방법 논문

천연 제품 연구에서 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법의 응용 분야: 사례 연구로서의 트로판 알칼로이드

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DOI:

10.3791/66620

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2024년 3월 8일

 ,  , 
1Department of Chemistry, Northern Michigan University

이 논문에서

요약

트로판 알칼로이드의 고속 질량 분석법(MS)/질량 분석법(MS) 기반 주석 및 분류를 위한 방법을 제시하며, 이는 트로판 함유 샘플의 예비 복제 및 분리를 위한 새로운 알칼로이드의 발견 모두에 유용합니다.

초록

오늘날 사용되는 많은 약물이 합성 원료이지만, 천연 제품은 여전히 새로운 화학적 다양성과 생체 활성의 풍부한 원천을 제공하며 내성 또는 신종 질병에 대한 유망한 단서를 제공할 수 있습니다. 그러나 도전 과제는 두 가지입니다: 연구자들은 천연 제품을 찾고 그 구조를 밝혀야 할 뿐만 아니라 분리하고 분석할 가치가 있는 것(그리고 이미 알려진 것 - 역복제라고 알려진 프로세스)을 식별해야 합니다. 최신 분석 기기의 출현으로 천연물 발견 및 복제 해제의 속도가 가속화되었습니다. 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)은 화학 구조를 식별하고 분류하는 데 특히 유용한 기술이 되었습니다. 트로판 알칼로이드(TA)는 의학 및 독성학적으로 중요한 식물 유래 화합물입니다. 이 연구에서는 QQQ(Triple-Quadrupole) 질량분석기에서 사용할 수 있는 여러 MS/MS 구성을 활용하여 고유한 단편화 패턴을 기반으로 TA 구조에 주석을 달고 분류하는 LC-MS/MS 기반 스크리닝 워크플로우를 개발했습니다. 데이터 의존형(DD) 제품 이온 스캔, 전구체 이온 스캔(PrIS) 및 중성 손실 스캔(NLS)의 조합을 사용하여 이 방법을 밤나무 Datura stramonium 및 Datura metel 의 TA가 풍부한 추출물에 적용했습니다.이 방법은 빠르고 민감하며, 복잡한 TA 함유 샘플의 예비 복제 제거와 분리, 정제(및 최종 생물학적 분석)를 위한 새로운 후보 물질의 발견에 성공적으로 사용되었습니다.

서론

최근 수십 년 동안 완전 합성 분자가 신약 개발에서 더욱 두드러지게 되었지만, 지난 39년 동안 승인된 모든 약물의 거의 3분의 2가 천연 제품 또는 천연 제품에서 영감을 받은 약물입니다.1,2  이는 천연 제품 연구의 지속적인 중요성을 강조합니다. 특정 질소 함유 천연 제품인 알칼로이드는 특히 의약 특성으로 인해 높이 평가됩니다. [3.2.1.]을 포함하는 트로판 알칼로이드(TA)-이환 질소 함유 시스템은 주로 Solanaceae (nightshade), Erythroxylaceae 및 Convolvulaceae 계통의 식물에 의해 생산됩니다. 예로는 아트로핀, 스코폴라민 및 코카인이 있습니다. 여러 반합성 또는 합성 트로판도 임상적으로 사용됩니다3. TA와 그 유도체는많은 질환을 치료하는 데 사용되며3,4 이러한 약물 중 일부는 WHO의 2023년 필수 의약품 목록(List of Essential Medicines)에 등재되어 있습니다5. 그들의 유력한 활동 때문에, TAs는 또한 레크리에이션 (자극제 또는 정신 착란제로) 사용되며 그들을 포함하는 식물 (또는 제제)의 섭취시 중독을 일으킬 수 있습니다 6,7. TA는 인간과 동물의 식품에서 바람직하지 않으며8 차, 향신료, 곡물, 꿀 및 허브 보충제를 오염시킬 수 있습니다 9,10. 의학적 가능성과 독 중독 능력으로 인해 새로운 TA의 발견(및 알려진 TA의 식별)에 도움이 될 수 있는 분석 방법이 유용합니다.

탠덤 질량 분석법(MS/MS)에서 "질량 필터"(예: 사중극자, ToF(Time-of-Flight) 튜브)는 물리적으로 함께 결합되거나("공간 내") 기기가 추가적인 "시간 내" 반응/분리 단계를 사용합니다. 공간 내 MS/MS는 서로 다른 모드를 사용하여 서로 다른 질량 필터(예: 삼중 사중극자 또는 QQQ 기기의 사중극자)에서 서로 다른 이온을 선택하고 단편화합니다. 이러한 다양한 모드를 사용하여 주어진 이온에 의해 어떤 특정 단편이 만들어지는지(생성물 이온 스캔), 시료의 어떤 이온이 특정 단편을 생성하거나(전구체 이온 스캔 또는 PrIS) 특성 질량의 손실을 겪는지(중성 손실 스캔 또는 NLS) 또는 어떤 특정 화합물이 어떤 특정 단편을 가지고 있는지(다중 반응 모니터링)를 확인할 수 있습니다. 따라서 MS/MS는 새로운 화합물에 대한 구조를 제안하거나 기존 화합물의 존재를 확인하는 데 유용한 단편을 제공합니다. MS/MS는 약물 발견, 천연물 화학 및 대사체학 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있으며,11,12 알칼로이드 함유 종을 프로파일링하고(식물화학적 특성 분석 또는 화학분류학 분석을 위해) 식품 또는 약용 식물에서 특정 알칼로이드를 검출 및 정량화하는 데 사용되었습니다 10,13,14,15,16.

