방법 논문

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

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DOI:

10.3791/66603

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2024년 5월 24일

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry II, Jena University Hospital, 2Cluster of Excellence Balance of the Microverse, Friedrich Schiller University, 3Jena School of Microbial Communication, Friedrich Schiller University, 4Dynamic42 GmbH, 5Jena Center for Sepsis Control and Care, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.

초록

상피 3D 기관형 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조를 재현하는 고급 intestine-on-chip 모델이 개발되었습니다. 면역 역량 모델에는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), Caco-2 장 상피 세포, 조직 거주 대식세포 및 수지상 세포가 포함되며, 이들은 인간 장 점막의 특성을 반영하여 조직 내에서 자체 조직화됩니다. 이 플랫폼의 독특한 측면은 순환하는 인간 1차 면역 세포를 통합하여 생리학적 관련성을 향상시키는 능력입니다. 이 모델은 박테리아 및 진균 집락 형성 및 감염에 대한 장 면역 체계의 반응을 조사하도록 설계되었습니다. 확대된 캐비티 크기로 인해 이 모델은 투과 분석, 사이토카인 방출 및 면역 세포 침투와 같은 다양한 기능적 판독을 제공하며 상피 세포층에 의해 형성된 3D 구조의 면역형광 측정과 호환됩니다. 이를 통해 세포 분화 및 기능에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다. intestine-on-chip 플랫폼은 미세생리학적 관류 바이오칩 플랫폼 내에서 살아있는 미생물군의 대리모와 인간 숙주 조직 간의 복잡한 상호 작용을 규명할 수 있는 잠재력을 입증했습니다.

서론

OoC(Organ-on-Chip) 시스템은 기존의 2D 세포 배양과 동물 모델 간의 격차를 해소할 수 있는 새로운 3D 세포 배양 기술입니다. OoC 플랫폼은 일반적으로 멤브레인 또는 하이드로겔과 같은 다양한 골격체에서 성장한 조직 특이적 세포를 포함하는 하나 이상의 구획으로 구성됩니다1. 이 모델은 하나 이상의 정의된 유기형 기능을 모방할 수 있습니다. 펌프는 세포 배양 배지의 지속적인 미세유체 관류를 가능하게 하여 세포 폐기물을 제거하고, 세포 분화 개선을 위한 영양 및 성장 인자를 공급하고, 필수적인 생체 내 조건을 재현할 수 있습니다. 면역 세포의 통합으로 OoC 시스템은 in vitro2에서 인간의 면역 반응을 모방할 수 있습니다. 현재까지 다양한 장기와 기능 단위가 제시되었습니다1. 이러한 시스템에는 약물 검사(drug testing)5,7 및 감염 연구(infection studies)6,8를 위해 촉진될 수 있는 혈관구조(vasculature)3, 폐4, 간(liver)2,5 및 장(intestine)6의 모델이 포함된다.

여기에서는 인간 상피 세포를 통합하는 인간 장 온 칩 모델을 제시하며, 내피 내벽 및 조직 상주 대식세포와 결합된 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조의 유기체형 3D 지형을 형성합니다. 이 모델은 미세한 슬라이드 형태의 미세유체 관류 바이오칩에서 배양됩니다. 각 바이오칩은 두 개의 개별 미세유체 공동으로 구성됩니다. 각 캐비티는 다공성 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인에 의해 상부 및 하부 챔버로 나뉩니다. 멤브레인 자체는 세포가 양쪽에서 자랄 수 있는 발판 역할도 합니다. 막의 기공은 세포 누화와 세포층 사이의 세포 이동을 가능하게 합니다. 각 챔버는 두 개의 암형 루어 잠금 장치 크기의 포트를 통해 접근할 수 있습니다. 선택적으로, 추가적인 미니 루어 잠금 장치 크기의 포트를 통해 상부 또는 하부 챔버에 접근할 수 있습니다(그림 1).

OoC 플랫폼은 단일 실험에서 얻을 수 있는 여러 판독값을 제공합니다. Intestine-on-Chip은 관류 3D 세포 배양, 유출물 분석 및 형광 현미경을 결합하여 세포 마커 발현, 대사 속도, 면역 반응, 미생물 집락 형성 및 감염, 장벽 기능 3,6,8을 평가하도록 맞춤화되었습니다. 이 모델에는 조직에 상주하는 면역 세포와 살아있는 미생물이 숙주 조직과 직접 접촉하는 것이 포함되는데, 이는 발표된 다른 모델에 비해 이점이 있다9. 또한, 상피세포는 3차원 구조로 자가조직화되어 살아있는 미생물군(living microbiota)과의 집락화에 생리학적으로 유의미한 인터페이스를 제공한다6.

프로토콜

이 프로토콜은 1차 인간 단핵구를 분리하기 위해 건강한 기증자로부터 바이오칩당 ~20mL의 신선한 혈액에 접근해야 합니다. 모든 기증자는 이 연구에 참여하기 위해 정보에 입각한 서면 동의서를 제출했으며, 이 동의는 예나 대학병원 윤리 위원회(허가 번호 2018-1052-BO)의 승인을 받았습니다. 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 모든 용액 및 매체의 구성에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오.

1. 바이오칩 취급 일반 주의사항

  1. 물통 스트립을 조심스럽게 분리하고 가열된 칼을 사용하여 뚜껑을 분리하여 단일 저장통과 뚜껑을 얻습니다. 실리콘 튜브가 꼭 맞도록 뚜껑의 구멍을 넓힙니다.
  2. 실리콘 튜브는 내경이 0.5mm이고 비대칭이며 두 개의 연동 펌프 스토퍼에 의해 더 긴(20cm) 면과 더 짧은(12cm) 면으로 분리됩니다. 튜브를 남성 루어 잠금 장치에 부착하고 튜브의 반대쪽에 있는 뚜껑에 연결하여 바이오칩당 각 대칭의 두 튜브를 조립합니다. 또한 바이오칩당 4개의 저장소를 조립합니다.
    알림: 튜브와 저장소를 미리 준비하고 사용하기 전에 고압멸균으로 멸균하십시오. 실리콘 튜브는 수명이 제한되어 있으므로 3-5번의 실험 후에 튜브를 교체하십시오. 약물 검사와 같은 특정 연구 관심 분야의 경우 각 실험에 대해 새 튜브를 준비하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 많은 단계가 병렬로 실행됩니다. 그림 2와 같이 하루에 수행된 다양한 단계를 강조 표시하는 개요 그림을 참조하십시오.

