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방법 논문

덱스트란 설페이트 나트륨을 사용한 직장결장절제술 및 회장낭-항문 문합술 후 낭염의 쥐 모델

1.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66623

⸱

2024년 5월 31일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Tianjin Medical University General Hospital, 2Tianjin General Surgery Institute, 3Department of General Surgery, Zibo Municipal Hospital, 4Department of General Surgery, Binzhou Medical University Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 낭염의 쥐 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 회장낭 모델은 미세수술 기법을 사용하여 회장낭-항문 문합(IPAA) 수술을 수행하여 만들어졌습니다. 수술 후, 쥐는 4 일 동안 4 % 덱스트란 설페이트 나트륨 (DSS)으로 치료되었습니다.

초록

궤양성 대장염(UC)은 만성 면역 매개 질환으로 결장과 직장 전체에 재발 및 완화 과정에 영향을 미쳐 평생 질병을 유발합니다. 의학적 치료가 효과적이지 않을 때, 특히 대규모 위장관 출혈, 천공, 독성 거대결장 또는 발암의 경우 수술이 UC를 치료하기 위한 마지막 방어선이 됩니다. 결장 직장 전절제술과 회장낭-항문 문합술(IPAA)은 장기 치료를 위한 가장 좋은 기회를 제공합니다. 낭염은 가장 흔하고 골칫거리인 수술 후 합병증입니다. 이 연구에서는 IPAA 수술을 통해 실험용 쥐에서 회장 주머니 모델을 만들기 위해 미세 수술을 사용합니다. 그 후, 덱스트란 설페이트 나트륨(dextran sulfate súdcal, DSS)으로 회장낭의 염증을 유도하여 낭염의 지속적인 쥐 모델을 확립합니다. 쥐낭염의 성공적인 확립은 수술 후 전반적인 상태, 체중, 음식 및 수분 섭취량, 분변 데이터, 주머니 조직 병리학, 면역조직화학, 염증 인자 분석 등을 통해 검증되었습니다. 이 낭염의 실험 동물 모델은 질환의 발병 기전 및 치료를 연구하기 위한 기초를 제공합니다.

서론

낭염은 회장낭에 영향을 미치는 비특이적 염증으로, 궤양성 대장염(UC)이 있는 개인에서 전체 직장 절제술 및 회장낭-항문 문합술(IPAA) 후 흔히 발생하는 합병증입니다1,2,3. 이 질환은 최대 50%의 비교적 높은 발생률을 보이며 설사, 복통, 분변 출혈, 발열 등 다양한 임상 증상을 유발할 수 있습니다. 낭염의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, 일부 연구자들은 낭 세균총의 변화가 면역 활성화와 그에 따른 염증을 유발할 수 있다고 생각합니다 4,5,6,7.

낭염에 대한 임상시험 수행과 관련된 어려움으로 인해 동물 모델은 낭염 약물 및 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 쥐 회장 주머니 생성에 대한 우려가 커지고 있으며, 염증 가능성이 있다는 보고가 있다8. 그러나 이 분야의 연구는 명확한 지침 9,10이 없는 제조 공정의 복잡한 특성으로 인해 여전히 드물게 남아 있습니다. 1998년, Lichtman은 Lewis 랫과 Sprague-Dawley(SD) 랫에서 전체 결장 절제술을 시행하여 회장 주머니 모델을 최초로 확립했습니다11. 그들은 대식세포 침투, 점막 궤양, 그리고 이 쥐의 장 내 혐기성 세균총의 증가를 관찰했으며, 이는 회장낭 염증에 대한 추가 연구를 위한 견고한 기초를 제공했습니다. 쥐 주머니염에 대한 이 실험 모델은 인간 주머니염에서 관찰되는 신체적 징후와 기본 메커니즘을 밀접하게 모방합니다.

일반적으로 적용되는 전임상 궤양성 대장염 모델에는 DSS 및 TNBS 모델이 포함됩니다. 유도 화학물질인 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산(TNBS)은 일반적으로 크론병을 시뮬레이션한다12. 효능, 안전성 프로필 및 경제성으로 존경받는 DSS 모델은 관찰된 명백한 증상으로 인해 UC 유도를 위한 신뢰할 수 있는 도구로 자주 사용됩니다. 주머니 조직의 집락화를 감안할 때, DSS13,14를 사용하여 낭염 모델을 성공적으로 유도했습니다.