사용할 수 있는 많은 질량 분석 기술에도 불구하고 새로운 알칼로이드를 찾는 데 어려움이 있습니다. 스크리닝할 후보 유기체를 찾는 것 외에도 알칼로이드의 완전한 구조적 확인은 다양한 분석 기술을 포함할 수 있는 힘든 과정입니다. 또한 연구원들은 노동력, 시간 및 자원을 낭비하는 이미 알려진 화합물을 분리할 수 있습니다. 이는 수천 개는 아니더라도 수백 개의 TA가 보고되는 TA의 경우 특히 어려우며, 그 중 다수는 서로 이성질체입니다. "알려진 것을 식별하고 알려지지 않은 것과 구별"하는 과정을 복제 (dereplication)라고 합니다. 이 과정을 돕기 위해 다양한 TA 및 기타 화합물의 머무름 시간(r.t.s) 및 질량 단편에 대한 데이터베이스가 게시됩니다17,18. 그럼에도 불구하고 복제 해제는 힘들다. 시료의 전체 LC-MS/MS 크로마토그램에서 알칼로이드에 주석을 달는(즉, 추정 구조를 할당하는 것)하는 것만으로도 시간이 많이 걸립니다. 최근에는 벤질이소퀴놀린, 모노테르펜 인돌 및 트로판 알칼로이드에 대해 분자 네트워킹1 9,20 및 수동 복제 18,21,22가 사용되었으며, PrIS는 피롤리지딘 및 솔라닌 유형 알칼로이드를 식별하기 위한 스펙트럼의 "구조적 필터링"에 사용되었습니다 23,24. 그러나 TA가 쉽게 식별할 수 있는 공통 단편을 가지고 있더라도 TA 함유 샘플의 신속한 LC-MS/MS 기반 복제에 사용할 수 있는 특정 분석법이나 워크플로우는 없습니다(그림 1). 여기에 설명된 분석법은 데이터 의존적(DD) 생성물 이온 스캔, PrIS 및 NLS의 조합을 사용하여 단일, 이산 및 삼치환 트로판에 대한 고유한 단편화 패턴(그림 1A)과 이러한 알칼로이드에서 발견되는 공통 에스테르 그룹의 손실(그림 1B)을 기반으로 식물의 TA 구조에 주석을 달고 분류합니다. 연구 유기체는 밤나무 속 Datura의 여러 종입니다. 다양한 TA의 풍부한 공급원인 Datura는 세계 역사 전반에 걸쳐 의학 및 문화 목적으로 사용되어 왔으며17- 구조적으로 유사한 수많은 TA로 인해 복제를 제거하기 어려운 매트릭스로, 당사의 방법을 테스트할 수 있는 매력적인 샘플을 제공합니다.

프로토콜

주의: 나열된 화학 물질을 사용하기 전에 모든 관련 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오.

1. 시료 전처리

주의: 액체 질소는 극저온 화상을 유발할 수 있습니다. 환기가 잘 되는 곳에서 극저온 장갑과 보안경을 사용하십시오. 알칼로이드 함유 식물 샘플은 피부에 자극을 줄 수 있습니다. 항상 장갑으로 다루십시오. 메탄올은 독성이 있고 가연성이므로 잠재적인 발화원에서 멀리 떨어진 흄 후드에서 취급해야 합니다.

참고: 이론적으로 재배 또는 야생 식물 조직을 사용할 수 있습니다(건조 또는 신선하게 분쇄). 아래 절차는 분석법 개발 중에 사용되는 절차입니다.

  1. 관심 있는 식물 조직이 신선하면 폴리프로필렌 원추형 튜브에 넣고 액체 질소에 2-3분 동안 담가 얼립니다.
  2. 얼어 붙은 식물 조직을 미리 냉각 된 모르타르 (액체 질소가 들어간 폴리스티렌 쿨러에)에 넣고 미리 냉각 된 유봉을 사용하여 조직을 균일 한 분말로 갈아줍니다.
  3. 미리 냉각된 주걱을 사용하여 원하는 양의 조직을 중량이 측정된 폴리프로필렌 미세 원심분리기 튜브에 빠르게 계량하고 조직 100mg당 1mL 농도로 20% 메탄올(실온[RT]에서)을 즉시 추가합니다.
    참고 : 메탄올 (20 %)은 일반적으로 TA25를 추출하는 데 사용됩니다. 때때로 0.1% 포름산이 첨가되지만 이 방법과 다른 방법의 개발 중에 추출 효율의 차이는 관찰되지 않았습니다.
  4. 뚜껑이 있는 튜브를 RT에서 최소 3시간 동안 흔들리는 셰이커(중간 속도)에 놓습니다.
  5. 튜브를 9464 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 LC-MS 자동시료주입기 바이알에 피펫팅하여 넣거나, 그래도 흐리면 먼저 0.45μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
    참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있지만, 가공된 신선한 식물 샘플 및 추출물은 잠재적인 알칼로이드 분해를 방지하기 위해 분석 전에 -80°C 냉동고에 보관해야 합니다.

2. LC-MS 기기 구성 및 데이터 수집

주의: 아세토니트릴은 독성이 있고 가연성입니다. 발화원에서 멀리 유지하고 흄 후드를 사용하여 증기를 제어하십시오. 포름산은 부식성입니다. 피부와 눈의 접촉을 피하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.