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그림 1: intestine-on-chip 모델의 개략도 . (A) 바이오칩은 단면도로 표시됩니다. (B) 전체 바이오칩의 치수와 평평하고 제거 가능한 PET 멤브레인의 치수를 볼 수 있습니다. 암형 루어 잠금 장치 크기의 포트를 포함한 상부 챔버의 총 부피는 하부 챔버에 대해 각각 290 μL 및 270 μL입니다. (C) 장-바이오칩의 개략적인 구성, 분화된 면역 세포와 점액층을 포함하는 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조를 닮은 3차원 돌출 상피를 볼 수 있습니다. PET 멤브레인의 다른 쪽은 내피 단층으로 덮여 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 모델 구축 타임라인 및 실험 설정에 대한 개략도. 이 그림은 제시된 프로토콜의 개략도를 보여줍니다. 세포의 파종 및 LPS를 사용한 상피 도전과 같은 중요한 절차는 화살표로 표시됩니다. 약어: HUVECs = human umbilical venous endothelial cells; LPS = 지질다당류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 바이오칩 살균

  1. 직경이 15cm인 멸균 유리 페트리 접시에 70% 변성되지 않은 에탄올을 채웁니다. 바이오칩의 모든 포트가 에탄올 용액으로 완전히 덮이도록 바이오칩을 내부에 넣습니다.
  2. 포트당 두 번씩 칩의 모든 챔버를 통해 70% 에탄올 1mL를 당깁니다. 실온(RT)에서 45-60분 동안 배양합니다.
    알림: 바이오칩 내부에 공기가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 이 시점부터 바이오칩 시스템에 공기가 유입되어서는 안 되며 캐비티는 액체로 채워진 상태로 유지되어야 합니다.
  3. 페트리 접시에서 에탄올을 제거하고 모든 포트가 완전히 덮일 때까지 멸균 이중 증류수(ddH2O)로 교체합니다. 다시 말하지만, 포트당 두 번, 바이오칩 캐비티를 통해 1mL의 ddH2O를 끌어들입니다. 페트리 접시에서 ddH2O를 새로 고치고 절차를 반복합니다.
  4. 페트리 접시에서 모든 액체를 제거하십시오. 이후로는 멸균 환경 외부에 있을 때마다 완전히 멸균된 바이오칩을 밀폐된 페트리 접시 안에 보관하십시오. 2-5mL ddH2O의 작은 저장소(예: 50mL 튜브의 뚜껑)를 페트리 접시에 추가하여 바이오칩 내부의 액체 증발을 줄입니다.
    알림: 바이오칩은 사용할 때까지 멸균 환경에 보관하는 경우 최대 3일 전에 멸균할 수 있습니다. 이를 통해 하루 만에 작업 부하를 유연하게 처리할 수 있습니다.

3. HUVEC 수확 및 파종

참고: 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVECs)는10 이전에 발표된 바와 같이 탯줄에서 분리되었습니다.

  1. HUVECs를 파종하기 전에 인간 콜라겐 IV로 멤브레인을 코팅합니다. 이를 위해 마그네슘과 칼슘(PBS +/+)을 함유한 Dulbecco의 인산염 완충 식염수에 콜라겐 원액(표 1)을 1:100으로 희석하여 준비합니다. 희석된 원액 350μL를 해당 챔버에 추가합니다. RT에서 5분 동안 배양합니다.
    알림: 멸균 후드에서 바이오칩을 취급하는 경우 과도한 매체를 수집하기 위해 그 아래에 멸균 조직을 놓는 것이 좋습니다.
  2. 350μL의 PBS +/+로 모든 챔버를 두 번 세척하여 남아 있는 콜라겐과 아세트산을 씻어냅니다. 그런 다음 각 챔버에 350μL의 내피 세포 성장(EC)-배지를 추가합니다.
    참고: 여기에서 바이오칩은 세포 파종 준비가 되었으며 사용할 때까지 37°C에서 보관할 수 있습니다.
  3. 80-90% 세포 밀도에서 통로 1-3에서 HUVEC을 사용합니다. 제조업체에서 제공한 정의된 보충제 혼합물을 포함하는 EC 배지에서 HUVEC를 배양합니다. HUVEC 세포 배양의 대표적인 명시야 이미지가 그림 3A에 나와 있습니다.
    참고: 공여체에 따라 더 높은 통로의 HUVEC는 역분화를 시작할 수 있으며 바이오칩 내부에 조밀하고 합류하는 단층을 안정적으로 형성할 수 없습니다. 항생제, 즉 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신의 사용은 선택 사항이지만 미생물 오염을 방지하기 위해 EC 배지의 보충제로 권장됩니다.
  4. T25 세포 배양 플라스크에서 세포 배양 배지를 제거하고 마그네슘과 칼슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 3-5mL로 세포를 부드럽게 세척합니다(PBS -/-). PBS -/-를 제거하고 트립신 해리 시약 1mL를 추가합니다(표 1). 세포가 세포 배양 플라스크에서 분리될 때까지 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
  5. PBS -/-에서 9mL의 5% 소 태아 혈청(FBS)을 사용하여 분리된 세포를 튜브로 옮깁니다. RT에서 350× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 1mL의 EC-배지에 재현탁한 다음 세포 수를 결정합니다. 세포 농도를 0.4 × 150 μL당 106 세포(하부 챔버에 파종) 또는 250 μL(상부 챔버에 파종)로 조정합니다.
  6. 챔버에 각각의 세포 부피를 추가합니다. 하부 챔버에 파종하는 경우 모든 포트를 닫고 즉시 바이오칩을 거꾸로 놓아 세포가 PET 멤브레인에 떨어지도록 합니다. 37 ° C 및 5 % CO2의 가습 된 인큐베이터에서 바이오 칩을 배양합니다.
  7. 24시간 후에 HUVEC 함유 챔버를 350μL의 EC-배지와 매체 교환을 수행합니다. 반대쪽 챔버의 매체는 교체할 필요가 없습니다.

4. 인간 혈청 채취 및 말초혈액 단핵세포(PBMC) 유래 단핵구 분리

참고: PBMC는 Mosig et al.11에 설명된 대로 분리되었습니다.

