방법 논문

항생제 내성을 연구하기 위한 모델로 Mycobacterial Biofilm 성장

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DOI:

10.3791/66607

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2024년 7월 12일

 , 
1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 펠리클 바이오필름을 개발하기 위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 다양한 배양 용량으로 확장 가능하여 다양한 실험 목표에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 방법의 설계는 여러 마이코박테리아 종의 생물막 형성 가능성에 대한 정성적 또는 정량적 평가를 가능하게 합니다.

초록

많은 박테리아는 복잡한 자연 군집에서 번성하며 의사 소통, 협력 및 경쟁과 같은 다세포성의 주요 속성을 나타냅니다. 박테리아 다세포 행동의 가장 흔한 징후는 종종 병원성과 관련된 생물막의 형성입니다. 생물막은 항균제에 대한 피난처를 제공하여 항균 내성의 출현을 촉진합니다. 쉐이크 플라스크 액체 배양에서 박테리아를 배양하는 기존의 관행은 자연에서 박테리아의 적절한 생리적 성장을 나타내지 못하며, 결과적으로 박테리아의 복잡한 역학에 대한 이해를 제한합니다. 특히, biofilms에서 거주하는 박테리아의 변화와 transcriptional 단면도는 바싹 자연적으로 성장하는 세포의 그들과 유사합니다. 이러한 평행법은 기초 및 중개 연구를 위한 이상적인 모델로서 생물막의 중요성을 강조합니다. 이 기사에서는 Mycobacterium smegmatis 를 모델 유기체로 활용하여 펠리클 생물막을 배양하는 기술을 설명하는 데 중점을 둡니다. 이 접근법은 다양한 배양량에 적용할 수 있어 항균 연구와 같은 다양한 실험 목표에 대한 구현을 용이하게 합니다. 또한, 이 방법의 설계는 약간의 조정으로 다양한 마이코박테리아 종의 생물막 형성 능력에 대한 정성적 또는 정량적 평가를 가능하게 합니다.

서론

박테리아는 단세포 개체로 생존할 수 있습니다. 그러나 대부분의 생리학적으로 관련된 조건에서 그들은 군집 모방으로 조직됩니다. 생물막(Biofilm)은 자가 생산 매트릭스(self-produced matrix) 1에 둘러싸인 응집된 세포에 의해 형성된 박테리아의 널리 알려진 군집 조직이다. 이러한 조립은 초기 다세포성의 시그니처를 가지고 있으며 박테리아 시스템에 더 높은 응력 탄력성을 제공합니다. 생물막은 종종 항균제에 관대하며 미생물 감염의 거의 80%를 담당하는 것으로 추정됩니다 2,3.

쉐이크 플라스크 및 플레이트 기반 배양은 전통적으로 박테리아 배양을 위한 일반적인 관행이었습니다. 그들의 엄청난 수용성과 성공은 취급 용이성, 재현성 및 확장성에 기인할 수 있습니다. 그러나 생리학적 맥락의 결핍은 이러한 시스템을 사용하여 생성된 지식의 번역 잠재력을 제한한다4. 따라서 생물막은 세균 병태생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델 시스템이 되고 있습니다. 생물막은 자연 조건을 밀접하게 반영하는 동적 모델 시스템을 제공하여 연구원이 영양 구배 및 공간 이질성과 같은 생리학적 측면을 복제할 수 있도록 합니다 5,6.

악명 높은 Mycobacterium tuberculosis를 포함한 마이코박테리아는 생물막 형성에 능숙하기 때문에 생물막 생활방식은 마이코박테리아 연구에서 특히 적절하다7. biofilms 안에서 번성하는 그들의 능력은 감염 도중 주인 조직에 있는 그들의 지속성에 공헌합니다. 이는 마이코세균성 질병을 치료하는 데 있어 만만치 않은 도전이며, 이는 생물막 생활양식과 관련된 고유한 항생제 내성을 감안할 때8. 생물막은 또한 복잡한 미생물 군집 내에서 마이코박테리아가 사용하는 고유한 대사 적응 및 영양소 활용 전략을 조사할 수 있기 때문에 마이코박테리아 대사를 연구하기 위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다9.