  1. 전기분무 이온화(ESI) 소스 및 역상 HPLC 컬럼(C18, 4.6 x 100mm)과 함께 LC-MS 기기를 사용합니다.
  2. HPLC의 경우 H2O의 0.1 % 포름산을 용매 A로 사용하고 아세토 니트릴의 0.1 % 포름산을 용매 B로 사용합니다. 컬럼을 99% A 및 1% B로 평형화합니다. 26분 동안 1%-50% B의 30분 그래디언트를 구성하고 26.01분에 1% B로 돌아가고 4분 동안 1% B를 유지합니다. 45°C의 컬럼 오븐 온도와 0.5mL/분의 유속을 사용하십시오.
  3. LC-MS 분석법에서는 질량분석기에 대해 인터페이스 전압: 4.0kV, 분무 가스 유량: 3L/min, 가열 가스 유량: 10L/min, DL 온도: 250°C, 히트블럭 온도: 400°C, 인터페이스 온도: 300°C, 건조 가스 유량: 10L/min, 충돌 유도 해리(CID) 가스(아르곤) 압력 17kPa의 작동 매개변수를 사용합니다.
  4. 자동 동위원소 배제가 활성화된 상태에서 Q3 스캔과 Q1 스캔(100-1000 Da)을 모두 포함하는 ESI 포지티브 모드에서 MS 분석법을 구축하여 조사 이벤트(LC 분석법의 길이로 설정)로 작동합니다. 50-1000 Da의 질량 창, -20 V의 충돌 셀 에너지 및 <0.2 s의 이벤트 시간을 가진 Q1 스캔(DD 분석)의 종속 이벤트로 제품 이온 스캔을 포함합니다.
    참고: Q1의 DD 제품 이온 스캔을 트리거하기 위한 계수 임계값은 가변적일 수 있지만 일반적으로 7,000-10,000 카운트 수준이 사용됩니다. 이 방법을 개발하는 데 사용된 것과 같은 일부 기기에서 Q3 스캔은 Q1보다 더 큰 질량 정확도와 감도를 제공하며 Q1 스캔에서 관찰된 이온을 확인하기 위해 포함되지만 2.4단계에서 문제 없이 생략할 수 있습니다.
  5. 위의 MS 분석법에 충돌 셀 에너지가 -20V이고 이벤트 시간이 0.75초인 LC 분석법의 길이와 동일한 포지티브 모드 PrIS를 추가합니다. 모든 경우에 Automatic Isotope Exclude(자동 동위원소 제외) 또는 De-isotoping(탈동위원소) 기능이 활성화되어 있는지 확인하십시오. TA 단편(Da의 경우 그림 1A 참조)에 대한 관심 m/z 값이 124.1(단일치환 TA의 경우, 125-1000Da의 질량 윈도우), 122.1 및 140.1(이치환 TA의 경우, 각각 123 및 141Da에서 시작하는 질량 윈도우) 및 156.1 및 138.1(삼치환 TA의 경우, 157 및 139Da에서 시작하는 질량 윈도우)인지 확인합니다. 각기).
    참고: 분석법 개발 중에 PrIS는 두 가지 다른 분석법으로 분할되었는데, 하나는 mono- 및 disubstituted TAs에 대한 것이고 다른 하나는 trisubstituted TAs에 대한 것이지만, 어떤 방식으로든 분할하거나 결합할 수 있습니다.
  6. 2.4단계의 매개 변수를 포함하는 두 번째 MS 메서드를 빌드합니다.
    1. 이 MS/MS 분석법에 LC 분석법의 길이와 동일한 포지티브 모드 NLS를 추가하고 충돌 셀 에너지는 -20V, 이벤트 시간은 0.75초를 제공합니다. 모든 경우에 Automatic Isotope Exclude(자동 동위원소 제외) 또는 De-isotoping(탈동위원소) 기능이 활성화되어 있는지 확인하십시오.
    2. TA의 에스테르에 대한 관심 중성 손실 질량 (Da, 그림 1B 참조)이 100.05 (티글산에서 파생 된 에스테르의 경우, 110-1000 Da의 질량 창), 60.03 (아세틸 그룹의 경우, 100-1000 Da의 질량 창) 및 166.06 (페닐 락틱 또는 트로픽 산 에스테르, 170-1000 Da의 질량 창)인지 확인하십시오.
  7. LC-MS 분석법을 다운로드하고 관심 시료에 대한 데이터 파일을 생성합니다. HPLC 컬럼이 45°C에서 평형을 이루면 서로 다른 종 또는 조직 유형 간에 적절한 추출 용매 블랭크를 사용하여 배치 또는 프로젝트 파일에서 관심 샘플을 실행합니다. 일반적인 주입 부피는 10-20 μL입니다.
    알림: 특히 높은 볼륨에서는 질량 분석기 검출기가 포화 상태일 수 있습니다. 매우 농축된 샘플을 실행하는 경우 ESI 소스를 청소하고 기기를 정기적으로 조정해야 합니다. 모든 데이터가 수집된 후 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

3. 데이터 분석

  1. Q1 및 Q3 스캔의 총 이온 크로마토그램(및 DD 제품 이온 스캔)을 검사하고 TA와 유사한 기능을 가진 풍부한 이온의 모체 질량을 확인합니다: a) 질량 <[M+H]+ 이온의 경우 500Da, 일반적으로 균일한 질량, b) 위의 LC 방법을 사용하여 2-22분 사이의 일반적인 r.t.s 및 c) 다음 목록의 단편. m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 또는 128Da.
  2. m/z 124에 대한 PrIS 크로마토그램/채널을 검사하고 어떤 피크/이온이 어떤 r.t.s(3.1단계에서 기록됨)가 이 단편을 생성하는지 확인합니다. 클릭으로 크로마토그램을 스캔별로 스캔할 수 있을 뿐만 아니라 DD 제품 이온 스캔에서 얻은 전체 MS/MS 스펙트럼을 검사할 수 있으며, 특히 저농도 종의 경우 더욱 그렇습니다.
    참고: 이 단편을 포함하는 실제 종은 여러 스캔에 대해 존재하며 Q1 및 Q3 스캔 모두에 나타납니다(후자가 사용되는 경우). 스프레드시트는 주석을 지원하기 위해 지원 정보(보충 파일 1)에 첨부됩니다.
  3. 다른 PrIS 크로마토그램에 대해 3.2단계를 반복합니다. m/z 122 및 140은 모두 이치환된 TA를 나타내고 m/z (138 및 156)는 모두 삼치환된 TA를 나타내므로 이러한 크로마토그램/채널을 함께 검사하십시오.
  4. m/z 100, 60 및 166에 대한 NLS 크로마토그램/채널을 검사하고 r.t.s(3.1단계에서 기록됨)가 이러한 중성 손실을 생성하는 피크/이온을 확인합니다. PrIS와 마찬가지로 크로마토그램을 스캔별로 클릭하고 DD 산물 이온 스캔에서 얻은 단편화와 비교하며, 특히 저농도 종의 경우 더욱 그렇습니다.
  5. DD 제품 이온 스캔 결과에 의해 지원되는 PrIS 및 NLS 데이터의 조합을 사용하여 가장 작은 트로판 질량(예: 124, 122 또는 138)과 중성 손실을 추가한 다음 나머지 남은 질량을 고려하여 관찰된 알칼로이드에 대한 추정 주석을 만듭니다.
    참고: TA(및 Da의 질량)를 치환하는 일반적인 그룹은 하이드록실(18), 아세틸(60), 프로피오닐(74), 이소부티릴(88), 티글로일(100), 포화 티글로일/2-메틸부티릴(102) 또는 페닐락테이트/트로픽산(166)입니다.
  6. 알칼로이드에 대한 주석을 문헌17 및 데이터베이스(예: MoNA)26 에 보고된 것과 비교하여 어떤 TA 치환 패턴이 보고되는지(그리고 잠재적으로 새로운 패턴인지)를 결정합니다. 또한 상업적으로 확인할 수 있는 일부 일반적인 트로판 알칼로이드(예: 아트로핀, 리토린, 스코폴라민)의 표준물질을 사용하십시오.
  7. 저농도 시료에 대한 추가 구조 정보(PrIS 및 NLS는 종속 이벤트 임계값 이하로 이온을 포착할 수 있음)를 위해 더 농축된 시료에서 특정 생성물 이온 스캔(관심 질량을 전구체 이온으로 활용)을 수집하십시오.
    참고: 이 방법은 저해상도 QQQ 기기에서 개발되었습니다. 모든 추정 가능한 새로운 화합물의 경우 정확한 질량 스펙트럼을 얻기 위해 고분해능 MS 기기를 사용해야 합니다.