  1. 건강한 기증자로부터 인간 정맥혈을 채취합니다. 바이오칩당 혈청 수집을 위해 규산염 함유 혈액 수집 튜브에 최소 10mL의 전혈을 조달합니다. 완전한 응고 후 혈액 수집 튜브를 2,500× g 에서 RT에서 10분 동안 원심분리합니다. 혈청, 부분 표본을 수집하고 추가 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
  2. PBMC 분리를 위해 EDTA 함유 혈액 수집 튜브에서 동일한 기증자로부터 최소 10mL의 전혈을 조달합니다. 응고되지 않은 혈액을 iso-buffer(표 1)와 1:1로 반전하여 부드럽게 혼합하고 이 혼합물 35mL를 50mL 튜브에 1.077g/mL의 밀도를 가진 밀도 구배 배지 15mL 위에 천천히 층을 이룹니다.
  3. RT에서 브레이크 없이 800× g 에서 20분 동안 원심분리합니다. 밀도 구배 매체 위에 나타나는 면역 세포층을 조심스럽게 빼내고 새로운 50mL 튜브로 옮깁니다. 최대 50mL의 차가운 이소 버퍼를 채우고 부드러운 반전으로 세포를 세척합니다.
  4. 200 × g 에서 4 °C에서 브레이크 없이 8분 동안 원심분리기. 상층액을 버리고 밀도 구배에 따라 10mL의 iso-buffer에 재현탁시킵니다. 선택 사항: 여러 그래디언트가 병렬로 실행되는 경우 한 기증자의 PBMC를 풀링합니다.
  5. 150 × g 에서 4 °C에서 8분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 밀도 구배당 10mL의 iso-buffer에 펠릿을 재현탁시킵니다. 원심분리 단계 4.4를 반복합니다. 마지막으로, 상층액을 버리고 세포를 2mL의 단핵구 분화 배지에 재현탁시킵니다(표 1).
    참고: M-CSF 및 GM-CSF의 추가는 고립된 단핵구가 단핵구 유래 대식세포 및 단핵구 유래 수지상 세포로 분화되도록 강제합니다(이 프로토콜의 뒷부분에 추가되는 지질다당류[LPS]와 함께). 항생제, 즉 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신의 사용은 선택 사항이지만 미생물 오염을 방지하기 위해 배지의 보충제로 권장됩니다.
  6. 세포 수를 결정하고 2mL의 단핵구 분화 배지에서 6-웰 플레이트의 웰당 ~10 ×10 6 개의 세포를 시드합니다(표 1). 37°C의 가습 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하여 단핵구를 6-well plate의 플라스틱에 부착할 수 있도록 합니다.
  7. 상층액을 조심스럽게 버리고 미리 데워진 2mL의 조혈 세포 배지로 2배 세척하여 결합되지 않은 세포를 제거합니다. 37°C에서 단핵구 분화 배지에서 24시간 더 배양합니다.
  8. 단핵구를 수확하려면 상층액을 조심스럽게 버리고 미리 데워진 PBS -/-의 2mL로 한 번 세척합니다. 그림 3B 를 참조하면 이 시점에서 단핵구 배양에 대한 명시야 이미지의 예가 표시됩니다. 그런 다음 37°C에서 1mL의 예열된 단핵구 분리 시약(표 1)에서 7분 동안 세포를 배양하여 6-웰 플레이트의 플라스틱에서 단핵구를 강제로 분리합니다.
  9. 분리된 단핵구를 결합이 낮은 튜브로 옮깁니다. 선택 사항: 더 높은 셀 수율을 얻으려면 PBS -/-로 6웰 플레이트를 여러 번 조심스럽게 세척하십시오.
  10. 상층액을 300× g 에서 RT에서 8분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 EC 조절 매체에 다시 현탁시킵니다(표 1). 세포 수를 측정하고 세포 농도를 150 μL당 0.1 × 106 세포(하부 캐비티에 파종) 또는 250 μL당(상부 캐비티에 파종)으로 조정합니다.
    참고: 면역 세포 분리의 모든 단계에서 부드럽게 하고 전단력을 줄여 면역 세포 활성화를 방지하십시오. 이러한 분리를 설정할 때 PBMC 유래 단핵구의 순도를 확인하십시오(예: 유세포 분석을 통해). 모든 세포의 95% 이상이 CD14와 같은 전형적인 단핵구 마커에 대해 양성이어야 합니다.

5. 단핵구 파종

  1. HUVEC 함유 챔버에서 350μL의 예열된 EC 컨디셔닝 배지와 매체 교환을 수행합니다.
  2. 준비된 단핵구 현탁액(단계 4.10 참조)의 150μL(하부 챔버) 또는 250μL(상부 챔버)를 동일한 챔버에 추가합니다. 하부 챔버에 파종하는 경우 모든 포트를 닫고 즉시 바이오칩을 거꾸로 놓아 세포가 HUVEC 층으로 떨어지도록 합니다. 37 ° C 및 5 % CO2의 가습 된 인큐베이터에서 바이오 칩을 배양합니다.
  3. HUVEC + 단핵구 함유 챔버에서 24시간마다 350μL의 EC 조절 배지로 배지 교환을 수행합니다.

6. C2BBe1 수확 및 파종

참고 : Caco-2 브러시 테두리 표현 셀 1 (C2BBe1) 12 는 통로 35까지 사용되며 80-90 % 밀도의 플라스크에서 가져옵니다. C2BBe1 배양권의 대표적인 명시야 이미지가 그림 3C에 나와 있습니다.

  1. C2-medium에서 C2BBe1 세포를 배양합니다(표 1).
    참고: 항생제, 즉 20μg/mL 겐타마이신의 사용은 선택 사항이지만 미생물 오염을 방지하기 위해 C2 배지의 보충제로 권장됩니다.
  2. T25 세포 배양 플라스크의 세포 배양 배지를 제거하고 3-5mL의 PBS -/-로 세포를 부드럽게 세척합니다. PBS -/-를 제거하고 트립신 해리 시약 1mL를 추가합니다(표 1). 세포가 세포 배양 플라스크에서 분리될 때까지 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
  3. PBS -/-에서 9mL의 5% 소 태아 혈청(FBS)을 사용하여 분리된 세포를 튜브로 옮깁니다. 상층액을 제거하고 1mL의 C2- 배지에 재현탁한 다음 세포 수를 측정합니다. 상층액을 제거하고 1mL의 C2-배지에 재현탁한 다음 세포 수를 결정합니다.× 세포 농도를 0.5 × 150 μL당 106 세포(하부 챔버에 파종) 또는 250 μL(상부 챔버에 파종)로 조정합니다.
  4. C2BBe1을 파종하기 전에 350μL의 C2-medium으로 해당 챔버를 부드럽게 세척합니다.
  5. 준비된 C2BBe1-현탁액(단계 6.3 참조)의 150μL(하부 챔버) 또는 250μL(상부 챔버)를 해당 챔버에 추가합니다. 하부 챔버에 파종하는 경우 모든 포트를 닫고 즉시 바이오칩을 거꾸로 놓아 세포가 PET 멤브레인에 떨어지도록 합니다. 37 ° C 및 5 % CO2의 가습 된 인큐베이터에서 바이오 칩을 배양합니다.

