우리는 막 단백질을 재구성하고 효소 및 기타 수용성 구성 요소를 마이크로미터 미만 및 마이크로미터 크기의 지질 소포에 캡슐화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
정제된 구성 요소를 사용하여 통합 막 단백질, 효소 및 형광 기반 센서를 포함하는 복잡한 단백질 네트워크를 소포에 통합하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 생물 반응기의 설계 및 건설과 복잡한 평형 외 대사 반응 네트워크 연구와 관련이 있습니다. 우리는 이전에 개발된 프로토콜에 따라 (다중) 막 단백질을 큰 단층 소포(LUV)로 재구성하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 동결-해동-압출을 통해 정제된 효소, 대사 산물 및 형광 기반 센서(형광 단백질 또는 염료)의 혼합물을 캡슐화하고 원심분리 및/또는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 통합되지 않은 구성 요소를 제거합니다. 대사 네트워크의 성능은 형광 판독을 통해 ATP/ADP 비율, 대사 산물 농도, 내부 pH 또는 기타 매개변수를 모니터링하여 실시간으로 측정됩니다. 100-400 nm 직경의 막단백질 함유 소포는 기존의 최적화된 절차를 사용하여 거대 단층 소포(GUV)로 전환할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 용해성 구성 요소(효소, 대사 산물, 센서)를 마이크로미터 크기의 소포에 포함할 수 있으므로 생물반응기의 부피를 수십 배로 늘릴 수 있습니다. GUV를 포함하는 대사 네트워크는 광학 현미경으로 분석하기 위해 미세유체 장치에 갇혀 있습니다.
서론
상향식 합성생물학 분야는생명공학적 목적3,4 또는 생물의학적 목적5,6,7,8을 위한 (최소) 세포 1,2 및 대사 생물반응기를 구성하는 데 중점을 둡니다. 합성 세포의 구축은 연구자들이 토착 환경을 모방한 잘 정의된 조건에서 (막) 단백질을 연구할 수 있는 고유한 플랫폼을 제공하여 단백질 및 반응 네트워크의 창발적 특성과 숨겨진 생화학적 기능을 발견할 수 있도록 합니다9. 자율적으로 기능하는 합성 세포를 향한 중간 단계로, 대사 에너지 보존, 단백질 및 지질 합성, 항상성과 같은 살아있는 세포의 필수 기능을 포착하는 모듈이 개발되었습니다. 이러한 모듈은 삶에 대한 우리의 이해를 향상시킬 뿐만 아니라 의학8 및 생명공학10
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프로토콜
1. 일반적인 준비 사항
- 화학 물질
- 미리 형성된 리포좀을 만들기 위해 CHCl3 에서 지질(분말 형태)을 25mg/mL로 용해시킵니다.
알림: 신선한 지질 스톡을 준비하는 것이 바람직하지만 스톡 용액은 -20°C에서 몇 주 동안 보관할 수도 있습니다. 분말 형태의 지질로 작업하는 것이 CHCl3에 이미 용해된 지질을 사용하는 것보다 더 정확합니다. CHCl3 는 유리 피펫 및/또는 주사기를 사용하여 처리해야 하며 CHCl3 는 플라스틱을 용해하므로 유리 용기에 보관해야 합니다. - 캡슐화 절차를 위한 소분자(뉴클레오티드, 아미노산, 형광 프로브)를 50mM KPi(완충액 A, 표 1 참조)에 용해시키고 pH를 7.00 ± 0.01로 조정합니다. 인산 마그네슘 침전물의 형성을 피하기 위해 MgCl2 를 탈 이온수에 용해시킵니다.
참고: 원액은 -20°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있으며, DTT는 예외로 실험 당일에 신선하게 준비됩니다. - 이오단(예: 발리노마이신, 니게리신)을 100-500 μM의 스톡 농도로 DMSO 또는 EtOH에 용해시킵니다. -20 °C에....
- 미리 형성된 리포좀을 만들기 위해 CHCl3 에서 지질(분말 형태)을 25mg/mL로 용해시킵니다.
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결과
리포좀에서 용해된 막 단백질의 재구성은 미리 형성된 소포의 불안정화를 필요로 합니다. 소량의 Triton X-100을 추가하면 초기에 소포의 팽창으로 인한 광 산란의 증가로 인해 540nm(A540)에서 흡광도가 증가합니다(그림 4). 최대 A540 값은 리포좀이 세제로 포화되는 지점(Rsat)이며, 그 후 Triton X-100을 더 추가하면 소포가 부분적으로 용해됩니다. Rsol에서 리포좀은 완전히 용해됩니다(그림 4). 막 단백질의 재구성을 위해 일반적으로 Rsat(화살표로 표시)보다 60% 이상 불안정한 소포를 사용합니다.
