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방법 논문

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

3.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66613

⸱

2024년 5월 24일

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

초록

성체 쥐에서 골수를 분리하기 위한 다양한 기술이 잘 확립되어 있습니다. 그러나 신생아 마우스에서 골수를 분리하는 것은 어렵고 시간이 많이 걸리지만, 일부 모델의 경우 번역학적으로 관련성이 있고 필요합니다. 이 프로토콜은 7-9일 된 새끼의 골수 세포를 준비하기 위한 효율적이고 간단한 방법을 설명합니다. 그런 다음 이러한 세포를 추가로 분리하거나 특정 관심 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 대식세포는 염증과 감염에 중요한 역할을 하는 중요한 면역 세포입니다. 발달 과정에서 신생아 대식세포는 조직 리모델링에 크게 기여합니다. 또한, 신생아 대식세포의 표현형과 기능은 성인 대식세포의 표현형과 기능이 다릅니다. 이 프로토콜은 또한 L929 컨디셔닝 배지가 있는 상태에서 분리된 골수 세포와 신생아 대식세포의 분화를 설명합니다. 분화된 신생아 대식세포에 대한 표면 마커는 유세포 분석을 사용하여 평가되었습니다. 기능성을 입증하기 위해 phagocytic efficiency는 pH 민감성 염료 접합 Escherichia coli를 사용하여 테스트했습니다.

서론

골수는 조혈모세포군과 중간엽줄기세포 집단을 모두 둘러싸고 있으며, 이들은 자가 재생이 가능하고 다양한 세포계로 분화할 수 있습니다. 골수에 있는 조혈모세포는 골수성 및 림프구 계통을 생성한다1. 중간엽 줄기세포는 골아세포(뼈), 지방세포(지방) 또는 연골세포(연골)를 생성합니다2. 이 세포는 유전자 치료 3,4를 포함하여 세포 생물학 및 조직 공학 분야에서 여러 응용 분야를 가지고 있습니다. 골수에 존재하는 전구 세포는 계통 특이적 성장 인자의 존재 하에 특정 세포 유형으로 분화합니다. 에리트로포이에틴(Erythropoietin)은 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)의 증식을 촉진하고, 과립구 집락 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)는 호중구 집락의 성장을 촉진하며, 트롬보포이에틴(thrombopoietin)은 혈소판 생성을 조절하는 계통 특이적 성장 인자(lineage-specific growth factor)의 몇 가지 예이다5. FACS 및 MACS(magnetic-activated cell sorting)로 표시된 세포 표면 항원은 특정 골수 유래 세포 유형의 분리 및 정제를 위한 잘 정립된 방법입니다6.

신생아 사망의 원인을 찾고 조산 중 합병증을 해결하기 위해 신생아 연구가 진행되고 있지만, 직접적인 치료법 개발은 여전히 충족되지 않은 의학적 수요로 남아 있습니다. Smith와 Davis는 "소아 환자들은 여전히 치료적 고아로 남아 있다"고 말했다.7. 신생아를 대상으로 한 임상시험에서 작은 표본, 결과의 평생 영향, 동의를 얻는 데 있어 윤리적 문제 등 여러 가지 어려움이 있다8. 따라서 번역 관련성을 달성하기 위해 신생아에 특화된 in vivo 및 in vitro 연구 모델에 대한 수요가 높습니다. 해부학적 수준과 조직 수준, 짧은 임신 기간, 새끼 크기 사이의 유사성 때문에 설치류는 가장 많이 연구된 포유류 모델 시스템입니다.

여기에서는 7-9일 된 새끼 쥐에서 골수를 분리하고 대식세포로 분화하는 능력을 위한 상세하고 실현 가능하며 재현 가능한 절차를 설명합니다. 그러나 뚜렷한 분화 신호를 사용하여 다양한 세포 계통을 얻을 수 있습니다. 또한 세포 표면 마커의 존재와 골수 유래 대식세포(BMDM)에 대해 예상되는 체외 식세포 활성의 존재를 입증합니다.