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그림 3: 바이오칩에 파종하기 전의 HUVEC, 단핵구 및 C2BBe1의 세포 형태. 이 그림은 프로토콜 전반에 걸쳐 사용되는 다양한 세포 소스의 대표적인 명시야 이미지를 보여줍니다. 이미지는 10x 배율을 사용하여 역명시야 현미경으로 촬영했습니다. 모든 세포 유형, (A) HUVECs, (B) 단핵구 및 (C) C2BBe1은 특정 프로토콜 섹션에 설명된 대로 2D 단층 세포 배양에서 배양되었습니다. 스케일 바 = 200 μm. 약어: HUVECs = human umbilical venous endothelial cells; PBMCs = 말초 혈액 단핵 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 연동 펌프 및 원형 관류에 연결

  1. 연동 펌프를 추가하여 빈 인큐베이터를 준비합니다. 인큐베이터와 펌프의 모든 영역을 소독제로 철저히 청소하여 준 멸균 환경을 제공합니다.
    알림: 연동 펌프는 작업하는 동안 많은 열을 생성할 수 있습니다. 단열이 잘 된 인큐베이터 또는 냉난방이 제대로 되지 않은 실험실에서는 인큐베이터가 과열되는 경향이 있기 때문에 인큐베이터당 사용 가능한 펌프의 수가 제한될 수 있습니다. 인큐베이터당 두 개의 연동 펌프가 적당해야 합니다.
  2. 멸균된 튜브를 바이오칩에 부착하기 전에 각 튜브를 700μL의 PBS +/+로 세척한 다음 500μL의 C2-매체 또는 EC 컨디셔닝 매체로 세척합니다. 매체당 각 대칭의 튜브 하나를 준비합니다(1.2단계 참조). 왼쪽 캐비티의 경우 루어 잠금 장치에서 연동 펌프 스토퍼까지의 거리가 짧은 튜빙을 사용하고 오른쪽 캐비티의 경우 다른 대칭이 있는 튜빙을 사용합니다.
  3. 인큐베이터에서 바이오칩을 회수하고 각 챔버에 대해 350μL로 배지 교환을 수행합니다. 모든 플러그를 뽑고 모든 포트를 맨 위까지 채우십시오.
  4. 왼쪽 캐비티에서 시작하여 루어 잠금 어댑터를 바이오칩의 포트에 삽입하여 첫 번째 튜브를 상부 챔버의 오른쪽 포트에 연결합니다. 그런 다음 두 번째 튜브를 하부 챔버의 왼쪽 포트에 연결합니다. 오른쪽 미세유체 캐비티에 대해 이 절차를 반복합니다.
  5. 저장소를 가져 와서 저장소 바닥에 세포 배양 배지 소량 방울을 추가합니다. 그런 다음 저장소를 첫 번째 튜브의 반대쪽에 삽입하고 다른 챔버에 대해 반복합니다. 모든 포트가 튜브 또는 reservoir에 연결되면 reservoir에 3.5mL의 세포 배양 배지를 채웁니다.
  6. 뚜껑이 부착된 튜브의 느슨한 면을 저장소 위에 놓아 각 챔버의 미세유체 시스템을 닫습니다. 이 상태에서 바이오칩을 연동 펌프로 운반합니다.
    알림: 인큐베이터까지의 거리와 실험실 주변 환경에 따라 이전에 세척하고 고압멸균한 상자를 사용하여 칩을 인큐베이터로 옮길 수 있습니다.
  7. 연동 펌프 스토퍼를 사용하여 튜브를 펌프에 연결합니다. 매체가 저장소에서 캐비티로, 튜브로, 펌프를 통해 저장소로 다시 흐르도록 각 튜브를 연동 펌프에 연결합니다(그림 4). 저장소는 원형 관류에서 기포 트랩 역할을 하며 공기가 시스템에 갇히는 것을 방지합니다. 각 챔버에 50 μL/min의 유속으로 관류하여 상부 챔버에서 0.013 dyn / cm2, 하부 챔버8에서 0.006 dyn / cm2의 전단 응력을 얻습니다.
    주의: 하부 및 상부 공동의 매체가 반대 방향으로 이동하면, 장 조직의 더 높은 3차원 돌출물을 얻을 수 있다13. 따라서 상부 및 하부 캐비티의 저장소는 반대쪽에 배치됩니다(그림 4). 순환 관류는 필요한 세포 배양 배지의 양을 줄이지만 잠재적으로 사이토카인과 대사 산물을 풍부하게 만들 수 있습니다. 원하는 경우, 바이오칩의 선형 관류도 가능하다.
  8. 37 ° C 및 5 % CO2에서 72 시간 동안 바이오 칩을 관류합니다.

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그림 4: 연동 펌프에 연결된 바이오칩. 연동 펌프에 연결된 바이오칩의 예가 제시됩니다. 상피 C2BBe1 세포는 하부 챔버(빨간색 C2-배지는 앞쪽의 저장소에 있음)에서 배양되고 HUVEC은 위쪽 챔버(노란색 EC-컨디셔닝-배지는 뒤쪽의 저장소에 있음)에서 배양됩니다. 다른 세포 배양 배지는 성장한 조직의 장벽 기능으로 인해 혼합되지 않습니다. 바이오칩은 매체가 저장소에서 캐비티로 흐르는 방식으로 연동 펌프에 연결됩니다. 여기에서 매체는 펌프를 통해 튜브를 통해 저장소로 다시 흐릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

8. 상피 장벽의 LPS 조절

  1. 72시간의 예비 관류 후 연동 펌프를 중지하고 각 저장소의 튜브에 연결된 뚜껑을 제거합니다. 펌프 옆의 멸균 조직에 놓습니다.
  2. 모든 배지를 제거하고 새로 준비된 배지 2mL로 저장소를 채웁니다. C2BBe1 세포를 포함하는 상피 쪽의 경우 배지에 100ng/mL LPS를 추가합니다.
    참고: LPS는 조직의 장벽 기능을 증가시키고, 단핵구 유래 대식세포가 상피 조직으로 이동하도록 자극하며, 단핵구 유래 수지상세포 분화를 가능하게 합니다.
  3. 튜브와 뚜껑을 저장소에 다시 연결하고 추가로 50시간 동안 24μL/min의 유속으로 원형 관류를 계속합니다.
    참고: 이 시점부터 칩 모델은 화합물 실험 또는 감염 연구에 사용할 수 있습니다. 24시간마다 저장소당 2mL의 매체 교체를 권장합니다.