생물막이 마이코박테리아 연구를 위한 더 나은 모델 시스템으로 점점 더 많이 받아들여지고 있지만10, 특히 서로 다른 실험실에서 수행된 연구 간에 평행선을 그리기 위해 일관되고 재현 가능한 표준 운영 절차가 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 마이코박테리아 종인 M. smegmatis에 대한 생물막 형성 절차를 설명합니다. M. smegmatis 는 비병원성 및 더 빠른 생물막 형성 역학을 감안할 때 마이코박테리아 생물막을 연구하기 위한 보다 접근하기 쉬운 모델입니다. 이 방법은 항마이코박테리아 스크리닝, 대사산물 추출 및 오믹스 연구와 같은 응용 분야에 맞게 수정할 수 있습니다.

프로토콜

연구에 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. Sauton의 미디어 준비

  1. 50g의 인산이수소칼륨 1.25g을 조심스럽게 무게를 측정하고 50mL의 탈이온수에 용해시켜 2.5% 인산이수소칼륨 용액 50mL를 준비합니다.
  2. 황산마그네슘 2.56g의 무게를 칭량하고 50mL의 탈이온수에 용해시켜 2.5% 황산마그네슘 용액 50mL를 준비합니다.
  3. 10g의 구연산철 암모늄 0.5g의 무게를 측정하고 10mL의 탈이온수에 용해시켜 5% 구연산철 암모늄 용액을 준비합니다. 호박색 튜브에 보관하십시오.
  4. 포도당 20g의 무게를 측정하고 100mL의 탈이온수에 용해시켜 20% 포도당 용액 100mL를 준비합니다. 튜브에 50mL 멸균 주사기와 0.2μM PVDF 주사기 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.
  5. 황산아연 0.1g을 조심스럽게 칭량하고 탈이온수 10mL에 용해시켜 멸균 1% 황산아연 용액 10mL를 준비합니다. 라미나 후드에서 10mL 멸균 주사기와 0.2μM PVDF 주사기 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.
  6. 표 1에 설명된 대로 준비된 성분을 750mL의 탈이온수에 혼합합니다. 용액의 pH를 측정하고 7로 조정합니다. 탈이온수로 부피를 900mL로 구성합니다.
  7. 15PSI 및 121°C에서 15-20분 동안 매체를 고압멸균합니다. 식히십시오. 그런 다음 필터 멸균된 1% 황산아연 100μL를 추가합니다. 필터 멸균된 20% 포도당 100mL를 넣고 잘 녹입니다.

2. 필터 멸균 된 5 % Tween-80의 제조

  1. 0.5mL의 Tween-80을 탈이온수 9.5mL에 녹입니다.
  2. 라미나 후드에서 10mL 멸균 주사기와 0.2μM PVDF 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터 멸균합니다.

3. 초등회 문화 준비

  1. 층류 후드에서 혈청학적 피펫을 사용하여 2mL의 오토클레이브 LB 배지를 두 개의 멸균 14mL 시험관에 분주합니다.
  2. 마이크로피펫을 사용하여 20μL의 필터 멸균된 5% Tween-80을 시험관에 추가합니다.
  3. 접종 루프를 사용하여 극저온 재고를 추가하여 M. smegmatis 를 튜브 중 하나에 접종합니다. 다른 시험관은 미디어 제어 역할을 합니다.
  4. 300 rpm 및 37 °C의 shaker 인큐베이터에서 48시간 동안 튜브를 배양합니다.
    알림: 미디어 제어 튜브에 성장이 나타나지 않아야 합니다.

4. 제2문화 준비

  1. 층류 후드에서 혈청학적 피펫을 사용하여 2mL의 오토클레이브 LB 배지를 두 개의 멸균 14mL 시험관에 분주합니다.
  2. 마이크로피펫을 사용하여 20μL의 필터 멸균된 5% Tween-80을 시험관에 추가합니다.
  3. 마이크로피펫을 사용하여 1차 배양액 20μL를 튜브 중 하나에 추가합니다. 다른 튜브는 미디어 컨트롤로 보관하십시오.
  4. 300 rpm 및 37 °C의 셰이커 인큐베이터에서 OD600 이 0.6 - 0.8이 될 때까지 배양액을 배양합니다.
    참고: 일반적으로 0.6에서 0.8의 OD600 에 도달하는 데 일반적으로 12-14시간이 걸립니다. 다른 세포 밀도도 사용할 수 있지만 정의된 OD600 값은 비교 연구에 도움이 됩니다.

