 포트에 연결되면 저장소에 500μL의 EC 매체를 채웁니다. 유속이 21μL/min인 관류의 튜브에 바이오칩을 연결합니다(그림 2). 기포 삽입을 위한 관류의 처음 15분 동안 면밀히 관찰하십시오. 두 챔버에서 매일 매체 교환을 수행합니다.
6. 9일차 - 11일차: 공기-액체 인터페이스 구축
- 관류를 중지하고 저장소를 비운 다음 멸균 안전 캐비닛 아래에 새로 준비된 배지를 다시 채웁니다. 500 μL의 EC 매체를 리저버에 피펫팅하고 200 μL의 RPMI+로 하부 챔버를 부드럽게 플러시합니다. 21μL/min의 관류 속도로 관류를 다시 시작합니다.
- 에어 리퀴드 인터페이스(ALI)
- 12일째부터 실험이 끝날 때까지(14일째) ALI를 설정합니다. ALI 배양 중에는 상피 세포를 공기에 노출시킵니다.
- ALI 배양을 확립하려면 칩의 모든 세포 유형을 유지하기 위해 새로운 혈관 배지 EC(1:100(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(10,000U/mL), 10ng/ml GM-CSF, 20% 자가 인간 혈청, 1μM 덱사메타손 추가)을 준비합니다. 이 시점에서 매체에는 더 높은 농도의 AS(20%)가 포함되어 있습니다.
- 멸균 안전 캐비닛 아래의 하부 챔버에 있는 플러그를 열고 그림 3과 같이 기포가 보일 때까지 매체를 조심스럽게 흡수합니다. 채널과 챔버에서 전체 액체가 제거되었는지 확인하고 포트를 조심스럽게 닫습니다.
- 저장소에 EC(-/-) 배지를 채우고 21μL/min의 유속으로 관류 배양을 계속합니다. 14일째까지 상부 챔버에서만 배지를 교환하고 하부 챔버의 상피 세포는 공기로만 유지합니다.
7. 14일차: 조직 채취 및 분석
- 흐름에서 바이오칩을 분리합니다. 튜브를 뽑고 현미경으로 세포 밀도를 확인합니다. 하부 챔버의 공기로 인해 세포층이 흐릿하게 보이고 시각화하기 어려울 수 있습니다. 이 시점에서 모델은 추가 실험을 수행할 준비가 되었습니다.
- 바이오칩의 조직 고정 및 염색
- PBS(+/+)로 캐비티를 세척하여 세포 배양 배지를 제거합니다. PBS(-/-)에 용해된 4% 파라포름알데히드(PFA) 300μL를 상부 챔버에 용해시키고 하부 챔버에 200μL를 피펫팅하고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
알림: PFA와 같은 고정 화학 물질로 작업할 때는 흄 후드를 사용하십시오. 그에 따라 폐기물을 수거하고 처리하십시오. - PBS(+/+)로 챔버를 3번 세척합니다. 부착 후에는 바이오칩을 4°C에서 보관하거나 세포의 면역형광 염색에 직접 사용하십시오.
- 투과화를 위해 PBS(+/+)에서 0.25% Triton X-100 300 μL를 피펫팅합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 배양 후 두 챔버 모두에서 PBS(+/+)의 PBS(+/+) 및 피펫 300μL의 3% 소 혈청 알부민(BSA)으로 세척합니다. RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- 그 동안 면역형광 염색을 위한 항체 패널을 준비합니다. 면역형광 염색을 위한 항체 패널을 준비하기 위해, 항체를 희석하기 위해 충분한 양의 3% BSA가 있는 튜브를 설정하였다. 각 멤브레인에 50μL의 항체 희석액을 사용합니다. 1차 항체 패널의 경우 1:100, 2차 항체 패널의 경우 1:200의 희석 비율을 사용합니다. 또한 2차 항체 패널의 경우 1:2,000의 희석 비율로 DAPI를 준비합니다. 해당 항체에 대해서는 (표 1)을 참조하십시오.
- 바이오칩 내의 세포에 직접 접근하려면 결합 호일을 제거해야 합니다. 미세유체 챔버를 열려면 캐비티 외부를 정확하게 절단하고 접착 호일을 제거합니다. 메스로 바이오칩에 밀봉된 가장자리를 제거하여 멤브레인을 잘라냅니다.
알림: 메스의 날카로움으로 인한 멤브레인 손상 및 부상을 방지하기 위해 이 단계에서 정확하고 정확하게 작업하십시오. - 바이오칩에서 멤브레인을 분리한 후 멤브레인을 두 조각으로 나눕니다. 핀셋으로 멤브레인 조각을 모아 염색을 위해 미세한 슬라이드에 놓습니다.