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프로토콜

모든 절차는 West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees의 승인을 받았으며 National Research Council의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 이 연구에는 C57BL/6J 새끼 쥐가 사용되었습니다. 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 미디어 준비

  1. 10% FBS, 2mM 글루타민, 25mM HEPES 및 페니실린(100U/mL)/스트렙토마이신(100μg/mL)이 보충된 MEM 배양 배지 3mL를 5mL 원심분리기 튜브에 준비하고 얼음에 보관합니다.
  2. 골수 전구 세포를 액체 질소에 보관해야 하는 경우 10% DMEM, 80% FBS 및 10% DMSO를 포함하는 냉동 배지를 준비합니다.
  3. 완전한 DMEM을 위해 10% FBS, 2mM 글루타민, 25mM HEPES 및 페니실린(100U/mL)/스트렙토마이신(100μg/mL)이 보충된 DMEM을 준비합니다.
  4. 대식세포 분화를 위해 10% FBS, 2mM 글루타민, 페니실린(100U/mL)/스트렙토마이신(100μg/mL) 및 10% L929세포 상층액 9,10,11이 보충된 DMEM을 준비합니다.

2. L929 세포 상층액 제제

  1. 액체 질소에 저장된 L929 세포를 해동하고 5mL의 완전한 DMEM이 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 실온에서 350 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  2. 5mL의 완전한 DMEM 배지에 세포를 재현탁시키고 2×105 세포 밀도의 T25 조직 배양 플라스크에 파종합니다. 0.4% 트리판 블루를 사용하는 자동 세포 카운터로 세포를 계수합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 로 70 % 밀도가 될 때까지 배양합니다.
  3. 세포를 분리하려면 먼저 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다. PBS를 흡인하고 2.5mL 0.05% 트립신-EDTA로 교체합니다.
  4. 37°C에서 5% CO2 로 5분 동안 배양하고 5mL의 완전한 DMEM을 추가합니다.
  5. 세포를 수집하고 실온에서 350 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  6. 세포 펠릿을 15mL의 완전한 DMEM 배지에 재현탁시키고 T75 플라스크에 옮깁니다.
  7. 세포가 90 % 밀도에 도달 할 때까지 5 % CO2 로 37 ° C에서 배양 한 다음 배지를 수집하고 500 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 0.45μm 필터를 통해 M-CSF가 포함된 매체를 여과하고 -80°C에서 5mL 부분 표본으로 동결합니다.

3. 동물 준비

  1. 생물 안전 캐비닛 아래에서 7-9일 된 C57BL/6J 새끼 C57BL/6J 새끼(6마리의 새끼)를 댐에서 조심스럽게 분리하여 별도의 케이지에 넣습니다.
  2. 수의학 등급 이소플루란 2mL에 면봉을 담그고 벨 항아리 또는 기타 격리실에 넣습니다.
  3. 챔버에 강아지를 놓고 뚜껑을 닫습니다. 신생아가 움직이지 않고 의식을 잃었는지 확인하기 위해 약 90초 동안 모니터링합니다.
  4. 강아지가 의식을 회복하기 전에 강아지를 빠르게 제거하고 날카로운 가위(기관에서 승인한 프로토콜에 따라)로 목을 베십시오.
    참고: 신생아는 이소플루란 흡입만으로는 안락사를 위해 충분히 깊게 숨을 쉬지 않습니다.
  5. 각 강아지를 제거한 후에는 용기의 뚜껑을 닫아야 합니다. 같은 면봉은 5-7마리의 새끼에게 사용할 수 있습니다.