결과

이 방법의 효과를 입증하기 위해 TA의 표준 혼합물(아세틸트로핀/아세틸슈도트로핀 혼합물[단일치환] 각각 10μg/mL, 히오시아민[단일치환], 리토린[단일치환] 및 스코폴라민[삼치환]과 함께 2개의 아니소다민 이성질체[이치환]의 혼합물 각각 10μg/mL)을 양성 대조군으로 분석했습니다(그림 2). 전체 Q1 스캔 크로마토그램(기본 피크 크로마토그램 보기에 표시)은 그림 2A에 나와 있으며, TA 표준 구조는 해당 피크로 표시됩니다. m/z 124에 대한 PrIS(그림 2B)는 단일치환 TA에 대한 크로마토그램의 피크를 표시합니다. Ergo, 아세틸트로핀/슈도트로핀 혼합물, 히오시아민 및 리토린이 표시됩니다. m/z 124 크로마토그램에서 아세틸트로핀 및 슈도트로핀에 해당하는 피크는 작습니다(다른 표준물질보다 농도가 낮고 다른 단일치환 TA보다 덜 풍부한 m/z 124 단편을 생성할 수 있기 때문일 수 있음). 그럼에도 불구하고 이 크로마토그램과 해당 PrIS 채널 모두에서 여전히 검출할 수 있습니다. 그림 2C와 그림 2D 는 각각 m/z 122 및 140에 대한 PrIS 크로마토그램입니다. 치환된 TA 단편을 검출하면 둘 다 m/z 140 채널에서 볼 수 있는 더 강한 신호와 함께 anisodamine의 두 이성질체에 플래그를 지정합니다. 서로 다른 TA가 서로 다른 강도의 단편을 가질 수 있으므로 m/z 122 및 140 채널을 함께 검사해야 합니다. 마지막으로, 삼치환 TA에 대한 진단인 m/z 156(그림 2E) 및 m/z 138(그림 2F) 채널은 모두 스코폴아민(표준 혼합물에서 유일한 삼치환 TA)에 대해 하나의 피크를 표시합니다.

그런 다음 NLS 크로마토그램을 사용하여 존재하는 에스테르 그룹을 할당했습니다. 그림 2G 는 60Da(아세테이트 에스테르에서 아세트산 손실)에 대한 NLS 크로마토그램을 보여줍니다: 두 개의 아세틸화 단일치환 TA 이성질체를 볼 수 있습니다. 페닐락틱 또는 트로픽 에스테르를 식별하기 위한 166 Da에 대한 NLS 크로마토그램(그림 2I)은 이러한 그룹(히오시아민, 리토린, 두 개의 아니소다민 이성질체 및 스코폴라민) 중 하나를 포함하는 모든 알칼로이드를 올바르게 식별합니다. 마지막으로, 예측한 바와 같이, 100Da(티글로일 에스테르 진단)의 손실에 대한 크로마토그램(그림 2H)은 표준 알칼로이드 중 어느 것도 이 그룹을 포함하지 않기 때문에 rt 1.75분에서 경미한 불순물을 제외하고는 비어 있습니다.

그런 다음 이 방법을 테스트하여 거짓 긍정을 테스트했습니다. 토마토(Solanum lycopersicum) 잎의 물/메탄올 추출물이 음성 대조군으로 작용했습니다. 밤송이임에도 불구하고 토마토는 TA를 생성하지 않습니다. 전체 Q1 스캔 베이스 피크 크로마토그램은 그림 3A에 나와 있습니다. m/z 124(그림 3B)에 대한 PrIS는 대부분 비어 있으며 검출기 노이즈일 가능성이 있는 작은 기준선 변동이 있습니다(Q1 또는 Q3 스캔에서 해당 질량과 일치하는 신호 없음). r.t.s가 2.6 및 3.4 min인 두 가지 특징 은 124 단편을 생성하지만, DD 제품 이온 스캔을 검사한 결과 이러한 특징이 다른 단일치환 트로판 단편(m/z 93 또는 142)을 생성하지 않는 것으로 나타났으며, 이는 TA가 아님을 시사합니다. 이 예는 또한 거짓 긍정을 배제하기 위해 이 방법에 DD 제품 이온 스캔을 포함하는 유용성을 강조합니다. 마찬가지로, 이치환된 TA의 m/z 122 채널(그림 3C)도 잡음만 보여줍니다. m/z 140, m/z 138 및 m/z 156에 대한 PrIS 크로마토그램과 DD 스캔에서 비 TA 특징만 제안하는 3개의 NLS가 보충 그림 1A-F에 나와 있습니다.