본 연구에서는 미세수술을 사용하여 IPAA 수술을 통해 실험용 쥐에서 회장낭 모델을 성공적으로 생성했습니다. 그 후, DSS로 회장낭의 염증을 유도하여 지속적인 쥐주머니염 모델을 확립하였다. 수술 중 정확성은 성공적인 모델 형성에 필수적이며 수술 후 관리도 중요합니다. 이 모델은 낭염의 발병 기전을 조사하고, 잠재적인 치료제를 평가하고, 이 복잡한 상태에 대한 이해를 높이는 데 사용할 수 있습니다. 이 연구는 회장 주머니 제조 절차를 간소화하여 수술 시간을 줄이고 효율성을 높임으로써 수술 후 주머니 질환에 대한 기초 연구를 위한 강력한 기반을 구축합니다.

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프로토콜

모든 동물실험은 천진의과대학 종합병원 윤리위원회의 방침에 따라 진행되었습니다. 이 연구에는 약 320-360g의 체중이 나가는 9주에서 12주 사이의 수컷 Sprague-Dawley 쥐가 사용되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 선택 및 유지 관리

  1. 건강한 동물(체중 ~ 220-240g)을 선택하십시오.
  2. 특정 병원체가 없는(SPF)15 수준의 기준을 충족하고 적절한 환기(시간당 8-12회 공기 순환), 쾌적한 온도(20-25°C), 적절한 습도(40%-70%), 최소 소음(70데시벨 미만) 및 자연광 주기(12시간의 빛과 12시간의 어둠)가 있는 환경에서 최소 2주 동안 적응적으로 사육되어야 합니다.
  3. 이 기간 동안에는 케이지 당 3-5 밀도의 표준 깨끗한 케이지에 수용하고 일주일에 두 번 침구를 교체하십시오. 실험용 쥐를 위한 표준 유지 사료뿐만 아니라 음식과 물에 대한 임시 접근을 제공합니다.

2. 수술 전 준비

  1. 대략 체중이 320g에서 360g 사이인 건강한 쥐를 선택하십시오. 수술 전에 8-12시간 동안 쥐를 단식시키고 생리식염수와 5% 포도당을 1:1 비율로 섞은 용액을 자발적으로 섭취할 수 있도록 합니다.
  2. 오토클레이브 미세 수술 기구(수술 전 알코올에 1시간 동안 담그기), 현미경, 쥐 해부 테이블, 8-0 준비 비흡수성 고분자 봉합사, 4-0 비흡수성 봉합사, 멸균 거즈, 멸균 면봉 등