4. 신생아 골수의 분리

  1. 신생아의 몸을 70 % 에탄올로 살균하십시오.
  2. "집게와 끝이 가는 수술용 가위를 사용하여 집 사이를 절개합니다.
    복부와 뒷다리. 뒷다리 발 쪽으로 당겨 피부를 제거합니다.
  3. 날카로운 집게를 사용하여 뼈에 붙어있는 결합 조직과 근육을 긁어냅니다.
  4. 그림 1과 같이 경골과 대퇴골을 가위로 잘라 분리하고 제거합니다. 집게를 사용하여 이 뼈를 얼음 위의 미디어 튜브에 넣습니다. 각 새끼에 대해 이 과정을 반복합니다.
  5. 집게를 사용하여 뼈를 수집 튜브가 있는 40μm 여과기로 옮깁니다. 뼈를 부수고 3mL 주사기 플런저로 여과기를 눌러 골수를 풀어줍니다.
  6. 셀 현탁액을 350 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  7. 상층액을 흡인하고 적혈구 용해를 위한 저긴장성 용액인 0.2% NaCl을 부드럽게 피펫팅하여 세포를 부유시킵니다. 즉시 1.6% NaCl의 동일한 부피를 추가하여 용액을 등장성으로 만듭니다.
  8. 350 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리하고 용액을 제거합니다.
  9. 즉시 사용할 수 있도록 완전한 DMEM에 재현탁하거나 보관을 위해 배지를 동결하고 혈구계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계수합니다.
    참고: 본 연구에서 이 방법은 106 개의 골수 세포/새끼× 6.55(± 1.44)를 산출했습니다(그림 1E).
  10. 셀을 -80 °C의 냉동 매체에 보관하거나 아래 설명된 대로 즉시 사용하십시오.
    참고: 나이가 들었기 때문에 뼈는 투명하고 투명하여 뼈를 통해 골수를 시각화할 수 있습니다. 뼈를 당기는 동안 약간의 압력을 가하면 골수를 풀어주기에 충분할 수 있으므로 주의하는 것이 중요합니다. 신생아 뼈의 골수는 성인 뼈에서 발견되는 온전한 실이 아니라 액체 형태입니다. 뼈를 채취하는 동안 골수가 빠져 나가면 골수를 채취하기가 어렵습니다.

5. 신생아 골수 유래 대식세포의 분화

  1. M-CSF의 공급원으로 10% L929 세포 상층액(2.5mL)을 함유한 10mL의 완전한 DMEM 10mL에 T75 플라스크당 2 × 107 개의 골수 세포를 파종합니다. 배양 접시를 37 ° C에서 5 % CO2 로 5 일 동안 배양합니다. 분화 3일차에 L929 컨디셔닝 배지 2mL를 추가합니다.
  2. 도립 현미경과 20배 배율의 이미징 시스템을 사용하여 현미경으로 매일 세포를 관찰합니다. 분화 시 대식세포는 부착성이 있고 길쭉하며 이질적으로 보여야 합니다(그림 2).
  3. 다운스트림 분석을 위해 대식세포를 수확하려면 분화 배지를 흡입합니다.
  4. 5mL의 PBS로 세포를 세척하여 분리를 방해하는 비부착 세포와 혈청 단백질을 제거합니다. PBS를 흡인합니다.
  5. 플라스크에 0.05% 트립신-EDTA 5mL를 첨가하여 세포를 수확합니다. 배양 플라스크를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터와 함께 5분 동안 놓고 5mL의 DMEM을 추가합니다.
  6. 세포를 피펫팅하여 분리하고 실온에서 350 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  7. 세포 펠릿을 1mL의 완전한 DMEM에서 해리하고 trypan blue를 사용하여 세포 생존율을 계산하고 확인합니다. 이 방법을 사용하여 분리된 BMDM은 7.05(± 2.52) ×105 세포/강아지입니다(그림 1E).
    참고: 분화 2일째에 나타나기 시작하는 방추체 모양의 세포가 있는지 관찰하십시오(그림 1B, 빨간색 화살표). 미디어의 색상이 노란색으로 변하여 사용되었음을 나타내면 차별화 4일차에 L929 컨디셔닝 미디어를 더 추가합니다. 미디어를 완전히 교체하는 것은 권장되지 않습니다.