TA 함유 샘플을 역복제하는 데 이 방법의 사용을 입증하기 위해 D. metel var. 'fastuosa' 뿌리의 추출물을 분석했습니다. 뿌리는 밤나무에서 TA 생합성의 주요 부위이며 다양한 TA가 많이 존재할 것으로 예측되었습니다. 전체 Q1 스캔 크로마토그램은 그림 4A에 나와 있습니다. 예상했던 대로, m/z 124 (그림 4B), m/z 122 (그림 4C), m/z 140 (그림 4D), m/z 156 (그림 4E) 및 m/z 138 (그림 4F)에 대한 PrIS에서 다양한 존재도의 수많은 특징이 검출되었습니다. 이러한 TA 중 다수는 그림 4G-I의 NLS 크로마토그램의 수많은 신호에서 각각 볼 수 있듯이 아세틸화 또는 티글로일화되거나 페닐락틱/트로픽산에서 파생되었습니다.

.xls 파일로 제공되는 스프레드시트(리더용 빈 시트는 보충 파일 1, D. metel root는 보충 파일 2에 있음)를 사용하여 먼저 어떤 기능(질량 또는 r.t.s)이 TA와 유사하게 나타났는지 문서화했습니다(3.1단계의 기준 사용). 다음으로, 이러한 특징에 속하는 단편 및 중립 손실에 주목했습니다. 이 분석법은 매우 민감하며, PrIS 채널은 해당 크로마토그램에서 눈에 띄는 피크를 생성하지 않는 저농도 TA도 쉽게 감지할 수 있습니다. 단편과 중성 손실을 사용하여 알칼로이드의 구조를 3.5 단계에 따라 제안 할 수 있습니다.

스펙트럼 데이터를 사용하여 알칼로이드에 주석을 추가하는 예가 그림 5에 나와 있습니다. D. metel 뿌리에 대한 전체 Q1 스캔 크로마토그램은 그림 5A에 나와 있습니다. 14.4분의 기능이 선택되었습니다. Q1 스캔 스펙트럼(그림 5B)은 이 피크에 대한 m/z 224의 모 질량을 보여줍니다. DD 제품 이온 스캔 스펙트럼은 그림 5C에 나와 있습니다. m/z 124에 대한 PrIS 채널(그림 5D)은 224 이온이 이 단편을 생성한다는 것을 나타냅니다(DD 제품 이온 스캔에서도 볼 수 있음). 100 Da에 대한 NLS 채널(tigloylated TA를 검출하기 위해)은 또한 m/z 224를 표시합니다(DD 제품 이온 스캔에 의해서도 확인됨). 중성 손실과 가장 낮은 질량의 TA 단편(100 + 124 Da)을 합산하면 모체 질량(224)과 같아 티글로일기가 유일한 치환임을 확인할 수 있습니다. 이 알칼로이드에 대한 가능한 구조는 그림 5C에 표시되어 있습니다. di- 및 tri-치환된 TA의 경우, 관찰된 중성 손실 질량을 가장 낮은 TA 질량에 추가한 후, 나머지 질량을 설명하기 위해 다른 치환이 제안되었다: 예를 들어, 140 및 122의 이치환된 TA 단편과 100Da의 중성 손실을 갖는 m/z 222는 100의 잔여 질량을 갖는다(222-122 = 100). 두 번째 티글로일 그룹이 될 가능성이 높습니다. 이 워크플로우는 제거 프로세스에 직관적으로 사용할 수 있습니다: 트로판 단편이 없는 피처(60, 100 또는 166Da가 손실될 수 있더라도)는 TA가 될 가능성이 낮습니다. 이 워크플로우를 사용한 철저하고 신속한 복제의 예에서, 여러 이성질체 화합물을 포함하여 D. metel 루트에서 다양한 존재량과 극성을 가진 71개의 뚜렷한 TA가 식별되었습니다(보충 파일 2). 이러한 화합물 중 일부는 쉽게 할당할 수 없는 에스테르 그룹을 가지고 있었고 일부 추가 화합물은 잠재적인 TA로 플래그가 지정되었지만 높은 신뢰도로 주석을 달 수 없었습니다.

분쇄된 D. 스트라모늄 씨앗의 메탄올/물 추출물도 분석되었습니다. D. metel root에 대한 전체 Q1 스캔 베이스 피크 크로마토그램은 그림 6A에 나와 있습니다. m/z(124)에 대한 PrIS는 도 6B에 나타내고, m/z(122)에 대한 PrIS는 도 6C에 나타내고; 다른 크로마토그램은 보충 그림 2A-F에 나와 있습니다. 그림 6B는 r.t. = 12.6분에서 매우 풍부한 단일치환된 트로판 알칼로이드를 나타내며, 이는 히오시아민일 가능성이 높습니다. 시드 TA 주석을 보여주는 스프레드시트는 보충 파일 3에 포함되어 있습니다. 이 방법의 성능은 이 특정 샘플에서 더 낮은 것으로 나타났습니다: 8.5 및 10.2분의 r.t.s에서 m/z가 259인 두 가지 매우 풍부한 특징은 해당 스펙트럼에 표시된 m/z 260(M+1 동위원소)의 질량과 함께 60 및 100Da(보충 그림 2 D,E)에 대한 NLS 크로마토그램에서 피크를 생성했습니다. 이들 화합물은 TA가 아니라 베타-카볼린 알칼로이드27과 일치하는 형성된 단편이다. 그들은 아세틸화되거나 티글로화되지 않지만 M+1 동위원소에서 60 또는 100을 잃어 이 두 NLS 채널에 나타나지 않습니다. 또한, 스코폴라민(r.t. = 10.5분)은 m/z 305 M+1 동위원소 피크에서 m/z 122 단편을 생성했으며, 이는 스코폴라민의 예상 m/z 121 단편의 동위원소입니다. 이러한 방법은 탈동위원소 기능을 사용하지만 이러한 높은 시료 농도에서 일부 동위원소 "누출"이 발생할 수 있습니다. 이것은 이 연구 또는 이 샘플에 사용된 기기에 고유한 현상일 수 있지만 주목할 가치가 있습니다.

