항생제 내성을 연구하기 위한 모델로 Mycobacterial Biofilm 성장

박테리아는 단세포 개체로 생존할 수 있습니다. 그러나 대부분의 생리학적으로 관련된 조건에서 그들은 군집 모방으로 조직됩니다. 생물막(Biofilm)은 자가 생산 매트릭스(^{self-produced} matrix) 1에 둘러싸인 응집된 세포에 의해 형성된 박테리아의 널리 알려진 군집 조직이다. 이러한 조립은 초기 다세포성의 시그니처를 가지고 있으며 박테리아 시스템에 더 높은 응력 탄력성을 제공합니다. 생물막은 종종 항균제에 관대하며 미생물 감염의 거의 80%를 담당하는 것으로 추정됩니다 ^2,3.

쉐이크 플라스크 및 플레이트 기반 배양은 전통적으로 박테리아 배양을 위한 일반적인 관행이었습니다. 그들의 엄청난 수용성과 성공은 취급 용이성, 재현성 및 확장성에 기인할 수 있습니다. 그러나 생리학적 맥락의 결핍은 이러한 시스템을 사용하여 생성된 지식의 번역 잠재력을 제한한다⁴. 따라서 생물막은 세균 병태생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델 시스템이 되고 있습니다. 생물막은 자연 조건을 밀접하게 반영하는 동적 모델 시스템을 제공하여 연구원이 영양 구배 및 공간 이질성과 같은 생리학적 측면을 복제할 수 있도록 합니다 ^5,6.

악명 높은 Mycobacterium tuberculosis를 포함한 마이코박테리아는 생물막 형성에 능숙하기 때문에 생물막 생활방식은 마이코박테리아 연구에서 특히 적절하다⁷. biofilms 안에서 번성하는 그들의 능력은 감염 도중 주인 조직에 있는 그들의 지속성에 공헌합니다. 이는 마이코세균성 질병을 치료하는 데 있어 만만치 않은 도전이며, 이는 생물막 생활양식과 관련된 고유한 항생제 내성을 감안할 때⁸. 생물막은 또한 복잡한 미생물 군집 내에서 마이코박테리아가 사용하는 고유한 대사 적응 및 영양소 활용 전략을 조사할 수 있기 때문에 마이코박테리아 대사를 연구하기 위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다⁹.

생물막이 마이코박테리아 연구를 위한 더 나은 모델 시스템으로 점점 더 많이 받아들여지고 있지만¹⁰, 특히 서로 다른 실험실에서 수행된 연구 간에 평행선을 그리기 위해 일관되고 재현 가능한 표준 운영 절차가 필요합니다. 여기에 설명된 방법은 마이코박테리아 종인 M. smegmatis에 대한 생물막 형성 절차를 설명합니다. M. smegmatis 는 비병원성 및 더 빠른 생물막 형성 역학을 감안할 때 마이코박테리아 생물막을 연구하기 위한 보다 접근하기 쉬운 모델입니다. 이 방법은 항마이코박테리아 스크리닝, 대사산물 추출 및 오믹스 연구와 같은 응용 분야에 맞게 수정할 수 있습니다.

연구에 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. Sauton의 미디어 준비

1. 50g의 인산이수소칼륨 1.25g을 조심스럽게 무게를 측정하고 50mL의 탈이온수에 용해시켜 2.5% 인산이수소칼륨 용액 50mL를 준비합니다.
2. 황산마그네슘 2.56g의 무게를 칭량하고 50mL의 탈이온수에 용해시켜 2.5% 황산마그네슘 용액 50mL를 준비합니다.
3. 10g의 구연산철 암모늄 0.5g의 무게를 측정하고 10mL의 탈이온수에 용해시켜 5% 구연산철 암모늄 용액을 준비합니다. 호박색 튜브에 보관하십시오.
4. 포도당 20g의 무게를 측정하고 100mL의 탈이온수에 용해시켜 20% 포도당 용액 100mL를 준비합니다. 튜브에 50mL 멸균 주사기와 0.2μM PVDF 주사기 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.
5. 황산아연 0.1g을 조심스럽게 칭량하고 탈이온수 10mL에 용해시켜 멸균 1% 황산아연 용액 10mL를 준비합니다. 라미나 후드에서 10mL 멸균 주사기와 0.2μM PVDF 주사기 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.
6. 표 1에 설명된 대로 준비된 성분을 750mL의 탈이온수에 혼합합니다. 용액의 pH를 측정하고 7로 조정합니다. 탈이온수로 부피를 900mL로 구성합니다.
7. 15PSI 및 121°C에서 15-20분 동안 매체를 고압멸균합니다. 식히십시오. 그런 다음 필터 멸균된 1% 황산아연 100μL를 추가합니다. 필터 멸균된 20% 포도당 100mL를 넣고 잘 녹입니다.