- 멤브레인 조각당 50μL의 항체 용액을 피펫합니다. 빛으로부터 보호된 4 °C에서 밤새 배양합니다.
- 배양 후 500개의 웰 플레이트에 멤브레인을 24μL의 PBS(-/-)에 넣고 멤브레인을 PBS(+/+)에서 각각 5분 동안 3번 세척합니다. 세척 후 50μL의 2차 항체 용액을 피펫팅하고 빛으로부터 보호된 상태에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- 멤브레인을 PBS(+/+)로 각각 3분 동안 5번 세척합니다. 한편, 실험을 위한 현미경 슬라이드를 준비하고 레이블을 지정합니다. 슬라이드에 장착 매체 한 방울을 놓고 해당 멤브레인을 놓습니다. 모든 멤브레인에 대해 이 단계를 반복합니다. 마지막에 멤브레인 상단에 장착 매체를 한 방울 더 떨어뜨리고 커버 유리를 사용합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- PBS(+/+)로 캐비티를 세척하여 세포 배양 배지를 제거합니다. PBS(-/-)에 용해된 4% 파라포름알데히드(PFA) 300μL를 상부 챔버에 용해시키고 하부 챔버에 200μL를 피펫팅하고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
결과
형태학적 변화와 마커 단백질의 발현에 대한 검사는 면역형광 염색을 사용하여 수행할 수 있습니다. 14일 동안 공동 배양 후, 혈관 및 상피 측을 분석하여 각 세포 마커의 발현을 확인합니다. 이 방법은 혈관 및 상피 구성 요소의 상호 작용 및 무결성을 연구하는 데 유용하며, 이는 감염과 관련된 기능적 생물학적 판독으로서 질병 모델링에 필수적입니다. 면역형광 염색은 정량화 분석, 형태학적 평가 및 사이토카인 방출, LDH 방출과 같은 세포 사멸 마커의 유출물 분석, 세포의 형태 측정 변화를 포함한 기능 분석을 통해 지원될 수 있습니다5. 혈관 측면에서는 VE-cadherin과 같은 내피 세포 접합 단백질의 무결성 및 형태를 연구하여 밀도 및 내피 장벽 형성을 평가할 수 있습니다6(그림 4A). 관류 후, 내피 세포층은 내피 세포 경계에서 VE-cadherin의 명확하게 구조화된 발현과 합류해야 합니다. 멤브레인의 바닥 부분은 E-cadherin 및 계면활성제 단백질 A(SP-A)7와 같은 상피 마커에 대해 면역염색할 수 있습니다. 폐 계면활성제의 핵심 구성 요소이자 지질과 단백질의 복잡한 혼합물인 SP-A의 발현은 상피 공기-액체 계면의 표면 장력을 감소시켜 호기 중 허파꽈리의 붕괴를 방지하고 적절한 폐 기능과 가스 교환을 유지합니다 6,8. 이 모델에서 상피 세포는 ALI 처리 후 SP-A를 발현하며 면역형광 염색으로 시각화할 수 있습니다(그림 4B). 상피 세포층의 밀도와 무결성은 폐포 상피 세포의 중요한 상피 접합 마커인 E-cadherin에 대한 면역형광 염색을 통해 확인할 수 있습니다(그림 4C). 대식세포의 존재는 대식세포 제조사 단백질 CD686에 대한 면역형광 염색을 통해 확인할 수 있습니다(그림 4C). 바이러스, 세균 또는 진균 감염을 연구하려면 Deinhardt-Emmer et al.6, Schicke et al.7 및 Hoang et al.9에서 제공하는 감염 모델에 대한 세부 정보를 찾으십시오.
그림 1: 3일째 바이오칩에 있는 합류 HUVECs 층의 대표 이미지. 이미지는 10x 배율의 명시야 현미경 검사를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: alveolus-on-chip 및 ALI 유도를 위한 설정. (A) alveolus-on-chip 모델에 대한 관류 설정의 대표 이미지 및 (B) 매체를 흡수하고 세포에 공기를 도입하여 챔버에서 ALI를 유도하는 대표 이미지. 챔버 내부에 기포가 형성된다는 것은 세포가 공기에 노출되어 있음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: alveolus-on-chip의 개략도. 14일간의 배양에 대한 자세한 프로토콜은 바이오칩 내에서 세포를 파종하고 성장시키기 위한 중요한 단계를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 내피 및 상피 세포층의 면역형광 염색. (A) 상피 측에서 (B) SP-A(빨간색) 및 (C) E-cadherin(주황색), SP-A(빨간색) 및 CD68(녹색) 발현을 발현하는 VE-cadherin(주황색), (B-C) H441 상피 세포를 발현하는 HUVEC 내피 세포. DAPI(파란색)는 DNA를 염색하고 세포핵을 나타냅니다. 눈금 막대는 50μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 충치 | 셀 |
| 상부 캐비티 | 내피 (0.4 x 10,6) |
| 하부 캐비티 | 상피 (0.5x106H441 + 1x105 단핵구) |
표 1: 바이오칩의 세포 파종에 대한 개요.