3. 쥐 회장 주머니 모델 확립

  1. 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액을 6mL/kg의 용량으로 복강내 주입하고 0.5% 로피바카인으로 국소 마취를 절개 침투하여 쥐를 마취합니다. 전기 램프로 마취하는 동안 쥐를 편안한 온도로 유지하십시오.
  2. 아래 단계에 따라 전체 결장 직장 절제술을 수행합니다.
    1. 만족스러운 마취 프로토콜에 따라 해부학 벤치에 쥐를 등쪽 누운 상태로 고정합니다. 발가락 꼬집을 통해 마취 깊이를 확인합니다. 면도 이발기를 사용하여 모발 부스러기를 제거하고 수술 현장 살균을 위해 요오드 용액을 두 번 바르십시오.
    2. 약 6cm 길이의 정중선을 절개하여 피부, 백색 라인 근막 및 복막을 절개하여 복강으로 들어갈 수 있도록 합니다. 견인기를 사용하여 복막 표면을 노출시키고 정균 식염수를 적신 멸균 거즈로 덮습니다.
    3. 말단 jejunum의 혈관 흐름을 분리하고 8-0을 사용하여 그 기원을 결찰합니다. 실을 봉합하고 나중에 절단하십시오. 회장 판막에서 1-2cm 떨어진 곳에 위치한 두창 그루터기를 정지 상태로 설정 한 다음 절단합니다.
    4. 우측 반결장 절제술을 시작하여 우측 반결장과 중간 배앓이 정맥을 보수적으로 결찰합니다.
    5. 또한 하장간막 동맥을 분리하고 하부 직장 동맥을 격리합니다. 항문 가장자리에서 2cm에 해당하는 간격이 될 때까지 직장을 계속 격리합니다. 수술 후 협착을 피하기 위해 원위 직장을 약 45도에서 비스듬히 절제합니다.
  3. J 파우치 구성을 수행합니다.
    1. 마이크로톰 메스를 사용하여 약 6-7cm를 측정해야 하는 장간막 장에서 말단 회장의 가로 부분을 분리합니다.
    2. 말단 회장을 J자 모양으로 접어 회장을 위한 주머니를 만듭니다. 맞물리는 스티치를 통해 후방벽 문합을 수행합니다. 수정된 코넬 스티치를 사용하여 전벽을 증강하고 원위 직장 그루터기의 단면 크기와 일치하는 적절한 장을 유지합니다.
    3. J 자 파우치를 강화 8-0 필요한 경우 바느질. J 파우치의 길이는 2.5cm에서 3.5cm 사이여야 합니다.
  4. 회장낭-항문 문합, IPAA를 수행합니다.
    1. 장간막에 비틀림이 없는지 확인하고 주머니 입구의 개미 측벽과 직장 그루터기의 측벽을 8-0으로 간격을 두고 봉합합니다. 견인을 위한 봉합 실.
    2. 궁극적으로, 전방 벽과 후방 벽 모두에 전체 층 연속 잠금 봉합사를 적용합니다.
    3. 활동성 출혈이 없는지 확인하고 생리식염수로 복강을 생리학적으로 세척합니다. 순차적으로 복부 근육 근막과 피부를 4-0 봉합사로 닫습니다.
  5. 수술 후 관리를 수행합니다.
    1. 복부 폐쇄 후 모든 쥐에게 수술 후 진통(40mg/kg, 피하)으로 케토프로펜을 투여합니다. 복원이 이루어질 때까지 전기 램프를 사용하여 쥐를 데우십시오.
    2. 장 폐색의 위험을 줄이기 위해 수술 후 최소 72시간 동안 동물의 음식 섭취를 제한하십시오. 에너지와 체액을 빠르게 보충하기 위해 5% 포도당 애드리비툼(ad libitum) 식단을 이용할 수 있도록 하고 배변 패턴에 따라 수유 빈도를 조정합니다.
    3. 수술 후 일주일 후에는 제한된 영양 섭취로 시작하여 점차적으로 섭취량을 늘리십시오. 그런 다음 쥐에게 정기적으로 설치류 사료를 제공하여 자유롭게 섭취할 수 있도록 하고 식단 섭취량, 물 섭취량 및 체중을 매일 기록합니다.

4. DSS를 이용한 쥐회장낭염 모델 구축

  1. 실험적 그룹화를 수행합니다.
    1. 전체 결장 직장 절제술 및 IPAA 수술을 받은 12마리의 쥐를 IPAA 그룹(그룹 A, n = 6)과 낭염 그룹(그룹 B, n = 6)에 무작위로 할당합니다.
    2. 매일 신선하게 준비한 4mL의 순수한 물에 DSS 4g을 첨가하여 100% DSS 용액을 준비합니다.
    3. IPAA 그룹과 낭염 그룹을 수술 후 31일째부터 35일째까지 각각 순수한 물 또는 4% DSS로 투여합니다. 투여 4일 연속 동안 쥐가 자유롭게 쥐 먹이를 마시고 먹을 수 있도록 합니다.
  2. 파우치 샘플링을 수행합니다.
    1. 수술 후 35일째 아침에 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액의 복강 내 주사로 쥐를 마취하고 6mL/kg의 용량을 투여합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
    2. 파우치의 장루에서 각 그룹의 입력 및 출력 파우치의 접합부까지 파우치를 수직으로 절단합니다. 파우치 표본을 얻습니다.
    3. 전벽 봉합선을 따라 파우치를 열고 장을 식염수로 세척합니다.
    4. 파우치 조직 조각을 미세 원심분리기 튜브에 넣고 즉시 -80°C에서 냉장 보관합니다. 염증 지표의 ELISA 감지를 위해 이 부분을 사용하십시오. 조직병리학적 점수 및 면역조직화학적 염색을 위해 나머지 파우치 부분을 10% 포름알데히드로 고정합니다.
    5. 마지막으로, 깊은 마취 하에 공기 색전증으로 쥐를 안락사시킵니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).