5. 생물막 설정

  1. 층류 후드에서 혈청학적 피펫을 사용하여 2% 포도당이 보충된 Sauton의 배지 6mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.
  2. 마이크로피펫을 사용하여 각 웰에 120μL(즉, 2%)의 2차 접종물을 접종합니다. 백신 접종을 완료하지 않은 것을 미디어 컨트롤로 잘 보관하십시오.
  3. 1mL 마이크로피펫으로 위아래로 피펫팅하여 배지와 배양물을 혼합합니다. 뚜껑을 덮고 파라핀 필름으로 접시를 조심스럽게 밀봉합니다.
  4. 37°C의 정적 인큐베이터에서 7일 동안 방해받지 않고 플레이트를 배양합니다.

6. 단계별 관찰을 위한 생물막 설정

참고: 전체 생물막 설정은 5단계에서 설명한 것과 동일합니다. 다른 시점에서 생물막을 수확하거나 이미지화하려면 동일한 생물막을 별도의 플레이트에 여러 세트로 설정하는 것이 좋습니다.

  1. 3일째와 6일 사이에 생물막을 관찰하려면 동일한 조건으로 4개의 플레이트를 준비하고 이미징을 위해 하루에 하나의 플레이트를 사용합니다.
    참고: 생물막 층은 플레이트 설정 3일째부터 공기-매체 계면에 나타나기 시작합니다.

7. 생물막 발달 추정

  1. 시각적 추정치
    1. epi-white light illumination이 있는 gel documentation system을 사용하여 플레이트를 이미지화합니다(그림 1).
      참고: 이미징은 형성된 생물막의 총 정성적 및 정량적 추정치를 제공합니다. 좋은 품질의 카메라를 대안으로 사용할 수 있습니다.
  2. 건조 중량 추정치
    1. 보다 정확한 정량화를 위해 건조 중량 측정을 수행합니다.
    2. 건조 중량을 측정하려면 먼저 압지의 무게를 측정하십시오.
      알림: 압지 대신 여과지를 사용할 수도 있습니다.
    3. 6웰 플레이트에서 생물막을 추출하고 주걱을 사용하여 종이에 옮깁니다.
    4. 배양물에서 대부분의 생물막을 조심스럽게 수집하고 과도한 양의 매체를 종이에 옮기지 않도록 주의합니다.
    5. 압지에 생물막을 놓습니다.
    6. 생물막이 완전히 건조될 때까지 50°C의 인큐베이터에 0.5-1시간 동안 넣습니다.
    7. 종이와 생물막의 결합된 무게를 측정합니다.
      참고 : 생물막의 건조 중량 = (생물막 + 종이의 무게)-(종이의 무게)