토론
폐포-온-칩(alveolus-on-chip) 모델은 인간 폐포의 다층 조직 모델을 나타내며, 폐 상피 세포, 내피 세포 및 대식세포를 포함한 하부 호흡기의 필수 세포 유형을 통합하며, 내피 내벽의 중간 관류와 함께 ALI에서 기관형 배열로 배양됩니다. 서로 다른 층의 세포는 폐 상피 세포의 칼슘 의존성 접착 분자인 E-cadherin과 같은 특정 세포 마커 단백질을 발현하며, 이는 세포 간 상피 장벽을 형성하는 데 핵심적입니다 5,10. E-cadherin은 물리적 장벽 요소를 형성하고 환경에서 유해한 병원체 및 물질에 대한 면역 반응을 제어합니다10,11. H441 상피세포는 계면활성제 단백질 A를 추가로 발현하는데, 이는 면역조절 및 항균 활성을 매개하여 감염에 대한 숙주 방어의 1차 방어선에서도 중요하다8. 폐포 모델에 면역 세포를 통합하면 세포 복잡성이 증가하여 염증 유발 요인에 대한 면역 반응을 더 잘 복제할 수 있습니다(예: 감염 중). 이러한 맥락에서 이 모델은 인플루엔자 바이러스 A와 인간 기회 감염 병원체인 황색포도상구균(S. aureus)의 동시 감염을 연구하는 데 사용되었습니다5. 이 연구에서 폐렴의 동시 감염 기전이 밝혀졌는데, 상피 세포의 바이러스 감염이 심각한 염증 반응을 일으켜 내피 세포에 상당한 손상을 일으켜 장벽 기능을 상실하게 되는 것입니다. 또 다른 연구에서는 황색포도상구균 감염이 폐의 중요한 면역 방어 구성 요소인 계면활성제 단백질-A(SP-A)의 세포외 수치를 감소시킨다는 것을 입증하기 위해 이 모델을 사용했는데, 이는 박테리아 프로테아제에 의한 것으로 보인다6. SP-A의 발현은 황색포도상구균 또는 인플루엔자 바이러스 A에 의해 직접적으로 영향을 받지는 않지만, 특히 대식세포의 존재 하에서 세균 감염에 대한 반응으로 고도로 생성되는 사이토카인인 TNF-α에 의해 현저히 하향 조절됩니다. 이러한 결과는 세균성 단일감염 및 중복감염이 폐의 SP-A 수치를 낮춰 세균성 폐렴의 결과를 악화시킬 수 있음을 시사한다6. 또한, 폐포 모델은 면역형광 염색 및 사이토카인 프로파일링을 포함한 분자 생물학적 분석과 함께 고해상도 현미경 및 알고리즘 기반 이미지 분석을 활용하여 Aspergillus fumigatus에 의한 폐포의 진균 감염 및 항진균제의 효능을 연구하는 데 사용되었습니다7. 폐포-온-칩(alveolus-on-chip)에서 침습성 폐 아스페르길루스증(invasive pulmonary aspergillosis)을 모델링한 결과, 곰팡이의 성장을 부분적으로 억제할 수 있는 인간 대식세포의 주요 기능이 밝혀졌습니다. 대식세포는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)과 케모카인(chemokine)을 방출하는 데 중심적인 역할을 했으며, 이는 침습성 진균 균사(invasive fungal hyphae)의 증가와 상관관계가 있었습니다. 또한, 이 연구는 곰팡이 증식 약물인 caspofungin이 곰팡이 성장을 효과적으로 제한하고 곰팡이 구조의 형태학적 변화를 유도한다는 것을 확인했으며, 이는 다른 연구의 결과와 일치합니다. 이러한 연구는 감염의 세포 표적을 식별하고 임상적으로 관련된 농도에서 약물을 테스트하기 위한 모델 플랫폼의 잠재력을 확인합니다.