6. 면역표지 및 유세포 분석

  1. 제조업체 권장 사항에 따라 100μL/라벨 유세포 분석 완충액(2mM EDTA 및 0.5% 소 혈청 알부민이 보충된 PBS)에서 제조업체 권장 사항에 따라 10μL/107 세포의 FcR 차단 시약으로 처리하여 BMDM(2x105/라벨)의 비특이적 항체 라벨링을 차단합니다. 10분 동안 얼음 위에 두십시오.
    알림: 세포는 대량으로 또는 개별 웰 또는 튜브에서 차단할 수 있습니다. 모든 후속 단계는 최종 부피 100 μL에서 개별 cell marker label당 양과 부피를 표시합니다.
  2. 200μL의 유세포 분석 완충액과 원심분리기를 추가하여 세포를 세척하고 실온에서 7분 동안 525 x g 에서 원심분리합니다.
  3. 상층액을 제거하고 웰당 5 × 105 셀의 밀도로 U-바닥 96 웰 플레이트에 세포를 파종합니다. 3,000배로 희석한 FVS780-Live/Dead 세포 계수 염료와 0.625μL의 BV786-CD11b, PE-F4/80 및 AlexaFluor488-CD206을 100μL의 유세포 분석 완충액에 개별적으로 또는 조합하여 12,13,14,15를 첨가하여 세포를 염색합니다. 호일로 덮인 얼음 위에서 45분 동안 세포를 배양합니다.
  4. 100 μL의 유세포 분석 완충액을 추가하고 실온에서 525 x g 에서 7분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.
  5. 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 부드럽게 소용돌이시킵니다. 각 웰에 0.4% 파라포름알데히드 100μL를 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
  6. 100 μL의 유세포 분석 완충액과 펠릿을 첨가하여 실온에서 525 x g 에서 7분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.
  7. 400 μL의 유세포 분석 버퍼에 세포를 재현탁시키고 유세포 분석기를 사용하여 분석합니다.

7. 신생아 골수 유래 대식세포의 식세포 효능을 평가하기 위한 시험관 내 분석

  1. 페놀 레드 또는 항생제 없이 BMDM을 완전한 DMEM에 재현탁시키고 500 μL 부피의 35mm 쿼드 접시에서 2 × 105/ 사분면의 밀도로 파종합니다.
  2. 25의 감염 다중성(MOI) 또는 기타 원하는 MOI에서 세균 접종물을 준비하려면 -80°C에서 보관된 미리 계산된 대장균 O1:K1:H7 재고를 제거합니다.
  3. 원하는 양의 박테리아를 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에 분취합니다. 총 부피 1mL에 PBS를 추가하여 박테리아를 세척합니다. 실온에서 2,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠렛화합니다. 세탁 단계를 반복합니다.
  4. 50 μL의 PBS에 박테리아 펠릿을 재현탁시키고 녹색 형광 pH에 민감한 염료를 최종 농도 500 μM에 첨가합니다. 이것은 중성 pH에서 형광 신호가 없는 pH에 민감한 염료이며 식세포작용 과정에서 산성화된 phagosome과 같은 산성 환경에서 밝게 형광을 발합니다.
  5. 염료 접합을 위해 어두운 곳에서 20분 동안 박테리아 세포를 배양합니다.
  6. 실온에서 1000 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하여 PBS 1mL로 박테리아를 4 회 세척합니다.
  7. 페놀 레드가 없는 500μL의 완전한 DMEM에 박테리아를 재현탁시키고 BMDM 배양에 추가합니다.
  8. BMDM을 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양한 다음 리소좀을 염색하는 세포 투과성 적색 형광 염료 200ng를 추가합니다.
    참고: 식세포 박테리아는 형광 현미경으로 시각화할 수 있습니다.