8. 생물막의 항생제 내성 분석

  1. Sauton의 매체11을 사용하여 Irith Wiegand et al.이 설명한 프로토콜에 따라 M. smegmatis 플랑크톤 배양에서 리팜피신의 MIC90을 추정합니다. 배양액이 OD600 0.2에 도달하면 항생제를 추가합니다.
  2. 프로토콜의 5단계에 설명된 대로 생물막 성장을 위한 플레이트를 설정합니다.
  3. 배양 4일째 되는 날에 층류 후드의 마이크로피펫을 사용하여 웰 측면에서 MIC90 농도(64μg/mL)로 배양액에 리팜피신을 추가합니다.
    알림: 생물막을 너무 많이 방해하지 않도록 주의해서 이 작업을 수행하십시오. 생물막이 있는 우물 중 하나를 처리하지 않고 그대로 두십시오.
  4. 항생제를 섞기 위해 플레이트를 천천히 휘젓습니다.
  5. 플레이트의 측면을 파라핀 필름으로 덮고 추가 성장을 위해 인큐베이터에 보관합니다.
  6. 24시간 후, 층류 후드에서 플레이트를 제거하고 생물막이 포함된 모든 웰에서 최종 농도 0.2%까지 Tween-80을 추가합니다.
  7. 다시 한 번, 플레이트를 파라핀 필름으로 덮고 4시간 동안 100°C 및 12rpm으로 유지합니다.
  8. 플레이트를 층류 후드에서 꺼내고 1mL 마이크로피펫으로 성분을 균질화합니다.
  9. Anand et al.12에 설명된 프로토콜을 사용하여 Sauton의 매체로 성분을 세척합니다.
  10. 마지막으로 6mL Sauton의 배지에 세포를 재현탁시키고 10-4, 10-5, 10-6 및 10-7의 최종 농도로 희석합니다.
  11. 오토클레이브 유리 비드를 사용하여 LB-한천 플레이트에 각 희석액을 100μL씩 펴 바릅니다.
  12. 파라핀 필름을 사용하여 모든 플레이트를 밀봉하고 37°C의 인큐베이터에 보관합니다.
  13. 배양 3일 후 각 플레이트의 콜로니를 세십시오. 콜로니 수가 30에서 300 사이인 판만 고려하십시오.
  14. 제공된 공식을 사용하여 CFU/mL와 CFU/mL의 상대적 감소를 계산합니다13.
    참고: CFU/mL = (콜로니 수 × 희석 계수) / (도금 부피(mL))
    CFU/mL의 상대적 감소 = ((미처리의 CFU/mL - 처리의 CFU/mL)) / ((미처리의 CFU/mL)) × 100

결과

생물막 펠리클은 3일째부터 육안으로 볼 수 있습니다. 생물막은 2% 포도당 없이 Sauton의 매체에서 자라지만, 첨가되었을 때 망상에서 개선이 관찰되었습니다. 우리는 4일 동안 성장한 1.5mL의 Sauton's 배지(2% 포도당 보충)와 함께 24웰 플레이트의 각 웰에서 10.48mg ± 3.13mg(n = 4)의 생물막 건조 중량을 얻었습니다. 그림 2에서 생물막 발달은 3일째부터 6일째까지 볼 수 있었습니다. 3일째에 약간의 망상으로 필름을 형성하기 시작하고 5일째가 되면 완전히 성숙합니다. 6일째부터 생물막이 분해되기 시작합니다. 리팜피신(64μg/mL)의 MIC90은 생물막의 CFU를 25% 감소± 12%(n=3)만 감소시켰습니다.

figure-results-1
그림 1 : Sauton의 매체에서 4 일 배양 후 M. smegmatis의 생물막. (1) 포도당없이 2 % 접종물을 접종합니다. (2) 포도당을 사용하지 않고 4% 접종물을 접종한다. (3) 2% 포도당으로 2% 접종물을 접종한다. (4) 2 % 포도당으로 4 % 접종을한다. (5) 및 (6)은 미디어 컨트롤입니다. 여기서 샘플은 표준 6웰 플레이트에 있습니다. 사진은 확대 없이 캡처됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 접종 후 3일째부터 6일째까지의 M. smegmatis 생물막 형태. 여기서 샘플은 표준 24웰 플레이트에 있습니다. 사진은 확대 없이 캡처됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

S. 아니.구성 요소작동 농도 (w/v)스톡 용액 농도스톡 용액의 부피/무게
1인산이수소칼륨0.05%2.50%20mL
2황산 마그네슘0.05%2.50%20mL
3구연산 제2철암모늄0.01%5%1mL
4글리세롤6%100%60mL
5L- 아스파라긴0.40%해당 없음4 지
6구연산0.20%해당 없음2 지

표 1: Sauton의 미디어 준비를 위한 구성 요소.

토론

미생물의 다세포 생활 방식은 거의 100년 전에 설명되었습니다. 그러나 임상연구는 여전히 드물게 진행되고 있는데, 이는 대부분 강력한 방법의 부족으로 인한 것이다14. 생물막 생물학에 대한 연구에서 설명된 방법은 종종 적용하기 어렵습니다. 여기에서 중요한 단계의 시연을 통한 상세한 방법론이 프로토콜의 재현성을 향상시킬 것으로 예상됩니다.