재구성 된 막 단백질 ArcD는 L-아르기닌을 소포로 운반하고 L-오르니틴을 소포 밖으로 운반하는 데.......
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토론
마이크로미터 미만의 지질 소포(proteoLUV)를 포함하는 (막) 단백질의 합성과 proteoLUV를 giant-unilamellar vesicles(proteoGUV)로 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질 13,19,30,40의 재구성 및 여기에 제시된 L-아르기닌 분해 및 글리세롤 3-인산염 합성 경로 이외의 대사 네트워크의 캡슐화에 적용할 수 있어야 합니다.
리포좀에서 막 단백질의 재구성은 일반적으로 지질막 내 단백질의 무작위 방향을 생성합니다. ArcD 및 Glpt의 경우 단백질이 양방향으로 작동하고 용질이 총 전기화학적 전위의 부호에 따라 이동하기 때문에 방향은 중요하지 않습니다. 한 방향으로 기능하는 단백질의.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자들은 pBAD-PercevalHR 유전자의 클로닝에 대해 Aditya Iyer에게 감사를 표하고, 단백질 생산 및 정제를 도와준 Gea Schuurman-Wolters에게 감사를 표합니다. 이 연구는 NWO 중력 프로그램인 "Building a Synthetic Cell"(BaSyC)의 자금 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가로스 | 시그마 알드리치 | A9414-25g | |
| 아미콘 컷오프 필터 | 시그마 알드리치 | 밀리포어 원심 필터 유닛 아미콘 울트라 | |
| BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
| CHCl3 | Macron Fine Chemicals | MFCD00000826 | |
| D(+)-Glucose | Formedium-D | ||
| (+)-Sucrose | Formedium-DDM | ||
| Glycon | D97002 -C | ||
| Diethyl Ether | Biosolve | 52805 | |
| DMSO | 시그마-알드리치 | 276855-100ml | |
| DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
| DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
| DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
| DTT | Formedium | DTT005 | |
| EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
| Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
| 형광계 | Jasco | 분광 형광계 FP-8300 | |
| 글리세롤 | BOOM | 51171608 | |
| 중력 흐름 기둥 | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Hamilton 주사기 100 µ L | Hamilton | 7656-01 | |
| Hamilton 주사기 1000 µ L | Hamilton | 81320 | |
| 핸드 헬드 LCP 디스펜서 | Art Robbins Instruments | 620-411-00 | |
| 핸드 헬드 초음파 발생기 | Hielscher 초음파 기술 | UP50H | |
| HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
| Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
| K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
| KCl | BOOM | 76028270.1 | |
| KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
| 대형 팔콘 튜브 원심분리기 | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006-100G | |
| 광학 현미경 | Leica | DM LS2 | |
| L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
| LSM 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
| Microfluidic chip | Homemade | PDMS 기반 | DOI : https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
| Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
| NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
| 나노 드롭 분광계 | Isogen Life Science | ND-1000 분광 광도계 NanoDrop | |
| NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
| GUV 용 바늘 | Henke-Ject | 14-14575 | 27 G x 3/4 ''0.4 x 20 mm |
| 바늘 미세 유체 | 공학 Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2 ''1.2 x 40 mm |
| Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
| Nutator | VWR | 83007-210 | |
| 삼투압 측정기 | Gonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 기본 동결 점 삼투압계 | |
| 플라즈마클리너 | 플라즈마 에칭 | PE-Avenger | |
| 폴리카보네이트 필터 | Cytiva Whatman | Nuclepor 트랙-에칭 멤브레인 제품: 10417104 | 0.4 &마이크로; m |
| 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 355647 | |
| Pyranine | Acros Organics | H1529-1G | |
| Quartz 큐벳 (검정) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
| Sephadex G-75 resin | GE 헬스케어 | 17-0050-01 | |
| Sonicator | Sonics Sonics & 재료 INC | Sonics vibra cell | |
| 주사기 필터 | Sarstedt | Filtropur S 플러스 0.2 0.2 | µ m |
| 주사기 펌프 | 하버드 장치 | A-42467 | |
| 탁상용 원심분리기 | Eppendorf | 원심분리기 5418 | |
| 테플론 스페이서 | 홈메이드 | 테프론 기반 | 45 x 26 x 1.5 또는 45 x 26 x 3 또는 20 x 20 x 3 mm |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 ml | |
| 초원심분리기 | Beckman Coulter | Optima Max-E | |
| UV 램프 | Spectroline | ENB-280C/FE | |
| UV/VIS 분광계 | Jasco | V730 분광 광도계 | |
| Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
| 광시야 형광 현미경 | Zeiss | AxioObserver | |
| β-Casein | Sigma Aldrich | C5890-500g |
참고문헌
- Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
- Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future ....
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재인쇄 및 허가