이 방법을 사용하여 D. stramonium 씨앗에 40 개의 TA에 주석을 달았으며, 그 중 몇 개는 당화 된 것으로 보이며 162 (hexose), 146 (deoxyhexose) 또는 132 Da (xylose 또는 이와 유사한 설탕)의 질량을 잃었습니다. Hexose 함유 TA는 Merremia (Convolvulaceae) 28, Duboisia29 및 Atropa25에서보고되었지만 deoxyhexose 또는 xylose-containing TAs에 대한 첫 번째 보고입니다. 하나의 TA는 rt가 13.8분(그림 7A)이고 질량이 m/z 436( 그림 7B의 Q1 스캔)이었습니다. 이 기능은 m/z 124 채널에서 신호를 생성하여 단일 치환 TA(그림 7D)를 나타내지만 다른 PrIS 또는 NLS 채널에서는 신호를 생성하지 않았습니다. DD 생성물 이온 스캔(그림 7C)은 예상 m/z 124, 즉 모 이온에서 312Da, 아마도 166 + 146Da의 손실을 나타냈습니다. 고분해능 MS/MS는 사중극자 ToF(Time-of-Flight) 기기( 그림 7E의 스펙트럼)에서 획득되었으며, 이는 m/z 290 단편을 나타내며, 이는 람노스 또는 이와 유사한 당으로 에스테르 수산기 부분에 히오시아민 또는 리토린 글리코실화되었음을 시사합니다. 측정된 정확한 질량은 또한 람노실-히오시아민 또는 리토린에 대해 계산된 정확한 질량에 매우 가까웠습니다( 그림 7E의 구조). 전례 없는 구조와 풍부함으로 인해 이 알칼로이드는 D. 스트라모늄 씨앗으로부터 분리할 가치가 있으며, 이는 새로운 알칼로이드 발견에서 이 방법의 사용을 보여주는 예입니다.

figure-results-1
그림 1: TA의 MS에서 관찰된 관련 단편 및 손실. (A) monosubstituted, disubstituted, trisubsituted TA로 형성된 특징적인 단편(및 이들의 진단 질량) 및 각 부류의 알칼로이드의 대표적인 예. (B) TA(및 그들의 진단 질량)의 에스테르기에서 관찰된 일반적인 중성 손실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: positive control precursor ion 및 neutral loss 스캔. 모든 크로마토그램에서 X축은 머무름 시간이고 Y축은 카운트(이온 풍부도)입니다. (A) 알칼로이드 표준 혼합물의 총 이온 크로마토그램(베이스-피크 크로마토그램 보기). 표준의 구조가 표시됩니다. 해당 피크는 빨간색 화살표로 표시됩니다. (B-F)는 (B) m/z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 및 (F) 138에 대한 PrIS 크로마토그램입니다. (지-나) 60 Da (아세틸, G), 100 Da (티글로일, H) 및 166 Da (페닐락틱산/트로픽산, I)에 대한 NLS 크로마토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 네거티브 컨트롤 전구체 이온 및 중성 손실 스캔. 모든 크로마토그램에서 X축은 머무름 시간이고 Y축은 카운트(이온 풍부도)입니다. (A) S. lycopersicum 잎의 메탄올/물 추출물의 염기-피크 크로마토그램 보기에서 본 총 이온 크로마토그램. (B) r.t. 2.6 및 3.4분에서 두 개의 비트로판 특징만 보여주는 m/z 124에 대한 PrIS 크로마토그램. (C) m/z 122에 대한 PrIS 크로마토그램, 검출기 노이즈를 제외하고는 비어 있음. 그림 2와 동일하게 사용되는 저울; 나머지 크로마토그램은 보충 그림 1에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: D. metel var. 'fastuosa' 뿌리에 대한 MS/MS 분석법의 적용. 모든 크로마토그램에서 X축은 머무름 시간이고 Y축은 카운트(이온 풍부도)입니다. (A) D. metel var. 'fastuosa' 뿌리의 메탄올/물 추출물의 염기-피크 크로마토그램 보기에서 총 이온 크로마토그램. (B-F)는 m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 및 (F) 138에 대한 PrIS 크로마토그램입니다. (G-I)는 60Da(아세틸, G), 100Da(티글로일, H) 및 166Da(페닐락틱/트로픽산, I)에 대한 NLS 크로마토그램입니다. 각 크로마토그램에서 수많은 TA에 해당하는 풍부한 신호에 주목하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: TA에 대한 구조를 제안하기 위한 DD 제품 이온 스캔, 전구체 이온 스캔 및 중성 손실 스캔 방법을 결합한 적용. (A) D. metel var. 'fastuosa' 뿌리의 메탄올/물 추출물의 총 이온 크로마토그램(베이스 피크 크로마토그램 보기). r.t. = 14.4분에서의 피크는 빨간색 화살표로 표시됩니다. (B) 이 피크에 대해 m/z 224의 풍부한 질량을 가진 Q1(측량 스캔). 모든 스펙트럼에서 X축은 질량이고 Y축은 강도입니다. (C) m/z 224 이온의 단편화를 보여주는 DD 생성물 이온 스캔은 100Da의 손실과 m/z 124 단편(빨간색 화살표)을 나타냅니다. 이 화합물은 (D) m/z 124 PrIS 채널과 (E) 100 Da NLS 채널 모두에 나타나며, 이는 단일 치환 및 티글로일화됨을 나타냅니다(패널 C의 구조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: D. stramonium 씨앗에 대한 MS/MS 분석법의 적용. 모든 크로마토그램에서 X축은 머무름 시간이고 Y축은 카운트(이온 풍부도)입니다. (A) D. stramonium 씨앗 의 메탄올/물 추출물의 염기-피크 크로마토그램 보기에서 총 이온 크로마토그램. (B) m/z 124에 대한 PrIS 크로마토그램; (C)는 m/z 140에 대한 PrIS 크로마토그램을 나타냅니다. 나머지 크로마토그램은 보충 그림 2에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: D. stramonium 씨앗의 새로운 알칼로이드에 주석 달기. 모든 크로마토그램에서 X축은 머무름 시간이고 Y축은 카운트(이온 풍부도)입니다. (A) D. stramonium 씨앗 의 메탄올/물 추출물의 염기-피크 크로마토그램 보기에서 총 이온 크로마토그램.r.t. = 13.7min의 특징이 표시됩니다. (B) 이 피크에 대한 m/z 436의 질량을 보여주는 Q1(측량 스캔). 모든 스펙트럼에서 X축은 질량이고 Y축은 강도입니다. (C) m/z 436 이온의 단편화를 보여주는 DD 생성물 이온 스캔. (D) 이 단일치환된 TA 화합물은 m/z 124 PrIS 채널에 나타납니다. (E) 이 새로운 TA에 대한 고분해능 MS/MS 스펙트럼과 제안된 구조 및 정확한 질량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 추가 negative control 전구체 이온 및 중성 손실 스캔. (A-C) m/z (A) 140, (B) 156 및 (C) 138에 대한 PrIS 크로마토그램. (D-F) 60 Da (아세틸, D), 100 Da (티글로일, E) 및 166 Da (페닐락틱산/트로픽산, F)에 대한 NLS 크로마토그램. 사용된 스케일은 그림 2와 동일합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: D. stramonium 종자에 대한 MS/MS 방법의 적용; 추가 크로마토그램. (A-C)는 m/z (A) 140, (B) 156 및 (C) 138에 대한 PrIS 크로마토그램입니다. (D-F) 60 Da (아세틸, D), 100 Da (티글로일, E) 및 166 Da (페닐락틱산/트로픽산, F)에 대한 NLS 크로마토그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 알칼로이드 주석에 사용되는 빈 스프레드시트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: D. metel var. 'fastuosa' 뿌리에 대한 알칼로이드 주석 및 구조 스프레드시트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: D. stramonium seeds에 대한 알칼로이드 주석 및 구조 스프레드시트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