이 기사에서 기술된 생물막 생산의 방법은 확장 가능하, 매체 부피 및 접종물 크기에 비례적인 증가를 요구한다. 대사산물 추출과 같은 응용 분야에는 더 많은 배양량이 필요한 반면, 항균제 감수성 분석에는 더 작은 바이오매스가 필요합니다12. 게다가, 접종물의 크기는 생물막 형성의 비율을 맞추기 위하여 조정될 수 있습니다. 이러한 유연성을 통해 연구원은 실험 시간을 적절하게 제어할 수 있습니다.

성장 조건과 미세환경은 생물막 생리학에서 중요한 역할을 합니다15. 특히, 포도당의 존재는 생물막을 형성하는 데 필수적이지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 2% 포도당의 포함은 생물막의 망상과 안정성을 향상시키기 위해 관찰되었습니다. 또 다른 흥미로운 관찰은 배양 웰의 바닥에 유리 커버슬립을 배치할 때의 생물막 강화 잠재력입니다. 1차 배양과 2차 배양에서 Tween-80을 추가하는 것은 세포 응집을 완화하는 데 매우 중요합니다.

생물막 발달에는 부착, 성숙 및 분산과 같은 뚜렷한 성장 단계가 포함됩니다. 여기에 설명된 생물막 설정은 일반적으로 7일 동안 배양되지만 펠리클은 3일째부터 육안으로 볼 수 있습니다. 이 설정을 통해 생물막 발달의 시간적 역학을 연구할 수 있습니다. 이 기사에서는 생물막 바이오매스를 평가하기 위한 건조 중량 추정을 설명하지만, 이 설정은 기존의 결정 보라색 염색 또는 현미경 기반 추정에도 적용할 수 있습니다12,16.

마이코박테리아에 의한 생물막의 생성은 병원성에 중요한 역할을 하며 약물에 대한 내성을 향상시킵니다 8,17. 우리는 진탕 플라스크 배양에 비해 생물막 배양에서 7-8배 더 높은 항생제 내성을 관찰했습니다. 몇몇 그룹은 세균성 생리학을 공부하기 위한 모형 체계로 biofilms를 이용합니다; Mycobacterial Research 커뮤니티에서 이 성장 모드를 광범위하게 채택하면 이 속 내 다양한 병원성 종의 병태생리학에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 아미테시 아난드(Amitesh Anand)가 수여한 DBT-Ramalingaswami Fellowship의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 & 마이크로; M PVDF 주사기 필터AxivaSFNY04 R
1 mL 팁GenetixGXM-611000 C
10 µ L 팁GenetixGXM-6110 C
200 µ L 팁GenetixGXM-61200C
6웰 폴리프로필렌 플레이트Tarsons980010
호박색 튜브Tarsons546051
오토클레이브Hospharma
생물안전 캐비닛 A IIMSET
블로팅 페이적합한 공급업체
원심분리기Eppendorf
Citric acidSigma251275
CuvettesBio-Rad2239955
Ferric ammonium citrateSigmaF5879
Gel 문서화 시스템Bio-Rad
Glass BeadsSigmaG8772
GlucoseSigma49139
글리세롤시그마G5516
접종 루프GenaxyHS81121C
L-Aspargine시그마A0884
LB-한천HimediaM1151
LB-mediaHimediaM575
M. smegmatis mc2155 cryo-stockATCC700084
황산 마그네슘시그마M2643
마이크로 피펫Gilson
파라 필름타손
페트리 접시Tarsons460020
pH 측정기Labman Scientific Instruments
플레이트 리더Tecan
폴리 프로필렌 시험관GenaxyGEN-14100-PS
인산칼륨 일염기성시그마P5379
리팜피신MedchemExpressHY-B0272
혈청학 피펫SPL Life Sciences95210
셰이커 인큐베이터Eppendorf
주걱
분광 광도계Thermo Scientific
정적 인큐베이터CARON
멸균 10 mL 주사기Becton Dickinson309642
멸균 50 mL 주사기Becton Dickinson309653
Tween-80SigmaP1754
계량 저울Sartorius
황산 아연SigmaZ0251
퍼

참고문헌

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  16. O'Toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis exp. (47), e2437(2011).
  17. Chakraborty, P., Bajeli, S., Kaushal, D., Radotra, B. D., Kumar, A. Biofilm formation in the lung contributes to virulence and drug tolerance of Mycobacterium tuberculosis. Nat Comm. 12 (1), 1606(2021).

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