9. 다른 해독 방법을 위한 조직에 접근

  1. 관류가 진행되는 동안 항상 저장소에서 세포 배양 배지 상층액을 수집합니다. 저장소를 열고 원하는 볼륨을 수집합니다(8.1-8.3단계 참조). 이러한 상층액을 대사 산물, 사이토카인 또는 기타 분자의 검출에 사용하십시오.
  2. 조직에 접근하려면 메스를 사용하여 상부 챔버 외부를 따라 정밀하게 절단하고 접착 호일을 제거하여 미세유체 공동을 엽니다. 이제 장-바이오칩 모델의 조직에 액세스할 수 있습니다. 미세유체 챔버의 외부를 따라 조심스럽게 절단하여 바이오칩에서 멤브레인을 분리합니다. 핀셋을 사용하여 조직 함유 막을 채취합니다.
    주의: 이 단계에서 손가락 위치에 주의하고 사고를 방지하기 위해 주의하십시오. 베임 방지 장갑을 착용하는 것이 좋습니다.
  3. 또는 효소 용액, 즉 트립신 또는 Triton X-100 함유 완충액을 사용하여 용해된 세포를 사용하여 바이오칩 내부의 개별 층에서 세포를 수확합니다.

10. FITC-dextran 확산을 통한 투과성 평가

참고: 조직의 장벽 기능은 연동 펌프를 분리한 후 FITC-dextran 투과성 분석을 통해 분석할 수 있습니다. FITC-덱스트란 투과성 평가는 Deinhardt-Emmer et al.4에서 채택되었습니다.

  1. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란(분자량 3-5kDa, 표 1)의 원액을 준비합니다.
  2. 저장소를 비우고 관류에서 칩을 분리합니다.
  3. 상부 및 하부 챔버에서 페놀 적색이 없는 배지로 매체 교환을 수행합니다.
    참고: 실험 중에 페놀 적색이 없는 매체가 이미 사용된 경우 이 단계가 필요하지 않습니다.
  4. C2BBe1 세포가 들어 있는 챔버에 350μL의 1mg/mL FITC-dextran 용액을 추가합니다.
  5. 포트를 닫고 상피 면이 위를 향하도록 하여 37°C에서 60분 동안 칩을 배양합니다.
  6. 배양 시간이 끝나면 칩의 두 챔버에서 배양 배지를 별도로 수집하고 측정할 때까지 빛으로부터 보호되는 4°C에 보관합니다.
  7. 측정을 위해 1,000 μg/mL - 0 μg/mL FITC-dextran 범위에서 페놀 레드가 없는 C2-배지 및 EC 컨디셔닝 배지에서 11회 연속 1:2 연속 희석으로 표준 곡선을 준비합니다.
  8. 각 시료 200μL를 바닥이 투명한 검은색 96웰 플레이트에 옮깁니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 495nm의 여기 파장과 517nm의 방출 파장에서 형광을 측정합니다.
  9. 표준 곡선을 사용하여 샘플의 FITC-덱스트란 농도를 계산하고 그에 따른 투과성 계수를 계산합니다.

11. 면역형광 염색

참고: 살아있는 조직은 현미경으로 조사할 수 있습니다. 더 쉽게 취급하려면 연동 펌프에서 바이오칩을 분리하고 도립 현미경에서 장거리 대물렌즈를 사용하는 것이 좋습니다. 종말점 분석으로, 조직은 면역형광 염색과 같은 절차를 위해 바이오칩 내부에 고정될 수 있습니다.

  1. 연동 펌프를 중지하고 모든 캐비티의 저장소를 엽니다. 저장소를 비우고 튜브와 바이오칩에서 저장소를 분리합니다.
  2. 챔버당 두 번, 500μL의 차가운 PBS +/+로 미세유체 캐비티를 세척합니다. 모든 캐비티에 500μL의 얼음처럼 차가운 메탄올을 추가하고 -20°C에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 캐비티당 두 번 미세유체 챔버를 500μL의 PBS +/+로 세척합니다.
    참고: 4% 파라포름알데히드 또는 Carnoy's 정착제로 고정하는 것과 같은 다른 고정 방법도 적합합니다. 부착 후 칩을 4°C에서 보관하거나 면역 형광 염색으로 바로 진행할 수 있습니다. 주의: 메탄올 또는 파라포름알데히드와 같은 고정 화학 물질은 독성이 있습니다. 흄 후드 아래에서 해당 작업을 수행하고 그에 따라 폐기물을 수거하십시오.
  3. 9.2단계에 설명된 대로 칩을 열어 조직에 접근합니다. 조직을 함유한 PET 멤브레인을 최대 3조각으로 절단하여 다른 면역 패널과 병렬로 염색합니다.
  4. 정밀 핀셋을 사용하여 차단 및 투과화 용액(표 1)이 포함된 별도의 24웰 플레이트로 각 멤브레인 조각을 옮깁니다. 전체 염색 과정에서 관심 세포층이 항상 위쪽을 향하도록 합니다. RT에서 30분 동안 멤브레인 조각을 배양합니다.
    참고: 혈청을 2차 항체와 일치시킬 때 최상의 염색 결과를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 염소 종에서 2차 항체를 얻은 경우 일반 염소 혈청을 사용하는 것이 좋습니다.
  5. 멤브레인 조각을 습한 챔버 내부의 깨끗한 유리 슬라이드로 옮깁니다. 염색 용액(표 1)에서 1차 항체 패널을 준비하고 각 멤브레인 조각에 50μL를 추가합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    참고: 최적의 항체 농도 및 염색 효능은 제조업체와 클론에 따라 다를 수 있습니다. 2D 세포 배양에서 염색 패널을 미리 테스트하는 것이 좋습니다.
  6. 배양 후 샘플을 24웰 플레이트로 옮기고 세척 용액으로 3 x 5분 동안 멤브레인을 부드럽게 세척합니다(표 1).
  7. 다시 말하지만, 멤브레인 조각을 습한 챔버 내부의 깨끗한 유리 슬라이드에 옮깁니다. 염색 용액(표 1)에서 2차 항체 패널을 준비하고 각 멤브레인 조각에 50μL를 추가합니다. 필요한 경우 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 또는 Hoechst와 같은 핵 대조염색을 추가합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: 형광단으로 작업하는 동안 이미지 품질을 높이기 위해 광표백을 방지하기 위해 샘플을 빛으로부터 보호하십시오.
  8. 배양 후 샘플을 24웰 플레이트로 옮기고 세척 용액으로 멤브레인을 2 x 5분 동안 부드럽게 세척합니다(표 1). 그런 다음 PBS +/+로 5분 동안 한 번 씻으십시오.
  9. 형광 장착 매체와 커버 유리를 사용하여 깨끗한 유리 슬라이드에 멤브레인 조각을 장착합니다. 현미경 이미징이 이루어질 때까지 4 °C에서 보관하십시오.