5. 조직학적 분석

  1. 쥐로부터 파우치 조직을 얻은 후 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 담그십시오. 그런 다음 탈수 및 임베딩 프로토콜을 진행합니다. 조직학적 검사를 위해 처리된 조직을 절편한다16.
  2. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 적용하여 그룹 간 조직병리학적 차이를 식별합니다. 샘플을 현미경으로 검사하고 문서화를 위해 사진을 캡처합니다.

6. 면역조직화학적 분석

  1. 조직 부분을 조심스럽게 왁스를 제거하고 탈수하십시오. 그런 다음 구연산나트륨 용액으로 절편을 냉각하고 차단 혈청으로 20분 동안 차단하여 항원 회수를 수행합니다.
  2. 그 후, 절편을 1차 항-오클루딘 항체에 노출시키고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그 후, 헤마톡실린 대조염색16 전에 30분 동안 2차 항체로 치료합니다.
  3. 조각이 건조되면 광학 현미경으로 관찰하고 사진을 찍습니다.

7. ELISA 테스트

  1. 7.1 철저한 균질화를 보장하기 위해 초음파 처리를 사용하여 용해 완충액의 조직 조각을 다지고 균질화합니다. 검출을 위해 생성된 상층액을 활용합니다.
  2. 그룹당 블랭크, 표본 및 반복실험에 대한 웰을 할당합니다. 450nm(OD 값)에서 흡광도를 읽고 선형 회귀 분석을 수행하여 단백질 농도를 결정합니다16.

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결과

설립 후 회장낭 모델 쥐의 일반 상태 평가
시술자가 IPAA 수술 학습 곡선을 통과한 후, 쥐는 수술 시간이 192.94분± 27.15분으로 수술을 잘 견뎌냈고 수술 후 합병증이 덜 발생했습니다. 수술 후 초기 기간 동안 쥐는 식이 섭취량이 감소했지만 수술 후 10일에서 14일 이내에 수술 전 식욕이 회복되었습니다. 수술 후 초기의 활동은 약간 감소하였고, 눈과 코에서 뚜렷한 분비물이 나오지 않았다. 수술 전후 체중 감량은 21.17g ± 1.59g이었다. 수술 후 초기 체중은 최대 69.58g ± 33.19g으로 감소 추세를 보였다. 수술 후 8.25일째± 2.53일째부터 안정적인 성장이 시작되었고, 수술 후 31일째 에는 수술 다음날 체중의 9.35%± 4.7%를 초과하였습니다. 쥐는 수술 후 24시간 이내에 배변을 할 수 있었으며, 묽은 변은 있었지만 혈변은 없었다. 무른 변의 형성은 수술 후 9일에서 12일째 에 발생했습니다.<...

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토론

궤양성 대장염(UC)은 재발성 상복부 통증, 설사, 점액 혈변을 특징으로 하는 만성 장 염증입니다. 주로 직장에 영향을 미치며 다양한 정도로 진행성 결장을 포함할 수 있습니다. 수술은 UC 17,18,19 관리에 중요한 역할을 합니다. Parks et al.20이 1978년 회장낭-항문 문합술(IPAA)을 이용한 전체 결장 절제술을 도입하여 변형된 조직을 제거하고 장 연속성을 회복하기 위해 이 수술은 UC의 외과적 치료의 국제 표준이 되었습니다. 파우치의 염증성 질환은 IPAA 수술 후 가장 흔한 합병증입니다.

낭염에 대한 임상 시험을 수행하는 데 직면한 어려움으로 인해 동물 모델은 낭염과 관련된 약물 및 메커니...

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
무수 에탄올Tianjin Fengchuan 화학 시약 기술 유한 회사중국Hematoxin-eosin 염색
덱스트란 황산염 나트륨   예센 파우치 염증을 유발하는 데 사용되는60316ES76
포름 알데히드 용액Tianjin Zhiyuan 시약 회사중국Hematoxin-eosin 염색
거즈Jiangxi Zhonggan Medical Equipment Company중국동물 미세 수술에 사용
HematoxylinBeijing Zhongshan Jinqiao Company중국Hematoxin-eosin 염색
인터페론 및 감마;   검출 시약 키트Cloud-cloneSEA049Ra염증 인자 검출
Interleukin-10 검출 키트Cloud-cloneSEA056Ra염증 인자 검출
Interleukin-17 검출 키트Cloud-cloneSEA063Ra염증 인자 검출
Interleukin-6 검출 키트Cloud-cloneSEA079Ra염증 인자 검출
IodophorTangpai Medical Equipment Co., Ltd중국동물 미세 수술에 사용
현미경 조작 기구Aesculap독일동물 미세 수술에 사용
Occludinabcamab216327면역조직화학 검사
재봉 바늘Yangzhou Fuda Medical Equipment Co., Ltd중국동물 미세 수술에 사용
종양 괴사 인자 &알파; 검출 시약 키트Cloud-cloneSEA133Ra염증 인자 검출
2 인 양안 수술 현미경OPTON독일동물 미세 수술에 사용
XyleneTianjin Yingda 희귀 및 귀중한 시약 공장중국Hematoxin-eosin 염색