2. 필터 멸균 된 5 % Tween-80의 제조

1. 0.5mL의 Tween-80을 탈이온수 9.5mL에 녹입니다.
2. 라미나 후드에서 10mL 멸균 주사기와 0.2μM PVDF 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터 멸균합니다.

3. 초등회 문화 준비

1. 층류 후드에서 혈청학적 피펫을 사용하여 2mL의 오토클레이브 LB 배지를 두 개의 멸균 14mL 시험관에 분주합니다.
2. 마이크로피펫을 사용하여 20μL의 필터 멸균된 5% Tween-80을 시험관에 추가합니다.
3. 접종 루프를 사용하여 극저온 재고를 추가하여 M. smegmatis 를 튜브 중 하나에 접종합니다. 다른 시험관은 미디어 제어 역할을 합니다.
4. 300 rpm 및 37 °C의 shaker 인큐베이터에서 48시간 동안 튜브를 배양합니다.
   알림: 미디어 제어 튜브에 성장이 나타나지 않아야 합니다.

4. 제2문화 준비

1. 층류 후드에서 혈청학적 피펫을 사용하여 2mL의 오토클레이브 LB 배지를 두 개의 멸균 14mL 시험관에 분주합니다.
2. 마이크로피펫을 사용하여 20μL의 필터 멸균된 5% Tween-80을 시험관에 추가합니다.
3. 마이크로피펫을 사용하여 1차 배양액 20μL를 튜브 중 하나에 추가합니다. 다른 튜브는 미디어 컨트롤로 보관하십시오.
4. 300 rpm 및 37 °C의 셰이커 인큐베이터에서 OD₆₀₀ 이 0.6 - 0.8이 될 때까지 배양액을 배양합니다.
   참고: 일반적으로 0.6에서 0.8의 OD₆₀₀ 에 도달하는 데 일반적으로 12-14시간이 걸립니다. 다른 세포 밀도도 사용할 수 있지만 정의된 OD₆₀₀ 값은 비교 연구에 도움이 됩니다.

5. 생물막 설정

1. 층류 후드에서 혈청학적 피펫을 사용하여 2% 포도당이 보충된 Sauton의 배지 6mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다.
2. 마이크로피펫을 사용하여 각 웰에 120μL(즉, 2%)의 2차 접종물을 접종합니다. 백신 접종을 완료하지 않은 것을 미디어 컨트롤로 잘 보관하십시오.
3. 1mL 마이크로피펫으로 위아래로 피펫팅하여 배지와 배양물을 혼합합니다. 뚜껑을 덮고 파라핀 필름으로 접시를 조심스럽게 밀봉합니다.
4. 37°C의 정적 인큐베이터에서 7일 동안 방해받지 않고 플레이트를 배양합니다.

6. 단계별 관찰을 위한 생물막 설정

참고: 전체 생물막 설정은 5단계에서 설명한 것과 동일합니다. 다른 시점에서 생물막을 수확하거나 이미지화하려면 동일한 생물막을 별도의 플레이트에 여러 세트로 설정하는 것이 좋습니다.

1. 3일째와 6일 사이에 생물막을 관찰하려면 동일한 조건으로 4개의 플레이트를 준비하고 이미징을 위해 하루에 하나의 플레이트를 사용합니다.
   참고: 생물막 층은 플레이트 설정 3일째부터 공기-매체 계면에 나타나기 시작합니다.

7. 생물막 발달 추정

1. 시각적 추정치
   1. epi-white light illumination이 있는 gel documentation system을 사용하여 플레이트를 이미지화합니다(그림 1).
      참고: 이미징은 형성된 생물막의 총 정성적 및 정량적 추정치를 제공합니다. 좋은 품질의 카메라를 대안으로 사용할 수 있습니다.
2. 건조 중량 추정치
   1. 보다 정확한 정량화를 위해 건조 중량 측정을 수행합니다.
   2. 건조 중량을 측정하려면 먼저 압지의 무게를 측정하십시오.
      알림: 압지 대신 여과지를 사용할 수도 있습니다.
   3. 6웰 플레이트에서 생물막을 추출하고 주걱을 사용하여 종이에 옮깁니다.
   4. 배양물에서 대부분의 생물막을 조심스럽게 수집하고 과도한 양의 매체를 종이에 옮기지 않도록 주의합니다.
   5. 압지에 생물막을 놓습니다.
   6. 생물막이 완전히 건조될 때까지 50°C의 인큐베이터에 0.5-1시간 동안 넣습니다.
   7. 종이와 생물막의 결합된 무게를 측정합니다.
      참고 : 생물막의 건조 중량 = (생물막 + 종이의 무게)-(종이의 무게)