결과

이러한 대표적인 결과는 intestine-on-chip 모델의 뚜렷한 조직층을 보여줍니다. 이들은 프로토콜 섹션 11에 설명된 대로 면역형광 염색됩니다. 이미지는 epifluorescence 또는 confocal fluorescence microscope를 사용하여 z-stack으로 촬영하고 직교 투영으로 처리했습니다. 현미경 설정 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 Table of Materials 를 참조하십시오. 그림 5 는 HUVEC과 대식세포로 구성된 장벽 형성 내피 단층인 혈관층을 보여줍니다. 내피 세포에 대한 VE-Cadherin 및 von Willebrand 인자와 대식세포에 대한 CD68과 같은 대표적인 세포 마커가 염색됩니다. C2BBe1 세포로 구성된 3차원 상피층은 그림 6 과 그림 7에 나와 있습니다. 조직 무결성은 E-Cadherin 및 ZO-1의 염색으로 확인됩니다. 모든 예상 조직 마커 및 조직 분극에 대한 자세한 분석은 Maurer et al.6에서 확인할 수 있습니다. 그림 8 은 장 융모와 같은 구조의 3차원 파생물이 결여된 예시적인 이미지를 보여줍니다. 일반적인 3차원 세포층(그림 6)과 비교했을 때, 염색된 핵의 수는 크게 줄어들었고 세포는 단층으로만 존재합니다. 이 특정 표현형은 세포 증식을 억제하는 세포 배양 배지에 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 첨가하여 생성되었습니다. 장벽 투과성은 FITC-dextran을 사용한 투과 분석으로 평가됩니다. 기회주의적 병원성 C. albicans에 감염되면 투과성이 증가했으며, 이는 그림 9A에서 볼 수 있습니다. 감염으로 인해 사이토카인 IL-1β, IL-6, IL-8 및 IL-10이 혈관 배지 상층액으로 방출되는 속도가 증가합니다(그림 9B)8.

figure-results-1
그림 5: intestine-on-chip의 고정된 혈관 쪽. 관류 5일 후 혈관 장벽의 대표적인 면역형광 이미지. 조직을 메탄올로 고정시켰다. 형광 현미경으로 1μm 절편의 z-stack을 촬영하고 이 z-stack의 직교 최대 투영을 표시합니다. (A) 핵 내의 DNA를 DAPI로 염색하였다. (B) 완전히 분화된 단핵구 유래 대식세포는 CD68을 발현하며 혈관 조직 전체에 퍼져 있습니다. (C) HUVEC은 VE-Cadherin과 같은 부착 접합부의 형성에 의해 조직 무결성을 보여주는 합류층을 생성합니다. 또한 (D) von Willebrand 요인은 HUVEC에 의해 많이 표현됩니다. 마지막으로 (E) 모든 마커가 오버레이에 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌; HUVECs = 인간 제대 정맥 내피 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 6: intestine-on-chip의 고정된 상피 쪽. 접합 단백질 E-Cadherin 및 ZO-1을 발현하는 관류 5일 후 편광 상피 세포층의 대표적인 면역형광 이미지. 조직을 메탄올로 고정시켰다. 1μm 절편의 z-stack을 형광 현미경으로 촬영했습니다. 이 Z 스택의 직교 최대 투영이 표시됩니다. (A) 핵 내의 DNA를 DAPI로 염색하였다. 단단한 상피 장벽은 E-Cadherin으로 염색된 (B) 부착 접합부와 ZO-1로 염색된 (C) 정점 접합부의 형성에 의해 개발됩니다. Tight junctions and adherens junctions는 (D) 오버레이 이미지에서 볼 수 있듯이 정점 세포막에서 co-localize합니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 7: 융모와 같은 돌출부가 있는 intestine-on-chip의 고정된 상피 쪽. 6일간의 관류 후 3차원 상피 세포층의 대표적인 면역형광 이미지. 조직은 Carnoy의 고정제로 고정되었습니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 1μm 섹션의 z-stack을 촬영하고 (A) 이 z-stack의 직교 최대 투영을 표시합니다. 핵 내의 DNA는 Hoechst로 염색되었습니다. 또한, 조직은 인간의 점액을 염색하는 렉틴인 밀 배아 응집체로 염색되었습니다. (B) 상피의 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조의 3차원 성장은 z-스택의 x 및 y 섹션에서 감지될 수 있습니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: WGA = 밀 배아 응집체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 8: 융모와 같은 돌출부가 없는 intestine-on-chip의 고정된 상피 쪽. 히스톤 탈아세틸화효소 억제제인 수베로일라닐리드 하이드록사믹산(SAHA)으로 처리하여 세포 증식을 방지한 상피세포층의 대표적인 면역형광 이미지. 조직을 메탄올로 고정시켰다. 1μm 절편의 z-stack을 형광 현미경으로 촬영했습니다. 이 Z 스택의 직교 최대 투영이 표시됩니다. (A) 핵 내의 DNA를 DAPI로 염색하였다. (B)에서 접착 접합부는 E-Cadherin으로 염색되고 (C)에서는 단단한 접합부가 ZO-1로 염색됩니다. Tight junctions 및 adherens junctions는 오버레이 이미지(D)에서 볼 수 있듯이 함께 국소화됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 9: 통합 선천성 면역 세포의 병원체 의존성 면역 반응: 이 수치는 Kaden et al.8에서 수정되었습니다. C. albicans SC5314에 감염되지 않은(-) 또는 감염된(+) intestine-on-chip 모델은 FITC-Dextran(3-5kDa) 및 (B) 사이토카인 분비에 대한 (A) 투과성에 대해 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

용액/매체구성
콜라겐 스톡 솔루션0.5mM 아세트산에 0.5mg/mL 콜라겐 IV
이소 버퍼PBS -/-, 1mg/mL 소 혈청 알부민 분획 V, 2mM EDTA
단핵구 분화 배지조혈 세포 배지 + 10% 인간 자가 혈청 + 10ng/mL 재조합 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF) + 10ng/mL 재조합 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)
트립신 해리 시약PBS에서 0.25% 트립신 + 1mM EDTA -/-
단핵구 분리 시약PBS에서 4mg/mL 리도카인 + 5mM EDTA -/-
EC 컨디셔닝 매체EC-미디엄 +10% 인간 자가 혈청 +10ng/mL M-CSF + 10ng/mL GM-CSF
C2-중간DMEM 고포도당(4.5g/L) + 10% FBS + 1% GlutaMax + 1% MEM 비필수 아미노산 용액 + 1mM 피루브산 나트륨 + 10μg/mL 인간 홀로-트랜스페린
플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란의 원액페놀 레드가 없는 예열된 C2-배지에서 1mg/mL
차단 및 투과성 솔루션3% 일반 당나귀 혈청(NDS) + PBS의 0.1% 사포닌 +/+
염색 용액0.3% 일반 당나귀 혈청(NDS) + PBS의 0.1% 사포닌 +/+
세척액PBS의 사포닌 0.1% +/+
카르노이의 고정제60% 에탄올, 30% 클로로포름, 10% 빙초산

표 1: 이 프로토콜에 사용된 솔루션의 목록 및 구성. 약어: PBS -/- = 마그네슘과 칼슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수.