alveolus-on-chip을 설정하는 동안 고려해야 할 몇 가지 측면이 있습니다. 정확한 세포 파종은 균일한 세포 분포와 층 형성을 달성하는 데 매우 중요합니다. 세포층의 무결성과 기능을 손상시킬 수 있는 서로 과도하게 성장하지 않고 합류를 달성하기 위해 세포가 적절한 밀도로 파종되었는지 확인하십시오. ALI 설정 과정에서 정점 쪽에서 매체를 조심스럽게 제거하고 오염을 방지하기 위해 포트를 닫습니다. 온도,CO2 수준 및 배지 조성과 같은 최적의 공동 배양 조건을 유지하는 것은 내피 세포와 상피 세포의 생존 및 상호 작용에 매우 중요합니다. 세포층을 방해하거나 기포가 유입되지 않도록 항상 매체 변경을 주의 깊게 수행하십시오. 피펫팅을 부드럽게 하고 사용된 모든 장비가 멸균 상태인지 확인하여 오염 위험을 최소화합니다. 기포를 방지하려면 천천히 피펫팅하고 매체 변경 중에 칩을 기울여 기포가 빠져나갈 수 있도록 합니다. 오염을 최소화하기 위해 깨끗하고 멸균되며 통제된 환경에서 작업하십시오. 모델에 대한 후속 실험을 위해 3D 모델을 설정하고 유지 관리하는 데 필요한 복잡성과 정밀도를 고려합니다. 세포층이 올바르게 형성되지 않는 경우, 공여체와 배치에 따라 세포 성장의 차이가 발생할 수 있으므로 세포 밀도와 세포 배치를 최적화하는 것이 좋습니다.
이 모델은 기존 방법에 비해 상당한 개선 사항을 제공하지만 몇 가지 제한 사항을 고려해야 한다는 점을 인정하는 것도 중요합니다. 이러한 제한 사항 중 하나는 미세유체 장치의 작동과 관련된 복잡성과 비용입니다. 장기 온 칩(organ-on-chip) 모델을 실행하려면 폐포-온-칩 모델을 채택하기 위해 미세유체역학에 대한 전문 장비와 전문 지식이 필요합니다. 또한 이 모델은 폐포 환경의 많은 주요 기능을 성공적으로 복제할 수 있지만 생체 내에서 발견되는 모든 세포 상호 작용 및 기계적 힘을 완전히 복제할 수는 없습니다. 예를 들어, 이 모델은 포괄적인 면역 체계나 인간 폐의 전체 세포 유형을 가지고 있지 않아 병원체-숙주 상호 작용 연구의 정확성에 영향을 미칠 수 있습니다.
이러한 한계에도 불구하고 lung-on-chip 모델은 Transwell 시스템과 같은 기존 2D 세포 배양에 비해 발전된 기능을 제공합니다. 이 모델은 공기-액체 계면, 내피 및 상피 세포, 면역 구성 요소를 역동적이고 관류된 환경 내의 다층 조직에 통합함으로써 체외에서 폐 생리학, 질병 및 치료 반응을 연구하기 위한 생리학적으로 보다 관련성 있는 접근 방식을 나타냅니다. 이는 인간 호흡기 감염에 대한 이해를 높이고 보다 효과적인 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다. 생물물리학적 및 생화학적 단서를 정밀하게 조작할 수 있는 모델의 능력은 질병 진행 및 약물 작용의 메커니즘을 해부하는 데 중요한 기능을 나타냅니다. 인간 세포 물질을 사용하면 동물 실험에서 볼 수 있는 종간 관련 차이를 더욱 줄일 수 있습니다. 여러 바이오마커 분석의 통합은 단일 실험에서 얻을 수 있는 데이터의 깊이와 폭을 더욱 향상시켜 체외 실험 비용을 줄이는 데 기여합니다. 폐-온-칩(lung-on-chip) 모델은 한계를 인정하면서도 호흡기 질환 연구에서 중요한 진전을 이루었으며, 기존 방법에 대한 보다 정확하고 윤리적이며 효율적인 대안을 제공합니다.