프로토콜에 제공된 계측기 매개변수는 만족스러운 성능을 허용하지만 이 방법을 성공적으로 사용하려면 몇 가지 중요한 단계에 세심한 주의를 기울이거나 최적화해야 할 수 있습니다. 2.2단계에서 제공된 HPLC 용매 그래디언트는 일반적으로 트로판 알칼로이드에 적합하지만, 시료 또는 검사 중인 식물 종의 트로판 알칼로이드 프로파일에 따라 수정해야 할 수도 있습니다. 시료 주입량은 기기의 감도와 분석법 사용 방법에 따라 변경될 수도 있습니다. "심층" 대사 프로파일링 또는 역복제는 더 큰 주입 부피(이 연구에서는 15-20 μL가 사용됨)를 사용해야 하는 반면, 알칼로이드의 간단한 검출은 더 작은 부피를 사용할 수 있습니다. (a) 이온 소스를 정기적으로 세척하고, (b) HPLC 컬럼의 압력 변화 또는 막힘을 모니터링하고(항상 적절한 가드 컬럼을 사용해야 함), (c) 시료 간 캐리오버를 방지하고, (d) 위에서 설명한 대로 크로마토그램에서 잠재적인 "동위원소 누출"을 검사하기 위해 대량의 시료를 사용할 때는 주의를 기울여야 합니다. 인터페이스 온도 및 전압은 조기 소스 내 단편화를 피하기 위해 방법에 지정된 것과 크게 변경되어서는 안 됩니다. 또한 20V의 충돌 셀 전압이 권장되지만 모든 TA에 대해 최적의 크로마토그램 신호(또는 진단 DD 제품 이온 스캔 단편)를 제공하지 않을 수 있습니다. 일부 MS 기기 및 기능에는 "충돌 에너지 램핑" 기능이 있거나 여러 또는 최적화된 충돌 에너지에서 스캔을 수집하는 기능이 있으며, 이는 이와 같은 방법에서도 유용성을 찾을 수 있습니다(30).

이 MS 분석법 자체도 쉽게 수정할 수 있습니다: 티글릭, 아세트산 및 페닐락틱/트로픽산 에스테르는 Datura 종에서 일반적이지만 TA 에스테르 치환 패턴은 다른 식물이나 샘플에서 다를 수 있습니다. NLS 질량은 다른 에스테르 그룹(예: 프로피온산 에스테르의 경우 74Da 손실) 또는 잠재적으로 글리코실화(예: 헥소시스의 경우 162Da 손실)를 검출하도록 변경할 수 있습니다. PrIS 질량도 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 두 Datura 샘플(r.t. = 12.5분, 보충 파일 1 및 보충 파일 2 참조)의 TA는 DD 생성물 이온 스캔 단편(m/z 110 및 93)을 기반으로 norhyoscyamine 또는 norlittorine(hyoscyamine/littorine - 트로판 N-메틸기)으로 주석을 달았고 문헌 스펙트럼31과 일치했습니다; 이 TA는 트로판 단편 PrIS 채널 중 어느 것에도 나타나지 않았습니다. 노르트로판을 검출하기 위해 이 두 질량에 채널을 추가할 수 있습니다. m/z 93 단편은 또한 대부분의 단일치환된 TA(17)에 존재하며; 이 채널을 추가하면 단일 치환 TA의 존재에 대한 추가 확인을 제공하고 거짓 긍정을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.

다양한 유형의 TA에 대한 적응성 외에도 이 프로토콜의 주요 장점 중 하나는 (기존 알칼로이드 주석 방법에 비해) 속도입니다. MS 분석법의 구성 방식(및 사용된 HPLC 실행 시간)에 따라 시료에 대한 모든 MS/MS 데이터를 60-90분 이내에 수집할 수 있습니다. 예를 들어, 연구 중에 단일 치환 및 이치환 TA PrIS는 한 가지 방법에, 삼중 치환된 TA PrIS는 다른 방법에, NLS는 세 번째 방법(모든 방법에 DD 산물 이온 스캔 포함)에 내장되어 각각 30분씩 총 3회 주입되었습니다. 결합된 MS/MS 데이터를 활용하여 시료에 대한 완전한 주석 달기는 모든 피크를 수동으로 검사하거나 수많은 관심 피크에 대한 개별 제품 이온 스캔을 수집하는 것보다 훨씬 빠릅니다. 이 방법은 제품 이온 스캔, PrIS 및 NLS 모드가 있는 모든 기기에서 수행할 수 있으며 신속한 정성 평가(즉, TA가 존재하거나 없는가?), 다양한 식물 속, 종, 품종 또는 품종, 장기 또는 성장 단계를 구별하거나 "핑거프린팅"하고, 관찰된 TA를 보고된 TA와 비교(복제 워크플로우의 일부로)하는 데 사용할 수 있습니다. 입증된 바와 같이, 이 프로토콜은 분리, 정제 또는 생물학적 검정을 위한 단서로서 새로운 TA를 발견하는 데에도 사용할 수 있을 뿐만 아니라 이를 분리하기 위한 후보 종 및 조직을 식별하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 방법은 식물 생화학을 이해하고 초기 단계의 약물 발견 조사를 포함하여 천연 제품 및 대사체학 분야에서 사용할 수 있습니다. 추가 응용 분야는 식품 안전 또는 법의학(예: 식품, 보충제 또는 생체 유체에서 TA 검출)에서 찾을 수 있습니다.