토론

제시된 프로토콜은 면역 능력이 있는 장-온-칩 모델을 생성하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다. 면역형광 현미경 검사, 사이토카인 및 대사산물 분석, 유세포 분석, 단백질 및 유전자 분석, 투과성 측정과 같은 특정 기술과 가능한 판독 방법을 설명했습니다.

기술된 모델은 6,14 이전에 기술된 바와 같이 점액 분비, 흡수성, 장내분비 및 파네스 세포 유사 집단의 측면을 나타내는 장 상피 세포의 3D 층과 공동 배양된 일차 HUVEC, 단핵구 유래 대식세포 및 단핵구 유래 수지상 세포로 구성됩니다. 프로토콜 단계를 수행하는 동안 몇 가지 중요한 점을 염두에 두어야 합니다. 모든 단계에서 미세유체 시스템 내에서 기포 형성을 방지해야 합니다. 따라서 바이오칩 또는 튜빙을 다룰 때는 항상 피펫팅을 반대로(두 번째 스톱에서 부피를 차지하고 첫 번째 스톱까지만 분주)하십시오. 바이오칩 내 세포에 가해지는 고압 또는 전단력을 방지하려면 바이오칩에서 피펫팅할 때 항상 부드럽게 피펫팅하고 반대쪽 챔버를 닫은 상태로 유지하십시오(예: 상부 챔버에서 배지를 교환할 때 해당 플러그로 하부 챔버를 닫음). 바이오칩은 PET 멤브레인의 양면에 세포를 파종할 수 있습니다. 따라서 모델은 PET 멤브레인 아래에 장 융모와 같은 구조로 설정하거나 멤브레인에서 위쪽으로 자랄 수 있습니다. 연구 관심사에 따라, 세포의 하나 또는 다른 방향은 유동 매체에 부유하는 순환 세포의 중력 보조 세포 부착과 같은 물리적 상호 작용 측면에서 특정 이점을 갖습니다.

미세유체 매체 흐름으로 인해, 분극화된 장 세포는 크립트(crypt)와 같은 구조와 융모(villus)와 같은 구조를 닮은 3차원 조직을 형성하며, 이는 단단한 접합부와 유착 접합부(attherens junctions)의 조밀한 네트워크에 의해 깊은 정점 조직 장벽을 형성한다6. 또한 통합된 선천성 면역 세포는 장 장벽 기능을 증가시키고 기증자 특이적 면역 반응을 포함하여 다양한 자극에 대한 사이토카인 및 면역 세포 반응을 자세히 조사할 수 있습니다 3,6. 이 모델은 인간 장의 미생물 공생체(예: Lactobacillus rhamnosus6) 및 병원체(예: Candida albicans 6,8)를 연구하기 위한 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다. 이 모델은 장내 미생물 구성 변화와 점막 면역 반응의 조절 메커니즘을 조사하는 데 활용되었다6. 이 연구에서 우리는 장 내강의 생리적 면역 내성을 재현하고 살아있는 미생물에 의한 항상성 집락화를 지원하는 방법을 보여주었습니다. 또한, 프로바이오틱스 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)를 사용한 모델의 내강 면의 사전 집락화는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 조직 침입을 줄이고 생체 내 상황과 유사하게 혈관 구획으로의 전위를 제한했습니다. 이 연구는 생리학적으로 관련된 체외 조건에서 장의 미생물 상호 작용, 면역 반응 및 병원성 메커니즘을 연구할 수 있는 모델의 잠재력을 입증했습니다.

그러나 이 칩 플랫폼은 인간의 장을 완전히 대표할 수 없는 암 유래 장 세포를 사용하고 1차 내피 및 면역 세포를 사용한다는 한계가 있습니다. 저산소 배양 조건은 인간 장의 생체 내 상황을 더 잘 반영하기 위해 관류 조건 하에서 저산소증 인큐베이터에서 모델을 배양하여 설정할 수 있습니다.

Kim et al.14,15에 의해 발표된 "gut-on-a-chip" 모델과 같은 다른 OoC 플랫폼과 비교하여, 제시된 조직 모델을 형성하는 초기 세포 수는 약 10배 더 높습니다. 예를 들어, 이를 통해 단일 실험 내에서 최대 3개의 면역형광 염색 패널을 동시에 분석할 수 있습니다. 세포 수가 많을수록 유세포 분석, 웨스턴 블롯 분석 및 사이토카인 프로파일링 및 젖산 탈수소효소(LDH) 측정과 같은 세포 배양 상층액이 필요한 기타 표준 기성 분석을 포함한 종말점 분석을 더욱 간소화할 수 있습니다. 단일 실험에서 여러 판독값을 얻을 수 있으므로 전체 비용과 실험 시간을 줄일 수 있습니다. 산업 인터페이스 및 풋프린트(칩의 미세한 슬라이드 형식, 루어 잠금 형식의 포트, 96웰 매트릭스에 정렬된 포트)를 특징으로 하는 표준화된 바이오칩 플랫폼 덕분에 광범위한 제조업체의 기성품 하드웨어 솔루션을 사용할 수 있습니다. 여기에는 또한 다양한 재료와 기공 크기의 많은 멤브레인이 포함됩니다. 공극 크기는 세포 성장과 조직 무결성16 및 세포 이동에 영향을 미칠 수 있습니다.

요약하면, 이 프로토콜은 인간 장 환경의 중요한 요소를 복제하는 상세하고 적응 가능한 intestine-on-chip 모델을 제시합니다. 특히 숙주 면역 반응 및 장 병태 생리학에 중점을 두고 장내 미생물군과 장 숙주 조직에 대한 광범위한 연구를 수행하기 위한 확장 가능하고 효과적인 플랫폼을 제공합니다. 따라서 이 모델은 전통적인 체외 모델과 인간 생물학 사이의 격차를 해소할 수 있어 장 생물학에 대한 심층 연구에 필수적인 도구가 됩니다.