공개 사항
K.R.은 Dynamic42 GmbH의 CEO이며 회사의 지분을 보유하고 있습니다. A.S.M.은 Dynamic 42 GmbH의 과학 고문이며 회사의 지분을 보유하고 있습니다. 다른 모든 저자는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
H.K.와 A.S.M.은 라이프니츠 협회의 전략적 네트워킹(Strategic Networking)이라는 자금 지원을 받는 라이프니츠 사이언스 캠퍼스 감염광 예나(Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena)의 자금 지원을 인정합니다. M.A.와 A.S.M.은 독일 연방하원의 결의안에 기초하여 연방 경제 에너지부(Federal Ministry for Economic Affairs and Energy)가 자금을 지원하는 IGF 프로젝트 IMPROVE의 지원을 받았습니다. A.S.M은 독일의 Excellence Strategy - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860에 따라 Cluster of Excellence Balance of the Microverse의 재정 지원을 인정합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Consumables | |||
| Cellcounting chamber slides (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
| Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| Coverslips (24x40mm; #1.5) | 멘젤-Gl ä ser | 15747592 | |
| 에코 와이프 | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| 거즈 면봉 | Noba | PZN 2417767 | |
| 장갑 니트릴 3000 | Meditrade | 1280 | |
| 현미경 슬라이드 | Menzel-Gl ä ser | AAAA000001##12E | |
| 멀티웰 플레이트 24 웰, 멸균 | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| 파스퇴르 피펫(유리) 150mm | 보조 | 40567001 | |
| 파스퇴르 피펫(유리) 230mm | 보조 | 40567002 | |
| 라운드 바닥 튜브(PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
| 안전 멀티플라이 세트, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| 메스 | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| 혈청학적 피펫 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| 혈청학적 피펫 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| 혈청학적 피펫 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| 혈청학적 피펫 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
| 혈청학 피펫 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 플라스크 | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| 팁 멸균 10µ L | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| 팁 멸균 1250µ L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
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| 팁 비멸균 200µ L | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| 핀셋 (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
| Chemicals | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| 에탄올 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란(3-5kDa) | 시그마 알드리치 | FD4-100MG | |
| 형광 장착 매체 | Dako | S3023 | |
| 메탄올 | VWR | 20847.295 | |
| 사포닌 | 플루카 | 47036 | |
| 테르가자임 | 알코녹스 | 1304-1 | |
| <강한>세포 배양 | |||
| 콜라겐 IV | 시그마-알드리치 | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| EDTA 솔루션 | Sigma-Aldrich | E788S | |
| 내피 세포 성장 매체 | Promocell | C-22020 | |
| 내피 세포 성장 매체 보충제 믹스 | Promocell | C-39225 | |
| 소 태아 혈청 시 | 그마-알드리치 | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| 인간 재조합 GM-CSF | 페프로텍 | 300-30 | |
| 리도카인 | 시그마-알드리치 | L5647-15G | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| 트리판 블루 염색 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Primary antibodies | |||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (염소) | BD | 610252 | |
| CD68 (토끼) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Cadherin (염소) | R& D | AF748 | |
| SP-A (마우스) | Abcam | ab51891 | |
| Secondary antibodies | |||
| AF488 (당나귀 안티 마우스) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (당나귀 안티 마우스) | Invitrogen | A31571 | |
| AF647 (당나귀 안티 토끼) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (당나귀 안티 염소) | jackson research | 705-165-147 | |
| microfluidic< / strong> | |||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
| Male Luer Lock (small) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| Male mini luer plugs, row of four, PP, green | Microfluidic Chipshop | 09-0558-0336-11 | |
| 남성 미니 루어 플러그, 4 행, PP, 불투명 | 미세 유체 칩 샵 | 09-0556-0336-09 | |
| 남성 미니 루어 플러그, 4 행, PP, 빨간색 | 미세 유체 칩 샵 | 09-0557-0336-10 | |
| 플러그 | 콜 파머 | GZ-45555-56 | |
| 저장소 4.5mL | 칩 샵 | 16-0613-0233-09 | |
| 튜빙 | 다이나믹 42 | ST001 | |
| Equipment | |||
| Autoclave | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | |
| 유세포계 | BD | FACS Canto II | |
| 냉동고 (-20 ° C) | Liebherr | LCexv 4010 | |
| 냉동고 (-80 ° C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| 냉장고 | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
| 현미경 | Leica | DM IL LED | |
| 오비탈 쉐이커 | Heidolph | Reax2000 | |
| 연동 펌프 | REGLO 디지털 MS-4/12 | ISM597D | |
| 피펫 10µ L | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
| 피펫 100µ L | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| 피펫 1000µ L | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
| 피펫 2.5µ L | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
| 피펫 20µ L | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
| 피펫 200µ L | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
| Scale | Sartorius | 6101 | |
| Scale | Sartorius | TE1245 | |
| 멸균 벤치 | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Waterbath | Julabo | SW-20C | |
| 형광 현미경 설정 | |||
| Apotome.2 | Zeiss | ||
| 조명 장치 | Zeiss | HXP 120 C | |
| 현미경 | Zeiss | Axio Observer 5 | |
| 광학 절편 | Zeiss | ApoTome | |
| 전원 공급 장치 현미경 | Zeiss | Eplax Vp232 | |
| Software | |||
| ZEN 블루 에디션 | 자이스 |
참고문헌
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