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결과

이 연구에서 설명한 방법을 사용하면 5마리의 C57BL/6 새끼 쥐에서 2,500만에서 3,700만 개의 골수 세포를 성공적으로 분리할 수 있습니다. 이 방법은 5마리에서 7마리 사이의 새끼 크기로 검증되었습니다. 우리 실험에서 격리를 위한 최소 연령은 7일이었습니다. 배설물의 크기와 실험에 필요한 세포의 수가 100만 개 미만인 경우, 연구자들은 생후 7일 미만의 생쥐에 대해 이 프로토콜을 시도할 수 있습니다. M-CSF의 공급원으로 L929-세포 상층액이 있는 경우, 골수 세포는 5일 만에 대식세포로 분화되었습니다(그림 2). 분화 2일째에 방추체 모양의 세포가 형성되었고(그림 2B), 세포의 거의 절반이 3일째에 방추체 모양을 보였으며(그림 2C), 대부분의 세포는 분화 5일째에 부착되어 길쭉한 방추 모양을 형성했습니다(그림 2...

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토론

신생아 마우스 모델과 관련된 연구는 여러 가지 과제를 제시할 수 있습니다. 신생아는 성인에 비해 독특한 면역 체계가 발달하고 있다8. 따라서 성체 동물 모델에서 생성된 데이터는 신생아에게 적용되는 것으로 가정해서는 안 되며, 여러 출판된 연구에서 이 아이디어를 잘 표현했습니다18,19. 따라서 신생아 특이적 모델과 세포의 출처는 생애 초기 면역 반응의 복잡성을 연구하는 데 필요합니다. 그러나 신생아 마우스의 크기, 민감도 및 섬세한 특성으로 인해 생물학적 샘플의 양이 제한될 수 있으며 수집 과정에 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 이 프로토콜은 신생아 마우스에서 골수를 추출하기 위한 간단하고 시간 효율적인 절차를 확립합니다.

다 자란 쥐의 뼈는 바늘을 찔러 골수를 쉽게 씻어낼 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 반대로, 바늘로 신생아 골수...

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공개 사항

저자는 이 문서와 관련된 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)[R01 AI163333]의 지원을 받아 CMR에 제공되었다. WV CTSI 보조금 GM104942, 종양 미세환경 CoBRE 보조금 GM121322 및 NIH 보조금 OD016165 통해 West Virginia University Flow Cytometry 및 Single Cell Core Facility에 제공된 추가 자금 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
40 & 마이크로; m 스트레이너Greiner542040세포 배양
96 웰 라운드 (U) 바닥 플레이트Thermo Scientific12-565-65세포 배양
안티 마우스 CD11b-BV786BD Biosciences740861FACS 분석
안티 마우스 CD206-Alexa Fluor488BD Biosciences141709FACS 분석
안티 마우스 F4/80-PEBD Biosciences565410FACS 분석
Countess3Thermo ScientificTSI-C3ACC자동 세포 계수기
DMEMHycloneSH30022.01세포 배양
DMSOVWRWN182세포 배양
DPBS, 1xCorning21-031-CV세포 배양
Escherichia coli O1:K1:H7ATCC11775감염
에보스 FL Invitrogen12-563-649세포 이미징 시스템 
FBS아반토르 76419-584세포 배양
FluoroBright BMDMThermo fisher ScientificA1896701무염료 배양 매체
글루타민CytivaSH30034.01세포 배양
HEPESCytivaSH30237.01세포 배양
L-929ATCC분화
LSRFortessaBecton Dickinson플로우사이토미터
Lysotracker 레드 DND 99InvitrogenL7528형광 염료
MEMCorning15-010-CV세포 배양
페니실린 /스트렙토마이신 HycloneSV30010세포 배양
pHrodo 그린 STP 에스테르 InvitrogenP35369형광 염료
T75 플라스크Cell star658170세포 배양
트립신-EDTAGibco25300120 세포 배양
Zeiss 710 자이스P20GM103434컨포칼

참고문헌

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