이 방법에는 논의가 필요한 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 사용하는 기기와 프로토콜 사용 목적에 따라 많은 양의 시료 주입이 필요할 수 있으며, 이로 인해 기기 성능 문제가 발생하고 경우에 따라 위양성(false positive)이 발생할 수 있습니다(위에서 설명한 대로). 둘째, 이 방법은 저분해능 QQQ 기기에서 개발되었으며 저해상도(예: TA가 아닌 negative control에 m/z 124 단편을 포함하는 기능)로 인해 위양성이 발생할 수 있습니다. 고분해능 기기는 더 나은 진단 기능을 제공할 수 있으며, 제안된 새로운 알칼로이드에 대해 정확한 질량 MS/MS 스펙트럼을 얻어야 합니다. 이 방법의 또 다른 단점은 단순히 MS/MS 분석 전체의 단점입니다. MS/MS는 구조(Metabolomics Standards Initiative32에서 지정한 "주석")를 제안하는 데 유용하지만, 분자 연결성("식별")에 대한 구체적인 할당을 제공하지는 않습니다. 예를 들어, 두 Datura 샘플에서 m/z 306 TA의 여러 이성질체를 발견했는데, 이는 m/z 124 및 m/z 140 단편을 모두 가지고 있는 것으로 보였으므로(보충 파일 2) 치환 패턴의 명확한 할당이 어려웠습니다. 이것은 아직 발견되지 않은 단편화 메커니즘을 나타낼 수 있으며 다른 기술(예: 핵 자기 공명 분광법)은 모호성을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. MS/MS 기반 방법은 종종 이성질체와 어려움을 겪습니다: 페닐락트산 에스테르 리토린(또는 그 유도체)은 히오시아민(트로픽산 에스테르)과 구별하기 어렵고, 다른 솔라나기 식물은 이성질체 티글로일, 세네시오일 및 안젤로일기로 치환된 TA를 함유하고 있습니다 33,34; 표준물질이 없는 경우 이러한 화합물을 구별하는 것이 불가능하지는 않더라도 구별하기 어려울 수 있습니다. 이 방법은 또한 거울상 이성질체(예: 3,6- 대 3,7-디히드록시트로판, 번호 매기기는 그림 1 참조) 또는 레오이질러(예: 표준물질 없이 3-아세틸과 7-아세틸 구별)를 구별하지 않습니다. 우리는 대부분의 monosubstituted tropanes를 Datura 속 및 다른 Solanaceous 식물17,35에서 보고된 이전 패턴에 기초하여 3-치환된 것으로 할당했습니다. 그러므로, 연구된 유기체에 대한 모든 생화학적 지식 또는 문헌(사용 가능한 경우)은 항상 기기 분석과 함께 참조해야 합니다.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 교수 연구 보조금(Northern Michigan University, M.A.C.에 수여), 학부 연구 펠로우십(Northern Michigan University, J.C.에 수여) 및 화학과에서 자금을 지원받았습니다. 저자들은 식물 조직 준비를 도와준 John Berger(NMU), LC-MS 유지 관리 및 문제 해결 지원을 제공한 Hannah Hawkins(NMU), 아세틸트로핀 혼합물을 준비해 준 Ryan Fornwald 박사와 그의 CH 495(Natural Products Synthesis) 학생들에게 감사를 표하고자 합니다. 저자들은 또한 고분해능 MS/MS 스펙트럼을 획득한 Daniel Jones 박사(Michigan State University)에게 감사의 뜻을 전합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세토니트릴, UHPLC용, 질량 분석에 적합시그마-알드리치900667HPLC 용매
아르곤 가스AirGasAR UHP300CID 가스
포름산, 분석용 99%Thermo ScientificAC270480010HPLC 첨가제
가드 컬럼 홀더Restek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58HPLC 컬럼
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44질량 분석기; 우리는 LabSolutions 소프트웨어를 실행했습니다. 이는 Shimadzu 기기의 표준입니다
액체 질소AirGasNI 180LT22
메탄올, HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400추출 용매
Microcentrifuge를 만들기 위해 VWR2400-37
마이크로 원심분리기 튜브, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
모르타르 Fisher ScientificFB961C식물 조직 분쇄용
PestleFisher ScientificFB961M식물 조직 분쇄용
피펫 1000 mLGilson 
피펫 팁 1000 mLFisher scientific02-707-404
식물 조직다양한 출처N/A야생이나 재배 무엇이든 될 수 있음
폴리프로필렌 원뿔형 튜브, 15 mLFisher Scientific05-539-4
폴리스티렌 냉각기ULINES-18312분자 생물학용 시약이 배송되는 냉각기의 유형은 다음과 같습니다. 적절한
Roc C18 3 &마이크로; m, 100 mm x 4.6 mmRestek9534315HPLC 컬럼
Roc C18, 10 mm x 4 mmRestek953450210Guard 컬럼
Rocking shakerThemo Scientific11-676-680
나사산 바이알 편의 키트(9 mm)Fisher Scientific13-622-190LCMS 자동시료주입기 바이알
주사기, 3 mLFisher Scientific03-377-27
주사기 필터 0.45 µ 엠 Avantor/VWR76479-008
물, 액체 크로마토그래피 및 질량 분석에 사용JT Baker9831-03추출 용매 제조용
수용액, 0.1% v/v 포름산 포함, UHPLC의 경우 질량 분석Sigma-Aldrich900687-1LHPLC 용매
. F144059M에 적합

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