공개 사항

M.R.은 Dynamic42 GmbH의 CEO이며 회사의 지분을 보유하고 있습니다. A.S.M.은 Dynamic 42 GmbH의 과학 고문이며 회사의 지분을 보유하고 있습니다.

감사의 글

이 연구는 V.D.W.와 A.S.M. 및 A.S.M. A.F. 및 A.S.M.에 대한 공동 연구 센터 PolyTarget 1278(프로젝트 번호 316213987)의 재정 지원을 받았으며, 독일의 Excellence Strategy - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860에 따른 Cluster of Excellence "Balance of the Microverse"의 재정 지원을 인정합니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 ZEISS LSM980을 사용할 수 있도록 지원해 준 Astrid Tannert와 Jena Biophotonic and Imaging Laboratory(JBIL)에 감사드립니다. 그림 1C와 그림 2 는 Biorender.com 로 만들어졌습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96웰 플레이트 블랙, 투명 바닥Thermo Fisher10000631소모품
아세트산Roth3738.4화학 물질
Alexa Fluor 488 AffiniPure, 당나귀, 안티 마우스 IgG (H + L)Jackson Immuno Research715-545-1502 차 항체 혈관 염색 및 상피 염색
Alexa Fluor 647 AffiniPure, 당나귀, 안티 토끼 IgG (H + L)Jackson Immuno Research711-605-1522차 항체 상피 염색
Alexa Fluor 647, 당나귀, 항토끼 IgG (H+L)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenA315732차 항체 혈관 염색
Axiocam ERc5s cameraZeiss426540-9901-000기술 장비
기초 매체 MV, 페놀 레드 프리PromocellC-22225세포 배양 소모품
BiochipDynamic 42BC002미세유체 소모품
BSA fraction VGibco15260-037세포 배양 소모품
C2BBe1 (Caco-2의 클론)ATCCCRL-2102상피 세포 출처
클로로포름시그마C2432화학
CO2 인큐베이터Heracell150i기술 장비
인간 태반의 콜라겐 IVSigma-AldrichC5533세포 배양 소모품
커버슬립 (24 x 40 mm; #1.5)Menzel-Glä ser15747592소모품
Cy3 AffiniPure, 당나귀, anti-goat IgG (H+L)Jackson Immuno Research705-165-147Secondary Antibody Vascular
Staining Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L)Jackson Immuno Research712-165-150Secondary Antibody Epithelial Staining
Descosept PURDr.Schuhmacher00-323-100Cell culture consumables
DMEM 고포도당Gibco41965-062세포 배양 소모품
DMEM 고포도당(페놀이 없음 적색Gibco31053028세포 배양 소모품
DPBS (-/-)Gibco14190-169세포 배양 소모품
DPBS (+/+)Gibco14040-133세포 배양 소모품
EDTA 용액Invitrogen15575-038세포 배양 소모품
내피 세포 성장 배지PromocellC-22020세포 배양 소모품
내피 세포 성장 배지 보충제 믹스PromocellC-39225세포 배양 소모품
에탄올 96%, 비변성Nordbrand-Nordhausen410화학 물질
소 태아 혈청invitrogen10270106세포 배양 소모품:
플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란(3-5 kDa)Sigma AldrichFD4-100MG화학 물질
형광 장착 매체DakoS3023화학
물질 겐타마이신(10mg/mL)Sigma AldrichG1272세포 배양 소모품
GlutaMAX Supplement(100x)Gibco35050061세포 배양 소모품
HistopaqueSigma-Aldrich10771세포 배양 소모품
Hoechst (bisBenzimid) H33342Sigma-Aldrich14533상피 염색
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human PlasmaMillipore616397세포 배양 소모품
Human recombinant GM-CSFPeprotech300-30Cell culture consumables
Human 재조합 M-CSFPeprotech300-25세포 배양 소모품
조명 장치ZeissHXP 120 C형광 현미경 설정
레이저 스캐닝 현미경ZeissCLSM980형광 현미경 설정
리도카인 염산염시그마-알드리치L5647세포 배양 소모품
지질다당류(LPS)시그마L2630세포 배양 소모품
Loftex 와이프Loftex1250115소모품
낮은 부착 튜브(PS, 5mL)Falcon352052소모품
상단 캡용 루어 어댑터(M)Mo Bi TecM3003미세유체 소모품
수 미니 루어 플러그, 4열, PP, 불투명미세유체 칩샵09-0556-0336-09미세유체 소모품
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140세포 배양 소모품
MethanolRoth8388.2화학 물질
현미경ZeissAxio Observer 5형광 현미경 설치
현미경 슬라이드MenzelMZ-0002소모품
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 항체 ( KP1)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen14-0688-821차 항체 혈관 염색
단클론, 쥐, 항인간 E-Cadherin 항체(DECMA-1)Sigma-Aldrich, MilliporeMABT261차 항체 상피 염색
Multiskan Go 플레이트 리더Thermo Fisher51119300기술 장비
일반 당나귀 혈청BiozolLIN-END9010-10화학 물질
광학 절단ZeissApoTome형광 현미경 설정
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)Gibco15140-122세포 배양 소모품
플러그Cole ParmerGZ-45555-56미세유체 소모품
다클론, 염소, 항인간 VE-Cadherin 항체R& D SystemsAF9381차 항체 혈관 염색
다클론, 토끼, 항인간 Von Willebrand 인자 항체DakoA00821차 항체 혈관 염색
다클론, 토끼, 항인간 ZO-1 항체Thermo Fisher Scientific, Invitrogen61-73001차 항체 상피 염색
전원 공급 장치 현미경ZeissEplax Vp232형광 현미경 설정
Primovert 현미경Zeiss415510-1101-000기술 장비
Reglo ICC 연동 펌프IsmatecISM4412기술 장비
SAHA (Vorinostat)Sigma AldrichSML0061-25MG화학
물질 SaponinFluka47036화학
물질 S-monovette, 7.5 mL Z-GelSarstedt01.1602소모품
S-Monovette, 9.0 mL K3ESarstedt02.1066.001소모품
Sodium PyruvateGibco11360-088세포 배양 소모품
탱크 4.5 mLChipShop10000079Microfluidic consumables
Trypane blue stain 0.4%InvitrogenT10282Cell culture consumables
TrypsinGibco11538876세포 배양 소모품
TubingDynamic 42ST001미세유체 소모품
핀셋(Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1소모품
밀 배아 응글레티닌 (WGA)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenW32464Epithelial Staining
X-VIVO 15LonzaBE02-060F세포 배양 소모품, Hematopoietic cell medium
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterileGreiner Bio-One662 160소모품
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterileGreiner Bio-One657 160소모품
Zen Blue 소프트웨어Zeiss버전 3.7현미경 소프트웨어
)

참고문헌

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