참고문헌

  1. Yang, M. L., Brar, M. S., Kennedy, E. D., De Buck Van Overstraeten, A. Laparoscopic versus transanal IPAA for ulcerative colitis: A patient-centered treatment trade-off study. Dis Colon Rectum. 67 (1), 107-113 (2024).
  2. Aktas, M. K., et al. Current status and surgical technique for restorative proctocolectomy with ileal pouch-anal anastomosis. Balkan Med J. 40 (4), 236-243 (2023).
  3. Zhao, L., et al. Microbiota DNA translocation into mesentery lymph nodes is associated with early development of pouchitis after ipaa for ulcerative colitis. Diseases of the Colon & Rectum. 66 (11), e1107-e1118 (2022).
  4. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: A systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  5. Pardi, D. S., D'haens, G., Shen, B., Campbell, S., Gionchetti, P. Clinical guidelines for the management of pouchitis. Inflamm Bowel Dis. 15 (9), 1424-1431 (2009).
  6. Shen, B., et al. Treatment of pouchitis, Crohn's disease, cuffitis, and other inflammatory disorders of the pouch: Consensus guidelines from the international ileal pouch consortium. Lancet Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 69-95 (2022).
  7. Dalal, R. L., Shen, B., Schwartz, D. A. Management of pouchitis and other common complications of the pouch. Inflamm Bowel Dis. 24 (5), 989-996 (2018).
  8. Li, K. Y., et al. A new rat model of pouchitis after proctocolectomy and ileal pouch-anal anastomosis using 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid. J Gastrointest Surg. 25 (6), 1524-1533 (2021).
  9. Drzymala-Czyz, S., et al. Discrepancy between clinical and histological effects of dha supplementation in a rat model of pouchitis. Folia Histochem Cytobiol. 50 (1), 125-129 (2012).
  10. Santiago, P., Barnes, E. L., Raffals, L. E. Classification and management of disorders of the J pouch. Am J Gastroenterol. 118 (11), 1931-1939 (2023).
  11. Lichtman, S. N., Wang, J., Hummel, B., Lacey, S., Sartor, R. B. A rat model of ileal pouch-rectal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 4 (3), 187-195 (1998).
  12. Guarner, F. Inulin and oligofructose: Impact on intestinal diseases and disorders. Br J Nutr. 93, Suppl 1 S61-S65 (2005).
  13. Kim, C. J., et al. L-tryptophan exhibits therapeutic function in a porcine model of dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis. J Nutr Biochem. 21 (6), 468-475 (2010).
  14. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  15. Letson, H. L., Morris, J., Biros, E., Dobson, G. P. Conventional and specific-pathogen free rats respond differently to anesthesia and surgical trauma. Sci Rep. 9 (1), 9399(2019).
  16. Gu, Y., et al. Saccharomyces boulardii, a yeast probiotic, inhibits gut motility through upregulating intestinal serotonin transporter and modulating gut microbiota. Pharmacol Res. 181, 106291(2022).
  17. Akiyama, S., et al. Endoscopic phenotype of the j pouch in patients with inflammatory bowel disease: A new classification for pouch outcomes. Clin Gastroenterol Hepatol. 20 (2), 293-302 (2022).
  18. Hata, K., et al. Pouchitis after ileal pouch-anal anastomosis in ulcerative colitis: Diagnosis, management, risk factors, and incidence. Dig Endosc. 29 (1), 26-34 (2017).
  19. Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
  20. Parks, A. Proctocolectomy without ileostomy for ulcerative colitis. BMJ. 2, 85-88 (1978).
  21. Shebani, K. O., et al. Pouchitis in a rat model of ileal J pouch-anal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 8 (1), 23-34 (2002).

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