8. 생물막의 항생제 내성 분석

1. Sauton의 매체¹¹을 사용하여 Irith Wiegand et al.이 설명한 프로토콜에 따라 M. smegmatis 플랑크톤 배양에서 리팜피신의 MIC90을 추정합니다. 배양액이 OD₆₀₀ 0.2에 도달하면 항생제를 추가합니다.
2. 프로토콜의 5단계에 설명된 대로 생물막 성장을 위한 플레이트를 설정합니다.
3. 배양 4일째 되는 날에 층류 후드의 마이크로피펫을 사용하여 웰 측면에서 MIC90 농도(64μg/mL)로 배양액에 리팜피신을 추가합니다.
   알림: 생물막을 너무 많이 방해하지 않도록 주의해서 이 작업을 수행하십시오. 생물막이 있는 우물 중 하나를 처리하지 않고 그대로 두십시오.
4. 항생제를 섞기 위해 플레이트를 천천히 휘젓습니다.
5. 플레이트의 측면을 파라핀 필름으로 덮고 추가 성장을 위해 인큐베이터에 보관합니다.
6. 24시간 후, 층류 후드에서 플레이트를 제거하고 생물막이 포함된 모든 웰에서 최종 농도 0.2%까지 Tween-80을 추가합니다.
7. 다시 한 번, 플레이트를 파라핀 필름으로 덮고 4시간 동안 100°C 및 12rpm으로 유지합니다.
8. 플레이트를 층류 후드에서 꺼내고 1mL 마이크로피펫으로 성분을 균질화합니다.
9. Anand et ^al.12에 설명된 프로토콜을 사용하여 Sauton의 매체로 성분을 세척합니다.
10. 마지막으로 6mL Sauton의 배지에 세포를 재현탁시키고 ^10-4, ^10-5, ^10-6 및 ^10-7의 최종 농도로 희석합니다.
11. 오토클레이브 유리 비드를 사용하여 LB-한천 플레이트에 각 희석액을 100μL씩 펴 바릅니다.
12. 파라핀 필름을 사용하여 모든 플레이트를 밀봉하고 37°C의 인큐베이터에 보관합니다.
13. 배양 3일 후 각 플레이트의 콜로니를 세십시오. 콜로니 수가 30에서 300 사이인 판만 고려하십시오.
14. 제공된 공식을 사용하여 CFU/mL와 CFU/mL의 상대적 감소를 계산합니다¹³.
    참고: CFU/mL = (콜로니 수 × 희석 계수) / (도금 부피(mL))
    CFU/mL의 상대적 감소 = ((미처리의 CFU/mL - 처리의 CFU/mL)) / ((미처리의 CFU/mL)) × 100

생물막 펠리클은 3일째부터 육안으로 볼 수 있습니다. 생물막은 2% 포도당 없이 Sauton의 매체에서 자라지만, 첨가되었을 때 망상에서 개선이 관찰되었습니다. 우리는 4일 동안 성장한 1.5mL의 Sauton's 배지(2% 포도당 보충)와 함께 24웰 플레이트의 각 웰에서 10.48mg ± 3.13mg(n = 4)의 생물막 건조 중량을 얻었습니다. 그림 2에서 생물막 발달은 3일째부터 6일째까지 볼 수 있었습니다. 3일째에 약간의 망상으로 필름을 형성하기 시작하고 5일째가 되면 완전히 성숙합니다. 6일째부터 생물막이 분해되기 시작합니다. 리팜피신(64μg/mL)의 MIC90은 생물막의 CFU를 25% 감소± 12%(n=3)만 감소시켰습니다.

그림 1 : Sauton의 매체에서 4 일 배양 후 M. smegmatis의 생물막. (1) 포도당없이 2 % 접종물을 접종합니다. (2) 포도당을 사용하지 않고 4% 접종물을 접종한다. (3) 2% 포도당으로 2% 접종물을 접종한다. (4) 2 % 포도당으로 4 % 접종을한다. (5) 및 (6)은 미디어 컨트롤입니다. 여기서 샘플은 표준 6웰 플레이트에 있습니다. 사진은 확대 없이 캡처됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 접종 후 3일째부터 6일째까지의 M. smegmatis 생물막 형태. 여기서 샘플은 표준 24웰 플레이트에 있습니다. 사진은 확대 없이 캡처됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: Sauton의 미디어 준비를 위한 구성 요소.

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.